CN109640707B - 干燥烟草材料的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供增加了苏氨酸含量的干燥烟草材料的生产方法。本发明是增加了苏氨酸含量的干燥烟草材料的生产方法，其中，该干燥烟草材料是由改变为内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低的烟草植物或其一部分生产的。

Description

干燥烟草材料的生产方法

技术领域

本发明涉及增加了苏氨酸含量的干燥烟草材料的生产方法、干燥烟草材料及其提取物、以及烟草制品。

背景技术

苏氨酸在植物中是带来各种有用效果的氨基酸，例如，在烟草植物中，将该植物作为烟草原料供于吸烟时，是对其香味(香吸味)有很大贡献的成分之一。用于生产增加了苏氨酸含量的烟草原料的品种开发是烟草育种的重要目标。

用于增加植物的苏氨酸含量的公知的途径之一是对苏氨酸生物合成的关键的酶(key酶)天冬氨酸激酶(Asparatate Kinase、AK)进行改变。AK是来自于天冬氨酸的苏氨酸等各种氨基酸的生物合成途径中的初始酶，通常AK的活性受到来自作为最终产物的苏氨酸、赖氨酸及S-腺苷甲硫氨酸 (S-adenosylmethionine)的反馈抑制的严苛控制(非专利文献1及非专利文献2)。

已知，表达改变成不受这样的来自于作为最终产物的氨基酸的反馈抑制的AK的植物叶显示出高水平的苏氨酸浓度(非专利文献3及专利文献1)。

另外已知，在从天冬氨酸至生成赖氨酸或甲硫氨酸的生物合成途径发生障碍的情况下，植物的苏氨酸含量也会增高。例如，丧失了赖氨酸生物合成途径中承担初始反应的酶的二氢吡啶二羧酸合成酶(dihydrodipicolinate synthase(DHDPS))的功能的拟南芥T-DNA***突变体在整个植株中显示出高水平的苏氨酸浓度(非专利文献4)。另外，反义抑制了作为甲硫氨酸生物合成途径的Key酶的胱硫醚γ合成酶(cystathionine gamma-synthase(CGS))表达的拟南芥的苗的苏氨酸含量也高(非专利文献5)。

但是，不限于上述的例子，改变为提高苏氨酸含量的植物伴有严重的发育不良(非专利文献6、非专利文献7及非专利文献8)。

这样，提高了苏氨酸含量的植物伴有与产量大幅减少相关的难以接受的性状。这在开发用于生产苏氨酸含量高的烟草原料等的品种方面是个严重的问题。

作为用于解决以上问题的一个方法，专利文献2公开了一种在诱导老化的启动子下表达不受反馈抑制的AK的方法。根据该方法，直到老化为止，苏氨酸含量不会增高，因此可以期待能够改善植物的发育不良。

另外，尚不知晓与以上所示的例子不同、抑制苏氨酸分解的改变而引起了植物的叶的苏氨酸含量增加的例子。例如，拟南芥具有负责从苏氨酸向甘氨酸的异化作用的2种苏氨酸醛缩酶(Threonine Aldolases(THA))，主要在种子及幼苗中表达的THA1的功能丧失虽然可提高种子的苏氨酸含量，但对苗的苏氨酸含量没有影响。另一方面，整个植株的维管束组织中表达的THA2 的功能丧失突变会导致致死性的白化变种(专利文献3、非专利文献9及非专利文献10)。另外，另一个作为苏氨酸分解途径的Key酶的苏氨酸脱氨酶 (ThreonineDeaminase(TD))的表达抑制严重阻碍植物的发育(非专利文献 11)。

已知，通过这样抑制苏氨酸分解来实现苏氨酸水平增加的方法难以用于实用品种的开发。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利申请公开6730832号说明书(2004年5月4日公开)

专利文献2：国际公开公报2010/018234号说明书(2010年2月18日公开)

专利文献3：国际公开公报2005/047472号说明书(2006年5月26日公开)

非专利文献1：Heldt and Piechulla,Plant biochemistry.Fourth Edition,Academic Press,291-293(2010).

非专利文献2：Jander and Joshi,The Arabidopsis book/American Society ofPlant Biologists,7(2009).

非专利文献3：Frankard et al.,Theoretical and Applied Genetics,82, 273-282(1991).

非专利文献4：Craciun et al.,FEBS letters,487,234-238(2000).

非专利文献5：Kimet al.Plant Science,151(1),9-18(2000).

非专利文献6：Shaul and Galili,Plant Physiol 100:1157-1163(1992).

非专利文献7：Karchi et al.,The Plant Journal,3,721-727(1993).

非专利文献8：Sarrobert et al.,The Plant Journal,24,357-368(2000).

非专利文献9：Jander et al.,The Plant Journal,39,465-475(2004).

非专利文献10：Joshi et al.,Plant Cell.18,3564-3575(2006)

非专利文献11：Kang et al.,The Plant Cell,18(11),3303-3320(2006).

发明内容

发明要解决的课题

仍然需要探索或开发适合苏氨酸含量高的烟草原料的生产、且不伴有发育不良的品种。另外，还要求能够从不是基因重组体的品种中选择具有这样特性的品种。

本发明是鉴于上述问题而完成的，其目的在于提供一种不具有烟草植物从栽培至收获、干燥的烟叶生产方面的缺点、用于生产增加了苏氨酸含量的干燥烟草材料的方法。

解决课题的方法

为了解决上述的课题，本发明包含以下的任意一种方式。

＜1＞一种增加了苏氨酸含量的干燥烟草材料的生产方法，该方法包括：

从改变为内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低的烟草植物或其一部分生产该干燥烟草材料，其中，

该苏氨酸醛缩酶为以下(a)及(b)中的至少任一者：

(a)包含由下述基因编码的多肽的苏氨酸醛缩酶，所述基因包含相对于具有序列号1中记载的碱基序列的多核苷酸具有90％以上序列同一性的多核苷酸，

(b)包含由下述基因编码的多肽的苏氨酸醛缩酶，所述基因包含相对于具有序列号3中记载的碱基序列的多核苷酸具有90％以上序列同一性的多核苷酸。

＜2＞一种增加了苏氨酸含量的干燥烟草材料的生产方法，该方法包括：

从改变为内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低的烟草植物或其一部分生产该干燥烟草材料，其中，

该苏氨酸醛缩酶为以下(a)及(b)中的至少任一者：

(a)包含相对于具有序列号2中记载的氨基酸序列的多肽具有90％以上序列同一性的多肽的苏氨酸醛缩酶，

(b)包含相对于具有序列号4中记载的氨基酸序列的多肽具有90％以上序列同一性的多肽的苏氨酸醛缩酶。

发明的效果

根据本发明，可以生产增加了苏氨酸含量的干燥烟草材料，可以提供该干燥烟草材料、由该干燥烟草材料制备的提取物、以及使用该干燥烟草材料及其提取物生产的烟草制品。

附图说明

图1是示出来自于天冬氨酸的氨基酸的代谢途径的图。

图2示出了烟草(Nicotiana tabacum)的各种组织中的NtTHA1基因及 NtTHA2基因的表达。

图3示出了NtTHA1基因的野生型等位基因及突变等位基因的碱基序列的比对。

图4示出了NtTHA1基因的野生型等位基因及突变等位基因的翻译产物的氨基酸序列的比对。

图5示出了NtTHA1基因的双重突变体中的NtTHA1基因的表达。

图6示出了田地中生长的NtTHA1基因的双重突变体及对照的烟草植物。

图7示出了热风干燥的标准干燥时间表。

图8示出了从NtTHA1基因的双重突变体及对照的烟草植物采集的新鲜叶的苏氨酸含量。

图9示出了对从NtTHA1基因的双重突变体及对照的烟草植物采集的叶进行了热风干燥时的苏氨酸含量。

图10示出了在各温度条件下对从NtTHA1基因的双重突变体及对照的烟草植物采集的叶进行了热风干燥时的苏氨酸含量。

图11示出了各种基因型的个体中的NtTHA1基因的表达。

图12示出了来自于各种基因型的个体的干叶的游离苏氨酸含量。

图13示出了空气干燥中的烟草叶。

图14示出了空气干燥中的烟草叶的附近温度、附近湿度的变化。

图15示出了空气干燥中的双重突变体及对照的烟草叶的游离苏氨酸含量的变化。

图16示出了双重突变体及对照的各种干叶的游离苏氨酸含量。

图17示出了经过基因组编辑的烟草植物中的NtTHA1基因的表达水平。

图18示出了经过基因组编辑的烟草植物的干叶的游离苏氨酸含量。

具体实施方式

如下所述，对本发明的实施方式进行说明。需要说明的是，本发明并不限定于此。

〔术语的定义〕

在本说明书中，“多核苷酸”也可以称为“核酸”或“核酸分子”，是指核苷酸的聚合物。另外，“碱基序列”也可以称为“核酸序列”或“核苷酸序列”，在没有特别说明的情况下是指脱氧核糖核苷酸的序列或核糖核苷酸的序列。

在本说明书中，“多肽”也可以称为“蛋白质”。

在本说明书中，“纯合体(homozygote)”是指编码苏氨酸醛缩酶的某个基因座为由一对相同的等位基因构成的纯合型(homozygous)的烟草植物。“杂合体(heterozygote)”是指编码苏氨酸醛缩酶的某个基因座为由一对不同的等位基因构成的杂合型(heterozygous)的烟草植物。

在本说明书中，“A和/或B”是包含A和B、以及A或B两者的概念，也可以称为“A及B中的至少一者”。

在本说明书中，“多核苷酸彼此存在互补的关系”与“对多核苷酸所具有的碱基序列彼此进行比较时存在互补的关系”含义相同。

在本说明书中，在对烟草植物使用的情况下，“对照(control)”是指，本发明的内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性未从正常状态改变的、例如未改变为降低的、烟草植物。因此，对照的烟草植物可以提供用于与内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低的烟草植物进行比较的标准。对照可以为野生型的同种的烟草植物。或者，对照也可以是包含后述的重组表达载体的空载体的烟草植物。

另外，在本说明书中，在对苏氨酸醛缩酶的蛋白质使用的情况下，“对照”是指，本发明的苏氨酸醛缩酶的活性未从正常状态改变的、例如未改变为降低的、苏氨酸醛缩酶的蛋白质。因此，对照的苏氨酸醛缩酶的蛋白质可以提供用于与苏氨酸醛缩酶的活性降低的苏氨酸醛缩酶的蛋白质进行比较的标准。

此外，在本说明书中，在对干燥烟草材料使用的情况下，“对照”是指，本发明的内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性未从正常状态改变的、例如未改变为降低的、使烟草植物或其一部分干燥而得到的干燥烟草材料。因此，对照的干燥烟草材料可以提供用于与干燥烟草材料进行比较的标准，所述干燥烟草材料是使内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低的烟草植物或其一部分干燥而制成的。

〔1.增加了苏氨酸含量的干燥烟草材料的生产方法〕

如下所述，对本发明的生产方法进行说明。

本发明的生产方法是增加了苏氨酸含量的干燥烟草材料的生产方法，该方法包括：从改变为内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低的烟草植物或其一部分生产该干燥烟草材料，其中，该苏氨酸醛缩酶为以下(a)及(b)中的至少任一者。

(a)包含由下述基因编码的多肽的苏氨酸醛缩酶，所述基因包含相对于具有序列号1中记载的碱基序列的多核苷酸具有90％以上序列同一性的多核苷酸，

(b)包含由下述基因编码的多肽的苏氨酸醛缩酶，所述基因包含相对于具有序列号3中记载的碱基序列的多核苷酸具有90％以上序列同一性的多核苷酸。

另外，本发明的生产方法是增加了苏氨酸含量的干燥烟草材料的生产方法，该方法包括：从改变为内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低的烟草植物或其一部分生产该干燥烟草材料，其中，该苏氨酸醛缩酶为以下(a)及(b) 中的至少任一者。

(a)包含相对于具有序列号2中记载的氨基酸序列的多肽具有90％以上序列同一性的多肽的苏氨酸醛缩酶，

(b)包含相对于具有序列号4中记载的氨基酸序列的多肽具有90％以上序列同一性的多肽的苏氨酸醛缩酶。

这里，上述苏氨酸醛缩酶是包含以下详细说明的(基因)项目中记载的多核苷酸的基因所编码的蛋白质。另外，对于苏氨酸醛缩酶而言，在以下的(作为苏氨酸醛缩酶的多肽)项目中记载了详细情况。

在本说明书中，“干燥烟草材料”是指使采集到的烟草植物或其一部分干燥而成的材料。

在一个实施方式中，本发明的生产方法包括使改变为内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低的烟草植物或其一部分干燥的干燥工序。对于干燥工序而言，在以下的(干燥工序)项目中记载了详细情况。

另外，在本说明书中，“增加了苏氨酸含量的干燥烟草材料”是指，与对照相比，经过干燥工序干燥后的烟草植物或其一部分的苏氨酸含量显著增加。

例如，与对照相比，干燥后的烟草植物或其一部分的苏氨酸含量以单位干燥重量计增加了20％以上，更优选增加了30％以上，进一步优选增加了40％以上，更进一步优选增加了50％以上，更进一步优选增加了60％以上，特别优选增加了80％以上，最优选增加了100％。具体而言，经过干燥工序干燥后的植物或其一部分的单位干燥重量优选苏氨酸含量为100μg/g(DW)以上，更优选苏氨酸含量为120μg/g(DW)以上，更进一步优选苏氨酸含量为140μg/g(DW)以上，更进一步优选苏氨酸含量为160μg/g(DW)以上，更进一步优选苏氨酸含量为180μg/g(DW)以上，更进一步优选苏氨酸含量为 200μg/g(DW)以上，特别优选苏氨酸含量为220μg/g(DW)以上，最优选为 240μg/g(DW)以上。在一个例子中，干燥烟草材料为叶材料，该干燥烟草材料中的苏氨酸含量与从未改变苏氨酸醛缩酶的对照烟草植物或其一部分制成的干燥烟草材料的苏氨酸含量相比，增加了20％以上。

这里，干燥烟草材料的苏氨酸含量是指干燥烟草材料中含有的游离苏氨酸的含量。

(烟草植物或其一部分)

首先，对本发明的生产方法所使用的烟草植物或其一部分进行说明。在本说明书中，“烟草植物或其一部分”包括烟草植物的、整个植物体、植物器官(叶、根、茎、腋芽、花及种子等)、植物组织片(表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部及维管束等)、以及植物细胞(培养细胞、愈伤组织、及原生质体等)。优选选自整个植物体、植物器官(叶、根、茎、腋芽、花及种子等)、以及植物组织片(表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部及维管束等)，更优选选自整个植物体及植物器官(叶、根、茎、腋芽、花及种子等)等，进一步优选选自整个植物体及叶，最优选为叶。需要说明的是，本发明的生产方法所使用的叶可以是位于植物体的茎的上部的叶(上部叶)，也可以是位于茎的正中部上方的叶(真叶)。或者，还可以是连着茎的状态的叶。

本发明的生产方法所使用的烟草植物是改变为苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低的烟草植物。这里，“表达或活性降低”是指“表达降低”或“活性降低”，是指由于基因的因素，该苏氨酸醛缩酶的“表达”、或者苏氨酸醛缩酶的“活性”低于对照的植物(例如野生型的同种植物)。另外，“表达或活性降低”中也包括“表达或活性缺失”。

另外，苏氨酸醛缩酶的“表达”是指，在烟草植物的细胞中，该苏氨酸醛缩酶被翻译，以蛋白质(苏氨酸醛缩酶蛋白质)的形式存在。

这里，苏氨酸醛缩酶的“表达降低”是指，烟草植物中的该苏氨酸醛缩酶蛋白质的存在量低于对照烟草植物(例如野生型的同种植物)的状态。

在某个实施方式中，该苏氨酸醛缩酶的表达降低可以是，相对于对照烟草植物(例如野生型的同种植物)，该苏氨酸醛缩酶蛋白质的存在量为80％以下、70％以下、60％以下、50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下或1％以下。

另外，苏氨酸醛缩酶的“活性降低”是指，与对照的烟草植物(例如野生型的同种植物)相比，该苏氨酸醛缩酶蛋白质本身的活性水平显著降低。在某个实施方式中，该苏氨酸醛缩酶蛋白质的活性降低可以是，相对于野生型的同种植物的对照，该苏氨酸醛缩酶蛋白质的活性水平为80％以下、70％以下、 60％以下、50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下或 1％以下。

(基因(苏氨酸醛缩酶基因))

本发明的生产方法的基因编码催化从苏氨酸至甘氨酸的异化作用的苏氨酸醛缩酶。另外，该基因的一个例子编码了催化从苏氨酸至甘氨酸的异化作用的苏氨酸醛缩酶，该苏氨酸醛缩酶具有活性时，在来自于天冬氨酸的氨基酸生物合成途径中，催化从苏氨酸至甘氨酸的异化作用。以下，本发明的生产方法的基因也记载为“苏氨酸醛缩酶基因”。

