CN108587947B - 一株溶磷菌及其与dehp降解菌复合菌剂与在土壤改良中的应用 - Google Patents

一株溶磷菌及其与dehp降解菌复合菌剂与在土壤改良中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一株溶磷菌及其与DEHP降解菌复合菌剂与在土壤改良中的应用。该菌株为Bacillus megaterium YLYP1，于2017年06月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC NO：60204。本发明还提供一种复合菌剂，包括YLYP1和Rhodococcus pyridinivorans XB。该复合菌剂协同性较好，其溶磷能力和DEHP降解能力得到显著提高，且培养方法简便易行，繁殖迅速，适应能力强，利用YLYP1和XB既可有效改善土壤磷素缺乏的状况，同时也可去除土壤中DEHP有机污染物，对培育和提升土壤生态肥力，保障农产品质量安全，实现边生产边修复具有重要意义。

Description

一株溶磷菌及其与DEHP降解菌复合菌剂与在土壤改良中的 应用
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一株溶磷菌及其与DEHP降解菌复合菌剂与在土壤改良中的应用。
背景技术
磷(P)是植物生长发育所必需的大量营养元素之一，参与植物多种生理代谢活动和形态建成，决定着农作物的产量和品质。植物所需磷素主要来源于土壤。由于土壤中的磷素通常以难溶盐的形态存在，导致大多数农田土壤磷素缺乏。我国约有70％以上的耕地缺乏磷素。近年来，随着农作物产量的不断提高，磷肥的施用量也不断加大，而施入农田的磷肥却极易被Ca2+、Fe3+、Al3+等阳离子结合形成难溶性磷酸盐而沉积，固定于土壤，从而导致作物对磷肥的当季利用率只有3.7～32.4％。大量施用磷肥不仅提高农业生产成本，还会导致土壤板结和肥力下降以及造成水体污染和土壤污染等一系列环境问题。因此，通过溶磷菌释放被土壤固定的磷素，减少磷肥的使用量，是提高磷的利用率有效方式之一，是应对我国化肥零增长政策的重要举措，对于我国农业可持续发展具有重要意义。
另一方面由于工业“三废”大量排放以及化肥、农药、农膜等农资产品的不合理使用，导致农田土壤邻苯二甲酸酯(PAEs)、多环芳烃(PAHs)等有机污染物污染。污染土壤中PAEs等有机污染物被农作物吸收累积，严重影响农产品质量安全。PAEs等有机污染物属于环境内分泌干扰物，可在人体内积累，具有生殖发育毒性、肝脏毒性和“三致”作用(致癌、致畸、致突变)，居民日常食用含PAEs等有机污染物的农产品导致长期低剂量暴露，严重危及人体健康。
因此，针对我国农田土壤磷素缺乏以及PAEs污染的现状，研究开发具有溶磷和PAEs降解功能的复合菌剂具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种溶磷菌。
本发明的另一目的在于提供一种复合菌剂。
本发明的再一目的在于提供上述溶磷菌、复合菌剂的应用。
本发明提供的溶磷菌及其复合菌剂既可以解决土壤磷素缺乏问题，又可以降低土壤DEHP污染，确保农产品质量安全。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一株溶磷菌，命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)YLYP1，是从污水处理厂的活性污泥中分离纯化得到的。
所述的溶磷菌为Bacillus megaterium YLYP1，其保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期：2017年06月21日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCC NO：60204。
所述巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)YLYP1菌体培养特征和形态特征：菌体为革兰氏阳性菌；有芽孢，芽孢中生或偏端生，芽孢呈椭圆形；电子显微镜下观察呈长杆状，菌体平均长度1.9～2.2μm，平均宽度0.7～0.9μm(图1)；在LB平板培养基上30℃培养24h，菌落呈乳黄色，菌落扁平***，边缘整齐，表面光滑不透明(图2)；所述菌株YLYP1的生理生化鉴定实验结果如表1所示。
本发明还提供上述Bacillus megaterium YLYP1在溶解难溶磷酸盐中的应用。
所述的难溶磷酸盐为磷酸钙、磷酸铝或磷酸铁。
优选的，所述的难溶磷酸盐为磷酸钙。
所述的Bacillus megaterium YLYP1在NBRIP培养基中，溶解难溶性磷酸盐至可溶性磷含量达95.3±3.2mg/L～405.0±3.7mg/L。
本发明还提供一种复合菌剂，包括Bacillus megaterium YLYP1和Rhodococcuspyridinivorans XB。
