CN107287131B - 一种小单孢菌、其代谢产物大环内酰胺化合物和在抗肿瘤中的应用 - Google Patents

一种小单孢菌、其代谢产物大环内酰胺化合物和在抗肿瘤中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种小单孢菌、其代谢产物大环内酰胺化合物和在抗肿瘤中的应用。本发明小单孢菌(Micromonospora sp.)FIM05‑328，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.13933，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017年3月27日。本发明小单孢菌(Micromonospora sp.)FIM05‑328的代谢产物经分离纯化可得到大环内酰胺化合物，该大环内酰胺化合物可用于制备抗肿瘤的药物。本发明通过对小单孢菌产生的肿瘤细胞毒性活性化合物进行分离纯化，为抗肿瘤药物的创新开发提供了备选化合物，对微生物的药物资源开发也具有重要意义。

Description

一种小单孢菌、其代谢产物大环内酰胺化合物和在抗肿瘤中 的应用
技术领域
本发明属微生物及其天然产物的应用技术领域，更具体地说，本发明涉及 一种小单孢菌(Micromonospora sp.)FIM05-328及其次生代谢产物分离纯化得 到的大环内酰胺化合物，以及将该化合物应用于抗肿瘤中。
背景技术
近年来肿瘤的发病率及死亡率呈上升趋势，癌症已成为严重危害人类健康 的第一杀手。目前肿瘤的治疗仍以药物治疗为主，因此，抗肿瘤药物的研发具 有巨大的市场前景，研究开发新的高效低毒的抗肿瘤药物具有重要意义。
微生物资源为创新药物研究提供无穷的源泉，从微生物次生代谢产物中寻 找有活性的化合物作为先导化合物创制新药是世界药学工作者公认的有效途径 之一。微生物丰富多样的次生代谢产物为化学药物新药研究与开发提供了大量 极为珍贵的模式结构和药物前体小分子，是药物发现源头创新和持续创新的重 要物质基础，对整个创新药物的研究具有决定性意义。
放线菌是微生物活性次生代谢产物的主要来源，其中以链霉菌属及一些稀 有放线菌为主。在稀有放线菌中，尤以小单孢菌属(Micromonospora)产生的新 型活性物质最多，仅次于链霉菌属。目前已从小单孢菌(Micromonospora)中发 现了庆大霉素、小诺霉素、美加米星、麦新米星、Dynemicin A、加利车霉素、 埃斯波霉素、kerdarcidin和卤霉素等重要抗生素。
发明内容
本发明的目的在于：根据目前***的药物仍不够全面有效等问题，提供 一种小单孢菌(Micromonospora sp.)FIM05-328及其次生代谢产物分离纯化得 到的大环内酰胺化合物，以及将该化合物应用于抗肿瘤中。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种小单孢菌(Micromonospora sp.)FIM05-328，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号 为：CGMCCNO.13933，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏 日期为2017年3月27日。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种大环内酰胺化合物，该化合 物是由小单孢菌(Micromonospora sp.)FIM05-328的次生代谢产物经分离纯化 得到，其结构式如式(I)所示：
Figure 1
为了实现上述发明目的，本发明还提供了小单孢菌(Micromonospora sp.)FIM05-328在制备所述大环内酰胺化合物中的应用，具体地，本发明提供了上述 大环内酰胺化合物的分离纯化方法，包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述的小单孢菌(Micromonospora sp.)FIM05-328接种 至培养基培养，得到种子培养液；
(2)将种子培养液接种至发酵培养液中进行发酵培养，得到发酵产物；
(3)将发酵产物离心得到菌丝体和上清液，使用有机溶剂提取菌丝体两次， 减压浓缩去除有机溶剂后得到浸膏；
(4)将浸膏与上清液合并、用大孔树脂吸附后，分别用去离子水和甲醇洗 脱，经TLC检测，展层剂为体积比为10:1的氯仿/甲醇，将Rf值为0.57的组分 拌样、装柱后，用氯仿/甲醇洗脱，再经TLC检测，展层剂为体积比为10:1的 氯仿/甲醇，将Rf值为0.60的组分进行柱层析，用甲醇/乙腈洗脱，得到所述大 环内酰胺化合物。
