CN106754846A - 一种具核梭杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体、基因、载体、工程菌及其应用 - Google Patents

一种具核梭杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体、基因、载体、工程菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具核梭杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体、基因、载体、工程菌及其在合成左旋多巴中的应用，本发明所提供的具核梭杆菌TPL突变体与野生型相比较，具有更优良的催化性能。TPL突变体合成左旋多巴累积浓度高达140g/L以上，与野生型相比提高了17％～25％，光学纯度大于99.5％；底物邻苯二酚的转化率达到99.8％以上，与野生型相比较提高了15％‑20％。

Description

一种具核梭杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体、基因、载体、工程菌 及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种来源于具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)的酪氨酸酚裂解酶(Tyrosine Phenol Lyase，TPL)突变体、编码基因及其在催化合成左旋多巴(L-DOPA)中的应用。
(二)背景技术
左旋多巴(β-3,4-二羟苯基-α-丙氨酸，3,4-dihydroxylphenylalanine-L-alanine，L-DOPA)是生物体内重要的生物活性物质。它能够通过血脑屏障，到达中枢神经***，在体内脱羧酶的作用下，转化为多巴胺，进而发挥治疗帕金森综合症的作用。随着现代社会生活压力的增加以及人口老龄化的加剧，帕金森病患者数日益升高，左旋多巴作为帕金森综合症治疗的首选药物，其需求量不断增加。
传统制备左旋多巴的主要方法包括从植物如藜豆、猫豆中提取以及化学法不对称合成等。其中，从植物中提取左旋多巴受到原料来源的限制，并且提取步骤繁杂、产量低，远不能满足市场需求；而化学不对称合成法由于反应条件苛刻、转化率及立体选择性低、环境不友好等问题，在工业生产中受到限制。生物催化因其反应条件温和、过程高效、高度立体、区域和化学选择性等优点，已成为左旋多巴工业化生产的重要方法。
酶法合成左旋多巴的生物催化剂主要包括酪氨酸酶、氨基酰化酶、p-羟基苯乙酸3-羟化酶、酪氨酸酚裂解酶等。酪氨酸酶催化L-酪氨酸合成左旋多巴的酶活较低，且由于酪氨酸酶同时具有二酚氧化活性，会将左旋多巴进一步氧化生成副产物多巴醌。氨基酰化酶动力学拆分N-乙酰-3-(3,4-二甲氧苯基)丙氨酸水解合成3-(3,4-二甲氧苯基)丙氨酸，其甲氧基经HBr去保护后合成左旋多巴。该工艺路线长，且使用和产生有毒气体MeBr，安全隐患大。p-羟基苯乙酸3-羟化酶催化L-酪氨酸合成左旋多巴时，需辅因子NADH参与催化反应，生产成本高。与上述酶法工艺相比，酪氨酸酚裂解酶(TPL)工艺以邻苯二酚、丙酮酸和氨为底物，通过C-C键形成反应合成左旋多巴，原子经济性高。由于左旋多巴在水中的溶解度低，在生物催化反应中不断析出，有利于该可逆反应向产物生成方向进行，达到较高的转化率，因而具有重要的工业开发前景。
TPL广泛存在于各种微生物中，目前已报道用于左旋多巴合成的TPL来源包括弗氏柠檬酸菌(Citrobacterfreundii)，草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)以及嗜热菌(Symbiobacterium sp.)等。
由于TPL催化合成左旋多巴的底物之一邻苯二酚并非该酶的天然底物，其催化效率有待提高。另一方面，邻苯二酚是强蛋白质变性剂，在高强度工业生产环境下，高浓度邻苯二酚会对TPL产生抑制作用，甚至使其不可逆失活。因此，开发新的高活力及高邻苯二酚耐受能力的TPL对实现左旋多巴的工业化生产具有十分重要的意义。
(三)发明内容
本发明目的是通过定向进化手段对具核梭杆菌来源的酪氨酸酚裂解酶进行改造，提供一种突变体蛋白，提高蛋白活力，以邻苯二酚、丙酮酸和氨为底物，高效催化合成左旋多巴。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种具核梭杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体(即TPL突变体)，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第84位和129位进行易错PCR双突变获得的。具体所述双突变是将第84位的谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，同时将第129位的苏氨酸突变(T)为异亮氨酸(I)，所述突变体氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。任何对SEQ ID NO.4所示氨基酸序列中氨基酸经过缺失、***或替换一个或几个氨基酸且具有TPL活性的，仍属于本发明的保护范围。