本课题组前期研究分离筛选的嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)XB能够有效降低土壤中邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)，并降低玉米对DEHP的吸收累积。该菌种的保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期：2016年09月28日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCCNO：60054。
所述的Bacillus megaterium YLYP1和Rhodococcus pyridinivorans XB制成浓度为108～1010cfu/mL的菌悬液；
所述的Bacillus megaterium YLYP1和Rhodococcus pyridinivorans XB按照体积比2～5：1～3进行混合；优选按照体积比2：1～3进行混合；更优选按照体积比2：1进行混合。
所述的复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将Bacillus megaterium YLYP1和Rhodococcus pyridinivorans XB分别接种于LB液体培养基中，28～30℃活化12～18h；
(2)挑取活化好的2种单菌分别接种于LB液体培养基中，分别培养至细菌数为108～1010cfu/mL；
(3)将2种单菌按照2～5：1～3的体积比均匀混合，即得多功能复合菌剂。
所述的复合菌剂在溶磷和/或降解DEHP中的应用。
所述的复合菌剂在NBRIP培养基中，可溶性磷含量达482.5～570.3mg/L。
所述的复合菌剂在含DEHP的MSM培养基中，对DEHP的降解能力得到提高，能够将DEHP基本完全降解。
结果显示，Bacillus megaterium YLYP1培养液中可溶性磷含量为405.0mg/L～436.2mg/L，Rhodococcus pyridinivorans XB培养液中可溶性磷含量15.7mg/L～20.2mg/L，而复合菌剂培养液中可溶性磷含量482.5mg/L～570.3mg/L。说明复合菌剂溶磷能力得到显著提升，达到1+1>2菌剂复配效果。
DEHP降解率测定：Bacillus megaterium YLYP1在含有DEHP的MSM培养基中DEHP不发生降解，Rhodococcus pyridinivorans XB在含有DEHP的MSM培养基中，对DEHP的降解率为80.5％～91.9％，而复合菌剂在含有DEHP的MSM培养基中，对DEHP降解率为90.5％～100％。因此，复合菌剂对DEHP的降解能力得到提高。
所述的复合菌剂在改良土壤质量中的应用。
优选的，将复合菌剂接加入土壤中，并搅拌均匀，可以使土壤中有效磷含量增加，并同时降解土壤中的DEHP。
将600g土壤加入500mL的烧杯中，并用锡箔纸遮光处理，向土壤中分别添加菌株YLYP1、XB和复配菌剂各60mL，均充分混匀。将土壤含水量调整至田间持水量30％，30℃恒温避光培养10d，以不接种任何菌剂土壤为对照，每个处理设置三个重复。测定不同处理土壤中有效磷含量。结果显示，对照土壤中有效磷含量39.8mg/kg，接种单菌Bacillusmegaterium YLYP1土壤中有效磷含量59.5～68.1mg/kg，接种单菌Rhodococcuspyridinivorans XB土壤中有效磷含量41.7～45.2mg/kg，接种复配菌剂土壤中有效磷含量为76.2～87.2mg/kg。
设置DEHP浓度为20mg/kg。将600g土壤加入500mL的烧杯中，加入DEHP，搅拌均匀，并用锡箔纸遮光处理，老化一周后，向土壤中分别添加菌株YLYP1、XB、复合菌剂60mL，搅拌均匀。将土壤含水量调整田间持水量的30％，30℃恒温培养15d，测定土壤中DEHP的残留量，以不添加任何菌剂的土壤为空白对照。上述每个处理设置3个重复。结果显示，空白对照中土壤中DEHP降解率27.1％，接种单菌Bacillus megaterium YLYP1土壤中DEHP降解率32.2％～36.5％，接种单菌Rhodococcus pyridinivorans XB土壤中DEHP降解率53.9％～65.3％，添加复合菌剂的土壤中DEHP的降解率分别为70.3％～93.7％。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明公开的多功能复合菌剂协同性较好，复合菌剂的溶磷能力和DEHP降解能力得到显著提高，所述复合菌剂培养方法简便易行，繁殖迅速，适应能力强，具有良好的应用潜力，利用溶磷菌Bacillus megaterium YLYP1和DEHP降解菌Rhodococcuspyridinivorans XB既可以有效改善土壤磷素缺乏的状况，同时也可以去除土壤中DEHP有机污染物，对培育和提升土壤生态肥力，保障农产品质量安全，实现边生产边修复具有重要意义。
附图说明
图1是巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)YLYP1细胞形态。
