CN104073440A - 一株玫烟色拟青霉及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株玫烟色拟青霉及其应用。本发明所提供的玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)TRCC22001保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为：CGMCC No.7993，以及本菌株在防治刺吸式口器害虫方面的应用。

Description

一株玫烟色拟青霉及其应用

技术领域

本发明涉及一种玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)，同时还涉及一种该玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)的制备方法，及其在防治刺吸式口器害虫中的应用。 

背景技术

随着可持续农业观的建立，探索无公害、无污染的生物防治措施已成为植物病害综合治理中的重要课题，日益受到世界各国的重视。 

据不完全统计，世界上记载的虫生真菌约100属800多种。在我国已报道的达405种，其中虫草属80种，寄生线虫的真菌10种，寄生昆虫的真菌种类215种，报道的新种达24种。我国自50年代以来，开发应用的昆虫病原真菌约20种，使用面积最广的是白僵菌和绿僵菌。 

昆虫病原真菌是指那些在寄主正常生理条件下能直接侵入体内、增殖和迅速引起死亡的类群。它们以吸收血淋巴中的养分、分解寄主组织或产生有毒代谢产物而杀死昆虫。在引起昆虫传染性疾病的致病微生物中，由真菌引起昆虫死亡的情形最多，约占60％。同时，昆虫病原真菌种类繁多，对虫口密度起着重要的调节作用，所以利用昆虫病原真菌种类资源进行“以菌治虫”应是生物防治工作的重要组成部分。昆虫病原真菌的致病机理：昆虫病原真菌从孢子萌发到菌体重新在虫体上产生孢子一般分为10个阶段：(1)孢子附着于寄主表皮；(2)孢子萌发；(3)穿透表皮；(4)菌丝在血腔内生长；(5)毒素产生；(6)寄主死亡；(7)菌丝侵入寄主的所有器官；(8)菌丝穿出表皮；(9)产生孢子；(10)侵染单位的扩散。只要完成了前四个阶段，就完成了对寄主的入侵和感染；当病原真菌在体内的菌丝大量增殖时，就可导致寄主死亡。 

发明内容

本发明的目的在于提供了一种防治刺吸式口器害虫的昆虫病原真菌---玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)。其rDNA ITS1-5.8S-ITS2序列： 

5’-TCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTAACGAGTTTTTTCAACTCCCTAACCCTTTGTGAACATACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCGGCGTCCGGACGGCCCTGCGCCGCCCGCGACGGACCCAGGCGGCCGCCGGAGACCCACAAATTCTGTTTCTATCAGTCTTTCTGAATCCGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGC CTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACACCTTCGGGGGAGTCGGCGTTGGGGACCGGCAGCATACCGCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGCCCGTCCGCGGCGACCTCTGCGTAGTACTCCAACGCGCACCGGGAACCCGACGCGGCCACGCCGAAACACCCAACTTCTGAACGTTGACCTCGGATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAA-3’。 

同时，本发明的目的还在于提供一种玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)的菌种培养方法和固体培养方法。 

更进一步地，本发明的目的在于提供了一种玫烟色拟青霉（Paecilomyces fumosoroseus)的应用。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)，其保藏号为CGMCC NO.7993。 

同时，本发明的技术方案采用了一种玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)的菌种培养方法，(1)斜面种子培养。斜面菌种培养基为改良式PDA：20％马铃薯，2％蔗糖，0.2％蛋白胨，0.1％K₂HPO₄·3H2O，0.3％NaNO₃，0.05％MgSO₄·7H2O，0.05％KCl，0.01％FeSO₄，2％琼脂，水1000ml。121摄氏度高压蒸汽灭菌30min。试管接种后放置26摄氏度恒温培养10d备用。(2)液体种子培养。培养基：改良式PDA(去琼脂)。将其装入500ml三角瓶，每瓶装100ml，121摄氏度高压蒸汽灭菌30min。接入试管斜面菌种(每支接两瓶)，放置摇床(180转／min)26摄氏度培养60h备用。 

同时，本发明的技术方案采用了一种玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)的固体培养方法：固体培养基为70％麦麸+30％米糠。按固体培养基配比称取原料，加1.2倍水充分拌匀，过夜后121摄氏度高压蒸汽灭菌30min备用。 

进一步地，本发明的技术方案采用了一种玫烟色拟青霉（Paecilomyces fumosoroseus)在防治刺吸式口器害虫方面的应用。 

本发明所涉及的玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)在对小菜蛾防治过程中，玫烟色拟青霉孢子粉对小菜蛾幼虫的死亡率为76.2％，玫烟色拟青霉孢子悬浮液对小菜蛾幼虫的死亡率为59.8％，玫烟色拟青霉孢子培养液对小菜蛾幼虫的死亡率为58.5％。 