本发明的生产方法的基因包含以下任一项记载的多核苷酸。

(a)相对于具有序列号1中记载的碱基序列的多核苷酸具有90％以上序列同一性的多核苷酸

(b)编码如下蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质相对于序列号2中记载的氨基酸序列具有90％以上序列同一性、且具有催化从苏氨酸至甘氨酸的异化作用的酶活性

(c)编码如下蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有序列号2中记载的氨基酸序列中1～35个氨基酸被取代、缺失、***、和/或添加而成的氨基酸序列、且具有催化从苏氨酸至甘氨酸的异化作用的酶活性

(d)在严格条件下和由与上述(a)中记载的多核苷酸互补的序列构成的多核苷酸杂交、且编码具有催化从苏氨酸至甘氨酸的异化作用的酶活性的蛋白质的多核苷酸

(e)相对于具有序列号3中记载的碱基序列的多核苷酸具有90％以上序列同一性的多核苷酸

(f)编码如下蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质相对于序列号4中记载的氨基酸序列具有90％以上序列同一性、且编码具有催化从苏氨酸至甘氨酸的异化作用的酶活性。

(g)编码如下蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有序列号4中记载的氨基酸序列中1～35个氨基酸被取代、缺失、***、和/或添加而成的氨基酸序列、且编码具有催化从苏氨酸至甘氨酸的异化作用的酶活性。

(h)在严格条件下和由与上述(e)中记载的多核苷酸互补的序列构成的多核苷酸杂交、且编码具有催化从苏氨酸至甘氨酸的异化作用的酶活性的蛋白质的多核苷酸。

需要说明的是，碱基序列的上述序列同一性分别优选为91％以上，更优选为92％以上，更进一步优选为93％以上，更进一步优选为94％以上，更进一步优选为95％以上，更进一步优选为96％以上，特别优选为97％以上，最优选为98％以上或99％以上。另外，被取代、缺失、***、和/或添加的氨基酸的个数分别优选为1～32个，更优选为1～28个，更进一步优选为1～25个，特别优选为1～21个，最优选为1～17个。

需要说明的是，严格条件下是指，例如，可以举出参考文献：Molecular cloning-aLaboratory manual 2nd edition(Sambrook等、1989)中记载的条件等。更具体而言，严格条件下是指例如如下条件：在含有6×SSC(1×SSC的组成：0.15M氯化钠、0.015M柠檬酸钠、pH7.0)、0.5％SDS、5×邓哈特(Denhardt’s) 及100mg/mL鲱鱼***DNA的溶液中，与探针一起在65℃下恒温8～16小时，进行杂交。需要说明的是，该多核苷酸相对于上述(a)或(e)中记载的多核苷酸的碱基序列优选为91％以上，更优选为92％以上，进一步更优选为93％以上，进一步更优选为94％以上，进一步更优选为95％以上，进一步更优选为96％以上，特别优选为97％以上，最优选为98％以上或99％以上。

本发明的苏氨酸醛缩酶基因可以以RNA(例如mRNA)的形态、或者DNA 的形态(例如cDNA或基因组DNA)存在。DNA可以是双链，也可以是单链。作为本发明的多核苷酸的一例的序列号1所示的碱基序列是编码序列号2所示的多肽的编码区(CDS)。作为本发明的多核苷酸的一例的序列号3所示的碱基序列是编码序列号4所示的多肽的编码区(CDS)。本发明的苏氨酸醛缩酶基因可以包含非翻译区(UTR)的序列等附加的序列。

作为苏氨酸醛缩酶基因的例子，可以列举：在作为烟草植物的烟草 (Nicotianatabacum)的S基因组中含有的NtTHA1s基因(序列号1)、T基因组中含有的NtTHA1t基因(序列号3)等。烟草(Nicotiana tabacum)是异源四倍体，这些基因源自彼此祖先种基因组的直向同源(ortholog)基因。

在一个例子中，本发明的生产方法的基因是上述的(a)～(d)中任一项记载的多核苷酸、及(e)～(h)中任一项记载的多核苷酸这两者，或者包含至少任一者。

本发明的苏氨酸醛缩酶基因的表达部位及表达的发育阶段没有特别限定。作为一个例子，优选在对照植物中，本发明的苏氨酸醛缩酶基因在整个植物体中表达，至少在叶中表达、以及在干燥工序中表达。

(作为苏氨酸醛缩酶的多肽)

本发明的生产方法的多肽是上述(基因)一栏中记载的基因的翻译产物，是至少具有催化从苏氨酸至甘氨酸的异化作用的活性的植物的苏氨酸醛缩酶。另外，作为一个例子，“催化从苏氨酸至甘氨酸的异化作用的苏氨酸醛缩酶”是L-苏氨酸醛缩酶(EC 4.1.2.5)。L-苏氨酸醛缩酶催化从L-苏氨酸生成甘氨酸和乙醛的反应。

作为本发明的生产方法的苏氨酸醛缩酶的多肽更具体而言是以下(a)～(d) 中的至少任一者。需要说明的是，该多肽是基因的翻译产物，对于术语“在严格条件下进行杂交”等的含义，直接参照上述(基因)一栏的记载。

(a)作为苏氨酸醛缩酶的多肽，所述苏氨酸醛缩酶由相对于具有序列号2 中记载的氨基酸序列的多肽具有90％以上序列同一性的多肽构成

(b)作为苏氨酸醛缩酶的多肽，所述苏氨酸醛缩酶由具有序列号2中记载的氨基酸序列中1～35个氨基酸被取代、缺失、***、和/或添加而成的氨基酸序列的多肽构成

(c)由多核苷酸编码的作为苏氨酸醛缩酶的多肽，所述多核苷酸在严格条件下和由与编码上述(a)中记载的多肽的多核苷酸互补的序列构成的多核苷酸进行杂交

(d)作为苏氨酸醛缩酶的多肽，所述苏氨酸醛缩酶由相对于具有序列号4 中记载的氨基酸序列的多肽具有90％以上序列同一性的多肽构成

(e)作为苏氨酸醛缩酶的多肽，所述苏氨酸醛缩酶由具有序列号4中记载的氨基酸序列1～35个氨基酸被取代、缺失、***、和/或添加而成的氨基酸序列的多肽构成

(f)由多核苷酸编码的作为苏氨酸醛缩酶的多肽，所述多核苷酸在严格条件下和由与编码上述(d)中记载的多肽的多核苷酸互补的序列构成的多核苷酸进行杂交。

需要说明的是，氨基酸序列的序列同一性分别优选为91％以上，更优选为92％以上，更进一步优选为93％以上，更进一步优选为94％以上，更进一步优选为95％以上，更进一步优选为96％以上，特别优选为97％以上，最优选为98％以上或99％以上。需要说明的是，被取代、缺失、***、和/或添加的氨基酸的个数优选为1～32个，更优选为1～28个，更进一步优选为1～25 个，更进一步优选为1～21个，特别优选为1～17个。

在一个例子中，本发明的生产方法的多肽可以是上述(a)～(c)中任一项记载的多肽和(d)～(f)中任一项记载的多肽这两者，或者是包含(a)～(f)中任一者的多肽。

(本发明的生产方法中使用的烟草植物的方式)

本发明的生产方法中使用的烟草植物是改变为内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低的烟草植物。

需要说明的是，“内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低”是由于上述的烟草植物具有突变等位基因(mutant allele)作为编码该苏氨酸醛缩酶的内源性基因而产生的，或者是由于为了抑制编码该苏氨酸醛缩酶的内源性的基因的表达所导入上述烟草植物的外源性的多核苷酸而产生的。

即，在一个实施方式中，本发明的生产方法中使用的烟草植物具有突变等位基因作为编码该苏氨酸醛缩酶的内源性的基因、或者具有为了抑制该基因的表达而导入的外源性的多核苷酸。

这里，本发明的生产方法中使用的烟草植物所具有的上述苏氨酸醛缩酶的突变等位基因可以包含选自***、缺失、移码突变、无义突变、无终止密码子突变(nonstopmutation)及剪接位点突变的突变。上述突变的种类可以通过与对照植物所具有的野生型等位基因的比较而明确。另外，该突变等位基因是包含通过选自突变诱导、基因组编辑及敲除法中的任意方法导入的人工突变的基因，或者是包含天然存在的自然突变的基因。

作为该突变诱导、基因组编辑或敲除法的方法，可以列举：暴露于化学物质或放射线、CRISPR system、Transcription Activator-Like Effector Nucleases、Zinc FingerNucleases、Oligonucleotide-directed mutagenesis、T-DNA ***、以及转座子***等。对于突变诱导或基因组编辑或敲除法的详细情况，在以下的(降低了苏氨酸醛缩酶的表达或活性的烟草植物的制备)中详细记载。

另外，“自然突变”是指不依靠人为操作，而是以自然界的放射线及基因复制等自然因素为原因所产生的突变。

需要说明的是，在一个实施方式中，上述突变等位基因与功能缺失型等位基因(loss of function allele)含义相同。

本发明的生产方法中使用的烟草植物可以包含染色体区域的大规模缺失，所述染色体区域含有编码苏氨酸醛缩酶的基因。

另外，改变后的烟草植物中的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低可以恒常产生，也可以间断产生，还可以是短暂性的。例如，仅在烟草植物暴露于给定温度以上的温度时，才可以产生该苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低。作为这样的苏氨酸醛缩酶，可以举出包含在加热条件下失活的温度敏感性突变的例子。

另外，本发明的烟草植物也包括：包含为了抑制内源性的苏氨酸醛缩酶的表达而导入的外源性多核苷酸的植物细胞、包含该植物细胞的植物体、具有该植物体的性状的烟草品种、以及它们的克隆等。即，本发明的植物包括：作为实施了转化处理而得到的再分化当代的“T0代”、作为T0代植物的自身繁殖种子的“T1代”等后代植物、以及以它们作为单亲本进行交配得到的杂种植物或其后代植物、为了抑制内源性的苏氨酸醛缩酶的表达而导入的含有包含外源性多核苷酸的载体等构建体的植物或其后代植物。

本说明书中的烟草的“品种(variety)”是指，关于能够区别于相同种的其它植物的至少一种特色，基本上不呈现除个体之间的遗传性变动的一组烟草植物。该品种可以通过通常的繁殖方法保持。此外，本发明的生产方法中使用的烟草的品种具有降低了内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性作为特色。在本说明书中，“品种(variety)”也可以称为cultivar或line。

需要说明的是，在烟草植物中的、苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低的性状(以下，也简称为“性状”)是由苏氨酸醛缩酶的突变等位基因赋予的性状的情况下，本说明书中的“烟草品种”通常可以是纯系(inbred)品种或F1杂交品种。但是，只要具有上述的性状，不一定需要如通常的纯系品种或F1 杂交品种那样在其它性状方面显示出一致性。上述烟草品种可以通过具有上述性状的烟草植物的自身繁殖、或者通过具有上述性状的2个不同烟草植物的交配来制备。本发明的生产方法中使用的烟草植物在用于商业的情况下，特别优选为具有苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低作为特色的烟草品种的植物。

降低了苏氨酸醛缩酶的表达或活性的烟草植物可以通过具有该特色的烟草植物的自身繁殖、或者通过具有该特色的2个不同烟草植物的交配来以种子的方式繁殖。由该种子生长成的烟草植物通常具备上述的特色。上述烟草植物也可以通过利用由组织或细胞诱导愈伤组织等的组织培养法使器官或个体再生来进行繁殖。

(苏氨酸醛缩酶基因的基因型)

在烟草植物中的内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低是由于该突变等位基因引起的情况下，对于编码苏氨酸醛缩酶的基因座而言，该烟草植物可以是在等位基因彼此之间具有相同种类的突变的纯合体、或者可以是在等位基因彼此之间具有不同突变的杂合体。

另外，基因的突变例如可以在1个基因座的1个区域中产生，也可以在 1个基因座的多个不同区域中产生。另外，在1个基因座的多个区域产生了突变的情况下，不同种类的突变可以在各个突变区域产生。需要说明的是，所述突变只要在相同染色体中的一对苏氨酸醛缩酶等位基因的至少一者中产生即可(即，杂合型)，优选在两者中产生。

需要说明的是，在烟草植物为烟草(Nicotiana tabacum)这样的异源四倍体的情况下，对于2种直向同源基因而言，优选至少一个基因座是一对等位基因彼此之间具有相同种类的突变的纯合型、或者是一对等位基因彼此之间具有不同突变的杂合型。

另外，在这些异源四倍体中，特别优选苏氨酸醛缩酶的2个基因座中的 4个基因的拷贝均为突变等位基因。

本发明的制造方法的烟草植物的一例可以举出：序列号1中记载的 NtTHA1s基因及序列号3中记载的NtTHA1t基因两者具有无义突变、且这些突变NtTHA1s基因(例如，序列号33或序列号34)和突变NtTHA1t基因(例如，序列号35)两者的突变NtTHA1基因分别为纯合型的烟草(Nicotiana tabacum) 的双重突变体。本发明的制造方法的烟草植物另一例可以举出：序列号1中记载的NtTHA1s基因及序列号3中记载的NtTHA1t基因两者具有1个碱基***、且这些突变NtTHA1s基因(例如，序列号49)和突变NtTHA1t基因(例如，序列号50或序列号51)两者的突变NtTHA1基因分别为纯合型的烟草 (Nicotiana tabacum)的双重突变体。这样的烟草植物通常可以通过交配或筛选等人为的操作而逐步获得。

另外，本发明的改变为内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低的烟草植物可以是表达降低了对反馈抑制的敏感性的天冬氨酸激酶(AK)的烟草植物。在本发明的生产方法中，通过使用这样的烟草植物或其一部分，可以生产苏氨酸含量进一步增加了的干燥烟草材料。

在一个实施方式中，本发明的烟草植物在内源性的AK基因中导入突变，表达降低了反馈敏感性的AK蛋白质。或者，烟草植物可以是具有由多核苷酸表达的降低了反馈敏感性的AK蛋白质的植物，所述多核苷酸编码通过适当的重组表达载体导入植物的突变型AK基因。因此，本发明的烟草植物的另一例可以是改变为内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低的、且改变为表达降低了反馈敏感性的AK的烟草植物。

需要说明的是，AK的表达所使用的重组表达载体可以使用以下的＜重组表达载体及转化体＞中记载的优选的载体。

在一个实施方式中，烟草植物中表达的降低了反馈敏感性的AK蛋白质具有序列号36中记载的氨基酸序列。在该氨基酸序列中，野生型烟草植物的AK蛋白质中的第405号亮氨酸被取代为苯丙氨酸。另外，烟草植物中表达的降低了反馈敏感性的AK蛋白质可以具有野生型烟草植物的AK蛋白质所具有的氨基酸序列中的多个氨基酸的取代等突变。

(使用判定方法或筛选方法得到的烟草植物)

在一个实施方式中，是否是适合本发明的生产方法使用的烟草植物可以将以下(a)或(b)所示的内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低作为指标来进行判定。另外，在另一实施方式中，示于本发明的生产方法使用的烟草植物可以经过筛选来培育，所述筛选基于与苏氨酸醛缩酶的表达或活性的降低相关的(a)～(e)中任一项所示的指标。

(a)苏氨酸醛缩酶的表达的降低

(b)苏氨酸醛缩酶的活性的降低

(c)加热处理后的叶中的苏氨酸含量的增加

(d)有无苏氨酸醛缩酶的突变等位基因

(e)与上述(d)的突变等位基因连锁的DNA标记物(连锁DNA标记物)

(f)有无为了抑制上述苏氨酸醛缩酶基因的表达而导入的外源性的多核苷酸。

＜用于判定适合本发明的生产方法使用的烟草植物的方法＞

在一个实施方式中，在以某种烟草植物或其一部分作为原料应用于本发明的生产方法时，通过确认候选的烟草植物的苏氨酸醛缩酶的表达或活性的降低，可以判定该烟草植物或其一部分是否是适合本发明的生产方法使用的烟草植物。

以下，对该判定方法进行说明。

该判定方法包括：对于内源性的苏氨酸醛缩酶的表达是否有所降低、或者该苏氨酸醛缩酶蛋白质本身的活性是否有所降低进行确认。在一个实施方式中，判定以(a)内源性苏氨酸醛缩酶的表达的降低或(b)内源性苏氨酸醛缩酶的活性的降低作为指标来进行。用于进行上述判定的具体方法没有特别限定，可以列举使用了分子遗传学方法的方法及使用了生化学方法的方法等。另外，作为该判定方法的一个实施方式，除了上述(a)或(b)的确认以外，还可以进一步包括(c)加热处理后的叶中的苏氨酸含量有无增加的确认。

1.苏氨酸醛缩酶的表达降低的确认

苏氨酸醛缩酶的表达的降低可以通过对烟草植物或其一部分中的苏氨酸醛缩酶蛋白质的存在量进行检测来确认。该蛋白的存在量的检测例如可以通过使用了抗体的蛋白质印迹分析(western)或ELISA分析等来实施。根据需要与作为基准的该蛋白的存在量进行比较，检测该蛋白质的存在量是否有所减少。另外，作为基准的蛋白质的存在量是指，例如，作为对照的同种烟草植物(例如，苏氨酸醛缩酶的表达或活性未从正常状态改变的、例如未改变为降低的烟草植物)中的苏氨酸醛缩酶蛋白质的存在量。