作为本发明大环内酰胺化合物的分离纯化方法的一种改进，步骤(1)中， 所述培养基的pH值为7.5，每份培养基包括如下组分：可溶性淀粉15g，葡萄 糖5g，蛋白胨5g，酵母粉5g，MgSO4·7H2O 0.5g，(NH4)2SO4 0.5g，CaCO3 1g， 海水1000mL；所述培养是在28～30℃、220～240rpm下摇床培养3～5天。
作为本发明大环内酰胺化合物的分离纯化方法的一种改进，步骤(2)中， 所述发酵培养液的pH值为7.0～7.4，每份发酵培养液包括如下组分：可溶性淀 粉20g，葡萄糖5g，蛋白胨5g，玉米浆干粉2.5g，酵母提取物2g，K2HPO4·3H2O 0.5g，CaCO3 1g，海水1000mL；所述发酵培养是在22～25℃、180～200rpm下摇 床培养7～8天。
作为本发明大环内酰胺化合物的分离纯化方法的一种改进，步骤(2)中， 所述种子培养液接种至发酵培养液中的接种量为5～10％(v:v)。
经抗肿瘤活性测试可知，本发明大环内酰胺化合物对肿瘤细胞，特别是人 食管鳞癌细胞具有显著的抑制活性，因此，本发明大环内酰胺化合物可用于制 备***的药物，更优选地，本发明大环内酰胺化合物可用于制备治疗食道 癌的药物。
相对于现有技术，本发明具有如下优点：
本发明发现了一种新的小单孢菌(Micromonospora sp.)FIM05-328，通过对 小单孢菌(Micromonospora sp.)FIM05-328产生的肿瘤细胞毒性活性化合物进 行分离纯化，得到一种新的大环内酰胺化合物，该化合物具有显著的肿瘤细胞 抑制活性，因此，本发明为抗肿瘤药物的创新开发提供了备选化合物，对微生 物的药物资源开发也具有重要意义。
本发明小单孢菌(Micromonospora sp.)FIM05-328，保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.13933，保藏地址 为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017年3月27日。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式，对本发明一种小单孢菌、其代谢产物大环 内酰胺化合物和在抗肿瘤中的应用以及有益效果进行详细说明。
图1是本发明小单孢菌(Micromonospora sp.)FIM05-328在高氏-天冬素琼 脂上28℃培养15天的形态。
图2是本发明小单孢菌(Micromonospora sp.)FIM05-328及其相近菌株的 ***进化树。
图3是本发明大环内酰胺化合物的紫外吸收图谱。
图4是本发明大环内酰胺化合物的HR-TOF-MS图谱。
图5是本发明大环内酰胺化合物的1H-NMR图谱。
图6是本发明大环内酰胺化合物的13C-NMR图谱。
图7是本发明大环内酰胺化合物的1H-1HCOSY图谱。
图8是本发明大环内酰胺化合物的HSQC谱图。
图9是本发明大环内酰胺化合物的HMBC谱图。
图10是本发明大环内酰胺化合物的ROESY谱图。
图11为本发明大环内酰胺化合物的HMBC和1H-1H COSY相关分析图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施 例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例 仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地 制宜做出选择而对结果并无实质性影响。
实施例1
菌株FIM 05-0328，为海洋稀有放线菌菌种，从浙江宁波海滩土中获得，在 不同琼脂培养基上均不产生气生菌丝，基内菌丝发育良好，在无机培养基上为 淡黄到浅澄，无可溶性色素。在有机培养基上基内菌丝的颜色为橙色到橙黄色， 孢子颜色为灰黑至黑。单个孢子着生在基内菌丝上，孢子圆形至椭圆形，直径 0.6-1.0μm(图1)。生长温度20-40℃，最适32℃，生长pH范围6-12，最适7.0。 不液化明胶、不凝固牛奶、硝酸盐还原能力弱，在ISP 6培养基上不产生硫化氢， 在ISP 7培养基上不产生黑色素。菌株碳源利用情况见表1，ISP等培养基上培 养特征描述见表2。
表1 菌株FIM05-0328的碳源利用
Figure BDA0001306850510000051
表2 菌株FIM05-0328的培养特征
Figure BDA0001306850510000052
Figure BDA0001306850510000061
