CN101448526A

CN101448526A - 基于西尼加谷病毒的组合物和治疗疾病的方法

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Publication number: CN101448526A
Application number: CNA2006800179284A
Authority: CN
Inventors: P·哈伦贝克; S·R·普利斯; L·M·豪尔斯
Original assignee: Novartis Nutrition AG; NEOTROPIX Inc
Current assignee: Novartis AG; NEOTROPIX Inc
Priority date: 2005-03-23
Filing date: 2006-03-13
Publication date: 2009-06-03

Abstract

本发明涉及一种新型RNA微小病毒，该RNA微小病毒被称为西尼加谷病毒(“西尼卡谷病毒”)。本发明提供了分离的西尼卡谷病毒核酸以及由这些核酸编码的蛋白。本发明还提供了针对SVV蛋白的抗体。因为西尼卡谷病毒具有选择性杀伤某些肿瘤的能力，本发明提供了使用西尼卡谷病毒和西尼卡谷病毒多肽进行肿瘤治疗的方法。因为西尼卡谷病毒特异性地靶向某些肿瘤，本发明提供了使用西尼卡谷病毒核酸和蛋白进行癌症检测方法。此外，由于西尼卡谷病毒肿瘤特异性机制所提供的信息，本发明提供了制造肿瘤细胞裂解性病毒衍生物和改变病毒使之具有肿瘤细胞类型趋向性的方法。

Description

基于西尼加谷病毒的组合物和治疗疾病的方法

该申请要求下述优先权：美国专利60/664,442，(提交于2005年3月23日)；美国专利60/726,313(提交于2005年10月13日)；美国专利11/335,891(提交于2006年1月19日)。这些申请引入此处以其全部做为参考。

该公开中所含内容受著作权保护。当该公开作为美国专利和商标局的的文件或记录时，著作权所有人不反对任何人对该专利文件或该专利公开进行复制拷贝；否则将保留所有的著作权权力。

在本说明书中引用的所有的专利申请、出版专利申请、审批的和授权的专利、文本和文章均引入此处以其全部做为参考，以便对本发明的技术状态进行更全面的描述。

背景技术

病毒疗法在癌症治疗方面很有前景。肿瘤细胞裂解性病毒旨在特异性地感染和杀伤肿瘤细胞。同其他治疗方案(如化疗或放疗)相比，天然的和或工程化的肿瘤细胞裂解性病毒可能会更有效而且毒性更小。此外，肿瘤细胞裂解性病毒疗法所使用的是具有复制能力的病毒，因此它是目前唯一可以在期望的位点放大疗效的疗法。

癌症治疗的关键在于能够实现相对正常细胞而言的癌细胞的高杀伤率。很多原因致使难以达到上述目标，所述原因包括所涉及的细胞类型广泛而繁多、由于转移而使癌细胞分布全身，以及癌细胞与正常细胞间的生物学差异很小。尽管取得了一些进步，但始终需要对现有的癌症治疗加以改进。

在过去，外科医生试图基本上不伤害患者地通过外科手术切除肿瘤。但是因为早期转移到身体的未知的位点并且遗留在那里而未能检测，所以即使将原位肿瘤完全切除也不能保证存活。有些研究建议由于由于切除肿瘤细胞产生血管生成抑制剂，外科介入可能促进远距离转移。最后，很多情况下，手术去除后肿瘤又长回到原来的位点。放疗的目的在于在以损伤其它细胞为代价的基础上，选择性地摧毁大多数迅速增殖的细胞。然而，肿瘤细胞可以或者通过变得具有抗性或者通过在治疗期间处于非***状态而逃避放疗。此外，放疗对活跃***的很多正常细胞并非总是选择性的，并且在治疗中这些正常细胞(例如骨髓中的细胞，胃肠道细胞和毛囊细胞等)也会被杀伤。

同放疗一样，化疗的选择性也不完全，因此也会摧毁很多正常细胞，并且由于细胞的药物抗性和/或细胞的***状态而不能杀伤所有的肿瘤细胞。因此由于化疗和放疗利用的是正常细胞和癌细胞之间存在的细微的敏感性差异，使得它们的治疗指数很窄。对于任何癌症治疗模式而言，小的治疗指数很明显不是人们所期望的特性。因此期待克服这些局限的新的癌症治疗方法。

肿瘤细胞裂解性病毒治疗就是这样一种新的治疗方法。最初，尝试利用携带有细胞毒性转基因的复制缺陷性病毒进行癌症治疗。然而，他们发现转导肿瘤细胞的效率低，在肿瘤块内扩散不充分并且没有充分地选择性地靶向肿瘤。为了克服这些局限，或者对病毒进行改良以使其能选择性地在肿瘤细胞中复制，或者寻找天然具有肿瘤特异性的病毒。这些肿瘤裂解性病毒因此具有通过局部注射或***递送这些病毒选择性地通过肿瘤块而复制、扩散并杀伤肿瘤细胞的特性(图1)。

尽管新定义的这类抗癌疗法在治疗上早期具有一定的优势，由于存在很多局限可能限制了将它们用作癌症治疗药物。因此亟需能够用于癌症治疗的新的肿瘤细胞裂解性病毒。

发明内容

人们发现了一种新型的微小RNA病毒(下文中称为西尼加谷病毒(SVV))，它们的天然特性包括：选择性杀伤某些类型的肿瘤细胞的能力。如下面的例子所阐明的，SVV选择性地杀伤肿瘤系带，具有神经趋向性(neurotropic)特性。在大多数情况下，杀伤50％肿瘤细胞和50％正常细胞所需病毒量(即，EC₅₀值)相差10000倍。在体内实验中也得到同样的结果，其中，小鼠中的肿瘤移植物被选择性地清除了。而且，体内实验结果显示SVV对正常细胞没有毒性，在免疫功能缺陷或免疫功能完备的小鼠中，即使***性给药高达1×10¹⁴vp/kg(载体或病毒颗粒数/千克)，也不会引起死亡，并且未观察到临床症状。

SVV在1×10⁸vp/kg这样低的剂量下可以发挥疗效，而且能达到>100000的很高的治疗指数。效果很强，表现在能够100％地将在小鼠中的大量的预先建立的肿瘤彻底根除(实施例11)。没有任何辅助性治疗的情况下，仅通过单纯的***性注射就可以达到这种效果。此外，SVV注射小鼠在接受注射后至少200天内，既没有出现任何临床症状也没有出现肿瘤复发。可以将SVV纯化至高滴度，并且在允许细胞系(permissive cell line)中能以>200000个病毒颗粒数/细胞进行生产。进而，对于选择的癌症类型而言，基于SVV的病毒治疗在安全、有效以及新的治疗线方面具有可观的前景。此外，SVV具有小而且易于操作的基因组、简单且快速的生活周期以及为大家所熟知的复制生物学，因此可以经得起修饰。至少部分这些特性允许采用生成修饰的SVV的方法使之具有新的细胞或组织特异性趋向性，进而基于SVV的治疗指向因为原来的SVV分离株而对感染抗性的新的肿瘤类型。

相应地，本发明提供了分离的病毒，其包含具有与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、168，或者这些序列中的任一个的长度至少为50个核苷酸的连续部分具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的序列一致性的核酸序列，或者与这些序列中的任一个的长度至少为10个、15个或20个核苷酸的连续部分具有95％的一致性的核酸序列。本发明的分离的核酸可以为RNA或者DNA。

本发明的各个方面提供了分离的核酸，其包含与文中的SVV核酸SEQIDNO序列中的任一个的连续部分具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列，其中，该连续部分的长度例如，至少为约20个、25个、50个、75个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、750个、1000个、1250个、1500个、2000个或2500个核苷酸。该SVV核酸SEQ ID NO序列包括例如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21和168。

本发明的各个方面提供了分离的蛋白质或多肽，其包含与文中的SVV的氨基酸SEQ ID NO序列中的任一个的连续部分具有至少50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性的氨基酸序列。其中，该连续部分的长度至少例如为约5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300或350个氨基酸。这些SVV氨基酸SEQ IDNO序列包括例如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和169。

另一方面，本发明提供了分离的核酸，其包含与SEQ ID NO：168或SEQ ID NO：168的长度至少为20、50、100或200个核苷酸的连续部分具有至少95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列，该分离的核酸可以包含SEQ ID NO：168的特定部分，包括但不局限于：位于SEQ ID NO：168的第1-666位核苷酸的SVV5’端的非翻译区(UTR)、位于SEQ ID NO：168的第667-7209位核苷酸的SVV多聚蛋白的编码序列、位于SEQ ID NO：168的第667至903位核苷酸的SVV导肽的编码序列、位于SEQ ID NO：168的第904-1116位核苷酸的SVV VP4蛋白的编码序列，位于SEQ ID NO：168的第1117-1968位核苷酸的SVVVP2蛋白的编码序列、位于SEQ ID NO：168的第1969-2685位核苷酸的SVV VP3蛋白的编码序列、位于SEQ ID NO：168的第2686-3477位核苷酸的SVV VP1蛋白的编码序列、位于SEQ ID NO：168的第3478-3504位核苷酸的SVV 2A蛋白的编码序列、位于SEQ ID NO：168的第3505-3888位核苷酸的SVV 2B蛋白的编码序列、位于SEQ ID NO：168的第3889-4854位核苷酸的SVV 2C蛋白的编码序列、位于SEQ IDNO：168的第4855-5124位核苷酸的SVV 3A蛋白的编码序列、位于SEQID NO：168的第5125-5190位核苷酸的SVV 3B蛋白的编码序列、位于SEQ ID NO：168的第5191-5823位核苷酸SVV 3C蛋白的编码序列、位于SEQ ID NO：168的第5824-7209位核苷酸的SVV 3D蛋白的编码序列以及位于SEQ ID NO：168的第7210-7280位核苷酸的SVV的3’UTR。

一方面，本发明提供了使用SVV 2A蛋白、SVV导肽或其它SVV蛋白或其多肽部分来关闭(shut off)宿主细胞的蛋白质翻译的方法。一方面，这样的SVV蛋白可以用于通过在宿主细胞内干扰或抑制“帽结合蛋白复合物”关闭宿主蛋白质的翻译。

另一方面，本发明提供了使用SVV 2A蛋白或其它SVV蛋白或其多肽部分来切割蛋白或多肽的方法。

一方面，本发明提供了分离的核酸，所述分离的核酸可在高、中等严格或低严格条件下与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、168或与这些序列中的任一个的至少长度为50个核苷酸的连续部分杂交。

另一方面，本发明也提供了载体，所述载体含有与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、168，或者这些序列中的任一个的长度至少为50个核苷酸的连续部分具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或者99％一致性的核酸序列。载体组合物还可以包含编码SVV蛋白的SEQ ID NO：168核酸序列区域。

本发明还提供了由下述核酸编码的分离的多肽，所述的核酸与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、168，或者这些序列中的任一个的长度至少为50个核苷酸的连续部分具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或者99％一致性。本发明还提供了由下述核酸编码的分离的多肽，所述的核酸与编码SVV蛋白的SEQID NO：168核酸序列区域具有至少95％、96％、97％、98％或99％的一致性。

一方面，本发明提供了分离的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、169或这些序列中的任一个的长度至少为10个氨基酸的连续部分具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的一致性的氨基酸序列。

另一方面，本发明提供了分离的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：169的长度至少为9、10、15、20或者50个氨基酸的连续部分具有至少95％，96％，97％，98％或99％一致性的氨基酸序列。例示性的SEQ IDNO：169的连续部分包括但不仅局限于：包含SVV蛋白质的区域，例如位于第1-79位残基的导肽)、位于第80-150位残基的VP4、位于第151-434位残基的VP2、位于第435-673位残基的VP3、位于第674-937位残基的VP1、位于第938-946位残基的2A、位于第947-1074位残基的2B、位于第1075-1396位残基的2C、位于第1397-1486位残基的3A、位于第1487-1508位残基的3B、位于第1509-1719位残基的3C、位于第1720-218位残基的3D。

另一方面，本发明提供了能够特异性结合下述多肽的分离的抗体，所述多肽包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、169，或者这些序列中的任一个的长度至少为9、10、15或20个氨基酸的连续部分具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列。生成的抗体可以与SEQ ID NO：2或169的任一个的蛋白质表位或抗原相结合。而且，该抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体或嵌合抗体。

一方面，本发明提供了分离的SVV、或及其衍生病毒、或其相关病毒。这些病毒的基因组序列包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：168具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的一致性的序列。

另一方面，本发明提供了分离的病毒，所述病毒具有美国标准培养物保藏中心(ATCC)专利保藏号为PTA-5343的全部鉴定特征和核酸序列。本发明的部分病毒指向PTA-5343的分离株、和变异株、同源株、相关株、衍生病毒和PTA-5343的突变株；或对已经确定的负责SVV病毒(野生株和突变株二者)癌细胞裂解性特性的序列进行修饰而得到的其它病毒的变异株、同源株、衍生病毒和突变株。

本发明还提供了分离的SVV，其具有下述特征：约7.5kb或约7.3kb的单链RNA基因组(正义链(+))；直径为约27nm；衣壳含有至少三种分子量近似的分别为约31kDa、36kDa和27kDa的蛋白质。在氯化铯(CsCl)密度梯度中的浮力密度约为1.34g/mL；和在肿瘤细胞内具有复制能力。一方面，31kDa的衣壳蛋白(VP1)可以含有与SEQ IDNO：8序列，或者SEQ ID NO：169的第674-937位残基具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列；36kDa的衣壳蛋白(VP2)可以含有与SEQ ID NO：4，或者SEQ ID NO：169的第151-434位残基具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列；27kDa的衣壳蛋白(VP3)可以含有与SEQ IDNO：6，或者SEQ ID NO：169的第435-673位残基具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的氨基酸序列。

另一方面，本发明提供了SVV衍生病毒或相关病毒，其具有下述特征：在肿瘤细胞中复制的能力、肿瘤细胞趋向性和在正常细胞中没有细胞裂解性。SVV相关病毒包括SVV样微小RNA病毒、包括来源于下列USDA的分离株：MN 88-36695、NC 88-23626、IA 89-47552、NJ90-10324、IL 92-48963、CA 131395、LA 1278、IL 66289、IL 94-9356、MN/GA 99-29256、MN 99197和SC 363649。如果SVV样微小RNA病毒不天然具有在下述特性：肿瘤细胞中的复制的能力、肿瘤趋向性和在正常细胞中没有细胞裂解性，可以通过突变SVV样微小RNA病毒而使之获得这些特性。可以通过比较SVV样微小RNA病毒和SVV的序列设计这类突变，并制造突变到该SVV样微小RNA病毒中，使它的氨基酸序列与SVV完全一致或基本一致(在特定的区域)。另一方面，病毒在具有神经内分泌特性的肿瘤细胞类型中能够复制。