通常，蛋白质的存在量的降低可能与基因表达的降低相关。基因的突变导致的表达量降低多数情况下基于由负载mRNA的品质监测的 nonsense-mediated mRNA decay(NMD)、nonstop decay(NSD)及no go decay(NGD)等机制导致的突变mRNA的分解。因此，苏氨酸醛缩酶蛋白质的存在量的降低的确认也可以通过确认苏氨酸醛缩酶基因的表达的降低来进行。引起蛋白质的量的降低的基因表达的降低的确认可以通过利用转录产物分析检测该基因表达来实施，所述转录产物分析使用了RNA印迹(Northern) 分析、RT-PCR分析等的特异性的探针或引物。

另外，对于上述的苏氨酸醛缩酶的表达的降低的确认，可以根据需要在特定的生长阶段、且部位特异性地实施。

2.苏氨酸醛缩酶的活性降低的确认

苏氨酸醛缩酶的活性的降低例如可以通过以下的2-1～2-2的方法来确认。

2-1.使用了甘氨酸缺陷型酵母的互补试验

某种烟草植物所具有的苏氨酸醛缩酶蛋白质本身的酶活性的降低可以通过使用了从该植物分离出的苏氨酸醛缩酶基因的cDNA的互补性试验而得到明确。在互补试验中，作为甘氨酸缺陷型酵母株的YM13(gly1 shm1 shm2) 可以优选用作宿主(host)(Monschauet al.1997,FEMS microbiology letters 150: 55-60.,Joshi etal.2006.The Plant Cell 18:3564-3575.)。分离的苏氨酸醛缩酶基因的翻译产物具有酶活性时，功能互补，因此导入了该基因的宿主可以在不含甘氨酸的培养基中生长。从试验的容易性的观点考虑，通常也通过下述的多肽活性的测定进行使用了酵母的互补试验。

2-2.多肽的活性测定

从作为对象的烟草植物或其一部分分离苏氨酸醛缩酶基因所编码的多肽。或者，将作为对象的植物中的苏氨酸醛缩酶基因的克隆导入表达载体，并导入宿主细胞，由此使多肽短暂性表达。使用将其培养、提取及纯化而得到的物质检测有无催化以苏氨酸作为底物的向甘氨酸转变的异化作用的酶活性，在没有该酶活性、或者该酶活性比作为对照的同种植物(例如，野生型的苏氨酸醛缩酶基因的纯合体)降低的情况下，视为苏氨酸醛缩酶的活性降低。

作为上述的多肽表达所使用的重组表达载体及宿主细胞，可以使用(重组表达载体及转化体)项目中的记载及本技术领域中公知的载体和细胞。

另外，多肽的合成、提取及纯化方法没有特别限定，可以适当使用公知的方法。作为多肽的合成方法的一个例子，可以列举：利用土壤杆菌在烟草植物的叶等中短暂性表达的方法；以及将多肽的表达载体转化至大肠杆菌并对该大肠杆菌进行培养，从而使多肽表达的方法等。

另外，作为催化以苏氨酸作为底物的甘氨酸合成的酶活性的测定方法，可以举出例如：对于通过上述方法得到的多肽添加苏氨酸，对孵育后的反应液中的乙醛进行定量的方法(参考文献：Liu et al.1998.European Journal of Biochemistry,255,220-226.)。

另外，在另一个方式中，可以举出：对于通过上述方法得到的多肽添加苏氨酸(例如，L-Thr)，将孵育后的反应液进行纯化，供于LC/MS/MS分析的方法。

作为上述的物质的量的测定方法，可以列举使用了质量分析装置的测定、使用了HPLC的测定等方法。其中，从灵敏度及精度优异的观点考虑，优选为使用了质量分析装置的测定方法。作为测定所用的质量分析装置，可以举出LC/MS/MS及GC/MS等。

2-3.苏氨酸含量的测定

另外，除了上述的＜2-1＞及＜2-2＞以外，还可以通过以下方式简单地进行是否是适合本发明的生产方法使用的烟草植物的判定：对该烟草植物或其一部分进行加热处理，测定加热处理后的烟草植物或其一部分所含有的游离苏氨酸的量，确认测定结果。例如，通过与对对照植物或其一部分进行了加热处理的情况相比，加热处理后的烟草植物或其一部分所含有的游离苏氨酸的量是否显著增多，来判定是否是适合的烟草植物。

显著增多是指优选多25％以上，更优选多50％以上、75％以上、100％以上。

为了上述的苏氨酸含量的测定而进行的上述烟草植物或其一部分的加热处理例如可以通过将从烟草植物切下的叶在给定的温度及湿度的条件下暴露一定时间以上来进行。作为一个例子，可以举出在温度36～40及湿度 80～90％的条件下暴露24～48小时的方法。

＜用于培育适合本发明的生产方法的烟草植物的筛选方法＞

在一个实施方式中，适合本发明的生产方法使用的烟草植物可以是经过筛选方法培育成的烟草植物，所述筛选方法包括：基于选自上述的(a)～(e)的指标进行筛选。

如上所述，是否是适合本发明的生产方法使用的烟草植物可以将(a)苏氨酸醛缩酶的表达的降低、或(b)苏氨酸醛缩酶的活性的降低作为指标进行判定。

这里，上述(a)苏氨酸醛缩酶的表达的降低、或(b)苏氨酸醛缩酶的活性的降低可以作为在培育适合本发明的生产方法使用的烟草植物的过程中进行的筛选的指标来使用。例如，也可以通过将从测交(test cross)得到的植物中的(a) 苏氨酸醛缩酶的表达的降低或(b)苏氨酸醛缩酶的活性的降低作为指标，从而有效地实施筛选。用于确认(a)苏氨酸醛缩酶的表达的降低或(b)苏氨酸醛缩酶的活性的降低的具体检测方法如上述的判定方法中所述。

在另一个实施方式中，适合本发明的生产方法使用的烟草植物可以经过以以下项目作为指标的筛选来培育：(d)有无苏氨酸醛缩酶的突变等位基因、 (e)与上述(d)的突变等位基因连锁的DNA标记物、或者(f)有无为了抑制苏氨酸醛缩酶基因的表达而导入的外源性的多核苷酸。即，本发明的生产方法所使用的烟草植物可以是例如通过利用以下1～3中的任意方法实施的筛选而培育成的烟草植物。

1.以有无苏氨酸醛缩酶的突变等位基因作为指标的筛选

检测苏氨酸醛缩酶基因中使该苏氨酸醛缩酶的表达降低或活性降低的突变。该突变的一个例子是选自***、缺失、移码突变、无义突变、无终止密码子突变及剪接位点突变中的突变。该突变的检测可以用各种方法，例如，可以优选使用PCR-RFLP法或利用了实时PCR的方法(Cycling Probe Method, TaqMan(注册商标)SNP Genotyping Assays)等。通过利用交配或筛选等的通常的育种程序中的育种过程，可以始终对苏氨酸醛缩酶的基因座的基因型进行监测。因此，在利用了苏氨酸醛缩酶的突变等位基因的育种程序中，可以通过将突变等位基因的突变本身作为指标，从而容易地筛选、培育降低了苏氨酸醛缩酶的表达或活性的烟草品种。

2.以有无为了抑制苏氨酸醛缩酶的突变等位基因的表达而导入的外源性的多核苷酸作为指标的筛选

在一个方面中，苏氨酸醛缩酶的表达的降低包括为了抑制苏氨酸醛缩酶基因的表达而导入的外源性的多核苷酸所引起的表达降低。在这样的情况下，通过利用有无为了抑制苏氨酸醛缩酶基因的表达而导入的外源性的多核苷酸作为指标，可以筛选及培育具有该性状的烟草植物。或者，可以利用与该外源性多核苷酸一起导入植物的构建体的构成要素(启动子序列等)作为筛选的指标。

3.以连锁DNA标记物作为指标的筛选

对于与苏氨酸醛缩酶的表达或活性的降低相关的苏氨酸醛缩酶的突变等位基因的有无而言，也可以利用与该突变等位基因连锁的DNA标记物来检测。在一个例子中，上述的连锁DNA标记物位于距苏氨酸醛缩酶基因所在位置约10cM以内的位置，优选位于约5cM以内，更优选位于约2cM以内，进一步优选位于约1cM以内。

在进行烟草植物筛选时，作为可用于marker assisted selection(MAS)的多态性连锁DNA标记物，可以列举：SNP、RFLP、RAPD、AFLP及microsatellite 等。

根据以上的说明，本发明的生产方法中使用的降低了苏氨酸醛缩酶的表达或活性的烟草植物可以是进行上述的判定方法来预先判定能否适用于本发明的生产方法的植物，和/或经过上述的烟草植物筛选而培育成的烟草品种的植物。

(降低了苏氨酸醛缩酶的表达或活性的烟草植物的制备)

本发明的改变为苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低的烟草植物包括通过以下记载的方法制备成的烟草植物。

这里，作为降低了苏氨酸醛缩酶的表达或活性的烟草植物的制备方法，可以举出利用编码苏氨酸醛缩酶的基因的突变等位基因的方法、以及通过导入外源性的多核苷酸来抑制基因的表达的方法。

需要说明的是，如上所述，苏氨酸醛缩酶的表达或活性的降低是遗传因素所产生的遗传性状，因此，具有该性状的烟草植物可以在基于交配或筛选等的通常的育种程序中进行制备。

1.利用突变等位基因的方法

引起苏氨酸醛缩酶的表达或活性的降低的编码苏氨酸醛缩酶的基因的突变等位基因包括选自***、缺失、移码突变、无义突变、无终止密码子突变、及剪接位点突变中的突变。

上述突变通常是指使编码苏氨酸醛缩酶蛋白质的氨基酸序列发生变化的突变，也可以是使苏氨酸醛缩酶基因的转录活性受到抑制的突变。作为这样的突变，可以举出例如，转录调节序列(启动子序列或增强子序列等)中的突变。

上述突变等位基因是包含利用选自突变原处理、基因组编辑及敲除法中的任意方法所产生的人工突变的基因、或者是包含天然存在的自然突变的基因。作为突变原处理的具体例子，可以列举：EMS(ethyl methane sulfonate：甲基磺酸乙酯)处理、电磁波、紫外线、X射线、γ射线、粒子束、中子束、α射线及β射线等各种放射线的照射、或重离子射束等的照射等方法。

通过突变原处理在苏氨酸醛缩酶基因中导入了突变的植物例如，可以通过利用TILLING(Till et al.，2003)或Amplicon Sequence分析等的方法从突变体群体中搜索。另外，可以通过与苏氨酸醛缩酶基因中包含自然突变的烟草植物相同的方法从烟草的遗传资源的集合中搜索。通过对这样的烟草植物所保持的苏氨酸醛缩酶基因(基因组DNA、mRNA及cDNA等)的碱基序列进行分析，可以明确导入的突变的内容。进而，有助于推定该突变等位基因对苏氨酸醛缩酶的表达或活性的降低是否有用。

例如，作为通过EMS处理得到的无义突变基因的多核苷酸，可以列举本说明书的实施例中得到的具有来自烟草的序列号33、序列号34及序列号 35所示的碱基序列的多核苷酸。

作为基因组编辑的具体例子，可以列举：TALEN(Transcription Activator-LikeEffector Nuclease)法、ZFN(Zinc Finger Nuclease)法及 CRISPR(Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeat) system(CRISPR/Cas9及CRISPR/Cpf1等)等基因组编辑技术。例如，作为通过使用了CRISPR/Cas9的基因组编辑而得到的1个碱基***突变基因的多核苷酸，可以举出本说明书的实施例中得到的具有来自于烟草的序列号49、序列号50及序列号51所示的碱基序列的多核苷酸。

在CRISPR/Cas9 system中，位于紧邻基因组上的XGG的上游的碱基序列及其互补序列可以被向导RNA识别，在该碱基序列内被Cas9切断。对于被向导RNA识别的该碱基序列而言，例如，在相对于具有序列号1或3中记载的碱基序列的多核苷酸具有90％以上序列同一性的多核苷酸、或者编码相对于具有序列号2或4所示的氨基酸序列的多肽具有90％以上序列同一性的多肽的多核苷酸的一部分中，位于紧邻XGG的上游的连续的10碱基以上、优选为17碱基以上、更优选为20碱基以上。

在TALEN中，形成二聚体的人工核酸酶的一对DNA结合结构域分别与在Fok I切断结构域的两端隔着5～7碱基的间隔区存在的碱基序列结合。该 DNA结合结构域以33～34个氨基酸残基作为重复单元(模块)，由待结合的碱基数和模块构成。对于通过DNA结合结构域结合的碱基序列而言，在相对于具有序列号1或3中记载的碱基序列的多核苷酸具有90％以上序列同一性的多核苷酸、或者编码相对于具有序列号2或4所示的氨基酸序列的多肽具有90％以上序列同一性的多肽的多核苷酸的一部分中，在FokI切断结构域的两端隔着5～7碱基的间隔区存在，分别为连续的6碱基以上、优选为10碱基以上、更优选为个21碱基以上。

在ZFN中，与TALEN一样，形成二聚体的人工核酸酶的一对DNA结合结构域分别与在FokI切断结构域的两端隔着5～7碱基的间隔区存在的碱基序列结合。该DNA结合结构域由多个锌指模块构成。对于该碱基序列而言，在相对于具有序列号1或3中记载的碱基序列的多核苷酸具有90％以上序列同一性的多核苷酸、或者编码相对于具有序列号2或4所示的氨基酸序列的多肽具有90％以上序列同一性的多肽的多核苷酸的一部分中，在FokI切断结构域的两端隔着5～7碱基的间隔区存在，分别为连续的9碱基以上、优选为 12碱基以上、更优选为18碱基以上。

另外，作为敲除法的具体例子，可以举出使用了反转录转座子等各种转座子、或T-DNA等的基因破坏法。该方法的具体例子是将烟草的反转录转座子tnt1或其它植物的转座子、或者土壤杆菌的T1质粒中的T-DNA导入烟草植物体的方法。

2.通过导入外源性的多核苷酸来抑制基因的表达的方法

接下来，对于通过导入外源性的多核苷酸来抑制苏氨酸醛缩酶基因的表达的烟草植物的制备方法进行说明。

外源性多核苷酸可以是抑制苏氨酸醛缩酶基因的表达的多核苷酸。例如，通过将包含该多核苷酸的构建体导入植物来制备。所述构建体例如为具备包含抑制基因表达的多核苷酸的表达盒的载体等。

作为通过将外源性的多核苷酸导入植物来抑制内源性的苏氨酸醛缩酶基因的表达的方法，可以列举例如：RNA干扰法、或反义RNA法、共抑制法、利用载体(抗体或肽等)与核酸的复合体的方法、使用了核酸载体(生物体内信号肽等功能性肽等)的向细胞导入核酸的方法、以及利用诱饵核酸抑制转录控制因子等的方法。即，上述抑制基因表达的多核苷酸为这些方法中使用的核苷酸分子，优选为选自反义RNA分子、RNAi分子及共抑制因子分子中的分子。

这里，反义法是指如下方法：使与从目标基因转录的mRNA互补的反义 RNA表达，并使该反义RNA与目标基因互补结合，妨碍目标蛋白质的翻译，其结果是抑制该基因的表达。具体而言，在植物中发挥功能的启动子的下游沿着反义方向连接苏氨酸醛缩酶基因的多核苷酸、或它们的片段，并导入植物细胞或组织，此时，可以产生与上述mRNA互补的反义RNA。

RNA干扰法是指利用按照以下机理使靶RNA分解的现象来抑制目标基因的表达的方法。首先，通过使用包含作为dsRNA(双链RNA、double-strand RNA)的模板的DNA的载体在细胞内形成dsRNA。接着，利用双链RNA特异性RNase(Dicer)切断该dsRNA，生成siRNA(smallinterfering RNA)。然后，以siRNA作为RISC(RNA-induced silencing complex)的一部分形成复合体，最终通过RISC利用相同性识别靶mRNA，使其分解。

作为RNA干扰所用的载体，优选为以引起RNAi的dsRNA作为发夹型 dsRNA进行表达的载体。表达dsRNA的RNAi载体可以使用发夹型的RNAi 载体，所述发夹型的RNAi载体通过以在内含子等数个碱基以上的间隔区序列的两端形成IR(inverted repeat：反向重复)的方式配置与dsRNA形成部分对应的DNA来构建。需要说明的是，对于载体的构成的详细情况，在后面进行说明。

另外，RNAi载体可以是串联型，其通过各自的启动子分别转录正义RNA 及反义RNA，它们在细胞内杂交而产生dsRNA。或者，可以构建可分别转录正义RNA和反义RNA的多个表达载体，引起RNAi。

共抑制法是指如下现象：在通过转化向植物中导入具有与作为靶的内源性基因相同或类似的序列的基因时，导入的外来基因及作为靶的内源性基因的表达均受到抑制。例如，为了获得苏氨酸醛缩酶基因被共抑制的植物体，以能够表达该基因、或能够表达具有与它们类似的序列的DNA的方式制备的载体来转化目标植物。