图2是巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)YLYP1菌落形态。
图3是巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)YLYP1***发育进化树。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中所用的菌株Rhodococcus pyridinivorans XB的保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期：2016年09月28日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCC NO：60054。
无机盐培养基(MSM，g·L-1)：K2HPO4 5.8，KH2PO4 4.5，(NH4)2SO4 2.0，MgCl2 0.16，CaCl2 0.02，Na2MoO4·2H2O 0.0024，FeCl3 0.0018，MnCl2·2H2O0.0015，pH 7.5。在MSM培养基中添加DEHP初始浓度为400mg L-1，作为唯一碳源。
实施例1
溶磷菌的筛选：
(1)所述菌株的分离方法为平板筛选法：采集污水处理厂的活性污泥于50mL无菌离心管中，置于洁净冰盒中。称取1g活性污泥溶解到装有40mL无菌水的50mL离心管中，130rpm振荡器振荡成均匀，用0.9％无菌生理盐水将样品梯度稀释制成10-1～10-5溶液。
(2)培养基：
蒙金娜(PVK)液体培养基：磷酸钙5.0g，蔗糖10.0g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.1g，七水合硫酸镁0.1g，氯化钾0.2g，硫酸锰0.03g，酵母膏0.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.2。PVK固体培养基则添加琼脂15g。
磷酸盐生长(NBRIP)培养基：葡萄糖10.0g，磷酸钙5.0g，六水合氯化镁5.0g，七水合硫酸镁0.25g，氯化钾0.2g，硫酸铵0.1g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。
LB液体培养基：酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。LB固体培养基则添加15g琼脂。
所有培养基于121℃，灭菌20min。
(3)溶磷菌筛选：分别吸取不同稀释倍数的稀释液0.1mL，均匀涂布于PVK固体培养基上，置于30℃倒置培养5天，挑选长势良好、解磷圈显著的菌落，用划线法再转接至PVK固体培养基上，重复2～3次，最终获得一株溶磷能力较强的溶磷菌，其编号为YLYP1。将其转接至LB培养基试管斜面4℃冰箱保藏，用于后续实验。
实施例2
溶磷菌株YLYP1鉴定：
形态特征和生理生化的检测依据和方法为细菌鉴定程序MS(i)/C005-C01。形态鉴定：所述菌株为***，有芽孢，芽孢中生或偏端生，芽孢呈椭圆形；电子显微镜下长杆状，菌体平均长度1.9～2.2μm，平均宽度0.7～0.9μm(图1)。在LB固体培养基上30℃培养24h，菌落呈乳黄色，菌落扁平***，表面光滑不透明，边缘整齐(图2)。
生理生化特征鉴定：生理生化实验结果见表1。
表1 Bacillus megateriumYLYP1的生理生化特征
生理生化试验 结果 生理生化试验 结果
接触酶 + D-葡糖糖发酵 -
氧化酶 - 海藻糖发酵 -
厌氧生长 - 甘露糖发酵 -
V-P测定 - 麦芽糖发酵 -
硝酸盐还原 - 鼠李糖发酵 -
淀粉水解 + 运动 +
明胶液化 + 2％NaCl生长实验 +
苯丙氨酸脱羟酶 - 5％NaCl生长实验 +
柠檬酸盐利用 - 7％NaCl生长实验 -
卵磷脂酶 - 10％NaCl生长实验 -
吲哚 - pH4培养基生长 -
酪素水解 + pH6培养基生长 +
酪氨酸水解 - pH10培养基生长 +
5℃生长 - pH11培养基生长 -
10℃生长 - 脲酶 +
20℃生长 + 丙二酸盐利用 -
30℃生长 + 硫化氢试验 -
40℃生长 + 鸟氨酸脱羟酶 -
42℃生长 - 精氨酸脱羟酶 -
精氨酸双水解酶 -
+：阳性；-：阴性
分子生物学鉴定：采用细菌总DNA提取试剂盒提取该菌总DNA，采用细菌16S rDNA通用引物F27和R1492对该菌基因组进行PCR扩增和测序(George et al.,2013)，序列如SEQID NO：1所示。将测序结果与GenBank中已报道的16S rDNA序列进行同源性比对，并进行***发育进化树分析，该菌株YLYP1的16S rDNA序列与Bacillus megaterium B2(KT307979.1)同源性较高，同源率达99％，构建的***发育进化树见图3。因此，根据所述菌株的形态特征、生理生化特征以及***进化分析，将该菌株鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)。菌种命名为Bacillus megaterium YLYP1。