另一方面，本发明提供：含有有效量的本发明的病毒和药学上可接受的载体的药物组合物、含有本发明的病毒的细胞、含有本发明的病毒抗原的病毒裂解物，和从本发明的病毒获得的分离的和纯化的病毒抗原。

另一方面，本发明提供了纯化本发明的病毒的方法，包括：用病毒感染细胞；回收细胞裂解物；使细胞裂解物接受至少一次密度梯度离心；和从梯度中分离该病毒。

一方面，本发明提供了治疗癌症的方法，包括给予有效量病毒或其衍生病毒。为了治疗癌症，其中，病毒具有下述基因组序列，所述序列与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、168，或SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：168的一部分的具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的序列。一方面，本发明提供了治疗癌症的方法，其包括：给予有效量的病毒或其衍生病毒。为了治疗癌症，其中，该病毒具有下述基因组序列，所述序列与SEQ ID NO：1具有至少95％、96％、97％、98％或99％的一致性。该病毒可以是例如，SVV突变体、SVV样微小RNA病毒或心病毒。SVV样微小病毒可以是例如，下述分离株中的一种：MN 88-36695、NC 88-23626、IA89-47752、NJ 90-10324、IL 92-48963、CA 131395；LA 1278；IL 66289；IL 94-9356；MN/GA 99-29256；MN 99197和SC 363649。SVV样微小病毒可以是野生型或突变体。

另一方面，本发明提供了治疗癌症的方法，包括给予有效量的具有衣壳蛋白编码区的病毒，所述衣壳蛋白编码区含有与SEQ ID NO：3、5、7、SEQ ID NO：169的第904-3477位核苷酸或它们的长度至少为75、100、200或500个核苷酸序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性的序列。本发明还提供了治疗癌症的方法，包括给予有效量的具有衣壳蛋白的病毒，所述的衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：4、6、8，SEQ ID NO：169的第80-937位氨基酸残基，或者上述序列的长度至少为25、50或100个氨基酸的连续部分具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或者99％一致性的序列。

一方面，本发明提供了抑制癌症进展的方法，包括使癌症细胞与病毒或其衍生病毒相接触，其中，病毒或其衍生病毒特异性地结合癌性细胞(cancerous cell)，其中，该病毒具有含有下述序列的基因组，所述序列与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21或168具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％一致性。

另一方面，本发明提供了抑制癌症进展的方法，包括使癌症细胞与病毒或其衍生病毒相接触，其中，病毒或其衍生病毒特异性地感染癌性细胞，其中，该病毒具有含有下述序列的基因组序列，所述序列与SEQ ID NO：168或SEQ ID NO：168的长度至少为50、100、200或500个核苷酸的连续部分具有至少95％、96％、97％、98％或者99％一致性。

另一方面，本发明提供了杀伤癌症细胞的方法，包括使癌症细胞与有效量的病毒或其衍生病毒相接触，其中，该病毒具有含有下述序列的基因组序列，所述序列与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21或168具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的一致性。

另一方面，本发明提供了杀伤癌症细胞的方法，包括使癌症细胞与有效量的病毒或其衍生病毒相接触，其中，该病毒具有含有下述序列的基因组序列，所述序列与SEQ ID NO：168或SEQ ID NO：168的长度至少为50、100、200或500个核苷酸的连续部分具有至少95％、96％、97％、98％或者99％一致性。

针对癌症的这些方法中，该病毒可以为微小RNA病毒。该微小RNA病毒可以是心病毒(cardiovirus)、马鼻病毒(erbovirus)、鹅口疮病毒(aphthovirus)、嵴病毒(kobuvirus)、肝病毒(heaptovirus)、副肠孤病毒(parechovirus)、捷申病毒(teschovirus)、肠道病毒(enterovirus)、鼻病毒(rhinoviruss)、SVV和SVV样微小RNA病毒。心病毒选自vilyuisk人脑脊髓炎病毒、赛勒氏鼠脑脊髓炎病毒和脑心肌炎病毒。SVV可以是ATCC保藏号为PTA-5343的病毒，或者是含有下述核酸序列的病毒，所述序列与SEQ ID NO：1，或SEQ ID NO：168或这些序列的长度至少为50、100、200或500个核苷酸的连续部分具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性。该SVV样微小RNA病毒可以是下述病毒，所述病毒含有与SEQ ID NO：168，或该序列的长度至少为50、100、200或500个核苷酸的连续部分序列具有至少为95％、96％、97％、98％或99％的一致性。SVV样微小RNA病毒可以是，例如，来自下述病毒之一的分离株：MN88-36695、NC 88-23626、IA 89-47752、NJ 90-10324、IL 92-48963、CA 131395；LA 1278；IL 66289；IL 94-9356；MN/GA 99-29256；MN99197和SC 363649。SVV样微小RNA病毒可以为野生型或突变型。

本发明还提供了杀伤异常增殖的细胞的方法，包括使本发明的病毒与该细胞接触。一方面，异常增殖的细胞为肿瘤细胞；本方法的另一方面，肿瘤细胞选自：人小细胞肺癌、人视网膜母细胞瘤、人神经母细胞瘤、人成神经管细胞瘤、小鼠成神经细胞瘤、维尔姆氏肿瘤和人非小细胞肺癌等。

本发明还提供了治疗受试者的肿瘤病况(neoplastic condition)的方法，包括向哺乳动物给予有效量的本发明的病毒。一方面，肿瘤新生物状况为神经内分泌癌；另一方面，受试者为哺乳动物；另一方面，受试者为人。

本发明还提供了生产本发明的病毒的方法，包括：在允许病毒复制的条件下培养以该病毒感染的细胞，和从细胞或培养上清中回收该病毒。该方法的一个方面，细胞为PER.C6细胞。该方法的一个方面，细胞为H446细胞。该方法的另一个方面，每个细胞可以产生超过200000个病毒颗粒。

另一方面，本发明提供了检测本发明的病毒的方法，包括：从怀疑含有本发明的病毒的待测物质中分离RNA；对对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：168的至少15个连续核苷酸的RNA进行标记；将标记过的RNA与待测物质进行探查(probing)；检测经标记的RNA与分离自待测物质的RNA的结合，其中结合指示病毒的存在。另一方面，本发明提供了核酸探针，其对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：168或其互补序列的至少15个连续核苷酸。

(a)本发明还提供了制造肿瘤细胞裂解性病毒的方法，该方法包括：(a)将SVV基因组序列与待测病毒基因组序列进行比较；(b)鉴定至少第一个SVV基因组序列编码的多肽和待测病毒的基因组序列编码的多肽之间的氨基酸的差异；(c)突变待测病毒的基因组序列，使得由待测病毒的基团组序列编码的多肽与SVV基因组序列编码的多肽之间的氨基酸的差异至少减少1个；(d)将突变后的待测病毒的基因组序列转染进肿瘤细胞中；和(e)测定肿瘤细胞是否被突变后的待测病毒的基因组序列裂解性地感染。一方面，待测病毒被突变的氨基酸位于结构区域，例如衣壳编码区中。另一方面，待测病毒被突变的氨基酸位于非结构区域中。

在制造肿瘤细胞裂解性病毒的方法的一方面，SVV基因组序列获自ATCC保藏号为PTA-5343的SVV病毒分离株，或获含有下述序列的病毒，所述序列与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、168或其连续部分的一致性至少为65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。一方面，SVV基因组序列获自ATCC保藏号为PTA-5343的SVV病毒分离株，或含有下述序列的病毒，所述序列与SEQ ID NO：168或其长度至少为50、100、200或500个核苷酸的连续部分的一致性至少为95％、96％、97％、98％或99％。本方法的另一方面，突变待测病毒基因组序列的步骤包括对具有待测病毒的基因组序列的cDNA进行突变。本方法的另一方面，转染突变的待测病毒基因组序列的步骤包括转染RNA，其中，该RNA产生自具有突变的待测病毒基因组序列的cDNA。

在制造肿瘤细胞裂解性病毒的方法的另一方面，该待测病毒为微小RNA病毒。该待测病毒包括捷申病毒、肠道病毒、鼻病毒、心病毒、马鼻病毒、鹅口疮病毒、嵴病毒、肝病毒、副肠孤病毒或捷申病毒。另一方面，该待测病毒是心病毒。另一方面，该待测病毒SVV样微小RNA病毒。SVV样微小RNA病毒可以是例如来自以下分离株的病毒：MN88-36695，NC 88-23626，IA 89-47552，NJ 90-10324，IL 92-48963，CA131395；LA 1278；IL 66289；IL 94-9356；MN/GA 99-29256；MN 99197和SC 363649。另一方面，在制造肿瘤细胞裂解性病毒的方法中鉴定的氨基酸差异是SVV衣壳蛋白和待测病毒衣壳蛋白的序列的差异。在制造肿瘤细胞裂解性病毒的方法的另一方面，待测病毒的基因组序列选自vilyuisk人脑脊髓炎病毒、塞勒氏鼠脑脊髓炎病毒和脑心肌炎病毒。另一方面，待测病毒基因组序列选自脑心肌炎病毒。另一方面，脑心肌炎病毒、SVV样微小RNA病毒或其它待测病毒选自含有下述核酸序列的分离株，所述核酸序列含有与ATCC保藏号为PTA-5343的SVV病毒，或者SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、168，或其长度至少为50、100、200或500个核苷酸的连续部分具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或者99％的一致性的序列。

在制造肿瘤细胞裂解性心病毒的方法的另一方面，待测病毒同SVV的氨基酸差异在SVV的衣壳蛋白区域中，其中，在SEQ ID NO：4，6，8、SEQ ID NO：169的第80-937位残基，SEQ ID NO：169的第80-150位残基，SEQ ID NO：169的第151-434位残基，SEQ ID NO：169的第435-673位残基或SEQ ID NO：169的第674-937位残基内比对氨基酸差异。

本发明还提供了制造具有改变的细胞类型趋向性的突变体病毒的方法，该方法包括：(a)创建含有多种核酸序列的病毒突变体文库；(b)将该病毒突变体文库转染到允许细胞中，使其产生多种突变体病毒；(c)分离多种突变体病毒；(d)将分离的多种突变体病毒与非允许细胞孵育；(e)回收非允许细胞产生的突变体病毒，由此制备具有改变的趋向性的突变体病毒。另一方面，该方法还可以包括步骤：(f)在非允许细胞中孵育回收的突变体病毒，和(g)回收非允许细胞产生的突变体病毒。另一方面，该方法还包括反复重复步骤(f)和(g)。另一方面，该病毒突变体文库创建自下述亲本序列、所述亲本序列包含与的SEQ IDNO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、168或其连续部分的序列；

在制造具有改变的细胞类型趋向性的方法的一个方面，在多孔高通量平台中进行孵育，其中该平台在每个孔内含有不同的非允许细胞类型。在这个方面，该方法可以还包括筛选该平台以鉴定含有杀死细胞的突变体病毒的孔。另一方面，通过分析每个孔的光吸收度进行筛选。

在制造具有改变的细胞类型趋向性的突变体病毒的方法的另一方面，非允许细胞是肿瘤细胞。

在制造具有改变的细胞类型趋向性的突变体病毒的方法的另一方面，创建病毒突变体文库的步骤包括：(i)提供具有与亲本序列的部分相一致的序列的多核苷酸；(ii)为了生成多种不同的突变体多核苷酸序列而突变该多核苷酸；和(iii)将多种突变的多核苷酸连接到具有除了步骤(i)的多核苷酸所含的病毒基因组序列部分之外的病毒基因组序列的载体中，据此创建病毒突变体文库。一方面，病毒的基因组序列来自微小RNA病毒。另一方面，病毒的基因组的序列含有与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、168或其连续部分的一致性至少为65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的序列。另一方面，病毒的基因组的序列含有下述序列，所述序列与SEQ ID NO：168或该序列的长度至少为50、100、200或500个核苷酸的连续部分的一致性至少为95％、96％、97％、98％或99％。一方面，含有与SEQ ID NO：168序列或该序列的长度至少为50、100、200或500个核苷酸的连续部分的一致性至少为95％、96％、97％、98％或99％的序列的病毒试SVV样微小RNA病毒。另一方面，创建病毒突变体文库的步骤中，通过将核苷酸随机***到多核苷酸中进行步骤(ii)的突变。一方面，通过三核苷酸诱变法(TRIM)进行核苷酸的随机***。另一方面，***多核苷酸中的核苷酸的至少一部分编码表位标签。另一方面，创建病毒突变体文库的步骤中，在多核苷酸的衣壳编码区域中进行步骤(ii)的突变。

本发明还提供了制造具有改变的细胞类型趋向性的突变体病毒的方法，该方法包括：(a)创建病毒的突变体核苷酸文库，其中该构建包括：提供编码病毒衣壳区域的多核苷酸序列，为了生成多种不同的突变体衣壳编码多核苷酸序列而突变该多核苷酸；和将多种突变的衣壳编码多核苷酸连接到具有除了衣壳编码区域之外的病毒基因组序列的载体中，据此创建该病毒的突变体多核苷酸序列文库；(b)将突变体多核苷酸序列文库转染到允许细胞中，从而产生多种突变体病毒；(c)分离多种突变体病毒；(d)将分离的多种突变体病毒与非允许细胞孵育；(e)回收非允许细胞产生的突变体病毒，据此制造具有改变的趋向性的突变体病毒。另一方面，该方法还可以包括步骤：(f)在非允许细胞中孵育回收的突变体病毒，和(g)回收非允许细胞产生的突变体病毒。另一方面，该方法还包括反复重复步骤(f)和(g)。另一方面，该病毒突变体文库创建自下述亲本序列，所述亲本序列包含与的SEQ IDNO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、168或其连续部分的序列；另一方面，通过将核苷酸随机***到衣壳编码多核苷酸中进行突变。随机***衣壳编码多核苷酸的核苷酸的至少一部分编码表位标签。另一方面，通过TRIM进行核苷酸的随机***。在另一方面，多个不同的突变体衣壳编码多核苷酸序列含有10⁸或10⁹以上的不同的衣壳编码多核苷酸序列。该多个突变体多核苷酸序列文库可以来自例如心病毒或SVV样微小RNA病毒。