抑制这些基因的表达的多核苷酸可以通过包含该多核苷酸的重组表达载体导入植物。将包含用于抑制这些基因的表达的多核苷酸的重组表达载体导入植物的方法没有特别限定，可以适当使用聚乙二醇法、电穿孔法 (electroporation法)、由土壤杆菌介导的方法、或基因枪法等。需要说明的是，包含该多核苷酸的重组表达载体可以对植物细胞、愈伤组织、植物组织、或植物个体进行导入。

另外，为了抑制苏氨酸醛缩酶基因的表达而导入的外源性多核苷酸可以包含内源性的苏氨酸醛缩酶基因的启动子序列或增强子序列区域的序列。

＜重组表达载体及转化体＞

以下，对于适用于本发明的烟草植物的重组表达载体及能够表达地导入了本发明的外源性的多核苷酸的转化体进行说明。

用于构成重组表达载体的载体的种类没有特别限定，可以适当选择在宿主细胞中能够表达的种类。即，可以根据宿主细胞的种类选择适合的启动子序列，将该启动子序列和本发明的苏氨酸醛缩酶基因的多核苷酸导入例如质粒、噬粒载体、或粘粒等并以此作为重组表达载体来使用。

上述重组表达载体优选为表达抑制载体。在重组表达载体中，本发明的多核苷酸与转录所需要的要素(例如，启动子等)功能性连接在一起。另外，可以根据需要连接增强子、选择标记物、剪接信号、多腺苷酸化信号及5’-UTR 序列等。启动子是在宿主细胞中显示转录活性的DNA序列，可以根据宿主的种类适当选择。

作为能够在宿主细胞内起作用的启动子序列，可以列举：花椰菜花叶病毒的35S启动子、土壤杆菌的胭脂碱合成基因启动子及来自玉米的泛素基因启动子、来自稻的肌动蛋白基因启动子等。作为能够在宿主细胞内起作用的启动子序列，还可以列举：诱导老化的拟南芥的SAG12基因的启动子(Ori et al.,The Plant Cell11.6:1073-1080(1999)、国际专利公开公报第WO 2010/018234 A1号)、热诱导性的拟南芥的HSP18.2基因的启动子(Yoshida,K., et al.,Applied microbiology and biotechnology44.3-4 466-472(1995))。

另外，作为上述的本发明的启动子，可以使用本发明的内源性的苏氨酸醛缩酶基因中启动子区域的序列。

重组表达载体及转化体的制备例如可以使用分离得到的苏氨酸醛缩酶基因的多核苷酸来进行。获得(分离)苏氨酸醛缩酶基因的多核苷酸的方法没有特别限定，例如，可以制备与上述苏氨酸醛缩酶基因的碱基序列的一部分特异性杂交的探针，对基因组DNA文库或cDNA文库进行筛选。

另外，作为获得苏氨酸醛缩酶基因中的多核苷酸的方法，可以列举使用 PCR等扩增方式的方法。例如，在该苏氨酸醛缩酶基因的cDNA中，由5’侧及3’侧的序列(或其互补序列)中分别制备引物，使用这些引物以基因组 DNA(或cDNA)等作为模板进行PCR等，对夹在两个引物之间的DNA区域进行扩增，由此大量得到包含苏氨酸醛缩酶基因的多核苷酸的DNA片段。

在重组表达载体中，本发明的多核苷酸可以根据需要与适当的终止子结合。例如，可以与胭脂碱合成酶(NOS)基因的终止子及CaMV35S RNA基因的终止子功能性结合。终止子的种类可以根据宿主细胞的种类适当选择。

另外，增强子是为了提高目标基因的表达效率而使用的，可以列举例如：包含CaMV35S启动子内的上游侧的序列的增强子区域及烟草花叶病毒的 omega序列。

本发明的重组表达载体可以进一步含有选择标记物。作为选择标记物，可以列举例如：氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素或奇霉素这样的耐药基因。

作为报告基因，只要是能够通过基因的表达确认植物细胞是否被转化即可，可以列举例如：β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、荧光素酶(LUC)、绿色萤光蛋白(GFP)及青色荧光蛋白(CFP)等荧光蛋白、以及β-半乳糖苷酶(LacZ)等。

需要说明的是，可以将包含报告基因的表达盒和目标基因分别配置在各重组表达载体上。在分别配置的情况下，可以将各载体共同导入(共转染)宿主。

另外，在重组表达载体中，本发明的多核苷酸可以根据需要与合适的间隔区序列结合。另外，作为重组表达载体的一个例子，可以举出具有在温度敏感性的启动子后结合有本发明基因的结构的载体等。

适用于本发明的烟草植物的载体可以是基因表达抑制用载体。基因表达抑制用载体是将用于抑制(基因)项目中记载的基因的表达的多核苷酸***合适的载体而得到的。

在用于烟草植物的转化的重组载体中，表达抑制载体可以是用于抑制植物细胞内的内源性的基因的表达的载体，是为了制备转化植物体而可以使用的载体。所述载体例如包含具有选自以下碱基序列的多核苷酸，所述碱基序列选自相对于具有序列号1中记载的碱基序列的多核苷酸及具有序列号3中记载的碱基序列的多核苷酸中至少任一序列优选具有90％以上、更优选具有 91％以上、进一步优选具有92％以上、更进一步优选具有93％以上、更进一步优选具有94％以上、更进一步优选具有95％以上、更进一步优选具有96％以上、更进一步优选具有97％以上、特别优选具有98％以上、最优选具有99％以上的序列同一性的碱基序列。作为这样的载体，可以列举：RNA干扰诱导载体、反义载体或共抑制用载体等。

RNA干扰诱导载体是包含作为成为RNA干扰的触发器的dsRNA(双链 RNA、double-strand RNA)的模板的DNA的载体。与形成成为RNA干扰的触发器的双链RNA的部分对应的多核苷酸是用于抑制内源性的苏氨酸醛缩酶基因的表达的多核苷酸，是具有相对于具有序列号1中记载的碱基序列的多核苷酸或具有序列号3中记载的碱基序列的多核苷酸、或者具有序列号1中记载的碱基序列的多核苷酸或具有序列号3中记载的碱基序列的多核苷酸优选具有90％以上、更优选具有91％以上、进一步优选具有92％以上、更进一步优选具有93％以上、更进一步优选具有94％以上、更进一步优选具有95％以上、更进一步优选具有96％以上、更进一步优选具有97％以上、特别优选具有98％以上、最优选具有99％以上的序列同一性的碱基序列的多核苷酸中的、连续的至少21～30碱基(例如，21碱基以上、22碱基以上、23碱基以上、 24碱基以上、25碱基以上、26碱基以上、27碱基以上、28碱基以上、29 碱基以上、及30碱基以上)的碱基序列所表示的多核苷酸(正义RNA部分)、以及与该多核苷酸互补的碱基序列所表示的多核苷酸(反义RNA部分)。上述的“连续的至少21～30碱基”的碱基序列更具体是指连续的21碱基以上、23 碱基以上、25碱基以上、30碱基以上、35碱基以上、40碱基以上、45碱基以上、50碱基以上、60碱基以上、70碱基以上、80碱基以上、90碱基以上、或100碱基以上的碱基序列。

作为RNA干扰诱导载体的例子，可以举出具有在老化诱导启动子或温度敏感性启动子后结合有上述作为RNA干扰的触发器的模板的DNA序列的结构的载体等。

反义载体是通过包含反义法抑制苏氨酸醛缩酶基因的表达的多核苷酸的载体。导入反义载体的用于抑制内源性的苏氨酸醛缩酶基因的表达的多核苷酸分子可以是具有相对于具有序列号1中记载的碱基序列的多核苷酸或具有序列号3中记载的碱基序列的多核苷酸、或者具有序列号1中记载的碱基序列的多核苷酸及具有序列号3中记载的碱基序列的多核苷酸中至少任一者优选具有90％以上、更优选具有91％以上、进一步优选具有92％以上、更进一步优选具有93％以上、更进一步优选具有94％以上、更进一步优选具有95％以上、更进一步优选具有96％以上、更进一步优选具有97％以上、特别优选具有98％以上、最优选具有99％以上的序列同一性的碱基序列的一部分碱基序列的反义核苷酸分子，例如可以是具有由连续的15碱基以上且低于全长、 20碱基以上且低于全长、优选为100碱基以上且低于全长、更优选为500碱基以上且低于全长构成的碱基序列的反义核苷酸分子。

另外，共抑制载体是包含通过共抑制法抑制苏氨酸醛缩酶基因的表达的共抑制因子分子的载体。共抑制所使用的核苷酸分子是用于抑制内源性的苏氨酸醛缩酶基因的表达的多核苷酸，是具有相对于具有序列号1中记载的碱基序列的多核苷酸或具有序列号3中记载的碱基序列的多核苷酸、或者具有序列号1中记载的碱基序列的多核苷酸或具有序列号3中记载的碱基序列的多核苷酸优选具有90％以上、更优选具有91％以上、进一步优选具有92％以上、更进一步优选具有93％以上、更进一步优选具有94％以上、更进一步优选具有95％以上、更进一步优选具有96％以上、更进一步优选具有97％以上、特别优选具有98％以上、最优选具有99％以上的序列同一性的碱基序列的多核苷酸中的、例如连续的50碱基、优选为100碱基、进一步优选为500碱基。或者，共抑制所使用的核苷酸分子例如可以是具有由上述碱基序列中的连续的50碱基以上且低于全长、优选为100碱基以上且低于全长、更优选为500 碱基以上且低于全长构成的碱基序列的核苷酸。

另外，转化体可以是能够表达地导入了上述的重组表达载体或苏氨酸醛缩酶基因的多核苷酸的植物体、植物细胞、植物组织片及植物器官等。

在苏氨酸醛缩酶的表达的降低是由为了抑制该基因的表达而导入的外源性的多核苷酸所引起的情况下，对于导入的多核苷酸序列，该烟草植物优选为纯合子，也可是半合子。

(干燥(curing)工序)

本发明的一个实施方式的干燥烟草材料的生产方法包括烟草植物或其一部分的干燥工序。

本说明书中的烟草植物或其一部分的干燥(curing)不仅是指对植物中的水分进行脱水，还指促进植物的内容成分的变化。

作为本说明书中的用于生产增加了苏氨酸含量的干燥烟草材料的干燥方法，没有特别限定，可以是通常实施的烟草叶的干燥(curing)方法、或其范围内的方法。作为该烟草叶的干燥(curing)方法，包括热风干燥、空气干燥、火烘干及日晒干燥、以及这些干燥方法的组合，但并不限定于此。在一个实施方式中，干燥通过选自热风干燥、空气干燥、火烘干及日晒干燥中的干燥方法来进行。一般来说，烟草叶的干燥方法通常由烟草的类型来确定，例如，弗吉尼亚烟草进行热风干燥(flue-cured)，白肋烟进行空气干燥，香料烟(Orienttobacco)进行日晒干燥。

作为用于实施烟草植物或其一部分的干燥(curing)的设备或装置，没有特别限定，例如，在干燥通过热风干燥进行的情况下，通常利用可以控制温度和湿度的空间或设备。另外，在干燥通过空气干燥进行的情况下，通常利用可以避开雨及直射阳光等对采集到的烟草植物或其一部分进行干燥的小屋等设施。

另外，用于干燥烟草植物或其一部分的干燥程序可以根据阶段、成熟度、器官等、待干燥的烟草植物或其一部分的状态而适当变更设定。另外，在干燥烟草植物的叶的情况下，可以使用例如在通常实施的热风干燥中使用的干燥程序。作为该干燥程序，可以示例出实施例的图7所示的程序。

另外，某种加热处理可以增加采集到的烟草植物或其一部分的苏氨酸含量。叶中的蛋白质在施加了热胁迫的条件下会通过被称为Heat-induced leaf senescence的机制促进分解。由这样的热胁迫产生的蛋白质分解产物直接或间接地有助于增加烟草植物或其一部分的苏氨酸含量。特别是在烟草植物是改变为内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低的烟草植物的情况下，由上述加热处理所带来的苏氨酸含量增加与对对照植物进行加热处理的情况相比是显著的。另外，在通常实施的方法中，干燥(curing)处理的烟草叶通常暴露于上述热胁迫中。用于增加上述苏氨酸含量的加热处理的条件(温度、时间等) 例如可以以蛋白质的分解作为指标来确定。蛋白质可以使用Bradford法或 BCA法(二喹啉甲酸法)等方法来定量。可以以总蛋白质量的10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上或60％以上被分解作为指标来确定温度及时间。另外，由于Heat-induced leaf senescence也促进叶绿素的分解，因此上述加热处理的条件也可以以叶的叶绿素分解作为指标来确定。叶绿素可以使用叶绿素仪等容易地测定。作为一个例子，可以举出以总叶绿素量的5％以上、10％以上、15％以上或20％以上被分解作为指标来确定温度及时间的方法。

上述加热处理的具体条件为例如在摄氏38℃左右的湿润气体氛围中暴露12小时。蛋白质的分解受到处理的温度及时间的影响，因此需要对它们进行适当调整。在上述加热处理中，用于暴露该烟草植物或其一部分的温度优选为25℃以上其60℃以下的范围，更优选为选自以下各范围的温度。

28℃～60℃、30℃～60℃、32℃～60℃、34℃～60℃、36℃～60℃、38℃～60℃、 40℃～60℃、42℃～60℃、44℃～60℃、46℃～60℃、48℃～60℃、50℃～60℃、 52℃～60℃、54℃～60℃、56℃～60℃、

28℃～58℃、30℃～58℃、32℃～58℃、34℃～58℃、36℃～58℃、38℃～58℃、 40℃～58℃、42℃～58℃、44℃～58℃、46℃～58℃、48℃～58℃、50℃～58℃、 52℃～58℃、54℃～58℃、

28℃～56℃、30℃～56℃、32℃～56℃、34℃～56℃、36℃～56℃、38℃～56℃、 40℃～56℃、42℃～56℃、44℃～56℃、46℃～56℃、48℃～56℃、50℃～56℃、 52℃～56℃、

28℃～54℃、30℃～54℃、32℃～54℃、34℃～54℃、36℃～54℃、38℃～54℃、 40℃～54℃、42℃～54℃、44℃～54℃、46℃～54℃、48℃～54℃、50℃～54℃、

28℃～52℃、30℃～52℃、32℃～52℃、34℃～52℃、36℃～52℃、38℃～52℃、 40℃～52℃、42℃～52℃、44℃～52℃、46℃～52℃、48℃～52℃、

28℃～50℃、30℃～50℃、32℃～50℃、34℃～50℃、36℃～50℃、38℃～50℃、 40℃～50℃、42℃～50℃、44℃～50℃、46℃～50℃、

28℃～48℃、30℃～48℃、32℃～48℃、34℃～48℃、36℃～48℃、38℃～48℃、 40℃～48℃、42℃～48℃、44℃～48℃、

28℃～46℃、30℃～46℃、32℃～46℃、34℃～46℃、36℃～46℃、38℃～46℃、 40℃～46℃、42℃～46℃、28℃～44℃、30℃～44℃、32℃～44℃、34℃～44℃、 36℃～44℃、38℃～44℃、40℃～44℃、

28℃～42℃、30℃～42℃、32℃～42℃、34℃～42℃、36℃～42℃、38℃～42℃、

28℃～40℃、30℃～40℃、32℃～40℃、34℃～40℃、36℃～40℃、

28℃～38℃、30℃～38℃、32℃～38℃、34℃～38℃、

28℃～36℃、30℃～36℃、32℃～36℃、

28℃～34℃、30℃～34℃或28℃～32℃。

另外，在上述加热处理中，用于暴露该植物或其一部分的时间优选为2 小时～96小时的范围，更优选为选自以下范围的时间。

2小时～96小时、4小时～96小时、8小时～96小时、12小时～96小时、 16小时～96小时、24小时～96小时、36小时～96小时、48小时～96小时、72 小时～96小时、

2小时～72小时、4小时～72小时、8小时～72小时、12小时～72小时、 16小时～72小时、24小时～72小时、36小时～72小时、48小时～72小时、

2小时～48小时、4小时～48小时、8小时～48小时、12小时～48小时、 16小时～48小时、24小时～48小时、36小时～48小时、

2小时～36小时、4小时～36小时、8小时～36小时、12小时～36小时、 16小时～36小时、24小时～36小时、

2小时～24小时、4小时～24小时、8小时～24小时、12小时～24小时、 16小时～24小时、

2小时～16小时、4小时～16小时、8小时～16小时、12小时～16小时、

2小时～12小时、4小时～12小时、8小时～12小时、

2小时～8小时、4小时～8小时或

2小时～4小时。

上述加热处理的湿度没有特别限定，例如在使用干燥装置的情况下，干燥装置内部的湿度优选为60～95％，更优选为70～90％。

烟草植物或其一部分的苏氨酸含量通过上述加热处理而增加，但通常仅进行该处理无法完成干燥(curing)。一般而言，需要除去残留的水分的大部分，停止内容成分的变化，完成干燥(curing)。因此，作为一个实施方式，上述加热处理可以与主要关注除去水分的其它干燥法(drying)组合来实施。或者，上述加热处理也可以与通常实施的烟草叶的干燥方法组合。例如，可以***现有的干燥程序的初始过程来实施。