本发明从具核梭杆菌(F.nucleatum，CGMCC 1.2526，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)提取其基因组为模板，成功克隆了编码TPL的基因(Fn-TPL)，转化于大肠杆菌(Escherichia coli)后进行了该基因的表达。进一步从大肠杆菌中提取含Fn-TPL质粒，使用多轮易错PCR方法对TPL基因进行随机突变，连接于表达载体后，同样表达于大肠杆菌，通过筛选获得活力提高的突变体，能够用于左旋多巴的工业化生产。
本发明对SEQ ID NO.1编码的TPL进行突变，可采用常规的分子改造手段。优先地，通过易错PCR扩增，改变PCR体系内Mg2+浓度，以及添加Mn2+，以获得突变DNA序列SEQ IDNO.3，其氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
本发明还提供一种所述具核梭杆菌TPL突变体的编码基因，所述编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。
本发明还涉及一种所述编码基因构建的重组载体以及由所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。
本发明可通过本领域常规方法将本发明的TPL突变体的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。本发明的重组载体没有限制，只要其可以在原核和/或真核细胞的各种宿主细胞中保持其复制或自主复制，所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET-28a。较佳地，可通过下述方法获得本发明的重组表达载体：将获得的野生型TPL及突变体基因产物与载体pET-28a连接，构建本发明的TPL突变基因重组表达质粒pET28a-FnTPL和pET28a-FnTPLM。
引入编码本发明的TPL突变体的DNA的宿主细胞没有限制，只要已经为其建立了重组表达***，满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本发明的TPL突变基因可以有效表达。例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、放线菌、曲霉菌，以及动物细胞和高等植物细胞。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。将重组质粒pET28a-FnTPL和pET28a-FnTPLM转化至E.coli BL21(DE3)中，获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-FnTPL和E.coli BL21(DE3)/pET28a-FnTPLM。
本发明重组TPL突变体的制备包括培养本发明的重组表达转化体，诱导获得重组TPL突变蛋白。其中，所述的培养重组表达转化体所用的培养基可以是本领域可使转化体生长并产生本发明的TPL的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水，pH 7.2。培养方法和培养条件没有特殊限制，只要使转化体能够生长并产生TPL即可。优选下述方法：将本发明涉及的重组E.coli BL21(DE3)/pET28a-FnTPLM接种至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃培养至光密度OD600达到0.5～0.7时，在终浓度为0.1～1.0mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本发明的TPL突变蛋白。
本发明还提供一种所述具核梭杆菌TPL突变体在合成左旋多巴中的应用，具体所述应用以含具核梭杆菌TPL突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以邻苯二酚、丙酮酸钠和醋酸铵为底物，以亚硫酸钠和EDTA·Na2为助剂，以磷酸吡哆醛(Pyridoxal 5’-phosphate,PLP)为辅酶，以pH5.0～9.0(优选pH8.0)的缓冲液为反应介质构成转化体系，在温度5～30℃(优选15℃)条件下进行转化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得左旋多巴。
进一步，所述转化体系中，初始时，邻苯二酚加入终浓度5～50g/L(优选5g/L)，丙酮酸钠加入终浓度5～50g/L(优选8g/L)，醋酸铵加入终浓度5～100g/L(优选50g/L)，亚硫酸钠加入终浓度0.5～10g/L(优选1g/L)，EDTA·Na2加入终浓度0.5～10g/L(优选2g/L)，磷酸吡哆醛加入终浓度0.05～5mM(优选1mM)，湿菌体用量为2～50g/L(优选20g/L)。
进一步，所述转化反应过程中对邻苯二酚、丙酮酸钠和醋酸铵进行补料，每隔0.5～4h补料一次，其中邻苯二酚每次补料0.1～10g/L(优选5g/L)，丙酮酸钠每次补料0.1～10g/L(优选5g/L)，醋酸铵每次补料1～20g/L(优选3.5g/L)。
本发明提供的TPL突变体可以以游离酶、固定化酶以及重组游离细胞的形式催化合成左旋多巴。
进一步，所述催化剂按如下方法制备：
(1)斜面培养：将含具核梭杆菌TPL突变体编码基因的重组基因工程菌接种至含50μg/ml卡那霉素的斜面培养基，在37℃培养8～16h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，1.5％琼脂，溶剂为去离子水，pH7.0。使用前加入50μg/ml卡那霉素。