一方面，制造具有改变的细胞类型趋向性的突变体SVV包括：(a)创建SVV突变体的cDNA文库；(b)由该SVV突变体cDNA文库生成相应的SVV RNA；(c)将SVV RNA转染至允许细胞中，以生成多种SVV病毒突变体；(d)分离多种突变体SVV；(e)将分离的多种突变体SVV与非允许肿瘤细胞一起孵育；和(f)回收裂解地感染了非允许肿瘤细胞的突变体SVV，由此制备具有改变的趋向性的突变体SVV。另一方面，该方法还包括步骤：(g)将回收的突变体SVV与非允许细胞孵育；和(h)回收裂解性感染非允许肿瘤细胞的突变体SVV。另一方面，该方法进一步包括：反复重复步骤(g)和(h)。一方面，在多孔高通量平台中进行孵育，其中该平台在每个孔内含有不同的非允许细胞类型。另一方面，该方法还包括筛选该平台以鉴定含有杀死细胞的突变体病毒的孔。另一方面，通过分析每个孔的光吸收度进行筛选。一方面，该SVV突变体的cDNA文库含有多种突变体SVV衣壳多核苷酸序列。另一方面，该多种突变体SVV衣壳多核苷酸序列产生自核苷酸的随机突变。另一方面，随机***的核苷酸序列的至少一部分编码表位标签。另一方面，通过TRIM进行核苷酸的随机***。另一方面，SVV突变体的cDNA文库产生自ATCC保藏号为PTA-5343的SVV。另一方面，SVV突变体的cDNA文库产生自含有下述序列的SVV，所述序列与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、168，或上述序列的长度至少为50、100酸、200或500个核苷酸的连续部分的一致性至少为99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％或65％。一方面，SVV突变体的cDNA文库产生自含有下述序列的SVV，所述序列与SEQ ID NO：168或其长度至少为50、100酸、200或500个核苷酸的连续部分的一致性至少为95％、96％、97％、98％或99％。另一方面，非允许肿瘤细胞为肿瘤细胞系或从患者分离的肿瘤细胞类型(tumor cell-type)。

本发明还提供了在体内制造具有肿瘤细胞类型趋向性的突变体病毒的方法，该方法包括：(a)创建含有多种核酸序列的病毒突变体文库；(b)将该病毒突变体文库转染到允许细胞中，从而产生多种突变体病毒；(c)分离多种突变体病毒；(d)将分离的多种病毒突变体施用到患肿瘤的哺乳动物，其中，该哺乳动物并非未突变的突变体病毒的天然宿主；和(e)回收在肿瘤中复制的病毒，从而在体内制造具有肿瘤细胞类型趋向性的突变体病毒。一方面，创建病毒突变体文库的步骤包括：提供编码病毒衣壳蛋白区域的多核苷酸；为了生成多个不同的突变体衣壳编码多核苷酸序列，突变该多核苷酸；和将该多种突变的衣壳编码多核苷酸连接到含有除了衣壳编码多苷酸之外的病毒基因组序列的载体中，据此创建病毒突变体文库。另一方面，将步骤(e)回收的病毒裂解性地感染肿瘤细胞。在体内制造具有肿瘤细胞类型趋向性突变体病毒的方法的另一方面，肿瘤为异源移植物、同系基因型肿瘤、同系物肿瘤或转基因肿瘤。另一方面，哺乳动物为小鼠。

本发明中所有方法中，病毒可以为微小RNA病毒。该微小RNA病毒可以是心病毒、马鼻病毒、鹅口疮病毒、嵴病毒、肝病毒、副肠孤病毒、捷申病毒、肠道病毒、鼻病毒或SVV所属的属的病毒。该病毒可以为心病毒。该病毒可以是SVV样微小RNA病毒。该病毒可以是SVV。该SVV病毒可以是ATCC保藏号为PTA-5343的SVV，或者含有下述序列的SVV，所述序列与SEQ ID NO：1、3、6、7、9、11、13、15、17、19、21、168或这些序列的连续部分的一致性至少为65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。另外，心病毒可以选自vilyuisk人脑脊髓炎病毒、塞勒氏鼠脑脊髓炎病毒和脑心肌炎病毒。一方面，SVV样微小RNA病毒选自：MN 88-36695，NC 88-23626，IA 89-47552，NJ90-10324，IL 92-48963，CA 131395；LA 1278；IL 66289；IL 94-9356；MN/GA 99-29256；MN 99197和SC 363649。另一方面，本发明中所包含的任一病毒选自具有下述序列一致性的分离株：与ATCC保藏号为PTA-5343的SVV，或SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、168以及上述序列的连续部分，或其他被认为因序列同源性而与SVV相关的分离株的一致性至少为99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％或65％。

另一方面，本发明中所包含的任一病毒与ATCC保藏号为PTA-5343的SVV；SEQ ID NO：168；或SEQ ID NO：1,168的长度至少为100、200、300、400、500、750、1000、1500或2000个核苷酸的连续部分的序列一致性至少为65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

本发明还提供了通过此处所公开的任一种制造病毒突变体的方法制备的肿瘤细胞裂解性病毒。一方面，本发明提供了用肿瘤细胞裂解性病毒***患者的方法，该方法包括：(a)将通过此处所公开的任一种制造方法所制备的肿瘤细胞裂解性病毒灭活，使得肿瘤细胞裂解性病毒成为非感染性的和该肿瘤细胞裂解性病毒得趋向性失效；和(b)将经辐照的肿瘤细胞裂解性病毒给予受肿瘤折磨的患者。另一方面，该治疗患者的方法还包括将毒素连接到灭活的病毒上。

另一方面，本发明提供了用SVV***患者的方法，该方法包括：(a)将SVV病毒灭活，使得SVV成为非感染性的和该肿瘤细胞裂解性病毒得趋向性失效；和(b)将失活得SVV给予受肿瘤折磨的患者。另一方面，该***患者的方法还包括将毒素连接到灭活的SVV上。

另一方面，本发明所提供了含有灭活SVV或SVV减毒得SVV组合物。另一方面，本发明提供了含有***到衣壳区域得包含表位肽的SVV。

本发明还提供了用SVV***患者的方法，该方法包括：(a)创建突变体SVV，其在衣壳含有编码的表位标签；(b)将毒素连接到该表位标签上；(c)将该连接有毒素的突变体SVV给予受肿瘤折磨得患者。一方面，该创建包括：将编码表位标签的多核苷酸***到SVV的衣壳编码区域多核酸序列中。一方面，突变体SVV的细胞类型趋向性酶未被改变。另一方面，该方法还包括灭活突变体SVV，使其没有感染性或者不能复制。

本发明还提共了检测样品中的肿瘤细胞的方法，包括：(a)从患者分离肿瘤样品；(b)将肿瘤样品与表位标签了的SVV孵育；(c)通过检测表位标签筛选结合SVV的肿瘤细胞。

一方面，本发明还提供了在体内检测肿瘤细胞的方法，包括：(a)给予患者灭活的表位标签的SVV，其中，在表位标签上缀合标记；(b)检测患者的标记。在本发明的检测肿瘤细胞的方法种，该SVV可以是通过此处所公开的方法生成的突变体SVV。

一方面，本发明提供了检测样品中的肿瘤细胞的方法，包括：(a)从受试者分离细胞样品；(b)将细胞样品与SVV(或SVV样微小RNA病毒)孵育；(c)将步骤(b)中回收到的细胞与SVV特异性抗体(或SVV样微小RNA病毒特异性抗体)孵育；和(d)筛选结合抗体的细胞样品，其中，结合抗体指示该样品含有肿瘤细胞。

一方面，本发明提供了测定受试者是否适于接受SVV治疗的方法，包括：(a)从受试者分离细胞样品；(b)将细胞与SVV孵育；(c)步骤(b)的细胞与抗SVV的抗体孵育；(d)检测细胞上或细胞中抗SVV的抗体的存在，其中，阳性检测指示受试者适于接受SVV治疗。

筛选结合抗体的细胞样品或者检测抗SVV抗体的存在可以通过添加能够结合抗SVV抗体的恒定区或者非表位结合区域的第二抗体来进行。其中，第二抗体用可检测的标记物缀合或标记。该可检测的标记物可以是例如荧光发色团，例如荧光素。当第二抗体用可检测的标记物标记后，该可检测的标记物可以被检测，例如被荧光显微镜检测。来自受试者的细胞可以来自受试者的组织的活组织检查。组织的活组织检查可取自受试者的肿瘤或者怀疑含有肿瘤细胞的受试者的区域。直接用荧光发色团标记的SVV还可以用于肿瘤细胞的鉴定。

此外，将***病况的、检测肿瘤病况的和生产SVV的方法应用到野生型SVV病毒株、突变株(包括修饰的或突变体)SVV、SVV相关病毒、SVV样微小RNA病毒和其它本发明的肿瘤特异性病毒。

本发明的病毒和其组合物可被用于治疗此处所提及的疾病的药物。此外，本发明的病毒和其组合物可以被用于治疗此处所提及的疾病。因此，本发明的一方面提供了SVV(或者是突变体病毒、衍生病毒、相关病毒或其组合物)在肿瘤治疗中的用途，或者在制备用于制备用来治疗癌症的药物的用途。

用于基因治疗的SVV和SVV样病毒：表达目的基因的复制缺陷性SVV可用于递送基因以纠正基因疾病。SVV或SVV样病毒同样还可被用作siRNA的递送载体以阻止任意特异性基因的表达。复制缺陷性病毒可以在互补细胞系中和/或在为重组病毒提供其缺失的功能的辅助病毒的存在下生长。

已知微小RNA病毒的IRES在以组织特异性方式的基因表达中起到非常重要的作用。SVV的IRES元件和SVV样病毒可以用于替换其他微小RNA病毒的IRES元件。这一策略可被用于生成具有改变的肿瘤趋向性的病毒。一方面，本发明提供了SVV或来自SVV相关病毒的IRES元件，其目的是以组织特异性的方式表达一个启动子下的两个基因。

SVV的2A蛋白酶的自我切割的特性可以用于使用一个启动子和转录终止信号序列等量地表达一种以上的基因。一方面，本发明提供了具有自我切割功能的SVV或SVV相关病毒的2A肽，其目的是在一个启动子和一个poly(A)信号的调控下可以等量地表达两种或更多的蛋白。另一方面，本发明也提供了利用SVV或SVV相关病毒3C蛋白酶来切割多肽以进行真核细胞的蛋白质的生产。另一方面，本发明也提供了利用SVV或SVV样病毒的导肽来关闭肿瘤细胞或其它目的细胞中的蛋白质合成。

SVV的病毒样颗粒可被生产或者用作疫苗和在混合的细胞群体中鉴定特定的细胞类型。

保藏信息

下列材料均被保存于美国标准培养保藏中心(ATCC)，10801University Blvd.，Manassas，Virginia，20110-2209，U.S.A.，依照国际认可用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约进行。在该专利申请得到批准，所有关于得到该保存材料的限制性条款都将无条件的被撤销。相关材料包括：西尼加谷病毒(SVV，ATCC保藏号PTA-5343)。保藏日期：2003年7月25日。

附图简述

图1是用肿瘤细胞裂解性病毒进行病毒治疗的示意图。通过局部注射病毒或者***递送病毒的方式，将病毒输送至肿瘤块内，病毒具有选择性地在肿瘤组织内复制、播散并杀伤肿瘤细胞的特性。

图2显示的是纯化后得到的SVV用醋酸双氧铀(uranyl acetate)进行染色并用透射电镜检查。球形病毒颗粒的直径大小为约27nm。

图3显示的是SVV感染PER.C6细胞后的电镜图片。图中显示的是晶状体包涵体和大的泡囊体。

图4A是对SVV RNA的分析。用异硫氰酸胍和使用Trizol(购自Invitrogen公司，Carlsbad，CA)的酚提取方法提取SVV的基因组RNA。在1.25％的变性琼脂糖凝胶电泳中对RNA进行分析，用EB(EtBr)染色后可以看到并成像。在第2号泳道中可以观察SVV的基因组RNA的显著条带，指示全长SVV基因组的大小为约7.5kb左右。

图4B显示的是包括SVV在内的微小RNA病毒的基因组结构以及通过多聚蛋白加工生成的蛋白产物的示意图。

图5A-5E显示的是SVV的核酸序列(SEQ ID NO：1)及其编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。第5671-3位的终止密码子用“*”表示。一般而言，在公布的序列中如果某一精确位置的核苷酸尚不能被确定则表示为“n”。因此如果密码子中含有“n”，则相应的氨基酸则表述为“x”。

图6A-6D显示的是大多数SVV基因组全长的核酸序列(SEQ IDNO：1)。核酸序列源自TCC保藏号：PTA-5343，保存日期：2003年7月25日的SVV分离株。

图7A-7B显示的由SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图8显示的是SVV部分1B或VP2编码区的核酸序列(SEQ ID NO：3)。该序列与SEQ ID NO：1序列中第4-第429位核苷酸一致。

图9显示的是由SEQ ID NO：3编码的部分SVV的VP2蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。所列出的SEQ ID NO：4序列与SEQ ID NO：2序列中第2-第143位的氨基酸一致。

图10显示的是SVV的1C或VP3蛋白编码区的核酸序列(SEQ IDNO：5)。该序列与SEQ ID NO：1中第430位-1146位核酸一致。

图11显示的是由SEQ ID NO：5编码的SVV VP3蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。该序列与SEQ ID NO：2序列中第144位-第382位氨基酸的序列一致。

图12显示的是编码SVV的1D或VP1蛋白的核酸序列(SEQ IDNO：7)。该序列与SEQ ID NO：1中第1147位-第1923位的核酸序列一致。

图13显示的是由SEQ ID NO：7编码的SVV VP1蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。所列出的SEQ ID NO：8的序列与SEQ ID NO：2中第383位-第641位氨基酸的序列一致。

图14显示的是SVV2A蛋白编码区的核酸序列(SEQ ID NO：9)。该序列与SEQ ID NO：1中第1924位-第1965位的核酸序列一致。

图15显示的是由SEQ ID NO：9编码的SVV2A蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。所列出的SEQ ID NO：10的序列与SEQ ID NO：2中第642位-第655位氨基酸的序列一致。

图16显示的是SVV 2B蛋白编码区的核酸序列(SEQ ID NO：11)。该序列与SEQ ID NO：1中第1966位-第2349位的核酸序列一致。

图17显示的是由SEQ ID NO：11编码的SVV2B蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。所列出的SEQ ID NO：12的序列与SEQ ID NO：2中第656位-第783位氨基酸的序列一致。