本发明所涉及的玫烟色拟青霉（Paecilomyces fumosoroseus)在对茶小绿叶蝉防治过程中，防效最高可达71.3％。 

本发明的菌株：玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)已经保藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为：中国.北京.北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物所，保藏日期为2013年08月13日，其保藏编号为CGMCC No.7993。 

具体实施方式：

实施例1TRCC22001菌株的鉴定： 

分子***学鉴定，DNA提取方法：采用石英砂研磨CTAB提取法(Scott et al.，2000)。 

遗传标记：rDNA ITS1-5.8S-ITS2，扩增引物：ITS5，ITS4(White et al.，1990)。 

PCR扩增反应条件：先94℃加热3分钟使模板DNA变性，然后进入下列温度循环：94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸45秒，共进行35个循环，最后在72℃延伸5分钟(Wang，2012)。 

PCR产物检测和测序：PCR产物与100bp DNA ladder(MBI Fermentas)用2.0％的琼脂糖凝胶(agarose gel)在0.5×TBE电泳缓冲液中于80V电压下电泳20分钟，然后置于0.5μg／ml的溴乙锭(EB，ehidium bromide)溶液中染色15分钟，在波长365和254nm的紫外光下检测为明显单一条带的产物由擎科生物技术有限公司纯化后用ABI3700(Applied Biosystems)进行双向直通测序。 

数据处理和统计学分析：原始序列用生物软件Bioedit7.0.9(Hall，1999)编辑后得到准确无误的序列，与GenBank下载的模式和权威菌株序列组成序列数据矩阵。对于序列矩阵，在Bioedit7.0.9下做必要的人工编辑和调整得到的新矩阵。将该矩阵用MEGA5.0(Tamura et al.，2011)进行邻居连接法(neighbor-joining，NJ)分析，推断出***发育树，并用自展法(bootstrap)进行1000次重复评估各分支的可靠性。 

菌株***发育树见附图1、附图2。结果表明TRCC22001菌株与（Paecilomyces fumosoroseus)相似度为98.90％，并且其菌体形态和生理生化指标符合(Paecilomyces fumosoroseus)的特征，所以可以鉴定TRCC82001菌株为(Paecilomyces fumosoroseus)。后经中科院微生物研究所将(Paecilomyces fumosoroseus)命名为玫烟色拟青霉。TRCC22001菌株于2013年8月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.7993。 

实施例2菌种培养： 

(1)斜面种子培养。斜面菌种培养基为改良式PDA：20％马铃薯，2％蔗糖，0.2％蛋白胨，0.1％K₂HPO₄·3H2O，0.3％NaNO₃，0.05％MgSO₄·7H2O，0.05％KCl，0.01％FeSO₄，2％琼脂，水1000ml。121摄氏度高压蒸汽灭菌30min。试管接种后放置26摄氏度恒温培养10d备用。(2)液体种子培养。培养基：改良式PDA(去琼脂)。将其装入500ml三角瓶，每瓶装100ml，121摄氏度高压蒸汽灭菌30min。接入试管斜面菌种(每支接两瓶)，放置摇床(180转／min)26摄氏度培养60h备用。 

实施例3固体培养 

(1)培养基配比：70％麦麸+30％米糠。按配比称取原料，加1.2倍水充分拌匀，过夜后 121摄氏度高压蒸汽灭菌30min备用。(2)培养方法及性状观察。将培养基分别铺在无菌瓷盘上(厚度以2～3cm为宜)，各按10％接种量接入液体种子，混合均匀，盖上盖子，26摄氏度恒温培养。第7d翻动1次后喷雾湿润或“灌水湿润”培养，第15d再次翻动后喷雾湿润或“灌水湿润”，连续培养20d，作好生长状况记录。培养20d后，32摄氏度烘40h即可。(3)产孢量测定：称取１g，放入三角瓶中，加适量的含有吐温-80的蒸馏水，打散孢子，用血球记数板计算每克的孢子数。 

实施例4玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)的毒力 

1、玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)对小菜蛾幼虫的侵染过程观察 

挑取刚蜕皮的小菜蛾3龄幼虫，将培养好的玫烟色拟青霉孢子粉接菌到小菜蛾3龄幼虫体表，接菌后于20摄氏度、相对湿度75％～80％条件下饲养，每天定时更换新鲜甘蓝叶片。3次重复，每重复20头幼虫。处理后10h开始取样，每2h取样1次，16h后每4h取样1次。样品用3％的戊二醛固定，系列处理后于扫描电镜下观察、拍照。孢子萌发以芽管长度超过孢子直径长度(非圆形孢子按较小的直径)的一半作为萌发标准。 