(2)种子培养：将斜面菌体接种至种子培养基，在37℃培养8～10h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，50μg/ml卡那霉素，溶剂为去离子水，pH 7.0。
(3)发酵培养：将种子液以体积浓度3％的接种量接种至无菌的装有3L发酵培养基的5L机械搅拌通风通用式发酵罐中，将已灭菌的终浓度为15g/L乳糖直接添加到发酵罐中于28℃下诱导培养。待培养6～8h后放罐收集湿菌体。所述发酵培养基终浓度组成为：蛋白胨15g/L，酵母粉12g/L，NaCl10g/L，甘油15g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 1.36g/L，K2HPO4·3H2O 2.28g/L，MgSO4·7H2O 0.375g/L，溶剂为去离子水，pH。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：本发明所提供的具核梭杆菌TPL突变体与野生型相比较，具有更优良的催化性能。TPL突变体合成左旋多巴累积浓度高达140g/L以上，与野生型相比提高了17％～25％，光学纯度大于99.5％；底物邻苯二酚的转化率达到99.8％以上，与野生型相比较提高了15％-20％。
(四)附图说明
图1为含野生型及突变体TPL全细胞催化合成左旋多巴的反应进程。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1 TPL基因的获得
用DNA提取试剂盒提取具核梭杆菌(F.nucleatum subsp.CGMCC 1.2526，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)的全基因组DNA，以该DNA为模板，上游引物(5’GCTGAGGATCCATGAGATTTGAAGATTATCCAGC3’)和下游引物(5’GCATCCTCGAGTTATTTTTTTATTCCAAATCTAGC3’)为作用引物进行PCR扩增反应。PCR反应体系各组分加入量(总体积50μL)：5×PrimeSTARTM HS DNA polymerase Buffer 10μL，10mMdNTPmixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)4μL，浓度为50μM的上游引物、下游引物各1μL，基因组DNA 1μL，PrimeSTARTM HS DNA polymerase 0.5μL，无核酸水32.5μL。PCR反应条件为：预变性95℃1min，然后进入温度循环95℃10s，56℃90s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min，终止温度为4℃。测序分析结果表明，经上述过程扩增得到的核苷酸序列长度为1383bp(其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)，该序列编码一个完整的开放阅读框，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
实施例2 易错PCR构建TPL突变文库
以实施例1获得的TPL基因为模板，通过易错PCR扩增，获得突变序列。扩增引物为(5’GCTGAGGATCCATGAGATTTGAAGATTATCCAGC3’)和(5’GCATCCTCGAGTTATTTTTTTATTCCAAATCTAGC3’)。
扩增体系为：50μl反应体系：
10xTaq polymerase buffer：5μL；
Mg2+(25mM)：2-8μL；
Mm2+(25mM):2-8μL；
10mMdNTP mixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)4μ；
浓度为50μM的上游引物、下游引物各1μL，
DNA模板：1μL；
Taq DNA聚合酶：10U；
用双蒸水补足体系。
PCR反应条件为：预变性95℃1min，然后进入温度循环95℃10s，56℃90s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min，终止温度为4℃。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析和切胶回收，由BamHI/XhoI进行双酶切，与同样进行酶切处理的pET28a连接，连接液电击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布含卡那霉素(50μg/ml)的LB平板，37℃培养过夜，得到TPL的突变文库。
实施例3 TPL突变文库的筛选
TPL突变文库的筛选同文献所述(Choi,et al.,Kor.J.Microbiol.2006,34:58-62)。以突变前的酶为参照，初筛获得活力提高的阳性克隆，进一步通过液相色谱测定。通过第一轮突变后，获得活性最高的突变体，测序表明获得的突变体为E84K。提取含E84K突变体的质粒为模板，进行第二轮易错PCR，如实施例2，转化于大肠杆菌后，再进行突变文库的筛选，获得活力较E84K提高的突变体，经测序表明获得的突变体为双突变体E84K/T129I，其氨基酸序列如SEQ ID No.4，核苷酸序列为SEQ ID No.3。
实施例4 野生型和突变体TPL工程菌的诱导表达