图18显示的是SVV2C蛋白编码区的核酸序列(SEQ ID NO：13)。该序列与SEQ ID NO：1中第2350位-第3315位的核酸序列一致。

图19显示的是由SEQ ID NO：13编码的SVV 2C蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)。所列出的SEQ ID NO：14的序列与SEQ ID NO：2中第784位-第1105位氨基酸的序列一致。

图20显示的是SVV 3A蛋白编码区的核酸序列(SEQ ID NO：15)。该序列与SEQ ID NO：1中第3316位-第3585位的核酸序列一致。

图21显示的是由SEQ ID NO：15编码的SVV 3A蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)。所列出的SEQ ID NO：16的序列与SEQ ID NO：2中第1106位-第1195位氨基酸的序列一致。

图22显示的是SVV3B蛋白编码区的核酸序列(SEQ ID NO：17)。该序列与SEQ ID NO：1中第3586位-第3651位的核酸序列一致。

图23显示的是由SEQ ID NO：17编码的SVV3B蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：18)。所列出的SEQ ID NO：18的序列与SEQ ID NO：2中第1196位-第1217位氨基酸的序列一致。

图24显示的是SVV 3C蛋白编码区的核酸序列(SEQ ID NO：19)。该序列与SEQ ID NO：1中第3652位-第4284位的核酸序列一致。

图25显示的是由SEQ ID NO：19编码的SVV 3C蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)。所列出的SEQ ID NO：20的序列与SEQ ID NO：2中第1218位-第1428位氨基酸的序列一致。

图26显示的是编码SVV 3D蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：21)。该序列与SEQ ID NO：1中第4285位-第5673位的核酸序列一致。

图27显示的是由SEQ ID NO：21编码的SV V3D蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：22)。所列出的SEQ ID NO：22的序列与SEQ ID NO：2中第1429位-第1890位氨基酸的序列一致。

图28A-28H显示的是将SVV SEQ ID NO：2与不同的心病毒属成员进行氨基酸序列比对的结果。所述的心病毒成员例如脑心肌炎病毒(EMCV；脑心肌炎病毒类)、塞勒氏鼠脑心肌炎病毒(TMEV；Theilovirus种)、大鼠TMEV样病毒(TLV；Theilovirus种)和Vilyuisk人脑脊髓炎病毒(VHEV；Theilovirus种)。不同的心病毒的特征性序列如下：SEQ ID NO：23(EMCV-R)，24(EMCV-PV21)，25(EMCV-B)，26(EMCV-Da)，27(EMCV-Db)，28(EMCV-PV2)，29(EMCV-Mengo)，30(TMEV/DA)，31(TMEV/GDVII)，32(TMEV/BeAn8386)，33(TLV-NGS910)和34(VHEV/Siberia-55)。

图28中位置号码并未对应于所列序列的编号。“/”表示的是切割位点，多聚蛋白在该处发生切割后生成最终的功能性产物，例如比对1A(VP4)区域内的第1位和第157位；1B(VP2)区域内的第159位和第428位；1C(VP3)的第430位和第668位；1D(VP1)区域内的第670位和第967位；2A区域内的第969位和第1111位；2B所在区域内的第1112位和1276位；2C区域内的第1278位和1609位；3A区域内的第1611位和1700位；3B区域内的第1702位和1723位；3C区域内的第1725位和1946位；3D区域内的第1948位和2410位。比对还显示了可通过标准序列分析程序测定的病毒序列间的潜在保守性或相似性。使用BioEdit 5.0.9和Clustal W生成该比对。

图29列出了对应于SEQ ID NO：2的SVV的最终的多肽产物。用粗体加下划线所标出的某些保守性基序：2A/2B“切割”(NPGP，SEQ IDNO：111)、2C的ATP结合(GxxGxGKS/T(SEQ ID NO：112)和hyhyhyxxD)、3B(VPg)/RNA装配残基(Y)、3C(pro)激活位点残基(H、C、H)；3D(pol)基序(KDEL/IR(SEQ ID NO：113)、PSG，YGDD(SEQ ID NO：114)，FLKR(SEQ ID NO：115))。

图30列出的是微小RNA病毒种，其用于与SEQ ID NO：1和2进行序列分析以确定SVV和这些微小RNA病毒的种族关系(phylogeneticrelationship)(参见第I部分的实施例4)。

图31显示的分析SVV(SEQ ID NO：4)与其它微小RNA病毒在VP2序列方面的种族(phylogenetic relationship)关系。图显示了引导扩展的邻位交联树(Bootstraped-joining tree)(参见第I部分的实施例4)。

图32显示了SVV(SEQ ID NO：6)与其他微小RNA病毒间的VP3蛋白的引导扩展的邻位交联树(参见第I部分的实施例4)。

图33显示了SVV(SEQ ID NO：8)与其他微小RNA病毒间的VP1蛋白的引导扩展的邻位交联树(参见第I部分的实施例4)。。

图34显示了SVV(例如部分P1蛋白-SEQ ID NO：2中第2位至第641位氨基酸)与其他微小RNA病毒间的P1蛋白(例如1A、1B、1C和1D)的引导扩展的邻位交联树(参见第I部分的实施例4)。

图35显示了SVV(SEQ ID NO：14)与其他微小RNA病毒间的2C蛋白的引导扩展的邻位交联树(参见第I部分的实施例4)。

图36显示了SVV(SEQ ID NO：20)与其他微小RNA病毒间的3C(pro)蛋白的引导扩展的邻位交联树(参见第I部分的实施例4)。

图37显示了SVV(SEQ ID NO：22)与其他微小RNA病毒间的3D(po l)蛋白的引导扩展的邻位交联树(参见第I部分的实施例4)。

图38显示的是SVV(SEQ ID NO：4)与其他微小RNA病毒间的VP2蛋白的一致性氨基酸的实际百分比(参见第I部分的实施例4)。

图39显示的是SVV(SEQ ID NO：6)与其他微小RNA病毒间的VP3蛋白中一致性氨基酸的实际百分比(参见第I部分的实施例4)。

图40显示的是SVV(SEQ ID NO：8)与其他微小RNA病毒间的VP1蛋白的一致性氨基酸的实际百分比(参见第I部分的实施例4)。

图41显示的是SVV(部分衣壳或部分P1(SEQ ID NO：2中第2位至第641位氨基酸))与其他微小RNA病毒间的P1蛋白的一致性氨基酸的实际百分比(参见第I部分的实施例4)。

图42显示的是SVV(SEQ ID NO：14)与其他微小RNA病毒间的2C蛋白的一致性氨基酸的实际百分比(参见第I部分的实施例4)。

图43显示的是SVV(SEQ ID NO：20)与其他微小RNA病毒的3C蛋白的一致性氨基酸的实际百分比(参见第I部分的实施例4)。

图44显示的是SVV(SEQ ID NO：22)与其他微小RNA病毒的3D(pol)蛋白的一致性氨基酸的实际百分比(参见第I部分的实施例4)。

图45用SDS-PAGE电泳对SVV的VP2蛋白(约36kDa)、VP1蛋白(约31kDa)和VP3蛋白(约27kDa)进行分析。将纯化的SVV进行SDS-PAGE，并且用银染使蛋白可见。“MWt”泳道是分子量标记；“SVV”的泳道含有SVV的结构蛋白。还给出了三种分子量标记的大小和病毒的蛋白的名称。

图46A-46B显示的是***给药后血液和肿瘤组织中的SVV量(实施例7)。用SVV处理对荷有H446肿瘤的裸鼠，剂量为1×10¹²vp/kg，通过尾静脉注射。在注射后0、1、3、6、24、48、72小时和第七天给小鼠取血。从收集后的血液中立即分离出血浆并稀释至感染培养基中，随后用于感染PER.C6细胞。在注射后第6、24、48、72小时和第7天采集肿瘤，将肿瘤切成小块并重悬于1ml培养基内制成CVL。

图46C-46D显示的是SVV在体内清除的相关数据。图中显示，与静脉注射相似剂量的腺病毒相比，SVV展示出实质上更长的血中残留时间(实施例7)，因此SVV具有比腺病毒更低的体内清除率。单一剂量进行静脉注射(i.v.)，SVV在血中可以维持高达6小时(如图46C，图46C是46A的副本，目的是为了与46D进行比较)；而腺病毒在血中一小时内便被清除或消耗殆尽(图46D)。

图47显示的是H446异源移植物切片进行免疫组化和苏木精-伊红(H&E)染色(实施例7)。给荷有H446的裸鼠尾静脉注射Hank’s平衡盐溶液(HBSS)或SVV(剂量为1×10¹²vp/kg)，注射后第三天处死小鼠并收集肿瘤组织。通过采用免疫组化的方法，用SVV特异性的小鼠抗体显示肿瘤细胞中的病毒蛋白质(上图)。从HBSS或SVV处理的小鼠体内收集肿瘤细胞H446，用H&E染色观察细胞形态(下图)。

图48显示的是SVV对人原代肝细胞的细胞毒性(实施例9)。将人原代肝细胞接种于胶原包被的12孔板中，用SVV进行感染，剂量为1、10、100和1000个颗粒/孔(ppc)。感染后第三天分别检测细胞的乳酸脱氢酶(LDH)和培养上清中的LDH含量。细胞毒性以比例的形式表述，以培养上清中LDH单位量作为分子，而细胞内LDH与上清中的LDH的最大量之和作为分母。

图49显示的是SVV在选择的细胞系内的病毒产量。为了评价SVV的复制能力，用SVV按照1个病毒颗粒/孔(ppc)感染所选择的正常细胞和肿瘤细胞(实施例9)。72小时后，收集细胞并且分析CVL对PER.C6细胞的滴度。对于每种细胞系，SVV复制的效率用“每毫升的集落形成单位(pfu/ml)”表述。

图50显示的是按照体重的裸鼠和CD1小鼠的毒性作用(实施例10)。在给予病毒后的不同天时测量各处理组小鼠的平均体重。小鼠在第一天通过尾静脉注射单剂量的SVV或PBS。

图51显示的是对H446异源移植物模型的效果。在裸鼠中建立H446中流，并且将小鼠分组(n＝10)，并通过尾静脉注射HBSS或者6个不同剂量的SVV(实施例11)。在研究的第20天，HBSS组有5只荷有较大的肿瘤(平均肿瘤体积为2000mm³)的小鼠以1×10¹¹vp/kg注射(箭头所示)。数据表示为平均肿瘤体积+标准差(SD)。

图52显示的是接受SVV治疗或不接受治疗的具有H446异源移植肿物的裸鼠的照片(实施例11)。SVV非常强效，表现在彻底根除了100％预先建立的肿瘤。SVV处理的小鼠在注射后的至少200天内没有表现出现任何临床症状，也没有肿瘤复发。

图53显示的是SVV在体外的肿瘤特异性和疗效的相关数据(实施例11)。图表显示的是H446人小细胞肺癌(SCLC)肿瘤细胞(图表上方)和H460人正常细胞(图表下方)在与SVV孵育后的细胞存活率。SVV特异性地杀死肿瘤细胞，其EC₅₀大约为10^-3个病毒颗粒/孔。与此相对应的，SVV在任何浓度下都不能杀伤正常人细胞。

图54描绘的是含有SVV病毒完整基因组序列的质粒(实施例15)。在SVV序列上游地T7启动子的存在允许SVV序列在体外转录从而生成SVV RNA分子。

图55描绘的是构建SVV全长或功能性基因组SVV质粒和随后的SVV病毒的产物示意图(实施例16)。为了获得功能性基因组SVV克隆，可以将SVV的完整基因组克隆到带有T7启动子的载体中。实现这一点可以通过制备病毒的cDNA克隆并对其进行测序，随后将连续性片段克隆的到一个质粒中，得到的质粒命名为“pSVV”。带有SVV全长基因组的质粒可以随后通过反转录以生成SVV RNA。然后该SVV RNA被转染进允许的哺乳动物细胞中，并且随后可以回收SVV病毒颗粒并进行纯化。

图56描述的是构建含有SVV衣壳蛋白编码序列(例如编码1A-1D区域)的载体(pSVV-衣壳)的示意图(实施例16)。pSVV-衣壳载体可随后用于生成SVV衣壳突变体文库。

图57显示的是突变SVV衣壳从而生成SVV衣壳突变体文库的方法(实施例16)。该图表对寡核苷酸***质粒的随机位点进行了说明。寡聚核苷酸可以为随机寡聚核苷酸，已知序列的寡聚核苷酸，或编码表位标签的寡聚核苷酸。在图中，限制性酶CviJI随机切割pSVV衣壳DNA。从凝胶分离和纯化出在单一位点发生切割的已经线性化的pSVV衣壳DNA，将其与寡聚核苷酸连接。

图58显示的是生成含有衣壳蛋白编码区序列突变的SVV突变体文库的流程(实施例16)。例如通过限制性酶切和凝胶纯化从pSVV突变体文库(例如依照图57中所描述的流程)中分离得到衣壳蛋白的编码区。含有SVV全长序列的载体同样也进行酶切消化从而切出衣壳编码区。然后将来自pSVV突变体文库的衣壳编码区与缺失了它的野生型衣壳序列的pSVV载体进行连接，从而创建含有全长SVV突变体(命名为“pSVVFL”载体)文库，该文库在衣壳编码区含有多种突变。

图59介绍了生产制造含有衣壳突变体的SVV病毒颗粒的常规方法(实施例16)。将pSVVFL载体进行逆转录从而生成SVV RNA。将SVV RNA转染进允许细胞中，其中产生SVV突变体病毒颗粒。该病毒颗粒裂解细胞，然后分离含有多种衣壳变体(SVV衣壳文库)的SVV病毒颗粒群体。

图60显示的是筛选能够特异性感染肿瘤细胞而不感染非肿瘤细胞的SVV衣壳突变体的常规方法。将SVV衣壳文库与肿瘤细胞或感兴趣的组织进行孵育。在初次孵育过后，清洗细胞以清除那些未能进入细胞的SVV病毒颗粒。随后将细胞进行持续培养直到观察到病毒性裂解性。然后收集培养上清以分离能裂解性地感染肿瘤细胞的SVV衣壳突变体。在进行反向筛选(counter-screen)前，将这些病毒感染已知的允许细胞系使其生长。反向筛选的过程如下：将能感染肿瘤细胞的SVV衣壳突变体病毒与正常细胞孵育。回收培养上清中残留的不结合的病毒，由此回收具有肿瘤特异性的突变体SVV病毒。可以重复这一过程以进一步纯化分离的肿瘤特异性的SVV。