*：G:生长情况；SM：基内菌丝；颜色描述参照ISCC-NBS，括号中数字为颜色编号。
从菌株基因组中克隆了16S rRNA基因几乎全长序列，含1,475个碱基(NCBIGenBank序列号：KC622312)，Blast比对结果显示，与小单孢菌属典型菌株 Micromonosporarifamycinica AM105T序列相似性最高，为98.58％(1453/1474bp)， 构建与相关菌株的***进化树(图2)。
形态学、生理生化特征以及16S rRNA基因同源性分析结果表明海洋稀有放 线菌FIM 05-0328归属放线菌目小单孢菌科小单孢菌属，暂命名Micromonospora sp.FIM 05-0328。16S rRNA基因与已知小单孢菌的同源性低于98.6％，提示该 小单孢菌FIM 05-0328可能是该属的一个新种，分类命名：(Micromonospora sp.) FIM05-328，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为： CGMCC No.13933。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏日：2017 年3月27日。
小单孢菌(Micromonospora sp.)FIM05-328发酵分离纯化大环内酰胺化合物：
(1)发酵条件：
培养基的制备：可溶性淀粉15g，葡萄糖5g，蛋白胨5g，酵母粉5g， MgSO4·7H2O0.5g，(NH4)2SO4 0.5g，CaCO3 1g，海水1000mL，pH7.5。121℃ 高温灭菌30min，备用。
取小单孢菌(Micromonospora sp.)FIM05-328高氏天冬素琼脂斜面培养物 接入上述培养基中，28～30℃，220～240rpm条件下摇床培养培养3～5天，得到 种子培养液。
发酵培养液的制备：可溶性淀粉20.0g，葡萄糖5.0g，蛋白胨5.0g，玉米 浆干粉2.5g，酵母提取物2.0g，K2HPO4·3H2O 0.5g，CaCO3 1.0g，海水1000mL， pH 7.0～7.4。121℃高温灭菌30min，备用。
将种子培养液以5～10％的接种量接种到发酵培养液中，22～25℃， 180～200rpm条件下摇床培养培养7～8天，得到发酵产物。
(2)提取分离：
将发酵产物(30L)在4500rpm条件下离心得到菌丝体和上清液，菌丝体用 1.5～2.0倍体积的甲醇/丙酮(1：1，v:v)提取两次，提取液在低于40℃减压浓 缩去除甲醇和丙酮得到浸膏(150g)，将浸膏与上清液合并，用HP-20大孔树脂吸 附，先用5倍柱体积去离子水洗脱，再用5倍柱体积甲醇洗脱，TLC检测，展 层剂为氯仿/甲醇(10:1，v:v)，合并相同组分，得到六种组分(Rf值分别为0.23、 0.45、0.57、0.71、0.82和0.93)，将组分3(110mg、TLC检测Rf值为0.57的 组分)用100～200目硅胶拌样，干法装柱后，用氯仿/甲醇(9:1～1:1，v:v)洗脱， 再经TLC检测，展层剂为氯仿/甲醇＝10:1，合并相同组分，得到五种组分(Rf 值分别为0.46、0.60、0.71、0.80和0.87)，组份2(30mg、TLC检测Rf值为0.60 的组分)再经SephadexLH-20柱层析，以甲醇/乙腈(1:1，v:v)为洗脱剂，洗 脱获得化合物FW05328-1(6.5mg)。
(3)结构鉴定：
对FW05328-1化合物进行质谱、紫外光谱和核磁共振等数据测试，从而确 定FW05328-1化合物的结构。FW05328-1化合物：淡黄色无定型粉末。UV (MeOH),λmax:294nm(图3)；HR-TOF-MS(m/z 484.3058[M+H]+,calcd for 484.3063[M+H]+)(图4)；分子式为C29H41NO5；计算其不饱和度为10。
分析FW05328-1化合物的1H-NMR(400MHz,in DMSO-d6)图谱(图5)， 可见高场区显示2组双峰甲基氢信号[δ1.04(3H,d,J＝7.0Hz)和δ1.20(3H,d, J＝7.0Hz)]和2组单峰甲基氢信号[δ1.56(3H,s)和δ1.80(3H,s)]，低场区有 多组烯氢质子信号和1组活泼氢质子信号δ7.77(1H,d,J＝7.7Hz)。