本说明书中记载的用于干燥处理的温度表示干燥工序中的干燥环境内 (例如干燥小屋或干燥装置内)的平均气温。平均气温可以是在干燥小屋或干燥装置内的1点以上或1个部位以上测定得到的值。

另外，在上述加热处理中，可以将加热的温度随时间经过而阶段性地升温。另外，在一个用于加热处理的程序中，可以包括任意次数的一定时间的升温和一定时间的降温。另外，上述加热可以连续进行，也可以间断进行。即，在加热时间与加热时间之间可以设置一定的加热中止时间期间。

上述加热处理可以通过燃烧燃料等来实施，也可以使用太阳光等的热或电来实施。另外，也可以使用简易的塑料大棚等封闭***设施。另外，也可以使用热风。

上述加热处理可以包括将烟草植物或其一部分在某个温度的环境中暴露某段时间的阶段。

在一个例子中，本发明的生产方法所使用的烟草植物或其一部分是通过经上述的干燥工序才增加了苏氨酸含量的烟草植物或其一部分。

(生产方法中能够使用的烟草植物的种类)

本发明的生产方法可以应用于作为烟草(Nicotiana)属植物的烟草植物。作为烟草植物，只要是属于烟草(Nicotiana)属的植物即可，没有特别限定，可以列举例如：绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)、林烟草(Nicotiana sylvestris)、黄花烟草(Nicotiana rustica)(黄花烟)、烟草(Nicotiana tabacum)(Nicotiana tabacum)、蓝茉莉叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)、花烟草(Nicotiana alata)(花烟草)(Nicotianaalata)、无茎烟草(Nicotiana acaulis)、渐尖叶烟草(Nicotiana acuminata)、渐尖叶烟草多花型变种(Nicotiana acuminata var. multzjlora)、非洲烟草(Nicotiana africana)、抱茎烟草(Nicotiana amplexicaulis)、阿伦特氏烟草(Nicotiana arentsii)、渐狭叶烟草(Nicotiana attenuata)、贝纳米特氏烟草(Nicotiana benavidesii)、本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)、毕基劳氏烟草(Nicotiana bigelovii)、博内里烟草(Nicotiana bonariensis)、洞生烟草 (Nicotiana cavicola)、克利夫兰式烟草(Nicotiana clevelandii)、心叶烟草 (Nicotiana cordifolia)、伞状烟草(Nicotianacorymbosa)、迪勃纳氏烟草(Nicotiana debneyi)、高烟草(Nicotiana excelsior)、福尔吉特氏烟草(Nicotiana forgetiana)、香烟草(Nicotiana fragrans)、粉蓝烟草(Nicotianaglauca)、粘毛烟草(Nicotiana glutinosa)、古特斯皮德氏烟草(Nicotianagoodspeedii)、哥西氏烟草(Nicotiana gossei)、Nicotiana hybrid、因古儿巴烟草(Nicotiana ingulba)、川上烟草(Nicotiana kawakamii)、奈特氏烟草(Nicotianaknightiana)、蓝格斯多夫烟草(Nicotiana langsdorfi)、狭叶烟草(Nicotianalinearis)、长花烟草(Nicotiana longiflora)、海滨烟草(Nicotiana maritima)、特大管烟草(Nicotiana megalosiphon)、摩西烟草 (Nicotiana miersii)、夜花烟草(Nicotiananoctiflora)、裸茎烟草(Nicotiana nudicaulis)、欧布特斯烟草(Nicotianaobtusifolia)、西方烟草(Nicotiana occidentalis)、西方烟草Hesperis亚种(Nicotianaoccidentalis subsp.Hesperis)、耳状烟草(Nicotiana otophora)、圆锥烟草(Nicotianapaniculata)、少花烟草 (Nicotiana pauczjlora)、矮牵牛状烟草(Nicotianapetunioides)、蓝茉莉叶烟草 (Nicotiana plumbaginifolia)、四科烟草(Nicotianaquadrivalvis)、雷蒙德氏烟草(Nicotiana raimondii)、残波烟草(Nicotiana repanda)、莲座叶烟草(Nicotiana rosulata)、莲座叶烟草因古儿巴亚种(Nicotiana rosulatasubsp.Ingulba)、圆叶烟草(Nicotiana rotundifolia)、赛特氏烟草(Nicotianasetchellii)、拟似烟草(Nicotiana simulans)、茄叶烟草(Nicotiana solanifolia)、斯佩格茨烟草(Nicotiana spegauinii)、斯托克通氏烟草(Nicotiana stocktonii)、香甜烟草(Nicotiana suaveolens)、蓝烟草(Nicotiana thyrsiflora)、绒毛烟草(Nicotianatomentosa)、三角叶烟草(Nicotiana trigonophylla)、荫生烟草(Nicotiana umbratica)、波叶烟草(Nicotiana undulata)、颤毛烟草(Nicotiana velutina)、以及芹叶烟草(Nicotiana wigandioides)等。另外，对于品种，包括黄色种(弗吉尼亚种)、白肋烟种、雪茄种、香料烟种、以及适应各地的气候水土而分化的现有种的各品种。在一个实施方式中，本发明的生产方法可以用于选自烟草(Nicotiana tabacum)及黄花烟草的烟草属植物。

〔2.干燥烟草材料〕

另外，本发明也提供通过上述的生产方法生产的干燥烟草材料。如上所述，在本说明书中，“干燥烟草材料”包括将采集到的烟草植物或其一部分干燥而成的材料。

通过本发明的生产方法生产的干燥烟草材料可以用于任意的烟草制品的制造用途，例如可以用于电子烟(e-cigarettes)、非燃烧型加热式烟草 (heat-not-burntobacco)、香烟、雪茄及烟斗烟草等吸烟产品、以及鼻烟、嚼烟等无烟烟草制品的制造用途。

通过本发明的生产方法生产的干燥烟草材料没有特别限定，可以在施加了蒸汽、烘烤、膨化等伴随含有的成分、物理性质的变化的进一步加工处理的基础上，用于上述产品的制造。此外，作为在另一个实施方式，通过本发明的生产方法生产的干燥烟草材料没有特别限定，可以在加工成烟丝、颗粒状形态、微粉末形态或液体(含有提取物)等的形态的基础上，用于上述产品的制造。

〔3.提取物〕

由本发明的干燥烟草材料制备的提取物在本发明范围内。该提取物可以通过包括从干燥烟草材料中提取1种以上成分的提取工序的制备方法来制备。

提取物的制备例如可以通过以下方式进行：在通过本发明的生产方法生产的干燥烟草材料中添加水性溶剂等合适的溶剂，分离成溶剂可溶的成分和干燥烟草材料残渣。没有特别限定，供于提取物的制备的干燥烟草材料可以施加了蒸汽、烘烤或膨化等伴随含有的成分、物理性质的变化的进一步加工处理。另外，对于得到的提取物，根据目的，为了除去不需要的成分或浓缩目标成分，可以进行柱纯化或过滤器过滤等。另外，也可以进行利用冷冻干燥或减压蒸馏法等的浓缩。另外，可以根据需要对提取物进行干燥。经过所述工序制备成的提取物可以是从干燥烟草材料中除去了不需要的成分的物质、或者是仅含有希望的成分的物质。因此，能够用于各种产品的生产。作为一个例子，提取物的制备方法包括以下工序：对通过上述的生产方法得到的干燥烟草材料添加水等水性溶剂，分离成水溶性烟草提取物和干燥烟草材料残渣。在从烟草提取物生产烟草制品的情况下，可以将进行了不需要成分除去等的提取物和残渣再次混合并干燥而成的产物用于烟草制品的制造。

〔4.烟草制品〕

本发明也提供烟草制品，其是使用通过本发明的生产方法生产的干燥烟草材料和/或由该干燥烟草材料制备的提取物作为原料来制造的。烟草制品可以使用上述的干燥烟草材料、进一步施加了加工处理的干燥烟草材料、或提取物来制造。上述的干燥烟草材料、进一步加工而成的干燥烟草材料或提取物可以以烟草制品中的烟草材料全部的形式使用，也可以以烟草制品中的烟草材料的一部分的形式使用。或者，由通过本发明的方法生产的干燥烟草材料进一步加工为粉末、液体等形态的材料可以添加在烟草制品中的其它烟草材料中使用。在通过本发明得到的干燥烟草材料作为烟草制品中的烟草材料的一部分使用的情况下，可以以任意比例使用。

烟草制品中除了干燥烟草材料以外，还可以含有调味剂、填料、粘合剂、 pH调节剂、缓冲剂、着色剂、崩解助剂、抗氧化剂、保湿剂及防腐剂等其它成分。

如上所述，根据本发明，可以生产增加了苏氨酸含量的干燥烟草材料，其能够作为用于制造广泛的烟草制品的原料而使用。

〔5.本发明的具体方式的示例〕

本发明包括以下的＜1＞～＜18＞中任一者。

＜1＞一种增加了苏氨酸含量的干燥烟草材料的生产方法，该方法包括：

从改变为内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低的烟草植物或其一部分生产该干燥烟草材料，其中，

该苏氨酸醛缩酶为以下(a)及(b)中的至少任一者：

(a)包含由下述基因编码的多肽的苏氨酸醛缩酶，所述基因包含相对于具有序列号1中记载的碱基序列的多核苷酸具有90％以上序列同一性的多核苷酸，

(b)包含由下述基因编码的多肽的苏氨酸醛缩酶，所述基因包含相对于具有序列号3中记载的碱基序列的多核苷酸具有90％以上序列同一性的多核苷酸。

＜2＞一种增加了苏氨酸含量的干燥烟草材料的生产方法，该方法包括：

从改变为内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低的烟草植物或其一部分生产该干燥烟草材料，

该苏氨酸醛缩酶为以下(a)及(b)中的至少任一者：

(a)包含相对于具有序列号2中记载的氨基酸序列的多肽具有90％以上序列同一性的多肽的苏氨酸醛缩酶，

(b)包含相对于具有序列号4中记载的氨基酸序列的多肽具有90％以上序列同一性的多肽的苏氨酸醛缩酶。

＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的生产方法，其中，所述经过改变的烟草植物中内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低是由编码该苏氨酸醛缩酶的基因的突变等位基因引起的、或者是由导入的用于抑制该苏氨酸醛缩酶的表达的外源性的多核苷酸引起的。

＜4＞根据＜3＞所述的生产方法，其中，所述突变等位基因包含选自***、缺失、移码突变、无义突变、无终止密码子突变、及剪接位点突变中的突变。

＜5＞根据＜4＞所述的生产方法，其中，所述突变是包含人工突变的突变、或者是包含天然存在的自然突变的突变，所述人工突变是利用选自突变诱导、基因组编辑及敲除法中的方法导入的。

＜6＞根据＜5＞所述的生产方法，其中，所述人工突变是通过突变诱导或基因组编辑导入的，该突变诱导或基因组编辑通过选自暴露于化学物质或放射线、CRISPRsystem、Transcription Activator-Like Effector Nucleases、Zinc Finger Nucleases、Oligonucleotide-directed mutagenesis、T-DNA***、及转座子***中的方法进行。

＜7＞根据＜3＞～＜6＞中任一项所述的生产方法，其中，作为编码所述苏氨酸醛缩酶的基因，所述经过改变的烟草植物是等位基因彼此具有相同种类的突变的纯合体、或者是等位基因彼此具有不同突变的杂合体。

＜8＞根据＜3＞所述的生产方法，其中，所述外源性的多核苷酸包含选自反义RNA分子、RNAi分子及共抑制因子分子中的分子。

＜9＞根据＜1＞～＜8＞中任一项所述生产方法，其中，所述经过改变的烟草植物是通过改变为内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低的烟草植物的自身繁殖而培育成的烟草品种的植物、或者是通过该经过改变的烟草植物彼此交配而培育成的烟草品种的植物。

＜10＞根据＜9＞所述的生产方法，其中，所述经过改变的烟草植物是基于选自以下(a)～(e)中的指标而筛选及培育成的烟草植物：

(a)所述苏氨酸醛缩酶的表达的降低，

(b)所述苏氨酸醛缩酶的活性的降低，

(c)加热处理后的叶中的苏氨酸含量增加，

(d)有无所述苏氨酸醛缩酶的突变等位基因，

(e)与所述(d)的突变等位基因连锁的DNA标记物，

(f)有无导入用于抑制所述基因的表达的外源性的多核苷酸。

＜11＞根据＜1＞～＜10＞中任一项所述生产方法，其中，所述烟草植物的一部分选自叶、根、茎、腋芽、花、种子、植物培养细胞、愈伤组织及原生质体。

＜12＞根据＜1＞～＜11＞中任一项所述生产方法，其中，所述干燥烟草材料中的苏氨酸含量的增加是由于所述经过改变的烟草植物或其一部分的干燥而产生的。

＜13＞根据＜12＞所述的生产方法，其中，所述干燥通过选自热风干燥、空气干燥、火烘干及日晒干燥中的干燥来进行。

＜14＞根据＜1＞～＜13＞中任一项所述的生产方法，其中，所述经过改变的烟草植物是选自烟草(Nicotiana tabacum)及黄花烟草中的烟草植物。

＜15＞根据＜1＞～＜14＞中任一项所述的生产方法，其中，所述干燥烟草材料是叶材料，该干燥烟草材料中的苏氨酸含量比从未改变为苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低的对照烟草植物或其一部分制备的干燥烟草材料的苏氨酸含量高20％以上。

＜16＞一种干燥烟草材料，其是通过＜1＞～＜15＞中任一项所述生产方法生产的。

＜17＞一种提取物，其是由＜16＞所述的干燥烟草材料制备的。

＜18＞一种烟草制品，其是使用＜16＞所述的干燥烟草材料和/或＜17 ＞所述的提取物制造的。

本发明并不限定于上述的各实施方式，可以在权利要求所示的范围内进行各种变更，将不同的实施方式中分别公开的技术手段适当组合而得到的实施方式也包含在本发明的技术范围内。

实施例

〔实施例1：烟草(Nicotiana tabacum)中的目标基因的选择及分离〕

已知苏氨酸醛缩酶(Threonine aldolase(THA))是与生物中的苏氨酸代谢相关的酶，在Arabidopsis thaliana中，被THA1(At1g08630)、THA2(At3g04520) 这两个基因所编码(非专利文献10)。将来自于天冬氨酸的氨基酸的代谢途径示于图1。

通过BLAST检索从公共核酸数据库鉴定了与A.thaliana的THA基因具有相同性的3种烟草基因。其中，2种位于烟草的S基因组，1种位于T基因组。S基因组的1种和T基因组的1种基因在氨基酸水平显示出99％的高序列同一性，因此推测具有相同功能。对于这些基因，将S基因组中的基因设为NtTHA1s，将T基因组中的基因设为NtTHA1t。剩余的1个基因与其它2个基因在氨基酸水平显示出87％的同一性，设为NtTHA2。将NtTHA1s、 NtTHA1t及NtTHA2的编码区(CDS)分别示于序列号1、3及5，将翻译产物的氨基酸序列示于序列号2、4及6。

〔实施例2：烟草中的THA基因的表达的确认〕

为了确认烟草中的THA基因的表达，从品种Tsukuba(つくば)1号播种后10天的幼芽、播种后4周的苗的叶片(lamina)、播种后5周的苗的根、实施了加热处理的叶片及种子中提取RNA，供于RT-PCR。对于叶片的加热处理而言，将从播种后8周的个体切下的叶在温度37℃及湿度85％的条件下暴露0、8、24或48小时来进行。种子的RNA由10、25、50或100粒制备。总RNA使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)提取。cDNA合成使用High Capacity RNA-to-cDNA Master Mix(Thermo Fisher Scientific Inc.)进行。方法按照提取Kit附带的操作手册进行。

NtTHA1及NtTHA2基因的RT-PCR使用表1所示的特异性引物组及 PrimeSTAR(注册商标)Max DNA Polymerase(TAKARA BIO INC.)实施。需要说明的是，在NtTHA1的检测中使用了将2种直向同源基因(NtTHA1_s和 NtTHA1_t)两者同时扩增的引物组。使用品种Tsukuba 1号的基因组DNA作为PCR扩增的阳性对照的模板。对得到的PCR产物进行电泳来确认。图2 示出了烟草(Nicotiana tabacum)的各种组织中NtTHA1及NtTHA2基因的表达。图2中的(a)示出了NtTHA1基因的表达，图2中的(b)示出了NtTHA2基因的表达。 NtTHA1基因在研究的全部样品中表达。特别是NtTHA1基因在根、幼芽、及加热处理后的叶片中大量表达。另一方面，NtTHA2基因仅在根中表达。

[表1]

〔实施例3：基因突变体的筛选〕

(NtTHA1_s基因及NtTHA1_t基因的突变体的筛选)