图61介绍了检测病毒突变体是否结合和/或感染细胞系的传统方法。传统的检测方法对生长细胞株而言显得效率不足，例如培养瓶培养的。这使得涉及多种不同的细胞株的病毒突变体文库的大量筛选变得繁琐。

图62显示了用于筛选具有特异性感染不同细胞系的能力的病毒突变体的本发明的高通量方法(实施例16)。在该图中，大量的不同的肿瘤细胞系生长在384孔板中。向每孔中加入病毒样本(例如SVV衣壳文库的样品)。从那些显示出细胞病理效应的孔中收集培养基，通过在培养瓶或大的组织培养皿中感染允许细胞系(例如对于SVV而言的H446或PER.C6)可以扩增任何在所述培养基中的病毒。病毒生长，从而可以分离RNA并进行测序分析，以确定通过衣壳的寡聚核苷酸***诱变法***的编码的多肽序列。随后可以对该肽本身进行检测以前额定它是否与肿瘤细胞类型特异性地结合。

图63显示的是另外一种高通量筛选方法的示意图(实施例16)。肿瘤细胞或正常细胞在多孔板中生长。将病毒加入到每个孔中来检测细胞是否能被病毒介导性裂解所杀伤。通过读取每个孔内地光吸收值可以对细胞病理效应进行迅速的分析。来自显示出细胞病理效应的孔的病毒生长起来，并且进一步在体外(肿瘤细胞和正常细胞的重新检测)和体内模型(检测病毒是否能够杀伤小鼠中的移植物)中进行检测。

图64显示了可以分析具有新的肿瘤特异性趋向性的SVV衣壳突变体(依据出现的顺序，分别为SEQ ID NO：45-48)，以生成肿瘤选择性肽。对具有特异性地感染肿瘤细胞系的能力的这些SVV衣壳突变体进行测序，从而确定***的多核苷酸编码的肽。从该成功的衣壳突变体可以确定一致性的氨基酸序列。随后对具有一致性序列的肽进行检测，以确定它们是否能够特异性地结合所关注地肿瘤细胞类型。可以随后将该肿瘤选择性肽段连接到毒素或药物上，以用作肿瘤特异性靶向载体。

图65对在体内首先检测SVV衣壳文库进行了介绍。给小鼠(包括正常小鼠、无胸腺小鼠、裸鼠、CD-1转基因鼠等)移植特定的肿瘤，随后给这些小鼠注射SVV衍生病毒文库，例如SVV衣壳文库。在某一时间点，从小鼠回收肿瘤细胞，在这些小鼠中表现为肿瘤被完全清除。从初始肿瘤样品中分离得到病毒颗粒，并在允许细胞株中进行培养。

图66显示了对本发明的SVV衍生病毒的临床检测流程。

图67对那些在衣壳中编码有表位标签的SVV病毒衍生病毒(具有新的肿瘤趋向性)的各种应用。它们可以作为筛选试剂，通过检测表位标签的存在，从而检查在组织样品中是否存在特定的肿瘤细胞。或者，将毒素或其他治疗药物与该表位相连，随后给予患者该病毒。进一步地，SVV野生型或其衍生病毒开被辐照或灭活，从而该病毒颗粒本身用作治疗装置(therapeutic device)。由于含有诱导凋亡的肽，病毒颗粒因此诱导细胞凋亡；或该颗粒可以连接毒素或某些其它治疗药物，从而将该病毒用作特异性向递送装置。

图68显示的是微小RNA病毒的基本生活周期。

图69比较SVV与其它微小RNA病毒的多肽长度。

图70列出了微小RNA病毒2A样NPG/P蛋白(依据出现的顺序，分别为SEQ ID NO：49-110)的氨基酸比较。该序列是所列出的SVV的SEQID NO：2中的第635位-第656位残基。

图71列出的为EMCV-R(SEQ ID NO：23)的氨基酸序列。

图72列出的为EMCV-PV21(SEQ ID NO：24，登记号CAA52361)的氨基酸序列。

图73列出的为EMCV-B(SEQ ID NO：25，登记号P17593)的氨基酸序列。

图74列出的为EMCV-Da(SEQ ID NO：24，登记号P17594)的氨基酸序列。

图75列出的为EMCV-Db(SEQ ID NO：27)的氨基酸序列。

图76列出的为EMCV-PV2(SEQ ID NO：28，登记号CAA60776)的氨基酸序列。

图77列出的为EMCV-mengo(SEQ ID NO：29，登记号AAA46547)的氨基酸序列。

图78列出的为TMEV/DA(SEQ ID NO：30，登记号AAA47928)的氨基酸序列。

图79列出的为TMEV/GDVII(SEQ ID NO：31，登记号AAA47929)的氨基酸序列。

图80列出的为TMEV/BeAn8386(SEQ ID NO：32，登记号AAA47930)的氨基酸序列。

图81列出的为TLV-NGS910(SEQ ID NO：33，登记号BAC58035)的氨基酸序列。

图82列出的为VHEV/Siberia-55(SEQ ID NO：34，登记号AAA47931)的氨基酸序列。

图83A-83H显示的是SVV全长基因组序列(SEQ ID NO：168)及其编码的多肽氨基酸序列(SEQ ID NO：169)。SVV全长基因组序列源自ATCC的SVV分离株(ATCC保藏号为PTA-5343)。SVV基因组序列的特定特征，例如此处描述了切割自多蛋白质序列的蛋白质的特定编码区域。

图84A-84D显示的是SVV全长基因组序列(SEQ ID NO：168)。该序列源自ATCC的SVV分离株(ATCC保藏号为PTA-5343)。

图85A-85B显示的是SVV全长多蛋白质的氨基酸序列(SEQ IDNO：169)，其由SEQ ID NO：168中第667至7209位核苷酸编码。

图86对源自SEQ ID NO：168和169的SVV全长基因组和多蛋白质序列进行种族关系或流行病学分析。SVV是一种独有的病毒，种族相近似于心病毒，但在分开的树上。由于SVV和SVV样微小RNA间的高水平的序列一致性，以及由于由SVV样微小RNA病毒产生的抗体具有与SVV病毒结合的能力(反之亦然)，SVV样微小RNA病毒因此最有可能与SVV位于相同的树或者属于相同的属(参见图87-89)。

图87A-87D显示了SVV病毒与某些SVV样微小RNA病毒在编码P1结构区域和2A的区域内的核酸序列比较。特别是，在VP2(部分)-VP3-VP1-2A(部分)进行比较。所列的SVV序列为SEQ ID NO：170；所列的分离的IA 89-47752的序列为SEQ ID NO：171；所列的分离的CA 131395的序列为SEQ ID NO：172；所列的分离的NC 88-23626的序列为SEQ ID NO：173；所列的分离的MN 88-36695的序列为SEQ IDNO：174；所列的分离的NJ90-10324的序列为SEQ ID NO：175；所列的分离的IL 92-48963的序列为SEQ ID NO：176；所列的分离的LA1278(97-1278)的序列为SEQ ID NO：177，而列出的一致性序列为SEQID NO：178。

图88将SVV同分离的IA 89-47752以及CA 131395在2C编码区(部分)进行核酸序列比较。所列的SVV序列为SEQ ID NO：179；所列的分离的IA 89-47752的序列为SEQ ID NO：180；所列的分离的CA131395的序列为SEQ ID NO：181；而列出的一致性序列为SEQ IDNO：182。

图89A-89B将SVV同分离的NC 88-23626、MN 88-36695、IA89-47752、NJ 90-10324、IL 92-48963、LA 97-1278和CA 131395在3D多聚酶编码区(部分)和3’UTR区域进行核酸序列比较。所列出的序列为：SVV序列(SEQ ID NO：183)、NC 88-23626(SEQ ID NO：184)、MN 88-36695(SEQ ID NO：185)、IA 89-47752(SEQ ID NO：186)、NJ90-10324(SEQ ID NO：187)、IL 92-48963(SEQ ID NO：188)、LA97-1278(SEQ ID NO：189)、CA 131395(SEQ ID NO：190)以及一致性序列(SEQ ID NO：191)。

图90A-90E单一剂量的SVV可以有效地降低在小鼠体内移植的肿瘤的大小并抑制其生长。图90A显示的是SVV可以降低移植的H446人SCLC肿瘤的大小并抑制其生长(ED₅₀＝0.0007)。图90B显示的是SVV可降低移植的Y79人视网膜母细胞瘤的大小并抑制其生长(ED₅₀＝0.0007)。图90C显示的是SVV可以降低移植的H69AR人SCLC-MDR(多药抗性)肿瘤的大小并抑制其生长(ED₅₀＝0.05)。图90D显示的是SVV能够降低移植的H1299人HSCLC肿瘤的大小并抑制其生长(ED₅₀＝4.8)。图90E显示的是SVV能够在A/J小鼠(免疫功能完善的正常小鼠)体内降低移植的NIE-115小鼠神经母细胞瘤的大小并抑制其生长(ED₅₀＝0.001)。

图91显示的是与SVV的序列进行比较的EMCV和TMEV衣壳结构的分子模型。分子模型结合算法用于抗原性预测，其用于选择适于产生多克隆抗体的多肽序列。图中棕色部分代表β片，绿色部分代表α螺旋，黄色代表的是用于生成多克隆抗体的长为12个氨基酸的肽。选择的特定序列(在VP2区域)是因为根据模型它表现出很好的表面暴露。

图92A-92D显示的是抗SVV多克隆抗体的特异性。92A为阴性对照，用SVV感染细胞后用非特异性的抗小鼠血清和第二抗体染色后显示的免疫荧光图片。92B和92C显示的是用SVV感染细胞后，用小鼠抗SVV血清(1:50稀释)和第二抗体(荧光素标记的抗小鼠Ig)进行染色后的免疫荧光成像。图92D显示可以用于进行病毒结合试验的多克隆抗SVV抗体。如图所示，因为之前将细胞置于冰上以阻止SVV病毒内化，所以免疫荧光显示SVV聚集在细胞轮廓周边。

图93显示的是GP102血清对SVV的中和实验结果(见实施例18)。中和滴度(可以将中和病毒的最大稀释计作100％)为1:100。

图94显示的是抗SVV抗血清对MN88-36695的中和试验(见实施例18)。中和滴度为1:560。

图95A和图95B所描绘的是邻位进化树。这些树是用PHYLIP(用于推断种族关系的种族推断压缩包电脑程序，Phylogeny InferencePackage Computer Programs for Inferring Phylogenies)构建而成。并且显示了SVV与7种SVV样微小RNA病毒在P1和部分2A区(图95A)以及基因组的3’末端(图95B)进行序列比较时得到的相互关系。

发明详述

术语“病毒”、“病毒颗粒”、“病毒粒子”、“病毒体”可以互换使用。

术语“病毒颗粒”和“病毒载体颗粒”可以互换使用，并能得到广泛的理解，例如指其形成了具有感染性的病毒颗粒。例如：本发明中的病毒载体转化或转染到合适的细胞或细胞系以产生感染性颗粒。

术语“衍生病毒”、“突变株”、“变体”和“修饰的”(modified)可以互换使用。衍生病毒、突变株、变体或修饰的可以具有与模版病毒核酸序列或氨基酸序列存在差异的核酸序列或氨基酸序列。例如SVV衍生病毒、突变株、变体或修饰过的SVV具有与与野生型SVV(ATCC保藏号为PTA-5343)存在差异的核酸序列或氨基酸序列。

此处所述的“SVV样微小RNA病毒”是指那些与SVV在核酸水平(参见SEQ ID NO：168，图84和图83中SVV全长基因组序列)的一致性至少为65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。序列比较不仅限于全基因组分析，也可以集中在基因组的特定区域，例如5’UTR、结构蛋白编码区域、非结构蛋白编码区域、3’UTR或它们的部分。对于本领域的技术人员而言，用于序列比较的特定长度的基因组序列足够确定与SVV的相关性/可能性。并且该足够的长度还与存在的一致性百分比密切相关。例如，序列比较时的序列长度可以是例如为20、50、100、200、300、400、500、750、1000、1500、2000或2500个核苷酸。如果序列较短，本领域的技术人员可以知道，例如两个序列之间的一致性很高，因此会认为二者具有相关性。然而，至少考虑到序列保守性时，这种教导是可以定量的，因为在基因组的特定区域比其他相关种属间更保守。此外，如果产生自病毒的抗血清能够中和SVV对SVV允许细胞的感染，并且该抗血清还能结合其他病毒(例如将该抗血清用于间接免疫荧光来检测病毒)，则可以人为被该抗血清结合的其他病毒为SVV样微小RNA病毒。依照本发明的目的，SVV病毒可以包括心病毒。SVV的允许细胞或细胞系包括但不局限于：Y79，NCI-H446，N1E-115，NCI-H1770，NCI-H82，PER.