从13C-NMR (100MHz,in DMSO-d6)图谱(图6)可见29个碳信号，结合DEPT135谱分析，可 见其包括3个季碳信号δ165.3,136.1和133.3，其中δ165.3为酰氨羰基碳信号， δ136.1,133.3为烯季碳信号；20个次甲基碳信号δ142.7,139.2,138.3,138.2,136.0,131.4,130.3,130.1,129.6,128.9,128.8,128.8,128.5,126.3,79.0,74.7,68.4,67.8,46.1和39.3，其中δ142.7,139.2,138.3,138.2,136.0,131.4,130.3,130.1, 129.6,128.9,128.8,128.8,128.5,126.3等14个为烯碳信号，δ79.0,74.7,68.4, 67.8,46.1等5个为与杂原子相连的碳信号；2个亚甲基碳信号δ42.8和38.6； 以及4个甲基碳信号δ24.2，21.0,18.8和16.0。从1H-1HCOSY图谱(图7)中， 可见δ5.85(H-2)―δ7.03(H-3)―δ6.33(H-4)―δ6.55(H-5)―δ6.14(H-6)― δ6.06(H-7)―δ2.51(H-8)―δ3.59(H-9)―δ3.34(H-10)―δ3.45(H-11)―δ 1.53(H-12)―δ4.24(H-13)―δ5.72(H-14)―δ5.90(H-15)―δ5.88(H-16)之 间顺次相关，可见δ7.77(NH-26)―δ3.65(H-25)―δ2.31(H-24)―δ5.59 (H-23)―δ5.70(H-22)―δ6.23(H-21)―δ6.01(H-20)之间顺次相关，再结合 HSQC谱图(图8)，可推出结构中含有如下的碳骨架片断： C2―C3―C4―C5―C6―C7―C8―C9―C10―C11―C12―C13―C14―C15―C16， C20―C21―C22―C23―C24―C25―NH。HMBC谱图(图9)中，可见H-26(δ1.20)和C-24(δ38.6)，C-25(δ46.1)；H-27(δ1.04)和C-7(δ142.7)，C-8(δ39.3)，C-9 (δ74.7)；H-28(δ1.56)和C-16(δ130.3)，C-17(δ136.1)，C-18(δ128.9)；H-29(δ 1.80)和C-18(δ128.9)，C-19(δ133.3)，C-20(δ129.6)；H-10-OH(δ4.57)和C-10 (δ79.0)，C-11(δ68.4)；H-13-OH(δ4.71)和C-12(δ42.8)，C-13(δ67.8)，C-14(δ 128.5)；H-NH(δ7.77)和C-1(δ165.2)，C-25(δ46.1)，C-26(δ21.0)之间远程相 关，再加上共用的碳就可以将FW05328-1化合物骨架连接起来；
综合以上分析，并结合ROESY谱图(图10)，得到FW05328-1化合物的全 部碳信号和氢信号归属(表3)。FW05328-1化合物的HMBC和1H-1H COSY相 关分析见图11。经
Figure BDA0001306850510000081
网络检索，未发现有与其相同结构的化合物，因而 确定FW05328-1化合物是一个新结构的26元多烯大环内酰胺类化合物。 FW05328-1化合物与化合物Salinilactam A的结构具有一定相似性，Salinilactam A的结构如式(II)所示：
Figure BDA0001306850510000091
但FW05328-1化合物与化合物Salinilactam A的内酰胺环上的羟基和烯键位 置有明显差异，且FW05328-1化合物比Salinilactam A的内酰胺环上多一甲基侧 链。
表3 FW05328-1化合物的1H NMR(in DMSO-d6,400MHz)和13C NMR(in DMSO-d6,100MHz)数据
Figure BDA0001306850510000092
Figure BDA0001306850510000101
实施例2
分别将FW05328-1化合物、Salinilactam A样品和抗肿瘤药物顺铂 (cis-Dichlorodiammineplatinum(II),DDP)溶解在DMSO中使得溶度达到1mg/mL，再分 别稀释使得终浓度为0.75ug/mL、0.5ug/mL、0.25ug/mL、0.125ug/mL、0.1ug/mL、 0.05ug/mL、0.005ug/mL、0.0025ug/mL。取处于指数增长期的人食管鳞癌细胞 KYSE30，KYSE180和EC109分别种在96孔板里(细胞浓度为105个/mL，100ul/孔)， 培养24hr使其贴壁，加100ul/孔带药新鲜培养基，每个浓度设3个复孔，继续培 养至72hr，终止培养。顺铂是临床常用的化疗药物之一，具有抗癌谱广、疗效确 切等特点，但其副作用大。