分别将含野生型(SEQ ID No.1)和突变体TPL(SEQ ID No.3)重组质粒的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-FnTPL和E.coli BL21(DE3)/pET28a-FnTPLM接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，再以1％(v/v)接种量接种到含50μg/mL卡那霉素的50mL LB培养基中，37℃、200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃诱导培养6～8h后，4℃、8000rpm离心10min收集湿菌体，于-80℃贮存备用。
实施例5 TPL突变体催化剂的制备
(1)斜面培养：将含具核梭杆菌TPL突变体编码基因的重组基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-FnTPLM接种至含50μg/ml卡那霉素的斜面培养基，在37℃培养16h，获得斜面菌体；所述斜面培养基质量终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，1.5％琼脂，溶剂为去离子水，pH 7.0，使用前加入50μg/ml卡那霉素。
(2)种子培养：将斜面菌体接种至种子培养基，在37℃培养8～10h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，50μg/ml卡那霉素，溶剂为去离子水，pH 7.0。
(3)发酵培养：将种子液以体积浓度3％的接种量接种至无菌的装有3L发酵培养基的5L机械搅拌通风通用式发酵罐中，将已灭菌的终浓度为15g/L乳糖直接添加到发酵罐中于28℃下诱导培养。待培养6～8h后放罐收集湿菌体。所述发酵培养基终浓度组成为：蛋白胨15g/L，酵母粉12g/L，NaCl10g/L，甘油15g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 1.36g/L，K2HPO4·3H2O 2.28g/L，MgSO4·7H2O 0.375g/L，溶剂为去离子水，pH自然。
实施例6 野生型及突变体TPL催化合成左旋多巴
以实施例4获得的突变体菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-FnTPLM和出发菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-FnTPL细胞分别测定催化合成左旋多巴的能力。
(1)在500ml反应体系中添加邻苯二酚5g/L，丙酮酸钠5g/L，醋酸铵5g/L，亚硫酸钠0.5g/L，EDTA·Na20.5g/L，磷酸吡哆醛(PLP)0.05mM，氨水调pH至8.0，实施例5制备的TPL突变体重组细胞浓度5g/L(湿重)；温度15℃条件下进行反应。反应过程采用补料的方式进行，每隔0.5h补料一次，其中邻苯二酚每次补料0.5g/L，丙酮酸钠每次补料0.8g/L，醋酸铵每次补料2g/L转化24h。反应结束后用高效液相色谱进行检测，检测条件如下：
流动相:A:B＝9:1(A:0.02M KH2PO4-6M HCl,pH＝2.6；B:甲醇)
色谱柱:C18(Welchrom 4.6*250mm)
检测波长:280nm
柱温:34℃
进样量:10μL
流速:1ml/min
TPL突变体菌株细胞催化合成左旋多巴，目标产物浓度达到20g/L，转化率达45％，产率39％，左旋多巴光学纯度大于99.5％；野生型TPL菌株细胞催化合成左旋多巴，目标产物浓度达到15g/L，转化率达36％，产率达29％，左旋多巴光学纯度大于99.5％。
(2)在500ml反应体系中添加邻苯二酚5g/L，丙酮酸钠8g/L，醋酸铵50g/L，亚硫酸钠1g/L，EDTA·Na22g/L，磷酸吡哆醛(PLP)1mM，氨水调pH至8.0，实施例5制备的TPL突变体重组细胞浓度20g/L(湿重)；温度15℃条件下进行反应。反应过程采用补料的方式进行，每隔1h补料一次，其中邻苯二酚每次补料5g/L，丙酮酸钠每次补料5g/L，醋酸铵每次补料3.5g/L转化17h。TPL突变体菌株细胞催化合成左旋多巴，目标产物浓度达到140g/L(图1)，转化率达99.8％，产率高于91％，左旋多巴光学纯度大于99.5％；而野生型TPL菌株细胞催化合成左旋多巴，目标产物浓度达到120g/L(图1)，转化率达85％，产率达78％，左旋多巴光学纯度大于99.5％。
(3)在500ml反应体系中添加邻苯二酚20g/L，丙酮酸钠20g/L，醋酸铵60g/L，亚硫酸钠5g/L，EDTA·Na25g/L，磷酸吡哆醛(PLP)3.5mM，氨水调pH至8.0，TPL突变体重组细胞浓度35g/L(湿重)；温度15℃条件下进行反应。反应过程采用补料的方式进行，每隔2h补料一次，其中邻苯二酚每次补料8g/L，丙酮酸钠每次补料8g/L，醋酸铵每次补料15g/L转化20h。TPL突变体菌株细胞催化合成左旋多巴，目标产物浓度达到58g/L，转化率达41％，产率达35％，左旋多巴光学纯度大于99.5％；而野生型菌株细胞催化合成左旋多巴，目标产物浓度达到45g/L，转化率达35％，产率达27％，左旋多巴光学纯度大于99.5％。