NCI-H69AR，SK-NEP-1，IMR-32，NCI-H187，NCI-H209，HCC33，NCI-H1184，D283Med，SK-N-AS，BEK PCB3E1，ST，NCI-H1299，DMS153，NCI-H378，NCI-H295R，BEK，PPASMC，PCASMC，PAoSMC，NCI-H526，OVCAR-3，NCI-H207，ESK-4，SW-13，293，Hs 578T，HS 1.Tes和LOX IMVI。

当用于此处，术语“癌症”、“癌细胞”、“瘤细胞(neoplasticcells)”、“瘤(neoplasmia)”、“肿瘤”、“肿瘤细胞”可以互换使用，指的是展示相对的自我生长性的细胞，它们展示了异常生长的表型，其特征在于显著失去对细胞增殖的控制。肿瘤细胞及可以为恶性的也可以是良性的。依照本发明，优选的肿瘤细胞类型是具有神经趋向性(neurotropic)的特性的细胞。

文中的两条或更多条核酸序列或蛋白序列的“一致性”或“一致性”百分比，是指当采用序列比较算法例如Protein-ProteinBLAST(GenBank数据库中的蛋白质-蛋白质BLAST比较程序(Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.& Lipman，D.J.(1990)＂Basic local alignmenet search tool.＂J.Mol.Biol.215：403-410)))或者同目测检查。比较或比对最大的一致性时，两条或更多条序列(包括亚序列)相同或者具有特定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸，或运用目测检测技术进行分析。BLAST逻辑算法在Altschul等发表的文章中有详细的介绍(参见Altschul et al，J.Mol. Biol..215：403-410(1990))，BLAST软件在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的公共网页上可以获得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

例如，用于此处的术语“一致性至少为90％”是指与参考多肽序列(或多核苷酸)相比，一致性在90％到100％之间，实际上是指在90％以上。举一个恰当的例子，如果与一个长度为100个氨基酸的多肽进行比较，如果待测序列与参考序列中不一致的氨基酸数目不超过10％(即，100个里面有10个)，则表述为90％以上。相似的比较也可以在比较待测序列和参考多核苷酸之间进行。这些差异氨基酸既可以为点突变的形式随机分布在全长氨基酸序列的之中，也可以在高达最大允许程度例如100个氨基酸中有10个不同(90％的一致性)的可变长度的一个或多个位置聚簇。差异可以定义为核酸或氨基酸的取代、***或缺失。如果一致性水平在85-90％以上，结果独立于程序和间隙参数组，此类高水平的一致性可以通过读取进行评价，通常不依赖于软件。

概念“高严格度”、“中等严格度”和“低严格度”是指核酸的杂交条件。高严格度是指为了使靶和探针发生退火或杂交，需要靶核酸序列与探针核酸序列之间具有很高的一致性的条件；低严格度是指为了使靶和探针发生退火或杂交，需要靶核酸序列与探针核酸序列之间具有低的一致性的条件。杂交的严格程度可以通过缓冲液中的盐浓度或进行杂交的温度来进行控制。高盐浓度可以降低杂交的严格程度，而高温则可以提高杂交的严格程度。尽管严格度的变化取决于发生杂交区域内核苷酸序列的长度及其核酸组成，在下面示例性条件中描述了高度、中度或低度严格度的代表性条件。常用的杂交缓冲液为SSC(氯化钠-柠檬酸三钠)，通常配制成20×的贮液(0.3M柠檬酸三钠、3M氯化钠)。在高严格度杂交条件下，SSC的工作液浓度可以为0.1×-0.5×(1.5-7.5mM的柠檬酸三钠，15-75mM的NaCl)，杂交温度设定为65℃；中度杂交条件下，SSC的工作液浓度为0.5×-2×(7.5-30mM的柠檬酸三钠、75-300mM的氯化钠)，杂交温度设定为55-62℃；低度杂交条件下的SSC的工作浓度为2×-5×(30-75mM的柠檬酸三钠、300-750mM的氯化钠)，杂交温度设定为50-55℃。请注意，所提供的这些条件仅仅是例示性的，不要认为是局限。

西尼加谷病毒(SVV)：

SVV是一种在之前未被发现的新型RNA病毒。与先前发现的特征性微小RNA病毒相比，SVV与微小RNA病毒科中的心病毒更密切相关，(参见国际专利申请：PCT/US2004/031594)。在PCT/US2004/031594中讨论了SVV与其它心病毒间的序列分析的结果。在本文中将其整体引入文中作为参考文献。自从在PCT/US2004/031594中对SVV进行序列分析的时候起，微小RNA研究小组便对是否应将SVV应作为新成员列入微小RNA病毒科进行了讨论。图86显示了微小RNA病毒科内成员间的遗传关系树。

在对已知的微小RNA病毒(参见国际专利申请号：PCT/US2004/031504)进行最初的序列比较之后，可以得到两种种族(phylogenetic classification)分类：(1)将SVV作为新的属包括在心病毒属；或(2)指定SVV为一个新的属。在申请本专利期间，SVV已经被指定为心病毒属的新成员。但在进一步的分析后发现，SVV有几种与心病毒不同的特征。例如：某些心病毒基因组含有在5’UTR上延长的内部poly(C)尾(tract)，而SVV则不含有poly(C)。二者除了在5’段序列信息上有差异之外，也对SVV的内源性核糖体进入位点(IRES)进行了做图并与其它微小RNA病毒进行比较。从比较的结果中发现SVVIRES属于IV型，而心病毒的IRES为II型。心病毒具有长的2A蛋白酶(150个氨基酸)，而SVV具有短的2A蛋白酶(9个氨基酸)。SVV与心病毒之间在2A蛋白和其它蛋白(导肽，3A蛋白等)的大小上也存在很大差异。从对其他微小RNA病毒的研究中可以得知，这些蛋白参与了与宿主细胞相互作用的过程，包括趋向性和毒力。最后由于SVV的整体基因组序列中有若干区域与心病毒如此不同，因此认为SVV是一类新的微小RNA病毒。此外，在USDA发现了多株独特的微小RNA病毒，同SVV相对于其它微小RNA病毒相比，其与SVV更相似。因此，国际病毒分类委员会(ICVT)依照微小RNA病毒研究组的研究结果，认为SVV是新的一类微小RNA病毒，并命名为西尼加谷病毒。但截至到目前为止，尚没有为SVV或那些在USDA发现的独特的微小RNA病毒(在文中我们命名为SVV样的微小RNA病毒类)划分明确的病毒类属。

在USDA发现的许多SVV样微小RNA病毒与SVV在核酸水平上有95-98％的同源性(举例说明，参见图87-89)。针对一种病毒(MN88-36695)的抗血清能中和SVV，且该病毒也对其它能够中和SVV的血清起反应。SVV样微小RNA病毒来源于猪，因此猪很可能是SVV和其它SVV样微小RNA病毒的允许宿主。从猪中分离出的SVV样病毒包括以下几种从USDA分离的病毒株(但不局限于此)：MN88-36695，NC88-23626，LA 89-47552，NJ 90-10324，IL 92-48963，CA 131395；LA1278；IL 66289；IL 94-9356；MN/GA 99-29256；MN 99197；和SC363649。SVV样微小RNA病毒还包括与SVV很近的心病毒(通过序列分析的结果以及病毒与抗SVV抗原的抗体的交叉反应程度来确定)。因此在本发明中认为SVV具有以下特点：(1)与微小RNA病毒家族的心病毒属很近或者是属于心病毒的成员；(2)是微小RNA病毒家族中的新成员，该新成员中包括SVV以及未被分类成其它属的成员的SVV样微小RNA病毒。

同心病毒一样，依照病毒基因组的组成特点、常见的病原属性以及在pH值在5-7之间的0.1M NaCl溶液中可分离出病毒颗粒等特性(参见由R.G.Webseter和A.Granoff与1999年编著的《病毒学百科全书》(第二版)中“心病毒(微小RNA病毒)”这一章节(Scraba，D.等编写))，可以将SVV与其它微小RNA病毒区分开来。SVV的基因组由单链正义RNA组成，大小为7310个核苷酸，且含有一个长为30个核苷酸的poly(A)尾(参见图83A-83H，图84A-84D，SEQ ID NO：168)。因为SVV属于微小RNA病毒，它具有所有微小RNA病毒所具有的最保守的特征：(i)基因组RNA具有感染性，可以直接被用于转染进细胞内而跳过“病毒受体结合-进入病毒生命周期的步骤”；(ii)在基因组的5’端有较长的(600-1200bp)的非翻译区(UTR)(对于SVV而言，位于SEQIDNO：168的第1-666位)，和较短的3’非翻译区(长约50-100bp，对于SVV而言，位于SEQ ID NO：168的第7210-7280位)；(iii)5’UTR含有三叶草样的二级结构，已知其为内部核糖体进入位点(IRES)(例如，位于SEQ ID NO：168的第300-360位)。心病毒具有II型IRES，并且SVV具有IV型IRES；(iv)剩余的基因组序列编码单个多聚蛋白质(对SVV而言，SEQ ID NO：168的第667-7209位核苷酸编码多聚蛋白质(SEQ IDNO：169))；和(v)基因组两端均被修饰，5’端连接有一个小的碱性蛋白“Vpg”，而3’端被多腺苷酸化(对SVV而言，位于SEQ ID NO：168的第7281-7310位)。

本发明提供了分离的SVV病毒株(ATCC保藏号为PTA-5343)以及SVV完整基因组信息。首先对分离的SVV核酸中的大片段进行测序，结果如图5A-5E以及图6A-6D所示。该SVV核酸是从PTA-5343分离株(含有绝大部分SVV基因组序列)衍生而来，在此被称为SEQ ID NO：1。该核酸序列翻译的结果表明SVV的单个多聚蛋白质的大部分由SEQ IDNO：1所编码。由SEQ ID NO：1中第1位至第5673位核苷酸编码的多肽氨基酸序列均列在图5A-E以及图7A-7B中，在此命名为SEQ IDNO：2。自此获得了SVV全长基因组和看来差不多是全长基因组的序列，并且将其列于图83A-83H和SEQ ID NO：168中，核酸667-7209编码SVV的全长多聚蛋白质，并且该多聚蛋白质的氨基酸序列列在图83A-83H和SEQ ID NO：169中。

本发明提供了分离的(或纯化的)包括SEQ IDNO：3，5，7，9，11，13，15，17，19和21的SEQ ID NO：1的部分；以及分离的SEQ ID NO：168的一部分，包括：5’UTR区域(1-666)、导肽的编码区域(667-903)、VP4蛋白的编码区域(904-1116)、VP2蛋白的编码区域(1117-1968)、VP3蛋白的编码区域(1969-2685)、VP1蛋白的编码区域(2686-3474)、2A蛋白的编码区域(3478-3504)、2B蛋白的区域(3505-3888)、2C蛋白的编码区域(3889-4854)、编码3A蛋白的编码区域(4855-5124)、3B蛋白的编码区域(5125-5190)、编码3C蛋白的区域(5191-5823)、3D蛋白的编码区域(5824-7209)以及编码包含poly(A)尾在内的3’UTR的区域(7210-7310)。本发明还提供了上述特异性部分的部分的分离的核酸。本发明还提供了这样的分离的部分的突变病毒或衍生病毒。SEQ ID NO：1和168的分离的部分可被亚克隆到表达载体中，从而分离这些部分编码的多聚蛋白质。此外，本发明还提供了在高度、中度和低度杂交严格度条件下可与SEQ ID NO：1或168以及其任何部分相杂交的核酸序列。下表列出了编码SVV蛋白的编码SEQ ID NO：168的核酸。本发明提供了分离(或纯化)的SVV蛋白或其部分。表中还列出了对应于在SEQ ID NO：169中列出的多聚蛋白质序列的SVV蛋白的氨基酸序列。

表A：SVV基因组及蛋白质特征

SVV特征	SEQ ID NO：168中的定位	SEQ ID NO：169中的定位
SVV特征	SEQ ID NO：168中的定位	SEQ ID NO：169中的定位	5′UTR	1-666	N/A(无)
导肽	667-903(导肽编码序列)	1-79	5′UTR	1-666	N/A(无)
导肽	667-903(导肽编码序列)	1-79	VP4	904-1116(VP4编码序列)	80-150
VP2	1117-1968(VP2编码序列)	151-434	VP4	904-1116(VP4编码序列)	80-150
VP2	1117-1968(VP2编码序列)	151-434	VP3	1969-2685(VP3编码序列)	435-672
VP1	2686-3474或3477(VP1编码序列)	674-936或937	VP3	1969-2685(VP3编码序列)	435-672
VP1	2686-3474或3477(VP1编码序列)	674-936或937	2A	3478-3504(2A编码序列)	938-946
2B	3505-3888(2B编码序列)	947-1074	2A	3478-3504(2A编码序列)	938-946
2B	3505-3888(2B编码序列)	947-1074	2C	3889-4854(2C编码序列)	1075-1396
3A	4855-5124(3A编码序列)	1397-1486	2C	3889-4854(2C编码序列)	1075-1396
3A	4855-5124(3A编码序列)	1397-1486	3B	5125-5190(3B编码序列)	1487-1508

3C	5191-5823(3C编码序列)	1509-1719
3C	5191-5823(3C编码序列)	1509-1719	3D	5824-7209(3D编码序列)	1720-2181
3′UTR	7210-7310	N/A	3D	5824-7209(3D编码序列)	1720-2181

本发明提供了分离的SVV导肽序列肽(其具有SEQ ID NO：169中第1-第79位残基的氨基酸序列)，其由SEQ ID NO：168的第667-903位核苷酸编码。

本发明提供了分离的SVV VP4蛋白(1A)(其具有SEQ ID NO：169中第80-第150位残基的氨基酸)，该段序列由SEQ ID NO：168中第904-1116位核苷酸编码。

本发明提供了分离的SVV VP2蛋白(1B)(其具有SEQ ID NO：169中第151-第434位残基的氨基酸)，该段序列由SEQ ID NO：168中第1117-1968位核苷酸编码。本发明还提供了分离的SVV VP2蛋白(1B)(其具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列)，并列在图9中(与SEQ IDNO：2中第2位-第143位氨基酸残基对应)。部分SVV VP2蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO：3编码，列在图8中(与SEQ ID NO：1中第4-429位核苷酸对应)。

本发明提供了分离的SVV VP3蛋白(1C)(其具有SEQ ID NO：169中第435-第673位残基的氨基酸序列)，该段序列由SEQ ID NO：168中第1969-2685位核苷酸编码。本发明还提供了分离的SVV VP3(1C)蛋白(具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列)，并列在图11中(与SEQ ID NO：2中第144位-第382位氨基酸残基对应)。SVV VP3蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO：5编码，列在图10中(与SEQ ID NO：1中第430-1146位核苷酸对应)。

本发明提供了分离的SVV VP1蛋白(1D)(其具有SEQ ID NO：169中第674-第937位残基的氨基酸序列)，该段序列由SEQ ID NO：168中第2686-3477位核苷酸编码。本发明还提供了分离的具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的SVV VP1蛋白(1D)，并列在图13中(与SEQ ID NO：2中第383位-第641位氨基酸残基对应)。SVV2A蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO：9编码，列在图12中(与SEQ ID NO：1中第1147-1923位核苷酸对应)。

本发明提供了分离的SVV2A蛋白(其具有SEQ ID NO：169中第938-第946位残基的氨基酸序列)，该段序列由SEQ ID NO：168中第3478-3504位核苷酸编码。本发明还提供了分离的SVV 2A蛋白(其具有SEQ ID NO：10位残基的氨基酸序列)，并列在图15中(与SEQ ID NO：2中第642位-第655位氨基酸残基对应)。SVV VP1蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO：7编码，列在图14中(与SEQ ID NO：1中第1924-1965位核苷酸对应)。