SRB检测：将终止培养的细胞，每孔加10％TCA 50ul，4℃条件固定1hr。用 蒸馏水冲洗5遍，自然晾干后每孔加入4mg/ml SRB溶液50ul，室温下染色30min， 弃上清，用1％乙酸冲洗5遍以去除非特异性结合的染料。每孔加入150ul 10mM Tris溶液，震荡5分钟，在540波长下酶标仪测OD值，并计算抑制率。通过对抑 制率的换算，使用SPSS软件计算出IC50值。
Figure RE-GDA0001375831460000141
结果如表4所示，FW05328-1化合物比Salinilactam A对人食管鳞癌细胞 KYSE30，KYSE180和EC109具有更优良的抑制活性，与Salinilactam A和对照组 药物顺铂相比，FW05328-1化合物对人食管鳞癌细胞株EC109的抑制活性尤其突 出。
表4 FW05328-1和Salinilactam A的肿瘤细胞毒活性
Figure BDA0001306850510000112
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述 实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的 具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保 护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为 了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (9)

1.一种小单孢菌(Micromonospora sp.)FIM05-328，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.13933，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017年3月27日。
2.一种大环内酰胺化合物，其特征在于，其结构式如式(I)所示：
Figure FDA0001375831450000011
3.权利要求1所述小单孢菌(Micromonospora sp.)FIM05-328在制备权利要求2所述大环内酰胺化合物中的应用。
4.权利要求2所述大环内酰胺化合物的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述的小单孢菌(Micromonospora sp.)FIM05-328接种至培养基培养，得到种子培养液；
(2)将种子培养液接种至发酵培养液中进行发酵培养，得到发酵产物；
(3)将发酵产物离心得到菌丝体和上清液，使用有机溶剂提取菌丝体两次，减压浓缩去除有机溶剂后得到浸膏；
(4)将浸膏与上清液合并、用大孔树脂吸附后，分别用去离子水和甲醇洗脱，经TLC检测，展层剂为体积比为10:1的氯仿/甲醇，将Rf值为0.57的组分拌样、装柱后，用氯仿/甲醇洗脱，再经TLC检测，展层剂为体积比为10:1的氯仿/甲醇，将Rf值为0.60的组分进行柱层析，用甲醇/乙腈洗脱，得到所述大环内酰胺化合物。
5.根据权利要求4所述的大环内酰胺化合物的分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述培养基的pH值为7.5，每份培养基包括如下组分：可溶性淀粉15g，葡萄糖5g，蛋白胨5g，酵母粉5g，MgSO4·7H2O 0.5g，(NH4)2SO4 0.5g，CaCO3 1g，海水1000mL；所述培养是在28～30℃、220～240rpm下摇床培养3～5天。
6.根据权利要求4所述的大环内酰胺化合物的分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述发酵培养液的pH值为7.0～7.4，每份发酵培养液包括如下组分：可溶性淀粉20g，葡萄糖5g，蛋白胨5g，玉米浆干粉2.5g，酵母提取物2g，K2HPO4·3H2O 0.5g，CaCO3 1g，海水1000mL；所述发酵培养是在22～25℃、180～200rpm下摇床培养7～8天。
7.根据权利要求4所述的大环内酰胺化合物的分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述种子培养液接种至发酵培养液中的接种量为5～10体积％。
8.权利要求2所述大环内酰胺化合物在制备***的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述***的药物为治疗食道癌的药物。
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