NtTHA1_s基因及NtTHA1_t基因中具有突变的***从烟草(Nicotiana tabacum)(Tsukuba 1号)的EMS突变体集合(M2)中筛选。筛选通过SingleStrand ConformationPolymorphism(SSCP)分析进行。供于SSCP分析的PCR片段使用以下表2所示的对NtTHA1基因特异性引物组及Multiplex PCR Kit(QIGEN) 进行扩增。然后，扩增产物的分析使用填充有POP(商标)Conformational Analysis Polymer(Thermo Fisher Scientific Inc.)的毛细管电泳装置(3130xl PRISM(注册商标)DNA analyzer,Thermo Fisher Scientific Inc.)来实施。用GeneMapper(注册商标)Version4.0(Thermo Fisher Scientific Inc.)分析得到的数据，以扩增了多态性PCR产物的***作为目标突变体的候选进行筛选。

[表2]

使用TOPO(注册商标)TA Cloning Kit(Thermo Fisher Scientific Inc.)对从筛选后的候选***扩增得到的PCR产物进行克隆。将产生的细胞集落在LB/Km 液体培养基中培养过夜，然后使用QiaPrep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)提取了质粒。然后，使用得到的质粒及BigDye(注册商标)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Thermo FisherScientific Inc.)解读PCR产物的碱基序列。利用 ATGC(Ver.7)Sequence AssemblySoftware(GENETYX CORPORATION)分析得到的数据，确定了导入NtTHA1基因的突变。各步骤中的所有方法按照Ki 中附带的操作手册进行。

最终鉴定了在NtTHA1_s基因中导入了无义突变的2种突变等位基因 (tha1-s1,tha1-s2)。另外，鉴定了在NtTHA1_t基因中导入了无义突变的1种突变等位基因(tha1-t)。任一突变均在外显子1(450bp)的内部被发现。在2种突变等位基因中，对于tha1-s1而言，野生型的NtTHA1s的序列号1中记载的碱基序列中第223号碱基由C被取代为T(序列号33)、野生型的NtTHA1s 的序列号2中记载的氨基酸序列中第75号氨基酸变为终止密码子。另外，对于tha1-s2而言，野生型的NtTHA1s的序列号1中记载的碱基序列中第376 号碱基由C被取代为T(序列号34)、野生型的NtTHA1s的序列号2中记载的氨基酸序列中第126号氨基酸变为终止密码子。另外，对于tha1-t而言，野生型的NtTHA1t的序列号3中记载的碱基序列中第121号碱基由C被取代为 T(序列号35)、野生型的NtTHA1t的序列号4中记载的氨基酸序列中第41号氨基酸变为终止密码子。

图3示出了NtTHA1基因的野生型等位基因及突变等位基因的碱基序列的比对。图4示出了NtTHA1基因的野生型等位基因及突变等位基因的翻译产物的氨基酸序列的比对。

(双重突变体的培育)

为了明确NtTHA1基因功能缺失的影响，培育了双重突变体植物，其是 tha1-s1或tha1-s2的纯合体、且是tha1-t的纯合体。

首先，如上所述，筛选了对于tha1-s1、tha1-s2或tha1-t为纯合体的M2 植物。接着制备了来自于这些M2植物的交配的2种F2分离集合(F2 population)。从各集合筛选两者的NtTHA1基因座为突变等位基因的纯合体的个体，得到了2个类型的双重突变体***(tha1-s1/tha1-t,tha1-s2/tha1-t)。另外，以两者的NtTHA1基因座为野生型的纯合体的植物(THA1-s/THA1-t)作为对照，从上述集合分别进行了筛选。

需要说明的是，2个NtTHA1基因座的基因型均通过使用了TaqMan(注册商标)MGB探针的SNP Genotyping Assay得到了明确。分析使用TaqMan(注册商标)Genotyping MasterMix(Thermo Fisher Scientific Inc.)和StepOnePlus Real-Time PCR System(商标)(Thermo Fisher Scientific Inc.)实施。将分析所使用的引物及探针组示于表3。

[表3]

〔实施例4：基因表达的分析〕

如下所述研究了双重突变体中的NtTHA1基因的表达。首先，从播种后第6周的苗提取RNA，使用PrimeScript(商标)RT reagent kit with gDNA Eraser(TAKARA BIO INC.)合成了cDNA。以得到的cDNA作为模板，使用以下的表4所示的引物及探针组和TaqMan(注册商标)Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific Inc.)实施了Real-TimePCR。分析中使用了 StepOnePlus Real-Time PCR System(Thermo Fisher ScientificInc.)。PCR的步骤按照试剂盒及装置的操作手册进行。

利用以elongation factor 1-alpha(EF-1alpha)基因(登录号No.AF120093)作为内标的comparative CT method分析了NtTHA1基因的表达量。使用Primer Express(注册商标)3.0(Thermo Fisher Scientific Inc.)按照NtTHA1s及NtTHA1t 的碱基序列之间完全一致的部分设计了引物及探针组(表4)。将双重突变体及对照(control)植物中的NtTHA1基因的表达量示于图5。图5中的(a)示出了 tha1-s1/tha1-t双重突变体的表达水平，图5中的(b)示出了tha1-s2/tha1-t双重突变体的表达水平。图5的纵轴表示相对于对照植物(THA1-s/THA1-t)中的 NtTHA1基因的表达量的相对表达量(Relative expression level)。任意双重突变体与对照植物相比，表达显著降低。

[表4]

〔实施例5：植物体的栽培及游离苏氨酸含量的分析〕

(生长状态及形态的观察)

按照通常的烟草耕作法将如上所述筛选得到的双重突变体 (tha1-s2/tha1-t)及对照(control)的植物栽培在田地中。图6中的(b)为双重突变体，图6中的(a)为对照植物。

如图6所示，在双重突变体与对照植物之间未确认到生长及形态方面的差异。

(植物体中的游离苏氨酸含量的分析)

接着，从双重突变体及对照植物分别采集叶，对新鲜的叶及热风干燥后的叶中的游离苏氨酸含量进行了分析。将热风干燥的标准干燥时间表 (Tabacco Curing schedule)示于图7。图7的横轴表示经过时间(Time)(小时)，左侧的纵轴表示温度(Tempreture)(℃)，右侧的纵轴表示相对湿度(Relative humidity、RH)(％)。另外，图8示出了双重突变体及对照植物的鲜叶(flesh leaves) 的游离苏氨酸含量。图9示出了双重突变体及对照植物的热风干燥后的叶 (cured leaves)的游离苏氨酸含量。

需要说明的是，图8中的(a)及图9中的(a)示出了tha1-s1/tha1-t双重突变体及对照植物的游离苏氨酸含量(threonine content)。图8中的(b)及图9中的(b)示出了 tha1-s2/tha1-t双重突变体和对照植物的游离苏氨酸含量(threonine content)。图 8及9的纵轴表示干燥烟草叶每单位干燥重量的游离苏氨酸含量(μg/gDW)。

如图8所示，从双重突变体刚刚采集到的鲜叶的苏氨酸含量与对照植物未显示出显著差异。另一方面，如图9所示，实施了热风干燥的双重突变体的叶的游离苏氨酸含量比对照大幅增加。

〔实施例6：热风干燥的温度对游离苏氨酸含量造成影响的分析〕

研究了热风干燥的温度对双重突变体(tha1-s2/tha1-t)及对照植物 (THA1-s/THA1-t)的叶的游离苏氨酸含量造成的影响。从干燥开始起0h、8h、 16h、24h、30h、36h、48h、60h及72h后随机选择3片干燥中的烟草叶，从它们中采集了约10cm见方的叶片。将3片叶片作为1个样品集中测定了游离苏氨酸含量。需要说明的是，热风干燥室保持一定温度(25℃、34℃、38℃或42℃)在湿度85％下运行。图10示出了将从NtTHA1基因的双重突变体及对照的烟草植物中采集的叶在各温度条件下进行了热风干燥时的苏氨酸含量。干燥开始起24小时以后的双重突变体的叶在任何温度条件下均比野生型的游离苏氨酸含量高。

〔实施例7：各种基因型的个体的分析〕

为了对各种基因型的个体中的NtTHA1基因的表达进行详细研究，制备了特异性检测NtTHA1s基因或NtTHA1t基因的引物及探针(表5)。表中的“位置”列表示序列号1或3中的位置。

[表5]

[引物]

[探针]

对于NtTHA1基因座为野生型或突变型的纯合体的4个基因型 (tha1-s2/tha1-t、tha1-s2/THA1-t、THA1-s/tha1-t、THA1-s/THA1-t)的植物，调查了NtTHA1基因的表达。图11示出了各种基因型的个体中的NtTHA1基因的表达。如图11所示，在tha1-s2的纯合体中，NtTHA1s基因的表达水平降低。同样地，在tha1-t的纯合体中，NtTHA1t基因的表达水平降低。将从这些植物中采集到的叶进行热风干燥，对干叶(干燥后的叶)的游离苏氨酸含量进行了分析。图12示出了来自于各种基因型的个体的干叶的游离苏氨酸含量。双重突变体的干叶的游离苏氨酸含量比其它基因型显著增高。

〔实施例7：空气干燥〕

将双重突变体(tha1-s1/tha1-t)和空气干燥类型的烟草品种(TN90)交配，得到了BC1F2的种子。从BC1F2植物的幼苗提取DNA，调查了NtTHA1基因的基因型。筛选双重突变体(tha1-s1/tha1-t)和对照植物(THA1-s/THA1-t)，按照通常的烟草耕作法在田地中分别栽培200个以上的个体。

烟草叶的空气干燥按照通常方法实施。首先，将收获的烟草叶在11天覆盖SunShade Net的Greenhouse中悬吊，促进干燥。进一步在干燥小屋中使烟草叶干燥37天。图13示出了空气干燥中的烟草叶。图13中的(a)示出了刚刚开始悬吊后的叶，图13中的(b)示出了开始悬吊起第10天的叶。图14示出了空气干燥中的烟草叶的附近温度及附近湿度的变化。从开始悬吊起0h、18h、24h、 42h、48h、90h、96h、7d、8d、9d、10d及11d后，随机选择3片烟草叶，从它们中采集了约10cm见方的叶片。以3片叶片作为1样品，集中测定了游离苏氨酸含量。图15示出了空气干燥中的烟草叶的游离苏氨酸含量的变化。如图15所示，双重突变体的游离苏氨酸含量通过空气干燥的过程与对照相比呈高水平变化。

位于茎的上部的叶(上部叶：Tips)、位于正中部上方的叶(真叶：Leaf)、及连着茎的状态的叶也按照同样的方法进行了干燥。图16示出了双重突变体及对照的各种干叶的游离苏氨酸含量。双重突变体的干叶的游离苏氨酸含量在不同部位的任意叶中均比对照高(图16)。另外，以连着茎的状态直接干燥的(stalk cut curing)双重突变体的干叶的游离苏氨酸含量也比对照高。

〔实施例8：基因组编辑〕

参照Li等(Li et al.,Nat Biotechnol.2013Aug；31(8)：688-912013)的方法实施了使用CRISPR-Cas9的基因组编辑。从NtTHA1s基因(序列号1)及NtTHA1t基因(序列号3)的共同部分选择了目标序列 (5’-GGAGGCATTGCCACTCTCGGAGG-3’：序列号42)。该序列是序列号1 或序列号3的第283号～第305号的碱基序列，3’末端的AGG(下划线部)为 PAM序列。用于使plant codon-optimized SpCas9(pcoCas9)和synthetic-guide RNA(sgRNA)在烟草中表达的一体型的植物表达载体通过以下方式制备：在 pRI201-AN(Takara Bio公司)的CaMV35S启动子下游的NdeI-SalI之间*** pcoCas9基因，在KpnI-BamHI之间***与Arabidopsis U6 polymerase III promoter连接的sgRNA表达盒。

使包含上述载体的土壤杆菌(LBA4404)感染播种第10天的烟草子叶 (Nicotianatabacum,SR-1)，制备了转化体。筛选包含在NtTHA1s基因及 NtTHA1t基因两者***1个碱基的3个T0(M1)个体，进行了自身繁殖。从各***筛选了T1(M2)植物，所述T1(M2)植物不包含pcoCas9/sgRNA构建体、且NtTHA1s基因及NtTHA1t基因两者是突变型的纯合体。使上述M2植物自身繁殖，得到了M3种子。这些***的NtTHA1基因均在第280号与第281 号碱基之间具有1个T或G的碱基***(表6)。将野生型的NtTHA1s的序列号1中记载的碱基序列中第280号与第281号碱基之间具有1个T碱基***的序列示于序列号49。另外，分别将野生型的NtTHA1t的序列号3中记载的碱基序列中第280号与第281号碱基之间具有1个T碱基***的序列示于序列号50，将具有1个G碱基***的序列示于序列号51。

[表6]

为了调查基因组编辑后的烟草植物中的NtTHA1基因的表达，在突变部位的上游和下游各分别设计了新的引物及探针组(组A及B)(表7)。设计参照了NCBI ReferenceSequence(RefSeq)accession number XM_016599601.1和 XM_016606047.1。使用任意组均可同时检测出NtTHA1＿s基因及NtTHA1 ＿t基因这两者。组A的探针与序列号1或序列号3的第13～36号的碱基序列一致。组B的探针与序列号1或序列号3的第694～711号的碱基序列一致。

[表7]

[引物]

[探针]

采集M3幼苗的叶调查了NtTHA1基因的表达水平(3个个体/line)。图17 示出了基因组编辑后的烟草植物中的NtTHA1基因的表达水平。如图17所示，基因组编辑后的个体的NtTHA1基因的表达水平比野生型SR-1大幅降低。另外，将这些幼苗移植至12cm赤土陶器，在温室内进行了培育。从形成花芽的阶段的3个个体分别采集3片叶供于热风干燥，分析了游离苏氨酸含量。热风干燥的温度及湿度的设定为38℃/100％RH/18h、38℃/88％RH/30h、45℃ /85％RH/48h、50℃/20％RH/72h。图18示出了基因组编辑后的烟草植物的干叶的游离苏氨酸含量。热风干燥后的叶的游离苏氨酸含量与野生型SR-1相比，基因组编辑后的个体更高(图18)。

工业实用性

本发明可以用于增加了苏氨酸含量的干燥烟草材料的生产、以及包含该干燥烟草材料和/或其提取物的烟草制品的制造。

序列表

<110> 日本烟草产业株式会社(JAPAN TOBACCO INC.)

<120> 干燥烟草材料的生产方法

<130> JT17271

<150> JP2016-162276

<151> 2016-08-22

<160> 51

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1080

<212> DNA

<213> 烟草(Nicotiana tabacum)

<400> 1

atggtgatga gaaccgtgga tcttcgctcg gacacagtca ctaaaccaac tgaagccatg 60

cggaacgcga tggccaatgc tgaagtggat gacgatgtat tgggttatga tccaactgcc 120

caacgccttg aagccgagat cgcaaggata atgggcaaag aagcagggct atttgttcct 180

tcaggcacta tgggcaacct tatcagtgtg ctgactcatt gccaaattag aggcagtgaa 240

attattcttg gtgattattc gcatatccat atttatgaaa atggaggcat tgccactctc 300

ggaggtgttc atccgaggac agtgaagaac aatgaagatg gaacaatgga tcttgatcta 360

attgaagctg caattcgaga tcctagcttt gagatatgtt acccaaccac taggctgatc 420

tgcttggaga attcacatgc acactcagga ggccgatgcc tttctgcaga gtatacagac 480

aaagtcggag agctagcaaa gaagtatggt ctgaagcttc acattgatgg agctcgtata 540

ttcaatgcat cagttgcact cggagtgcct gttcatagac ttgtacgggc tgctgattca 600

gtttcggtat gcttatcaaa aggtcttggt gctccagtcg ggtctgtggt tgttggttca 660

aagagcttca ttgccaaggc gaaaattctc aggaagactc taggcggtgg aatgaggcag 720

gttggtgtcc tttgtgctgc tgcttttatc gctttccaag agaatcttgt taagctggaa 780

ggagatcaca aaaaggctaa gattttggct gaggaactta acaaaatcaa agggctgaaa 840

gttgatattg ctgccgtaga gactaacatt gtatattgtg atatactgaa ggggtcaaag 900

ataagcgaaa cagagatgtg caagactttg gaacaacatg gtttacttat actaccagaa 960

gggccacaga gaatcagatt tgttattcat caccagattt cagaaaatga tgtgcactat 1020

gcagcgtcgt gcgttcagcg agctttggca ggagtggccg aagaaaatgg tgacaagtaa 1080

<210> 2

<211> 359

<212> PRT

<213> 烟草(Nicotiana tabacum)