所述的Bacillus megaterium YLYP1的保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期：2017年06月21日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCC NO：60204。
实施例3
菌株Bacillus megaterium YLYP1溶磷能力测定：
(1)菌悬液的制备：用接种环挑取少量保藏于试管斜面的YLYP1菌种于50mL LB液体培养基中，于30℃，150rpm，培养12h，取40mL培养液于50mL离心管中，4℃，3500rpm离心3min，收集菌体，用0.9％无菌生理盐水洗涤菌体3次，并用生理盐水制备菌密度为108cfu/mL的菌悬液。
(2)磷酸盐预处理：称取20.0g分析纯磷酸铝、磷酸铁或磷酸钙于大烧杯中，用2L超纯水超声溶解，每隔30min弃去上层浑浊液，保留烧杯底部难溶的磷酸铝、磷酸铁或磷酸钙，重复超声洗涤2～3次至上层溶液澄清，并收集沉淀在烧杯底部的磷酸铝、磷酸铁或磷酸钙，置于60℃烘箱烘干，碾磨后，装入棕色试剂瓶中，置于干燥器中备用。
(3)NBRIP培养基配制：
以难溶磷酸铝、磷酸铁或磷酸钙为唯一磷源配制培养基，用NaOH溶液调节pH值至7.0，于121℃灭菌20min。NBRIP培养基配方参照实施例1步骤(2)所示。
(4)接种和培养：将上述制备好的菌悬液(108cfu/mL)按照培养体系的4％(V：V)的接种量，接种到NBRIP培养基。于30℃，130rpm培养5d。
(5)可溶性磷酸盐的测定：培养5d后，取培养液2mL于的离心管，4℃，3500rpm离心10min，取0.2mL上清液稀释至10mL，用钼锑抗分光光度法测定可溶性磷酸盐含量(HJ 704-2014土壤有效磷的测定碳酸氢钠浸提-钼锑抗分光光度法)。以121℃灭菌20min的菌悬液作为对照。NBRIP培养基中，溶解磷酸铝，获得可溶性磷含量达到95.3±3.2mg/L，溶解磷酸铁，获得可溶性磷含量达到130.4±5.6mg/L，溶解难溶性磷酸钙释放可溶性磷达405.0±3.7mg/L。为了排除高温高压灭菌对培养液中可溶性磷酸盐含量的影响，我们测定了灭菌前后培养液中的可容性磷酸盐的含量，结果表明，高压灭菌对可溶性磷酸盐含量没有影响。
实施例4
复合菌剂溶磷能力分析：
(1)将Bacillus megaterium YLYP1和Rhodococcus pyridinivorans XB分别接种于LB液体培养基中，30℃活化12h；
(2)挑取活化好的2种单菌分别接种于LB液体培养基中，分别培养至细菌数为109cfu/mL；
(3)将2种单菌按照2：1的体积比均匀混合，即得多功能复合菌剂。
(4)将等菌体数量的复合菌剂、Bacillus megaterium YLYP1和Rhodococcuspyridinivorans XB分别接种到NBRIP培养基(唯一磷源采用磷酸钙)中，于30℃，130rpm培养5天，每个处理设置3个重复。
(5)可溶性磷酸盐的测定：培养5天后，取培养液2mL于离心管，4℃，3500rpm离心10min，取0.2mL上清液稀释至10mL，用钼锑抗分光光度法测定可溶性磷酸盐的含量。结果显示，Bacillus megaterium YLYP1培养液中可溶性磷含量为413.2mg/L，Rhodococcuspyridinivorans XB培养液中可溶性磷含量18.2mg/L，而复合菌剂培养液中可溶性磷含量529.5mg/L，说明复合菌剂溶磷能力得到显著提升，达到1+1>2菌剂复配效果。
实施例5
复合菌剂溶磷能力分析：
(1)将Bacillus megaterium YLYP1和Rhodococcus pyridinivorans XB分别接种于LB液体培养基中，28℃活化12h；
(2)挑取活化好的2种单菌分别接种于LB液体培养基中，分别培养至细菌数为108cfu/mL；
(3)将2种单菌按照2：3的体积比均匀混合，即得多功能复合菌剂。
(4)将等菌体数量的复合菌剂、Bacillus megaterium YLYP1和Rhodococcuspyridinivorans XB分别接种到NBRIP培养基(唯一磷源采用磷酸钙)中，于30℃，130rpm培养5天，每个处理设置3个重复。
(5)可溶性磷酸盐的测定：培养5天后，取培养液2mL于离心管，4℃，3500rpm离心10min，取0.2mL上清液稀释至10mL，用钼锑抗分光光度法测定可溶性磷酸盐的含量。结果显示，Bacillus megaterium YLYP1培养液中可溶性磷含量为405.0mg/L，Rhodococcuspyridinivorans XB培养液中可溶性磷含量15.7mg/L，复合菌剂培养液中可溶性磷含量482.5mg/L，说明复合菌剂溶磷能力得到显著提升，达到1+1>2菌剂复配效果。
实施例6
复合菌剂溶磷能力分析：
(1)将Bacillus megaterium YLYP1和Rhodococcus pyridinivorans XB分别接种于LB液体培养基中，30℃活化18h；