本发明提供了分离的SVV 2B蛋白(其具有SEQ ID NO：169中第947-第1074位残基的氨基酸序列)，该段序列由SEQ ID NO：168中第3505-3888位核苷酸编码。本发明还提供了分离的SVV 2B蛋白(与SEQID NO：12中相对应)，并列在图17中(与SEQ ID NO：2中第656位-第783位氨基酸残基对应)。SVV 2B蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO：11编码，列在图16中(与SEQ ID NO：1中第1966-2349位核苷酸对应)。

本发明提供了分离的SVV 2C蛋白(其具有SEQ ID NO：169中第1075-第1396位残基的氨基酸序列)，该段序列由SEQ ID NO：168中第3889-4854位核苷酸编码。本发明还提供了分离的SVV2C蛋白(其具有SEQ ID NO：14位残基的氨基酸序列)，并列在图19中(与SEQ ID NO：2中第784位-第1105位氨基酸残基对应)。SVV 2B蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO：13编码，列在图18中(与SEQ ID NO：1中第2350-3315位核苷酸对应)。

本发明提供了分离的SVV 3A蛋白(其具有SEQ ID NO：169中第1397-第1486位残基的氨基酸序列)，该段序列由SEQ ID NO：168中第4855-5124位核苷酸编码。本发明还提供了分离的SVV3A蛋白(其具有SEQ ID NO：16位残基的氨基酸序列)，并列在图21中(与SEQ ID NO：2中第1106位-第1195位氨基酸残基对应)。SVV 3A蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO：15编码，列在图20中(与SEQ ID NO：1中第3316-3585位核苷酸对应)。

本发明提供了分离的SVV 3B(VPg)蛋白(其具有SEQ ID NO：169中第1487-第1508位残基的氨基酸序列)，该段序列由SEQ ID NO：168中第5125-5190位核苷酸编码。本发明还提供了分离的SVV 3B蛋白(其具有SEQ ID NO：18位残基的氨基酸序列)，并列在图23中(与SEQ IDNO：2中第1196位-第1217位氨基酸对应)。SVV3B蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO：17编码，列在图22中(与SEQ ID NO：1中第3586-3651位核苷酸对应)。

本发明提供了分离的SVV3C(pro或蛋白酶)蛋白(与SEQ IDNO：169中第1509-第1719位氨基酸残基对应)，该段序列由SEQ IDNO：168中第5191-5823位核苷酸编码。本发明还提供了分离的SVV3C蛋白(与SEQ ID NO：20中相对应)，并列在图25中(与SEQ ID NO：2中第1218位-第1428位氨基酸残基对应)。SVV 3C蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO：19编码，列在图24中(与SEQ ID NO：1中第3652-4284位核苷酸对应)。

本发明提供了分离的SVV 3D(pol或聚合酶)蛋白(其具有SEQ IDNO：169的第1720-第2181位氨基酸残基)，该段序列由SEQ ID NO：168中第5824-7209位核苷酸编码。本发明还提供了分离的SVV 3D蛋白(其具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列)，并列在图27中(与SEQ ID NO：2中第1429位-第1890位氨基酸残基对应)。SVV 3C蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO：19编码，列在图24中(与SEQ ID NO：1中第4285-5673位核苷酸对应，核苷酸5671-5673为终止密码子“tga”，在氨基酸序列列表中表示为星号“*”)。

本发明所提供的核酸包括RNA和DNA这两种形式，以及默认的列表中所提供的列表中的序列的互补序列。

因此，分离的SVV核苷酸编号为SEQ ID NO：168(长度为7310个核苷酸)，而其编码的多聚蛋白质具有SEQ ID NO：169所示的氨基酸序列。分离的SVV核酸序列由长度为5752个核苷酸的SEQ ID NO：1所表示，其编码具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多聚蛋白质。SVV基因组序列被翻译成单个多蛋白质，其被剪切成各种下游“转录产物”。本发明含有SEQ ID NO：168和SEQ ID NO：1的所有片段的核酸序列，以及所有由这些片段编码的多肽。

SVV多聚蛋白质的全长氨基酸序列由SEQ ID NO：169表示，并且其编码SEQ ID NO：168的第667-7209位核苷酸。这段全长SVV多聚蛋白质氨基酸序列的大部分由SEQ ID NO：1中第1-5673位核苷酸编码。多聚蛋白质被剪切成三个蛋白前体，分别为P1、P2和P3(参见图4B)。P1、P2和P3进一步被切割成更小的蛋白产物，P1(1ABCD或衣壳区域)的结构区域的剪切产物为1ABC、VP0、VP4、VP2、VP3和VP1。非结构蛋白P2(2ABC)的剪切产物为2A、2BC、2B和2C。非结构区域P3蛋白(3ABCD)的剪切产物为3AB、3CD、3A、3C、3D、3C’和3D’。

在某些实施方案中，本发明中所提供了分离的核酸，其包括：(i)1ABCD或衣壳区域的编码序列(SEQ ID NO：168中第904位-第3477位核苷酸)；(ii)1ABC的编码序列(SEQ ID NO：168中第904-第2685位核苷酸)；(iii)VP0的编码序列(SEQ ID NO：168中第904-1968位核苷酸)；(iv)2ABC的编码序列(SEQ ID NO：168中第3478-4854位核苷酸；SEQ ID NO：1中第1924-3315位核苷酸)；(v)2BC的编码序列(SEQID NO：168中第3505-4854位核苷酸或SEQ ID NO：1种第1966-3315位核苷酸)；(iii)3ABCD的编码序列(SEQ ID NO：168中第4855-7209位核苷酸或SEQ ID NO：1的第3316-第5673位核苷酸)；(iv)3AB的编码序列(SEQ ID NO：168中第4855-5190位核苷酸或SEQ ID NO：1中第3316-3651位核苷酸)；和(v)3CD的编码序列(SEQ ID NO：168中第5191-7209位核苷酸或SEQ ID NO：1中第3652-5673位核苷酸)。本发明还提供了由上述序列编码的蛋白或多肽，以及相应的片段。

微小RNA病毒的基础衣壳结构由60个原体(protomer)相互紧密排列组成20面体，每个原体由4种多肽VP1、VP2、VP3和VP4组成。这四种多肽均由最初的原体VP0剪切而来。SVV病毒颗粒的直径为大约27nm(参见图2)，大小上与其它微小RNA病毒一致(后者直径为约27-30nm)。

微小RNA病毒的复制动力学很快，完成一个周期大约5-10小时(典型的约为8小时)(参见图68微小RNA病毒的复制周期示意图)。当与受体结合后，基因组RNA便从颗粒中释放进入到胞浆内。基因组RNA随后由多聚体直接翻译，不过要在感染后的30分钟内，细胞内蛋白合成骤然降低，几乎降为0。这一现象被称为“关闭”，也是细胞病理作用(cpe)的主要原因。翻译关闭的出现是由宿主细胞的220kDa的帽结合复合物(CBC)的切割引起的。CBC涉及在所有真核mRNA的翻译起始阶段向5’端的m7G帽结构的结合。CBC的切割看来是由2A蛋白酶所引起的。

病毒的5’UTR内含有IRES。通常，当真核翻译起始时，核糖体结合于5’端甲基化的帽子，然后沿着mRNA扫描以发现第一个AUG起始密码子。而IRES突破了这一过程，它可以允许微小RNA病毒的RNA在CBC发生降解后继续转录。在一个实施方案中，本发明提供了含有SVVIRES的分离的核酸，其中，IRES包含在5’UTR内。在一个实施方案中，SVV IRES也可来自SEQ ID NO：168的第300-366位核苷酸。SVV的5’UTR位于SEQ ID NO：168的第1-第666位核苷酸处。

病毒的多聚蛋白质最初被2A蛋白酶切割成多聚蛋白质P1、P2和P3(参见图4B)。进一步的剪切事件由3C(是微小RNA病毒的主要蛋白酶)蛋白进行。3C蛋白的剪切产物之一为病毒RNA依赖的RNA聚合酶(3D)，它拷贝基因组RNA以产生反义链。反义链为正义链(基因组)RNA合成的模版。部分正义链被翻译出额外的病毒蛋白产物，其将某些正义链包装进衣壳中形成新的病毒颗粒。

尽管基因组和衣壳蛋白之间的分子作用机制尚不清楚，但是认为正义链RNA基因组被包装到预加工的衣壳蛋白中。在所有的微小RNA病毒的感染中，空衣壳的情况很常见。将P1多聚蛋白前体剪切成由VP0、VP3和VP1组成的原体，在由这些原体组装成衣壳，它们连结合一起包装基因组。使病毒颗粒成熟并具有感染性依赖于病毒内部自体催化VP0为VP2和VP4的剪切。当细胞裂解时，新形成的病毒颗粒便被释放出来。

本发明还提供了具有与ATCC专利保藏号为PTA-5343的病毒完全一致的特征和核酸序列的分离株。本发明的病毒可以指向PTA-5343分离株、变异株、同源株、衍生株或突变株，以及其他微小RNA病毒，所述的其他微小RNA病毒是对确定为负责SVV(野生株或此处所述的突变株)的肿瘤细胞裂解性特的SVV序列进行了修饰的病毒。

本发明还提供了特异性抗体，所述抗体抗：SVV(ATCC专利保藏号为PTA-5343)以及分离的下述SVV蛋白质的抗原表位。所述的分离的SV蛋白质具有SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22和169(包括完整的多聚蛋白质：VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D及其部分，参见前述表A构成这些蛋白质的SEQ ID NO：169的氨基酸序列)的氨基酸序列。本发明还提供了特异性抗由SEQ ID NO：1或168的片段或部分所编码的蛋白质的表位。

各种心病毒分离株的RNA序列的比较分析表明在基因组之间具有大于45％的核苷酸一致性。心病毒又可以亚分类为EMC样病毒(EMCV-例如Mengo，B，R；和MM，ME，Columbia-SK)，赛勒氏样病毒(“TMEV”，例如BeAn，DA和GD VII株)和Vilyuisk病毒。

将SVV序列同其他病毒进行分析，发现SVV是一种心病毒(实施例4和此处参照的图)。如果将EMCV和TMEV作为标准的心病毒，那么SVV显然不是典型的心病毒。尽管如此，EMCV和TMEV之间也存在一些差异，尤以5’UTR的差异最为明显(Pevear et al.，1987，J.Virol.，61：1507-1516)。在对SVV与EMCV和TMEV聚类以及进行如此多的它们的多聚蛋白质(P1，2C，3C^pro和3D^pol区；参见图31-37)的种族性分析时，发现SVV与非常可能是心病毒。

SVV在种族上与心病毒很相似，不过已经被确定它在分开的树上(参见图86)。SVV可能在分开的属中，因为：(1)SVV的IRES是IV型(而心病毒的IRES为II型)；(2)多种独特病毒(SVV样微小RNA病毒)同其它微小RNA病毒相比，与SVV更相似(参见实施例18和图87-89)。那些能中和SVV对允许细胞株的感染的抗体或者抗SVV的抗体能够结合SVV样微小RNA病毒的SVV的抗体。因此SVV样微小RNA病毒可以用于本发明的任何方法，包括癌症治疗，其中，已经确定SVV样微小RNA病毒是天然肿瘤细胞裂解性的或制造成具有肿瘤细胞裂解性(例如根据SVV序列通过设计在SVV样微小RNA病毒基因组的突变)。在一个实施方案中，将MN 88-36696用于本发明的方法用来治疗癌症。

治疗癌症的方法

本发明参照SVV的癌细胞裂解性特性，采用修饰的病毒进行癌症治疗。这些病毒包括微小RNA病毒(包括SVV样微小RNA病毒)、衍生病毒、变异病毒、突变病毒或同源病毒。本发明显示野生型SVV(ATCC保藏号为PTA-5343)具有选择性杀伤某类肿瘤细胞的能力。例如SVV可以选择性的杀伤那些神经源性(neurotropic)或具有神经内分泌功能(neuroendocrine)的肿瘤细胞，包括小细胞肺癌细胞(SCLC)或神经母细胞瘤。其他可用本发明的病毒进行治疗的肿瘤细胞包括以下几种(但不局限于此)：肾上腺嗜铬细胞瘤、胃泌素瘤(引起Zollinger-Ellison综合征)、胰高血糖素瘤、胰岛素瘤、髓样癌(包括甲状腺髓样癌)、多发性内分泌瘤综合征、胰腺内分泌肿瘤、副神经节瘤、VIPomas(血管活性肠肽肿瘤)、胰岛细胞肿瘤和嗜铬细胞瘤。

一个实施方案中，本发明提供了通过向对象给予SVV或SVV样微小RNA病毒来治疗或减少神经内分泌瘤的方法。而神经内分泌肿瘤或表达(或过表达)一种或多种神经内分泌肿瘤标志，包括但不局限于：NTR(神经降压素受体)、ATOH(GL11、Myc、GRP受体、GRP、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、癌胚抗原(CEA)、嗜铬素A、NCAM、IgF2、BCL-2、音猬因子(sonic hedgehog)信号通路和趋化因子受体。

本发明中还包括四种类型的神经内分泌性肺肿瘤。最严重的一型为小细胞肺癌(SCLC)，在所有癌细胞中生长速度和扩散速度最快。大的细胞神经内分泌瘤十分罕见，除了形成肿瘤的细胞的大小与SCLC不同外，其它方面(例如预后和治疗方法等)均与SCLC类似。类癌(Carcinoid tumors)，作为类癌已知包括另外两种类型的肺神经内分泌性癌，这两种类型为典型类癌和非典型类癌。

不受理论的局限，SVV特异性杀伤肿瘤细胞的能力包括但不局限于：选择性的复制、关闭细胞蛋白质合成、凋亡、通过肿瘤选择性细胞进入而引起裂解、肿瘤选择性翻译、肿瘤选择性蛋白裂解、肿瘤选择性RNA复制以及他们的组合。

同其他肿瘤细胞裂解性病毒(包括修饰的腺病毒)相比，SVV具有以下优良的特征：(i)SVV针对具有神经性特性的癌症具有高度选择性，所述癌症包括：SCLC、维尔姆氏肿瘤、视网膜母细胞瘤和神经母细胞瘤-例如SVV对神经内分泌肿瘤的选择性要高达10000倍；(ii)同化疗资料相比，SVV的细胞杀伤特异性要超过1000倍；(iii)在对小鼠***性给予SVV(剂量为10¹⁴病毒颗粒/千克)进行治疗时，未发现任何毒副作用；(iv)SVV的效果非常强大，表现在能100％地根除在小鼠上预先建立的大的肿瘤，且无肿瘤生长的复发；(v)SVV可通过纯化至高滴度，并且在允许细胞株中，可以达到每个细胞产生的颗粒数超过200000个；(vi)SVV很小(SVV病毒颗粒的直径不超过30nm)，因此与其它肿瘤细胞裂解性病毒相比，能更好地渗透和传播；(vii)SVV复制迅速(少于12小时)；和(viii)未经任何修饰的SVV适于作为特异性抗肿瘤药物。