<400> 2

Met Val Met Arg Thr Val Asp Leu Arg Ser Asp Thr Val Thr Lys Pro

1 5 10 15

Thr Glu Ala Met Arg Asn Ala Met Ala Asn Ala Glu Val Asp Asp Asp

20 25 30

Val Leu Gly Tyr Asp Pro Thr Ala Gln Arg Leu Glu Ala Glu Ile Ala

35 40 45

Arg Ile Met Gly Lys Glu Ala Gly Leu Phe Val Pro Ser Gly Thr Met

50 55 60

Gly Asn Leu Ile Ser Val Leu Thr His Cys Gln Ile Arg Gly Ser Glu

65 70 75 80

Ile Ile Leu Gly Asp Tyr Ser His Ile His Ile Tyr Glu Asn Gly Gly

85 90 95

Ile Ala Thr Leu Gly Gly Val His Pro Arg Thr Val Lys Asn Asn Glu

100 105 110

Asp Gly Thr Met Asp Leu Asp Leu Ile Glu Ala Ala Ile Arg Asp Pro

115 120 125

Ser Phe Glu Ile Cys Tyr Pro Thr Thr Arg Leu Ile Cys Leu Glu Asn

130 135 140

Ser His Ala His Ser Gly Gly Arg Cys Leu Ser Ala Glu Tyr Thr Asp

145 150 155 160

Lys Val Gly Glu Leu Ala Lys Lys Tyr Gly Leu Lys Leu His Ile Asp

165 170 175

Gly Ala Arg Ile Phe Asn Ala Ser Val Ala Leu Gly Val Pro Val His

180 185 190

Arg Leu Val Arg Ala Ala Asp Ser Val Ser Val Cys Leu Ser Lys Gly

195 200 205

Leu Gly Ala Pro Val Gly Ser Val Val Val Gly Ser Lys Ser Phe Ile

210 215 220

Ala Lys Ala Lys Ile Leu Arg Lys Thr Leu Gly Gly Gly Met Arg Gln

225 230 235 240

Val Gly Val Leu Cys Ala Ala Ala Phe Ile Ala Phe Gln Glu Asn Leu

245 250 255

Val Lys Leu Glu Gly Asp His Lys Lys Ala Lys Ile Leu Ala Glu Glu

260 265 270

Leu Asn Lys Ile Lys Gly Leu Lys Val Asp Ile Ala Ala Val Glu Thr

275 280 285

Asn Ile Val Tyr Cys Asp Ile Leu Lys Gly Ser Lys Ile Ser Glu Thr

290 295 300

Glu Met Cys Lys Thr Leu Glu Gln His Gly Leu Leu Ile Leu Pro Glu

305 310 315 320

Gly Pro Gln Arg Ile Arg Phe Val Ile His His Gln Ile Ser Glu Asn

325 330 335

Asp Val His Tyr Ala Ala Ser Cys Val Gln Arg Ala Leu Ala Gly Val

340 345 350

Ala Glu Glu Asn Gly Asp Lys

355

<210> 3

<211> 1080

<212> DNA

<213> 烟草(Nicotiana tabacum)

<400> 3

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<210> 4

<211> 359

<212> PRT

<213> 烟草(Nicotiana tabacum)

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<211> 1119

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<213> 烟草(Nicotiana tabacum)

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gtcagtagaa cacatttgtg taagattttg gaacaacatg gtatacttgt actaccagaa 960

gggccaatga gaatcaggtt tgttatacac caccagattt cagaaagtga tgtgcactat 1020

actgtctctt gccttcagca aactttggcg ggagaggcag aagaaaatgg tgatattaag 1080

catcttatga acggtttcaa acataatctt tatctgtaa 1119

<210> 6

<211> 372

<212> PRT

<213> 烟草(Nicotiana tabacum)

<400> 6

Met Ala Val Arg Thr Val Asp Phe Arg Ser Asp Thr Val Thr Lys Pro

1 5 10 15

Thr Glu Ser Met Arg Asn Ala Met Ala Asn Ala Glu Val Asp Asp Asp

20 25 30

Val Leu Gly Tyr Asp Pro Thr Ala Gln Arg Leu Glu Ala Glu Met Ala

35 40 45

Arg Ile Met Gly Lys Glu Ala Gly Leu Phe Val Pro Ser Gly Thr Met

50 55 60

Gly Asn Leu Ile Cys Leu Leu Thr His Cys Gln Ile Arg Gly Ser Glu

65 70 75 80

Val Ile Leu Gly Asp Asn Ser His Ile His Val Tyr Glu Asn Gly Gly

85 90 95

Ile Ser Thr Ile Gly Gly Val His Pro Arg Thr Val Lys Asn Asn Glu

100 105 110

Asp Gly Thr Met Asp Leu His Leu Ile Glu Ala Ala Ile Arg Asp Ser

115 120 125

Ser Phe Glu Ile Leu Tyr Pro Thr Thr Arg Leu Ile Cys Leu Glu Asn

130 135 140

Ser His Ala Arg Ser Gly Gly Arg Cys Leu Thr Val Glu Tyr Thr Asp

145 150 155 160

Lys Val Gly Glu Leu Ala Lys Lys Tyr Gly Leu Lys Leu His Ile Asp

165 170 175

Gly Ala Arg Ile Phe Asn Ala Ser Val Ala Leu Gly Val Pro Val His

180 185 190

Arg Leu Val Gln Ala Ala Asp Ser Val Ser Ala Cys Leu Ser Lys Gly

195 200 205

Leu Gly Ala Pro Ala Gly Ser Val Ile Val Gly Ser Lys Ser Phe Ile

210 215 220

Ala Arg Ala Lys Ile Leu Arg Lys Thr Leu Gly Gly Gly Met Arg Gln

225 230 235 240

Ile Gly Val Leu Cys Ala Ala Ala Ser Val Ala Leu Gln Glu Asn Leu

245 250 255

Val Lys Leu Glu Gly Asp His Arg Lys Ala Lys Leu Leu Ala Glu Glu

260 265 270

Leu Asn Lys Ile Lys Gly Leu Lys Val Asp Ser Ala Ala Val Glu Thr

275 280 285

Asn Ile Val Tyr Cys His Ile Leu Lys Gly Ser Lys Val Ser Arg Thr

290 295 300

His Leu Cys Lys Ile Leu Glu Gln His Gly Ile Leu Val Leu Pro Glu

305 310 315 320

Gly Pro Met Arg Ile Arg Phe Val Ile His His Gln Ile Ser Glu Ser

325 330 335

Asp Val His Tyr Thr Val Ser Cys Leu Gln Gln Thr Leu Ala Gly Glu

340 345 350

Ala Glu Glu Asn Gly Asp Ile Lys His Leu Met Asn Gly Phe Lys His

355 360 365

Asn Leu Tyr Leu

370

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 7

ggggtcaaag atcagcgaaa cagaga 26

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 8

tcttcggcca ctcctgctaa agctc 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 9

tactgaaagg gtcaaaggtc agtag 25

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 10

ttcttctgcc tctcccgcca aagttt 26

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 11

cagggaaaat ggtgatgaga acc 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 12

atgcaccaat atgaggatcg ctg 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 13

cagggaaaat ggtgatgaga acc 23

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 14

accagataat gtaccaaata gagag 25

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tha1_s1_F 引物

<400> 15

gcactatggg caaccttatc agt 23

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tha1_s1_R 引物

<400> 16

aacacctccg agagtggcaa t 21

<210> 17

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tha1_s1_W 探针

<400> 17

tcattgccaa attaga 16

<210> 18

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tha1_s1_M 探针

<400> 18

tgctgactca ttgctaa 17

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tha1_s2_F 引物

<400> 19

cgaggacagt gaagaacaat gaag 24

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tha1_s2_R 引物

<400> 20

tcagcctagt ggttgggtaa ca 22

<210> 21

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tha1_s2_W 探针

<400> 21

aagctgcaat tcgaga 16

<210> 22

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tha1_s2_M 探针

<400> 22

aagctgcaat ttga 14

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tha1_t_F 引物

<400> 23

caatggccaa cgctgaagt 19

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tha1_t_R 引物

<400> 24

ggttgcccat agtgcctgaa g 21

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tha1_t_W 探针

<400> 25

ccaactgccc aacgccttg 19

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tha1_t_M 探针

<400> 26

ccaactgcct aacgccttg 19

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> THA1_F 引物

<400> 27

taggtcaggg aaaatggtga tga 23

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> THA1_R 引物

<400> 28

cgttccgcat ggcttcag 18

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> THA1 探针

<400> 29

accgtggatc ttcgctcgga caca 24

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EF-1_F 引物

<400> 30

ctaagggtgc tgccagcttt 20

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EF-1_R 引物

<400> 31

gtcaagcact ggagcatatc ca 22

<210> 32

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EF-1 探针

<400> 32

atcatgaacc atccaggaca gattgg 26

<210> 33

<211> 1080

<212> DNA

<213> 烟草(Nicotiana tabacum)

<400> 33

atggtgatga gaaccgtgga tcttcgctcg gacacagtca ctaaaccaac tgaagccatg 60

cggaacgcga tggccaatgc tgaagtggat gacgatgtat tgggttatga tccaactgcc 120

caacgccttg aagccgagat cgcaaggata atgggcaaag aagcagggct atttgttcct 180

tcaggcacta tgggcaacct tatcagtgtg ctgactcatt gctaaattag aggcagtgaa 240

attattcttg gtgattattc gcatatccat atttatgaaa atggaggcat tgccactctc 300

ggaggtgttc atccgaggac agtgaagaac aatgaagatg gaacaatgga tcttgatcta 360

attgaagctg caattcgaga tcctagcttt gagatatgtt acccaaccac taggctgatc 420

tgcttggaga attcacatgc acactcagga ggccgatgcc tttctgcaga gtatacagac 480

aaagtcggag agctagcaaa gaagtatggt ctgaagcttc acattgatgg agctcgtata 540

ttcaatgcat cagttgcact cggagtgcct gttcatagac ttgtacgggc tgctgattca 600

gtttcggtat gcttatcaaa aggtcttggt gctccagtcg ggtctgtggt tgttggttca 660

aagagcttca ttgccaaggc gaaaattctc aggaagactc taggcggtgg aatgaggcag 720

gttggtgtcc tttgtgctgc tgcttttatc gctttccaag agaatcttgt taagctggaa 780

ggagatcaca aaaaggctaa gattttggct gaggaactta acaaaatcaa agggctgaaa 840

gttgatattg ctgccgtaga gactaacatt gtatattgtg atatactgaa ggggtcaaag 900

ataagcgaaa cagagatgtg caagactttg gaacaacatg gtttacttat actaccagaa 960

gggccacaga gaatcagatt tgttattcat caccagattt cagaaaatga tgtgcactat 1020

gcagcgtcgt gcgttcagcg agctttggca ggagtggccg aagaaaatgg tgacaagtaa 1080

<210> 34

<211> 1080

<212> DNA

<213> 烟草(Nicotiana tabacum)

<400> 34

atggtgatga gaaccgtgga tcttcgctcg gacacagtca ctaaaccaac tgaagccatg 60

cggaacgcga tggccaatgc tgaagtggat gacgatgtat tgggttatga tccaactgcc 120

caacgccttg aagccgagat cgcaaggata atgggcaaag aagcagggct atttgttcct 180

tcaggcacta tgggcaacct tatcagtgtg ctgactcatt gccaaattag aggcagtgaa 240

attattcttg gtgattattc gcatatccat atttatgaaa atggaggcat tgccactctc 300

ggaggtgttc atccgaggac agtgaagaac aatgaagatg gaacaatgga tcttgatcta 360

attgaagctg caatttgaga tcctagcttt gagatatgtt acccaaccac taggctgatc 420

tgcttggaga attcacatgc acactcagga ggccgatgcc tttctgcaga gtatacagac 480

aaagtcggag agctagcaaa gaagtatggt ctgaagcttc acattgatgg agctcgtata 540

ttcaatgcat cagttgcact cggagtgcct gttcatagac ttgtacgggc tgctgattca 600

gtttcggtat gcttatcaaa aggtcttggt gctccagtcg ggtctgtggt tgttggttca 660

aagagcttca ttgccaaggc gaaaattctc aggaagactc taggcggtgg aatgaggcag 720

gttggtgtcc tttgtgctgc tgcttttatc gctttccaag agaatcttgt taagctggaa 780

ggagatcaca aaaaggctaa gattttggct gaggaactta acaaaatcaa agggctgaaa 840

gttgatattg ctgccgtaga gactaacatt gtatattgtg atatactgaa ggggtcaaag 900

ataagcgaaa cagagatgtg caagactttg gaacaacatg gtttacttat actaccagaa 960

gggccacaga gaatcagatt tgttattcat caccagattt cagaaaatga tgtgcactat 1020

gcagcgtcgt gcgttcagcg agctttggca ggagtggccg aagaaaatgg tgacaagtaa 1080

<210> 35

<211> 1080

<212> DNA

<213> 烟草(Nicotiana tabacum)

<400> 35

atggtgatga gaaccgtgga tcttcgctcg gacacagtca ctaaaccaac tgaagccatg 60

cggaacgcaa tggccaacgc tgaagtggat gacgatgtat tgggttatga tccaactgcc 120

taacgccttg aagccgagat cgcaaggata atgggcaaag aagcagggct atttgttcct 180

tcaggcacta tgggcaacct tatcagtgtg ctgactcatt gccaaattag aggcagtgaa 240

attattcttg gtgattattc acatatccat atttatgaaa atggaggcat tgccactctc 300

ggaggtgttc atccgaggac agtgaagaac aatgaagatg gaacaatgga tcttgattta 360

attgaagctg caattcgaga tcctagcttt gagatatgtt acccgaccac taggctgatc 420

tgcttggaga attcacatgc acactcagga ggcagatgcc tttctgcaga gtatacagac 480

aaagtcggag agctagcaaa gaagtatggt ctgaagcttc acattgatgg agctcgtata 540

ttcaatgcat cagttgcact tggagtgcct gttcatagac ttgtacgtgc tgctgattca 600

gtttcggtat gcttatcaaa aggtcttggt gctccagttg ggtctgtggt tgttggttca 660

aagagcttca ttgccaaggc aaaaattctg aggaagactc taggcggtgg aatgaggcag 720

gttggtgtcc tttgtgctgc tgcttttatc ggtttccaag agaatcttgt taagctggaa 780

ggagatcaca aaaaggctaa gattttggct gaggaactaa acaaaatcaa agggctgaaa 840

gttgatattg ctgccgtaga gactaacatt gtatattgcg atatactgaa ggggtcaaag 900

atcagcgaaa cagagatgtg caagattttg gagcaacatg gtttacttat actaccagaa 960

ggcctaatga gaatcagatt tgttattcat caccagattt cagaaaatga tgtgcactat 1020

gcggtatctt gtgttcagcg agctttagca ggagtggccg aagaaaatgg tgacaagtaa 1080

<210> 36

<211> 552

<212> PRT

<213> 烟草(Nicotiana tabacum)