2、致病力测定 

(1)接种孢子粉：将小菜蛾3龄幼虫和涂有火棉胶的盖玻片置于培养皿盖中，然后将25摄氏度、SDA培养基培养14d的玫烟色拟青霉菌落倒置于内放小菜蛾幼虫的皿盖上，用手轻拍培养皿底部数次，使孢子粉落到小菜蛾幼虫和盖玻片上，取出盖玻片反盖在血球计数板上，滴两滴棉蓝液，使盖玻片上孢子数量为6～7个mm^-2。将处理后的小菜蛾幼虫放入垫有湿滤纸、直径为15cm的培养皿内饲养。饲养条件为20摄氏度、相对湿度75％～80％，每天定时更换新鲜甘蓝叶，观察感病症状并记录死亡虫数。3次重复，每重复20头幼虫，以不接菌的小菜蛾幼虫为对照。数据处理采用Duncan新复极差法。 

(2)接种孢子悬浮液：取25摄氏度、SDA培养基培养14天的玫烟色拟青霉分生孢子，用含0.1％吐温-80的无菌水制成孢子悬浮液(磁力搅拌器搅拌10min以上)，调节孢子悬浮液浓度为2×10^７个mL^-1。用喷雾器对放在滤纸上的小菜蛾3龄幼虫和盖玻片定量喷雾，然后取出盖玻片镜检孢子数量，使盖玻片上孢子数为6～7个mm^-2。每处理20头幼虫，3次重复，以0.1％吐温-80无菌水为对照。饲养条件及数据处理同上。 

(3)接种孢子培养液：取25摄氏度、SDA培养基培养14天的玫烟色拟青霉分生孢子置于沙氏液体培养基中，将孢子浓度调节为2×10^７个mL^-1，摇床培养8小时后再进行接菌处理，接菌方法及饲养条件同上。 

3、3种不同接菌方法对小菜蛾幼虫的致病力 

不同接菌方法玫烟色拟青霉对小菜蛾幼虫的致病速率和致病力明显不同。玫烟色拟青霉分生孢子培养液比孢子悬浮液和孢子粉对小菜蛾幼虫的致病速率快，处理后44小时发现虫体表现出明显的感病症状，72小时出现死亡高峰，其致死中时为3.18天；孢子悬浮液和孢子粉处理的小菜蛾幼虫，60小时出现感病症状，比孢子培养液晚16小时，96h出现死亡高峰，致死中时分别为4.20天和4.34天。 

实施例4玫烟色拟青霉（Paecilomyces fumosoroseus)制剂的制备及药效 

1、孢子粉生产与悬乳剂配制 

将保存的菌种在SDAY平板上活化，恒温(25e)光照培养至产孢时，取孢子粉至萨氏培养液(不含琼脂的SDAY)中振荡培养24小时，转接后继续培养48小时然后，将含大量菌丝的菌液接入经浸泡和蒸汽灭菌至适当熟度的大米上，接种量为10％，菌液与大米充分混合后摊于托盘中，在25度下培养10天，在35度下风干1天再过机械振动的120目筛而收集孢子粉，其含孢量大于1011g^-1，将定量孢子粉加入配方优化的可乳化溶剂油中而配制成孢子悬乳剂，含孢量为1010ml^-1，此即为纯孢子悬乳剂，简称纯孢剂，在此基础上，用10％吡虫啉可湿性粉剂作为增效剂，按3％(W／V)的比例加入纯孢子悬乳剂中(即3g·100ml^-1)，由此获得混配的孢子悬乳剂，简称混配剂。选吡虫啉作为增效剂，一是因为它是目前被允许在茶园使用的化学杀虫剂，二是因为它与杀虫真菌之间极好的生物相容性。 

2、田间试验 

选择代表性茶园(茶小绿叶蝉危害严重且分布相对均匀)进行田间药效试验，管理条件一致；该茶园为典型山丘茶园，茶垅(宽约1～115米)呈梯级分布，坡度约60°，坡底至坡顶高约40m。试验包括4个处理，清水对照(CK)、含3％吡虫啉10％可湿剂的矿物油载体对照(OI)、玫烟色拟青霉的纯孢剂(OP)和混配剂(OPI)。每处理小区重复3次，每小区面积约60m²(约60m长的独垄)，小区之间设1垄空白(不作任何处理)作为保护区。各菌剂用水稀释500倍喷雾，使喷液的实际孢子浓度为2×10^７个孢子·ml^-1，每小区喷菌液约5kg，非菌剂处理的喷液量(CK及OI)相同，所有处理按随机区组排列，共喷雾2次，第二次喷雾在第一次喷雾后的第12d进行，两次用菌时间均为晴天傍晚。 