(2)挑取活化好的2种单菌分别接种于LB液体培养基中，分别培养至细菌数为1010cfu/mL；
(3)将2种单菌按照2：2的体积比均匀混合，即得多功能复合菌剂。
(4)将等菌体数量的复合菌剂、Bacillus megaterium YLYP1和Rhodococcuspyridinivorans XB分别接种到NBRIP培养基(唯一磷源采用磷酸钙)中，于30℃，130rpm培养5天，每个处理设置3个重复。
(5)可溶性磷酸盐的测定：培养5天后取培养液2mL于离心管，4℃，3500rpm离心10min，取0.2mL上清液稀释至10mL，用钼锑抗分光光度法测定可溶性磷酸盐的含量。结果显示，Bacillus megaterium YLYP1培养液中可溶性磷含量为436.2mg/L，Rhodococcuspyridinivorans XB培养液中可溶性磷含量20.2mg/L，而复合菌剂培养液中可溶性磷含量570.3mg/L，说明复合菌剂溶磷能力得到显著提升，达到1+1>2菌剂复配效果。
实施例7
复合菌剂降解DEHP的能力分析：
(1)将Bacillus megaterium YLYP1和Rhodococcus pyridinivorans XB分别接种于LB液体培养基中，28℃活化12h；
(2)挑取活化好的2种单菌分别接种于LB液体培养基中，分别培养至细菌数为108cfu/mL；
(3)将2种单菌按照2：1的体积比均匀混合，即得多功能复合菌剂。
(4)将等菌体数量的Bacillus megaterium YLYP1和Rhodococcuspyridinivorans XB以及复合菌剂分别接入以DEHP为唯一碳源的MSM培养基内，于30℃，130rpm培养3天，同时以未接菌培养基为空白对照，每个处理设置3个重复。
(5)Bacillus megaterium YLYP1培养液中DEHP不发生降解，Rhodococcuspyridinivorans XB对DEHP的降解率为80.5％，而复合菌剂对DEHP降解率为90.5％。因此，复合菌剂对DEHP的降解能力得到提高。
实施例8
复合菌剂降解DEHP的能力分析：
(1)将Bacillus megaterium YLYP1和Rhodococcus pyridinivorans XB分别接种于LB液体培养基中，在30℃活化18h；
(2)挑取活化好的2种单菌分别接种于LB液体培养基中，分别培养至细菌数为1010cfu/mL；
(3)将2种单菌按照2：3的体积比均匀混合，即得多功能复合菌剂。
(4)将等菌体数量的单菌Bacillus megaterium YLYP1和Rhodococcuspyridinivorans XB以及复合菌剂分别接入以DEHP为唯一碳源的MSM培养基内，于30℃，150rpm的无菌摇床中培养3天，同时以未接菌培养基为空白对照，每个处理设置3个重复。
(5)Bacillus megaterium YLYP1培养液中DEHP不发生降解，Rhodococcuspyridinivorans XB对DEHP的降解率为91.9％，而复合菌剂将DEHP完全降解。因此，复合菌剂对DEHP的降解能力得到提高。
实施例9
复合菌剂应用于磷素缺乏土壤改良：
(1)供试土壤：农田水稻土，pH 5.62，有机质17.40g/kg，总氮0.79g/kg，总磷0.66g/kg，风干后过60目。
(2)将Bacillus megaterium YLYP1和Rhodococcus pyridinivorans XB分别接种于LB液体培养基中，30℃活化18h；
(3)挑取活化好的2种单菌分别接种于LB液体培养基中，分别培养至细菌数为108cfu/mL；
(4)将2种单菌按照2：1的体积比均匀混合，即得多功能复合菌剂。
(5)土壤中有效磷含量测定：
将600g土壤加入500mL的烧杯中，并用锡箔纸遮光处理，向土壤中分别添加菌株YLYP1、XB、复合菌剂60mL，均充分混匀。将土壤含水量调整至田间持水量的30％，在30℃培养10d，以不接种任何菌剂的土壤为对照，每个处理设置三个重复。测定不同处理土壤中有效磷含量，结果显示，对照中有效磷含量39.8mg/kg，接种单菌Bacillus megaterium YLYP1土壤中有效磷含量59.5mg/kg，接种单菌Rhodococcus pyridinivorans XB土壤中有效磷含量41.7mg/kg，接种复合菌剂土壤中有效磷含量为76.2mg/kg。
实施例10
复合菌剂应用于磷素缺乏土壤改良：
(1)供试土壤：农田水稻土，pH 5.62，有机质17.40g/kg，总氮0.79g/kg，总磷0.66g/kg，风干后过60目。
(2)将Bacillus megaterium YLYP1和Rhodococcus pyridinivorans XB分别接种于LB液体培养基中，30℃活化18h；
(3)挑取活化好的2种单菌分别接种于LB液体培养基中，分别培养至细菌数为1010cfu/mL；
(4)将2种单菌按照2：1的体积比均匀混合，即得多功能复合菌剂。
(5)土壤中有效磷含量测定：