<400> 36

Met Ala Ser Leu Ser His Phe Cys Gly Val Lys Thr Pro Cys Ser Ser

1 5 10 15

Leu Phe Lys Arg Ser Val His Phe Arg Gln Leu Asp Phe Val Ala Ser

20 25 30

Val Pro Phe Ala Ser Ala Pro Ser Lys Tyr Val Lys Ala Ser Cys Cys

35 40 45

Glu Arg Val Thr Cys Lys Ala Gln Ala Ala Asp Val Val Glu Leu Lys

50 55 60

Glu Thr Lys Asn Glu Ala Phe Gly Glu Phe Thr Cys Val Met Lys Phe

65 70 75 80

Gly Gly Ser Ser Val Ala Ser Ala Glu Arg Met Arg Glu Val Ala Asp

85 90 95

Leu Ile Leu Ser Phe Pro Glu Glu Arg Pro Val Ile Val Leu Ser Ala

100 105 110

Met Gly Lys Thr Thr Asn Asn Leu Leu Leu Ala Gly Glu Lys Ala Val

115 120 125

Thr Cys Gly Val Ser Asn Val Cys Asp Leu Gln Glu Leu Asp Phe Ile

130 135 140

Lys Asp Leu His Phe Arg Thr Ile Asp Gln Leu Gly Val Glu Lys Ser

145 150 155 160

Thr Ile Ser Lys His Leu Leu Glu Leu Glu Gln Leu Leu Asn Gly Ile

165 170 175

Ala Met Met Lys Glu Leu Thr Pro Arg Thr Arg Asp Tyr Leu Val Ser

180 185 190

Phe Gly Glu Cys Met Ser Thr Arg Ile Phe Thr Ala Tyr Leu Asn Lys

195 200 205

Leu Gly Val Lys Ala Arg Gln Tyr Asp Ala Phe Glu Met Gly Ile Ile

210 215 220

Thr Thr Asp Glu Phe Thr Asn Ala Asp Ile Leu Glu Ala Thr Tyr Pro

225 230 235 240

Ala Val Ala Lys Arg Leu Ser Gly Asp Trp Met Asn Asn Pro Ala Ile

245 250 255

Pro Ile Val Thr Gly Phe Leu Gly Lys Gly Trp Arg Thr Cys Ala Val

260 265 270

Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Leu Thr Ala Thr Thr Ile Gly

275 280 285

Lys Ala Leu Gly Leu Arg Glu Ile Gln Val Trp Lys Asp Val Asp Gly

290 295 300

Val Leu Thr Cys Asp Pro Asn Ile Tyr Pro Arg Ala Gln Pro Val Pro

305 310 315 320

Tyr Leu Thr Phe Asp Glu Ala Ala Glu Leu Ala Tyr Phe Gly Ala Gln

325 330 335

Val Leu His Pro Gln Ser Met Arg Pro Ala Arg Glu Gly Asp Ile Pro

340 345 350

Val Arg Val Lys Asn Ser Tyr Asn Pro Lys Ala Pro Gly Thr Leu Ile

355 360 365

Cys Arg Ala Arg Asp Met Ser Lys Ala Val Leu Thr Ser Ile Val Leu

370 375 380

Lys Arg Asn Val Thr Met Leu Asp Ile Val Ser Thr Arg Met Leu Gly

385 390 395 400

Gln Phe Gly Phe Phe Ala Lys Val Phe Ser Ile Phe Glu Asp Leu Gly

405 410 415

Ile Ser Val Asp Val Val Ala Thr Ser Glu Val Ser Ile Ser Leu Thr

420 425 430

Leu Asp Pro Ser Lys Leu Trp Ser Arg Glu Leu Ile Gln Gln Glu Leu

435 440 445

Asp His Val Val Glu Glu Leu Glu Lys Ile Ala Val Val Asn Leu Leu

450 455 460

Gln His Arg Ser Ile Ile Ser Leu Ile Gly Asn Val Gln Arg Ser Ser

465 470 475 480

Leu Ile Leu Glu Lys Ala Phe His Val Leu Arg Thr Asn Gly Val Asn

485 490 495

Val Gln Met Ile Ser Gln Gly Ala Ser Lys Val Asn Ile Ser Leu Ile

500 505 510

Val Asn Asp Ser Glu Ala Glu Gln Cys Val Arg Ala Leu His Lys Thr

515 520 525

Phe Phe Glu Ser Asp Leu Ser Glu Leu Val Trp Glu Asn Gly His Val

530 535 540

Thr Pro Leu Ser Thr Leu Ser Thr

545 550

<210> 37

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 37

actaccagaa gggccaca 18

<210> 38

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 38

ccaaagctcg ctgaacg 17

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 39

ctaccagaag gcctaatgag a 21

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 40

ctgctaaagc tcgctgaaca 20

<210> 41

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAM/TAMRA 探针

<400> 41

tcaccagatt tcagaaaatg atgtgcac 28

<210> 42

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRISPR-Cas9的靶区域

<400> 42

ggaggcattg ccactctcgg agg 23

<210> 43

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 43

taggtcaggg aaaatggtga tga 23

<210> 44

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 44

cgttccgcat ggcttcag 18

<210> 45

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 45

ttggttcaaa gagcttcatt gc 22

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 46

ccgataaaag cagcagcaca a 21

<210> 47

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAM/TAMRA 探针

<400> 47

accgtggatc ttcgctcgga caca 24

<210> 48

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAM/NFQ (MGB) 探针

<400> 48

aagactctag gcggtgga 18

<210> 49

<211> 1081

<212> DNA

<213> 烟草(Nicotiana tabacum)

<400> 49

atggtgatga gaaccgtgga tcttcgctcg gacacagtca ctaaaccaac tgaagccatg 60

cggaacgcga tggccaatgc tgaagtggat gacgatgtat tgggttatga tccaactgcc 120

caacgccttg aagccgagat cgcaaggata atgggcaaag aagcagggct atttgttcct 180

tcaggcacta tgggcaacct tatcagtgtg ctgactcatt gccaaattag aggcagtgaa 240

attattcttg gtgattattc gcatatccat atttatgaaa tatggaggca ttgccactct 300

cggaggtgtt catccgagga cagtgaagaa caatgaagat ggaacaatgg atcttgatct 360

aattgaagct gcaattcgag atcctagctt tgagatatgt tacccaacca ctaggctgat 420

ctgcttggag aattcacatg cacactcagg aggccgatgc ctttctgcag agtatacaga 480

caaagtcgga gagctagcaa agaagtatgg tctgaagctt cacattgatg gagctcgtat 540

attcaatgca tcagttgcac tcggagtgcc tgttcataga cttgtacggg ctgctgattc 600

agtttcggta tgcttatcaa aaggtcttgg tgctccagtc gggtctgtgg ttgttggttc 660

aaagagcttc attgccaagg cgaaaattct caggaagact ctaggcggtg gaatgaggca 720

ggttggtgtc ctttgtgctg ctgcttttat cgctttccaa gagaatcttg ttaagctgga 780

aggagatcac aaaaaggcta agattttggc tgaggaactt aacaaaatca aagggctgaa 840

agttgatatt gctgccgtag agactaacat tgtatattgt gatatactga aggggtcaaa 900

gataagcgaa acagagatgt gcaagacttt ggaacaacat ggtttactta tactaccaga 960

agggccacag agaatcagat ttgttattca tcaccagatt tcagaaaatg atgtgcacta 1020

tgcagcgtcg tgcgttcagc gagctttggc aggagtggcc gaagaaaatg gtgacaagta 1080

a 1081

<210> 50

<211> 1081

<212> DNA

<213> 烟草(Nicotiana tabacum)

<400> 50

atggtgatga gaaccgtgga tcttcgctcg gacacagtca ctaaaccaac tgaagccatg 60

cggaacgcaa tggccaacgc tgaagtggat gacgatgtat tgggttatga tccaactgcc 120

caacgccttg aagccgagat cgcaaggata atgggcaaag aagcagggct atttgttcct 180

tcaggcacta tgggcaacct tatcagtgtg ctgactcatt gccaaattag aggcagtgaa 240

attattcttg gtgattattc acatatccat atttatgaaa tatggaggca ttgccactct 300

cggaggtgtt catccgagga cagtgaagaa caatgaagat ggaacaatgg atcttgattt 360

aattgaagct gcaattcgag atcctagctt tgagatatgt tacccgacca ctaggctgat 420

ctgcttggag aattcacatg cacactcagg aggcagatgc ctttctgcag agtatacaga 480

caaagtcgga gagctagcaa agaagtatgg tctgaagctt cacattgatg gagctcgtat 540

attcaatgca tcagttgcac ttggagtgcc tgttcataga cttgtacgtg ctgctgattc 600

agtttcggta tgcttatcaa aaggtcttgg tgctccagtt gggtctgtgg ttgttggttc 660

aaagagcttc attgccaagg caaaaattct gaggaagact ctaggcggtg gaatgaggca 720

ggttggtgtc ctttgtgctg ctgcttttat cggtttccaa gagaatcttg ttaagctgga 780

aggagatcac aaaaaggcta agattttggc tgaggaacta aacaaaatca aagggctgaa 840

agttgatatt gctgccgtag agactaacat tgtatattgc gatatactga aggggtcaaa 900

gatcagcgaa acagagatgt gcaagatttt ggagcaacat ggtttactta tactaccaga 960

aggcctaatg agaatcagat ttgttattca tcaccagatt tcagaaaatg atgtgcacta 1020

tgcggtatct tgtgttcagc gagctttagc aggagtggcc gaagaaaatg gtgacaagta 1080

a 1081

<210> 51

<211> 1081

<212> DNA

<213> 烟草(Nicotiana tabacum)

<400> 51

atggtgatga gaaccgtgga tcttcgctcg gacacagtca ctaaaccaac tgaagccatg 60

cggaacgcaa tggccaacgc tgaagtggat gacgatgtat tgggttatga tccaactgcc 120

caacgccttg aagccgagat cgcaaggata atgggcaaag aagcagggct atttgttcct 180

tcaggcacta tgggcaacct tatcagtgtg ctgactcatt gccaaattag aggcagtgaa 240

attattcttg gtgattattc acatatccat atttatgaaa gatggaggca ttgccactct 300

cggaggtgtt catccgagga cagtgaagaa caatgaagat ggaacaatgg atcttgattt 360

aattgaagct gcaattcgag atcctagctt tgagatatgt tacccgacca ctaggctgat 420

ctgcttggag aattcacatg cacactcagg aggcagatgc ctttctgcag agtatacaga 480

caaagtcgga gagctagcaa agaagtatgg tctgaagctt cacattgatg gagctcgtat 540

attcaatgca tcagttgcac ttggagtgcc tgttcataga cttgtacgtg ctgctgattc 600

agtttcggta tgcttatcaa aaggtcttgg tgctccagtt gggtctgtgg ttgttggttc 660

aaagagcttc attgccaagg caaaaattct gaggaagact ctaggcggtg gaatgaggca 720

ggttggtgtc ctttgtgctg ctgcttttat cggtttccaa gagaatcttg ttaagctgga 780

aggagatcac aaaaaggcta agattttggc tgaggaacta aacaaaatca aagggctgaa 840

agttgatatt gctgccgtag agactaacat tgtatattgc gatatactga aggggtcaaa 900

gatcagcgaa acagagatgt gcaagatttt ggagcaacat ggtttactta tactaccaga 960

aggcctaatg agaatcagat ttgttattca tcaccagatt tcagaaaatg atgtgcacta 1020

tgcggtatct tgtgttcagc gagctttagc aggagtggcc gaagaaaatg gtgacaagta 1080

a 1081

Claims (29)

1.一种增加了苏氨酸含量的干燥烟草材料的生产方法，该方法包括：

从改变为内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低的烟草植物或其一部分生产该干燥烟草材料，其中，

该苏氨酸醛缩酶为以下(a)及(b)中的至少任一者：

(a)包含由下述基因编码的多肽的苏氨酸醛缩酶，所述基因包含相对于具有序列号1中记载的碱基序列的多核苷酸具有90％以上序列同一性的多核苷酸，

(b)包含由下述基因编码的多肽的苏氨酸醛缩酶，所述基因包含相对于具有序列号3中记载的碱基序列的多核苷酸具有90％以上序列同一性的多核苷酸，

所述干燥烟草材料中的苏氨酸含量的增加是由于所述经过改变的烟草植物或其一部分的干燥而产生的。

2.根据权利要求1所述的生产方法，其中，所述经过改变的烟草植物中内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低是由编码该苏氨酸醛缩酶的基因的突变等位基因引起的、或者是由导入的用于抑制该苏氨酸醛缩酶的表达的外源性的多核苷酸引起的。

3.根据权利要求2所述的生产方法，其中，所述突变等位基因包含选自***、缺失、移码突变、无义突变、无终止密码子突变(nonstop mutation)、及剪接位点突变中的突变。

4.根据权利要求3所述的生产方法，其中，所述突变是包含人工突变的突变、或者是包含天然存在的自然突变的突变，所述人工突变是利用选自突变诱导、基因组编辑及敲除法中的方法导入的。

5.根据权利要求4所述的生产方法，其中，所述人工突变是通过突变诱导或基因组编辑导入的，该突变诱导或基因组编辑通过选自暴露于化学物质或放射线、CRISPR***、转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases)、锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases)、寡聚核苷酸定点诱变(Oligonucleotide-directedmutagenesis)、T-DNA***、及转座子***中的方法进行。

6.根据权利要求2所述的生产方法，其中，作为编码所述苏氨酸醛缩酶的基因，所述经过改变的烟草植物是等位基因彼此具有相同种类的突变的纯合体、或者是等位基因彼此具有不同突变的杂合体。

7.根据权利要求2所述的生产方法，其中，所述外源性的多核苷酸包含选自反义RNA分子、RNAi分子及共抑制因子分子中的分子。

8.根据权利要求1所述的生产方法，其中，所述经过改变的烟草植物是通过改变为内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低的烟草植物的自身繁殖而培育成的烟草品种的植物、或者是通过该经过改变的烟草植物彼此交配而培育成的烟草品种的植物。

9.根据权利要求8所述的生产方法，其中，所述经过改变的烟草植物是基于选自以下(a)～(e)中的指标而筛选及培育成的烟草植物：

(a)所述苏氨酸醛缩酶的表达的降低，

(b)所述苏氨酸醛缩酶的活性的降低，

(c)加热处理后的叶中的苏氨酸含量的增加，

(d)有无所述苏氨酸醛缩酶的突变等位基因，

(e)与所述(d)的突变等位基因连锁的DNA标记物，

(f)有无为了抑制所述苏氨酸醛缩酶的表达而导入的外源性的多核苷酸。

10.根据权利要求1所述生产方法，其中，所述烟草植物的一部分选自叶、根、茎、腋芽、花、种子、植物培养细胞、愈伤组织及原生质体。

11.根据权利要求1所述的生产方法，其中，所述干燥通过选自热风干燥、空气干燥、火烘干及日晒干燥中的干燥来进行。

12.根据权利要求1所述生产方法，其中，所述经过改变的烟草植物是选自烟草(Nicotiana tabacum)及黄花烟草(Nicotiana rustica)中的烟草植物。

13.根据权利要求1所述的生产方法，其中，所述干燥烟草材料是叶材料，该干燥烟草材料中的苏氨酸含量比由对照烟草植物或其一部分制备的干燥烟草材料的苏氨酸含量高20％以上，所述对照烟草植物没有被改变为苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低。

14.一种增加了苏氨酸含量的干燥烟草材料的生产方法，该方法包括：

从改变为内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低的烟草植物或其一部分生产该干燥烟草材料，其中，

该苏氨酸醛缩酶为以下(a)及(b)中的至少任一者：

(a)包含相对于具有序列号2中记载的氨基酸序列的多肽具有90％以上序列同一性的多肽的苏氨酸醛缩酶，

(b)包含相对于具有序列号4中记载的氨基酸序列的多肽具有90％以上序列同一性的多肽的苏氨酸醛缩酶，

所述干燥烟草材料中的苏氨酸含量的增加是由于所述经过改变的烟草植物或其一部分的干燥而产生的。

15.根据权利要求14所述的生产方法，其中，所述经过改变的烟草植物中内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低是由编码该苏氨酸醛缩酶的基因的突变等位基因引起的、或者是由导入的用于抑制该苏氨酸醛缩酶的表达的外源性的多核苷酸引起的。

16.根据权利要求15所述的生产方法，其中，所述突变等位基因包含选自***、缺失、移码突变、无义突变、无终止密码子突变(nonstop mutation)、及剪接位点突变中的突变。

17.根据权利要求16所述的生产方法，其中，所述突变是包含人工突变的突变、或者是包含天然存在的自然突变的突变，所述人工突变是利用选自突变诱导、基因组编辑及敲除法中的方法导入的。

18.根据权利要求17所述的生产方法，其中，所述人工突变是通过突变诱导或基因组编辑导入的，该突变诱导或基因组编辑通过选自暴露于化学物质或放射线、CRISPR***、转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases)、锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases)、寡聚核苷酸定点诱变(Oligonucleotide-directedmutagenesis)、T-DNA***、及转座子***中的方法进行。

19.根据权利要求15所述的生产方法，其中，作为编码所述苏氨酸醛缩酶的基因，所述经过改变的烟草植物是等位基因彼此具有相同种类的突变的纯合体、或者是等位基因彼此具有不同突变的杂合体。

20.根据权利要求15所述的生产方法，其中，所述外源性的多核苷酸包含选自反义RNA分子、RNAi分子及共抑制因子分子中的分子。

21.根据权利要求14所述的生产方法，其中，所述经过改变的烟草植物是通过改变为内源性的苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低的烟草植物的自身繁殖而培育成的烟草品种的植物、或者是通过该经过改变的烟草植物彼此交配而培育成的烟草品种的植物。

22.根据权利要求21所述的生产方法，其中，所述经过改变的烟草植物是基于选自以下(a)～(e)中的指标而筛选及培育成的烟草植物：

(a)所述苏氨酸醛缩酶的表达的降低，

(b)所述苏氨酸醛缩酶的活性的降低，

(c)加热处理后的叶中的苏氨酸含量的增加，

(d)有无所述苏氨酸醛缩酶的突变等位基因，

(e)与所述(d)的突变等位基因连锁的DNA标记物，

(f)有无为了抑制所述苏氨酸醛缩酶的表达而导入的外源性的多核苷酸。

23.根据权利要求14所述生产方法，其中，所述烟草植物的一部分选自叶、根、茎、腋芽、花、种子、植物培养细胞、愈伤组织及原生质体。

24.根据权利要求14所述的生产方法，其中，所述干燥通过选自热风干燥、空气干燥、火烘干及日晒干燥中的干燥来进行。

25.根据权利要求14所述生产方法，其中，所述经过改变的烟草植物是选自烟草(Nicotiana tabacum)及黄花烟草(Nicotiana rustica)中的烟草植物。

26.根据权利要求14所述的生产方法，其中，所述干燥烟草材料是叶材料，该干燥烟草材料中的苏氨酸含量比由对照烟草植物或其一部分制备的干燥烟草材料的苏氨酸含量高20％以上，所述对照烟草植物没有被改变为苏氨酸醛缩酶的表达或活性降低。

27.一种干燥烟草材料，其是通过权利要求1或14所述的生产方法生产的。

28.一种提取物，其是由权利要求27所述的干燥烟草材料制备的。

29.一种烟草制品，其是使用权利要求27所述的干燥烟草材料和/或权利要求28所述的提取物制造的。

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