3、虫口调查 

茶小绿叶蝉喜阴凉且活动性强，善跳跃，给田间抽样调查带来难度。试验期间，抽样调查一般在晨露未干前(早上8：30时以前)该虫不太活动时进行，阴天则可全天进行。因每小区实为一垄，故采用对茶树编号的方法，调查时随机选取一编号的茶树作为起始抽样株，然后每隔2株抽取1株，每小区共查10株，每株抽查10片嫩叶(取芽下第二片嫩叶)，轻轻地 翻看(受触动的芽叶不用于观察)，就地计数并记载若虫数和成虫数，最后按处理统计每10叶虫数，首次用菌前调查虫口基数，然后每隔3或4天调查一次，在第二次用菌2周后作最后一次调查，田间试验期间的当地气象数据从当地气象站获得。 

4、数据分析 

对各处理的茶小绿叶蝉密度(虫量／10叶)，用DPS数据处理***软件进行方差分析。各处理的相对防效(E)按以下公式计算： 

E=[1-(P_CK0×P_T1)／(P_CK1×P_T0)]×100 

式中，P_T0和P_T1分别表示处理小区在处理前后调查的平均10叶虫量，P_CK0和P_CK1分别表示清水对照小区喷雾前后调查的平均10叶虫量。 

5、试验结果 

(1)试验期间天气状况：环境条件是影响真菌杀虫剂的重要因素；本研究的田间试验正值当地高温季节，从喷菌至观察结束的25天中，温度变化范围为21.2～38.1摄氏度，最低日均温22.7摄氏度，最高日均温31.2摄氏度，平均日均温26.6摄氏度。从降雨情况看，共有14个降雨日，其中4个降雨日的雨量小于1mm，1～5mm的小雨日4d，5～25mm的中雨日3天，25～50mm的大雨日4天，总降雨量达241.2mm。总之，6月中旬至7月中旬正是试验所在地浙江遂昌的盛夏，温度偏高，雨水偏多，因而试验期间天气变化较大。 

(2)田间防效：与清水对照相比，两种真菌的孢子悬乳剂500倍稀释液喷雾都对茶小绿叶蝉产生一定的控制效果，但以混配剂的效果明显好于纯菌剂，玫烟色拟青霉的最高防效为71.3%。单用含3％吡虫啉10％可湿性粉剂的矿物油载体的500倍稀释液喷雾也获得相当的防效，且防效总是在施用后第一次调查最高，而后大幅下降。将用菌后历次调查的防效给予平均和排序，结果是玫烟色拟青霉混配剂防效62.1±12.2％，其次是含微量吡虫啉的矿物油50.3±14.3％和玫烟色拟青霉纯菌剂，仅有防效19.0±23.2％。 

最后所应说明的是，以上实例仅用于说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。 

表1：3种不同接菌方法处理后小菜蛾幼虫的死亡率 

接菌方法	校正死亡率(％)	化蛹率(％)	致死中时
				孢子粉	76.2±1.13a	20.4±1.39a	4.34
孢子悬浮液	59.8±1.36b	36.2±1.81b	4.30
				孢子培养液	58.5±2.04b	38.4±1.56b	3.18

附图说明

图1为玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)TRCC22001CGMCC No.7993的rDNA ITS1-5.8S-ITS2序列。 

图2为玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)TRCC22001CGMCC No.7993基于rDNA ITS1-5.8S-ITS2序列构建的***发育树。 

Claims (5)

1.玫烟色拟青霉菌株，其于2013年8月13日保藏在中国微生物菌种保管管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为7993。

2.玫烟色拟青霉的菌种培养方法，其特征在于：(1)斜面种子培养，斜面菌种培养基为改良式PDA：20％马铃薯，2％蔗糖，0.2％蛋白胨，0.1％K₂HPO₄·3H₂O，0.3％NaNO₃，0.05％MgSO₄·7H₂O，0.05％KCl，0.01％FeSO₄，2％琼脂，水1000毫升；121摄氏度高压蒸汽灭菌30分钟；试管接种后放置26摄氏度恒温培养10天备用；(2)液体种子培养，培养基：改良式PDA(去琼脂)；将其装入500毫升三角瓶，每瓶装100毫升，121摄氏度高压蒸汽灭菌30分钟；接入试管斜面菌种(每支接两瓶)，放置摇床(180转／分钟)26摄氏度培养60小时备用。

3.玫烟色拟青霉的固体培养方法，其特征在于：按固体培养基配比称取原料，加1.2倍水充分拌匀，过夜后121摄氏度高压蒸汽灭菌30分钟备用。

4.根据权利要求3所述的玫烟色拟青霉的制备方法，其特征在于：固体培养基为70％麦麸+30％米糠。

5.玫烟色拟青霉菌株，其特征在于所述玫烟色拟青霉菌株在防治刺吸式口器害虫中的应用。