将600g土壤加入500mL的烧杯中，并用锡箔纸遮光处理，向土壤中分别添加菌株YLYP1、XB、复合菌剂60mL，均充分混匀。将土壤含水量调整至田间持水量的30％，在30℃培养10d，以不接种任何菌剂的土壤为对照，每个处理设置三个重复。测定不同处理土壤中有效磷含量，结果显示，对照中有效磷含量39.8mg/kg，接种单菌Bacillus megaterium YLYP1土壤中有效磷含量68.1mg/kg，接种单菌Rhodococcus pyridinivorans XB土壤中有效磷含量45.2mg/kg，接种复合菌剂土壤中有效磷含量为87.2mg/kg。
实施例11
复合菌剂对DEHP污染土壤修复应用：
(1)供试土壤：农田水稻土，pH 5.62，有机质17.40g/kg，总氮0.79g/kg，总磷0.66g/kg，风干后过60目。
(2)将Bacillus megaterium YLYP1和Rhodococcus pyridinivorans XB分别接种于LB液体培养基中，30℃活化18h；
(3)挑取活化好的2种单菌分别接种于LB液体培养基中，分别培养至细菌数为108cfu/mL；
(4)将2种单菌按照2：3的体积比均匀混合，即得多功能复合菌剂。
(5)复合菌剂修复DEHP污染土壤
设置DEHP污染浓度为20mg/kg。将600g土壤加入500mL的烧杯中，加入DEHP，搅拌均匀，并用锡箔纸遮光处理，老化一周后，向土壤中分别添加菌株YLYP1、XB、复合菌剂60mL，搅拌均匀。将土壤含水量调整至田间持水量的30％，30℃恒温培养15d，以不添加任何菌剂的土壤为空白对照，上述每个处理设置3个重复，测定中DEHP的残留量。结果显示，空白对照中土壤中DEHP降解率27.1％，接种单菌Bacillus megaterium YLYP1土壤中DEHP降解率32.2％，接种单菌Rhodococcus pyridinivorans XB土壤中DEHP降解率53.9％，添加复合菌剂的土壤中DEHP的降解率分别为70.3％。
实施例12
复合菌剂对DEHP污染土壤修复应用:
(1)供试土壤：农田水稻土，pH 5.62，有机质17.40g/kg，总氮0.79g/kg，总磷0.66g/kg，风干后过60目。
(2)将Bacillus megaterium YLYP1和Rhodococcus pyridinivorans XB分别接种于LB液体培养基中，30℃活化18h；
(3)挑取活化好的2种单菌分别接种于LB液体培养基中，分别培养至细菌数为1010cfu/mL；
(4)将2种单菌按照2：1的体积比均匀混合，即得多功能复合菌剂。
(5)复合菌剂修复DEHP污染土壤
设置DEHP污染浓度为20mg/kg。将600g土壤加入500mL的烧杯中，加入DEHP，搅拌均匀，并用锡箔纸遮光处理，老化一周后，向土壤中分别添加菌株YLYP1、XB、复合菌剂60mL，搅拌均匀。将土壤含水量调整至田间持水量的30％，30℃恒温培养15d，以不添加任何菌剂的土壤为空白对照，上述每个处理设置3个重复，测定中DEHP的残留量。结果显示，空白对照中土壤中DEHP降解率27.1％，接种单菌Bacillus megaterium YLYP1土壤中DEHP降解率36.5％，接种单菌Rhodococcus pyridinivorans XB土壤中DEHP降解率65.3％，添加复合菌剂的土壤中DEHP的降解率分别为93.7％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一株溶磷菌及其与DEHP降解菌复合菌剂与在土壤改良中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1450
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Bacillus megaterium YLYP1的16S rDNA序列
<400> 1
agcctggggc tctataatgc agtcgagcga ctgattagaa gcttgcttct atgacgttag 60
cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggcaac ctgcctgtaa gactgggata acttcgggaa 120
accgaagcta ataccggata ggatcttctc cttcatggga gatgattgaa agatggtttc 180
ggctatcact tacagatggg cccgcggtgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc 240
aaggcaacga tgcatagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 300
cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg 360
agcaacgccg cgtgagtgat gaaggctttc gggtcgtaaa actctgttgt tagggaagaa 420