(4)在500ml反应体系中添加邻苯二酚50g/L，丙酮酸钠50g/L，醋酸铵100g/L，亚硫酸钠10g/L，EDTA·Na210g/L，磷酸吡哆醛(PLP)5mM，氨水调pH至8.0，实施例5制备的TPL突变体重组细胞浓度50g/L(湿重)；温度15℃条件下进行反应。反应过程采用补料的方式进行，每隔3h补料一次，其中邻苯二酚每次补料10g/L，丙酮酸钠每次补料10g/L，乙酸铵每次补料20g/L转化9h。TPL突变体菌株细胞催化合成左旋多巴，目标产物浓度达到45g/L，转化率达35％，产率达28％，左旋多巴光学纯度大于99.5％；而野生型菌株细胞催化合成左旋多巴，目标产物浓度达到30g/L，转化率达25％，产率达19％，左旋多巴光学纯度大于99.5％。
本发明不受上述具体文字描述的限制。本发明可在权利要求书所概括的范围内作各种改变，这些改变均在本发明的范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江工业大学
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atgagatttg aagattatcc agcagagcca tttagaatta aaagtgtaga aactgttaaa 60
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<213> Fusobacteriumnucleatum
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Claims (10)

1.一种具核梭杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第84位和129位进行易错PCR双突变获得的。
2.如权利要求1所述具核梭杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体，其特征在于所述双突变是将第84位的谷氨酸突变为赖氨酸，同时将第129位的苏氨酸突变为异亮氨酸。
3.一种权利要求1所述具核梭杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体的编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。
4.一种由权利要求3所述编码基因构建的重组载体。
5.一种由权利要求4所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。
6.一种权利要求1所述具核梭杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体在合成左旋多巴中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用以含具核梭杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以邻苯二酚、丙酮酸钠和醋酸铵为底物，以亚硫酸钠和EDTA·Na2为助剂，以磷酸吡哆醛为辅酶，以pH5.0～9.0的缓冲液为反应介质构成转化体系，在温度5～30℃条件下进行转化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得左旋多巴。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述转化体系中，初始时，邻苯二酚加入终浓度5～50g/L，丙酮酸钠加入终浓度5～50g/L，醋酸铵加入终浓度5～100g/L，硝酸铵加入终浓度0.1～5g/L，亚硫酸钠加入终浓度0.5～10g/L，EDTA·Na2加入终浓度0.5～10g/L，磷酸吡哆醛加入终浓度0.05～5mM，湿菌体用量为2～50g/L。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述转化反应过程中对邻苯二酚、丙酮酸钠和醋酸铵进行补料，每隔0.5～4h补料一次，其中邻苯二酚每次补料0.1～10g/L，丙酮酸钠每次补料0.1～10g/L，醋酸铵每次补料1～20g/L。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：
(1)斜面培养：将含具核梭杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体编码基因的重组基因工程菌接种至含50μg/ml卡那霉素的斜面培养基，在37℃培养8～16h，获得斜面菌体；所述斜面培养基质量终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，1.5％琼脂，溶剂为去离子水，pH 7.0；
(2)种子培养：将斜面菌体接种至种子培养基，在37℃培养8～10h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，50μg/ml卡那霉素，溶剂为去离子水，pH 7.0；
(3)发酵培养：将种子液以体积浓度3％的接种量接种至无菌的装有3L发酵培养基的5L机械搅拌通风通用式发酵罐中，将已灭菌的终浓度为15g/L乳糖直接添加到发酵罐中于28℃下诱导培养，待培养6～8h后放罐收集湿菌体；所述发酵培养基终浓度组成为：蛋白胨15g/L，酵母粉12g/L，NaCl10g/L，甘油15g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 1.36g/L，K2HPO4·3H2O2.28g/L，MgSO4·7H2O 0.375g/L，溶剂为去离子水，pH。
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