caagtacgag agtaactgct cgtaccttga cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact 480
acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt atccggaatt attgggcgta 540
aagcgcgcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc cacggctcaa ccgtggaggg 600
tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agagaaaagc ggaattccac gtgtagcggt 660
gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc ggctttttgg tctgtaactg 720
acgctgaggc gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg 780
taaacgatga gtgctaagtg ttagagggtt tccgcccttt agtgctgcag ctaacgcatt 840
aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact caaaggaatt gacgggggcc 900
cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct 960
tgacatcctc tgacaactct agagatagag cgttcccctt cgggggacag agtgacaggt 1020
ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1080
aacccttgat cttagttgcc agcatttagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa 1140
accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1200
gtgctacaat ggatggtaca aagggctgca agaccgcgag gtcaagccaa tcccataaaa 1260
ccattctcag ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagctggaa tcgctagtaa 1320
tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1380
ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt ggagtaaccg taaggagcta gccgcgtaag 1440
gtgaacaaat 1450

Claims (7)

1.一株溶磷菌，其特征在于：名称为Bacillus megaterium YLYP1，于2017年06月21日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC NO：60204。
2.权利要求1所述的溶磷菌在溶解难溶磷酸盐中的应用。
3.根据权利要求2中所述的应用，其特征在于：
所述的难溶磷酸盐为磷酸钙、磷酸铝或磷酸铁。
4.一种复合菌剂，其特征在于：包括权利要求1所述的Bacillus megaterium YLYP1和Rhodococcus pyridinivorans XB；
所述的Rhodococcus pyridinivorans XB，于2016年09月28日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCCNO：60054；
所述的Bacillus megaterium YLYP1和Rhodococcus pyridinivorans XB分别制成浓度为108～1010 cfu/mL的菌悬液；
所述的Bacillus megaterium YLYP1和Rhodococcus pyridinivorans XB按照菌悬液的体积比2：1～3进行混合。
5.权利要求4所述的复合菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将Bacillus megaterium YLYP1和Rhodococcus pyridinivorans XB分别接种于LB液体培养基中，28～30 ℃活化12～18 h；
（2）挑取活化好的2种单菌分别接种于LB液体培养基中，分别培养至细菌数为108～1010 cfu/mL；
（3）将2种单菌按照2：1～3的体积比均匀混合，即得多功能复合菌剂。
6.权利要求4所述的复合菌剂在溶磷和/或降解邻苯二甲酸二异辛酯中的应用。
7.权利要求4所述的复合菌剂在改良土壤质量中的应用。
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