此外，最初的研究(参见实施例6)表明存在某些附加因素，其使得SVV成为用于肿瘤细胞裂解性病毒治疗的良好工具：(i)人血清内不含有抗SVV的中和抗体；(ii)SVV不被补体所抑制；和(iii)SVV不会引起人红细胞发生血凝集。所有这些作用于SVV的因素使其较其肿瘤细胞裂解性病毒而言，展示更长的体内循环时间(实施例7)。

本发明提供了在细胞群中选择性杀伤新生细胞(neoplasticcell)的方法。该方法包括：将有效剂量的SVV与所述细胞群在一定条件下相互接触，在该条件下病毒可以转导进入到细胞群体的新生细胞中，复制并杀伤新生细胞。除了SVV在体内杀伤肿瘤细胞的方法外，，本发明的方法包括这样的实施方案，其中的肿瘤细胞可以为(1)用SVV感染后在体外进行培养；(2)在非肿瘤细胞的存在下培养；(3)细胞(肿瘤细胞和非肿瘤细胞)为其中包括人的细胞的哺乳动物的细胞。在体外对细胞进行培养并用SVV感染可以有多种用途。例如体外感染可被用作生产大量SVV病毒的方法，作为测定或检测在细胞群中是否存在肿瘤细胞的方法，或者作为筛选突变体SVV是否能够特异性的靶向和杀伤不同的肿瘤细胞或组织类型。

本发明还提供了体外治疗癌症的方法，其中，从人癌症患者分离出癌症细胞，在体外培养，用选择性杀伤肿瘤细胞的SVV感染，并且将非肿瘤细胞回输至病人体内。另外，作为向患者给予SVV的方法，将从患者体内分离出的肿瘤细胞用SVV进行感染，随后立刻回输之病人体内。一个实施方案中，肿瘤细胞起源于造血细胞。或者，将体外培养的正常细胞回输之前接受治疗(如放疗或化疗)将患者体内的肿瘤细胞全部摧毁。在一个实施方案中，该治疗方法也可以用于摧毁患者的骨髓细胞。

多聚物包被的SVV可被用于将SVV靶向到任何一种特定类型的细胞。这种包被策略也可以用来克服针对SVV的抗体。

SVV具有潜在的抗肿瘤活性，其抗具有神经性特征的肿瘤细胞类型。SVV对检测的正常人细胞没有展示细胞裂解活性。SVV还对人原代肝脏细胞也不具有细胞裂解性。下面的表1总结了初始研究，所述研究是已经进行了的为了确定体外SVV对选择的肿瘤细胞类型的细胞裂解性作用。

表1：SVV对选择的肿瘤细胞类型的细胞裂解性作用

细胞系	细胞类型	EC₅₀(病毒颗粒/细胞)
细胞系	细胞类型	EC₅₀(病毒颗粒/细胞)	H446	人SCLC	0.0012
PER.C6	人胚胎视神经母细胞瘤	0.02	H446	人SCLC	0.0012
PER.C6	人胚胎视神经母细胞瘤	0.02	H69AR	SCLC-多药抗性	0.035
293	经AD5DNA转化的人	0.036	H69AR	SCLC-多药抗性	0.035
293	经AD5DNA转化的人	0.036	Y79	人视神经母细胞瘤	0.00035
IMR32	人大脑神经母细胞瘤	0.035	Y79	人视神经母细胞瘤	0.00035
IMR32	人大脑神经母细胞瘤	0.035	D283	人脑小脑髓母细胞瘤	0.25
SK-N-AS	人大脑神经母细胞瘤	0.474	D283	人脑小脑髓母细胞瘤	0.25
SK-N-AS	人大脑神经母细胞瘤	0.474	N1E-115	小鼠神经母细胞瘤	0.0028
BEKPCB3E1	经Ad5E1转化的牛胚肾细胞	0.99	N1E-115	小鼠神经母细胞瘤	0.0028
BEKPCB3E1	经Ad5E1转化的牛胚肾细胞	0.99	H1299	人非SCLC	7.66
ST	猪睾丸细胞	5.9	H1299	人非SCLC	7.66
ST	猪睾丸细胞	5.9	DMS153	人SCLC	9.2
BEK	牛胚肾细胞	17.55	DMS153	人SCLC	9.2
BEK	牛胚肾细胞	17.55	M059K	人脑恶性神经胶质瘤	1,061
PK15	猪肾细胞	1,144	M059K	人脑恶性神经胶质瘤	1,061
PK15	猪肾细胞	1,144	FBRC	肽牛视网膜细胞	10,170

HCN-1A	人脑细胞	23,708
HCN-1A	人脑细胞	23,708	H460	人LCLC	>30000(灭活的)
Neuro 2A	小鼠神经母细胞瘤	>30000(灭活的)	H460	人LCLC	>30000(灭活的)
Neuro 2A	小鼠神经母细胞瘤	>30000(灭活的)	DMS79	人SCLC	>30000(灭活的)
H69	人SCLC	>30000(灭活的)	DMS79	人SCLC	>30000(灭活的)
H69	人SCLC	>30000(灭活的)	C8D30	小鼠脑细胞	>30000(灭活的)
MRC-5	人胎肺成纤维细胞	>30000(灭活的)	C8D30	小鼠脑细胞	>30000(灭活的)
MRC-5	人胎肺成纤维细胞	>30000(灭活的)	HMVEC	新生血管内皮细胞	>30000(灭活的)
HMVEC	成年血管内皮细胞	>30000(灭活的)	HMVEC	新生血管内皮细胞	>30000(灭活的)
HMVEC	成年血管内皮细胞	>30000(灭活的)	A375-S2	人恶性黑色素瘤细胞	>30000(灭活的)
SK-MEL-28	恶性黑色素瘤细胞	>30000(灭活的)	A375-S2	人恶性黑色素瘤细胞	>30000(灭活的)
SK-MEL-28	恶性黑色素瘤细胞	>30000(灭活的)	PC3	人***细胞	>30000(灭活的)
PC3M2AC6	人***细胞	>30000(灭活的)	PC3	人***细胞	>30000(灭活的)
PC3M2AC6	人***细胞	>30000(灭活的)	LnCap	人***细胞	>30000(灭活的)
DU145	人***细胞	>30000(灭活的)	LnCap	人***细胞	>30000(灭活的)

下方的表1-A列出的是SVV感染的允许细胞系和非允许细胞系。表显示的是SVV的细胞裂解性能力和选择性。

表1-A SVV在体外的癌细胞裂解性能力和选择性

^*EC50：如没有特别注明，均在给药后第三天检测EC50

表1-A列出的是来自8个不同的种的SVV在代表22种组织的165种原代细胞和细胞系中进行的允许性实验的结果。结果显示几乎所有的成年正常细胞都是SVV的非允许细胞。经检验的13种原代成年人细胞培养物是非允许的。12种经检验的牛、绵羊、猪和原代正常细胞培养物中仅有3种细胞培养物为允许性的，且均为猪的平滑肌细胞。该结果与SVV的天然宿主是猪的假想是一致的。除了猪的平滑肌细胞之外，仅有神经内分泌癌症细胞系或大多数胚胎细胞系是允许性的。

鼠类实验(参见实施例)表明SVV可以以高效和高特异性在体内特异性地杀伤肿瘤细胞。这些体内研究表明同其它肿瘤细胞裂解性病毒相比，SVV具有很多优点。例如，影响肿瘤细胞裂解性肿瘤病毒去根除已经建立的肿瘤的能力的一个重要因素是病毒的穿透性。在对腺病毒载体的研究中，发现基于Ad5的载体对无胸腺小鼠的SCLC肿瘤没有作用。在免疫组化实验结果的基础上，发现腺病毒不能透过预先建立的肿瘤细胞。相反，SVV在单次***给药后，可以清除无胸腺裸鼠体内H446SCLC肿瘤。SCC的大小很小(直径小于30nm)，因此在肿瘤组织内较其它病毒更容易渗透和播散。因此SVV的较小体积对其能成功渗透并清除已经建立的肿瘤起到了作用。

在体内试验中，以无胸腺裸鼠和免疫功能完备的小鼠建立肿瘤模型，分析单次剂量静脉注射SVV后的治疗效果。这些肿瘤模型包括：(1)H446(人SCLC)；(2)Y79(人视网膜母细胞瘤)；(3)H69AR(人多药抗性SCLC)；(4)H1299(人NSCLC)；以及(5)N1E-115(小鼠神经母细胞瘤)。这些检测的试验结果参见图90A-E和实施例11。检测表明SVV在上述所有模型中的治疗效果，且疗效与体外试验的ED₅₀和体内治疗人异源移植肿物的效果保持一致。在治疗N1E-115免疫功能完备的小鼠神经母细胞瘤模型中，SVV显示了出在正常免疫***下的抗肿瘤活性。

在癌症患者接受化疗时，有可能出现产生化疗抗性的情况。患者通常会出现这种情况，此时患者的预后很差，且很有可能没有其它可选的治疗方法。通常情况下，产生化疗抗性的原因是一种被称为多药抗性蛋白(MRPs)的一类蛋白家族发生了表达、过表达或活性增加。专利申请人同样也发现：某种类的肿瘤细胞对SVV的敏感程度也与癌细胞的化疗抗性或MRP的表达情况相关。H69是一株对化疗(阿霉素)敏感的细胞株，但在体外对SVV却具有抗性。而H69AR是一株化疗抗性细胞株，其细胞内过表达MRPs，但在体外试验中却对SVV治疗敏感(参见表1)。这些证据表明，MRPs(包括MDP)的过表达情况与细胞对SVV杀伤作用的敏感性之间密切相关。总之，本发明提供了用SVV杀伤那些过表达MRP的细胞的方法。

本发明还提供了用SVV治疗那些因细胞发生异常(例如细胞异常增殖而导致的疾病的方法。方法是将SVV与异常细胞相接触，从而使部分或全部异常细胞被破坏。SVV可被用于治疗各种因细胞发生异常而导致的疾病，包括下列疾病(但不局限于此)：表现为神经内分泌瘤或神经纤维瘤的肿瘤细胞。

神经内分泌肿瘤可以通过很多方法来进行鉴定。例如有些神经内分泌瘤会产生和分泌多种多肽激素和胺类物质。这些物质中有些会特异性的引起某些临床症状，包括：类癌、Zollinger-Ellison综合症，高血糖症，胰高血糖素瘤和WDHA综合症等。这些症状的特异性分子标志包括尿中5-HIAA、血清或血浆中胃泌素、胰岛素、胰高血糖素、血管活性肠肽等物质的基线和/或刺激后的水平。部分类癌和约1/3的内分泌胰腺癌并没有表现出任何临床特征，所以称他们为“无功能肿瘤”。因此，对那些肿瘤相关症状并不明显的患者，则通常检测那些常见的肿瘤标志分子如：嗜铬粒蛋白A、胰多肽、血清神经元特异性烯醇酶和糖蛋白激素亚单位等。在这些肿瘤标志分子中，嗜铬粒蛋白A(尽管功能尚不清楚)对许多神经内分泌性肿瘤而言是一种非常敏感和特异的血清标志分子。因为在那些低分化的神经内分泌瘤的早期阶段，在没有其它激素分泌时，嗜铬粒蛋白A已经显著提高。因此对于广泛的神经内分泌肿瘤而言，嗜铬粒蛋白A被认为是最合适用于诊断和疗效评价用的肿瘤标志物，它在各种神经内分泌肿瘤患者体内通常会升高50-100％。嗜铬粒蛋白A的血清和血浆水平反映肿瘤复合的大小，而且也可以作为中肠型类癌患者预后的独立标志。

本发明还提供了由SVV和药学上可被接受的载体所组成的药物组合物。此类药物组合物在药学上可被接受的载体中含有有效量的SVV，因此适用于按照一个单位的剂量进行局部或***给药。药物的制剂类型包括无菌肠外注射液或悬液、无菌非肠外注射液或口服溶液或悬液、油包水型乳剂、水包油型乳剂以及其它相关制剂。肠道外和非肠道外药物递送的配方是本领域的技术人员公知的。药物组合物中包括SVV的冻干和/或再生形式。可被接受的药物学载体包括盐溶液、硫酸鱼精蛋白(Elkins-Sinn，Inc.，Cherry Hill，NJ)、水、水溶性缓冲液(例如磷酸缓冲液和Tris缓冲液或病毒上清(Polybrene，Sigma化学试剂公司，St.Louis，MO))、磷酸缓冲盐溶液(PBS)和蔗糖溶液。选择合适的药物学载体其实是一门很深的学问。这些溶液都需要进行灭菌处理并且不含有除SVV以外的其他颗粒物质。药物中还含有药物学上可被接受的辅助性物质，从而是溶液的条件接近生理学条件。这些辅助性物质包括pH值调节剂、毒性调节剂及相关试剂(例如乙酸钠等)。辅助物质也可以增强SVV感染细胞的能力。

给予宿主或受试者足够剂量的SVV，通过病毒在肿瘤细胞内复制从而抑制肿瘤生长或摧毁肿瘤细胞。利用SVV进行癌症治疗的方法包括***性、区域性或局部输送病毒这几种方式。给药剂量包括安全剂量、可发展剂量和科耐受剂量。选择适当的用药剂量以确保能够获得疗效并摧毁肿瘤细胞。即使死在***型给药之后，SVV的治疗指数也至少为10，理想情况下可能至少为100或1000更多。一般而言，SVV的给药剂量在1 x 10⁸到1 x 10¹⁴vp/kg之间。给药的精确剂量取决于多种因素，包括年龄、体重、患者的性别肿瘤的大小和严重程度等。病毒可以按照一次或多次剂量给予，具体次数取决于宿主的免疫反应能力。由主治医生决定是单一剂量还是多剂量进行治疗，并决定剂量水平和给药方式。如果必要的话，通过使用各种免疫抑制剂来降低患者的免疫反应，从而有助于反复给药和/或增强病毒的复制能力。本发明中的抗肿瘤病毒疗法可以与其它抗肿瘤药疗法联合使用。给药方式可以有很多种，例如利用脂质体介导、直接注射、导管输注、局部外用、吸入等等。此外，SVV基因组RNA的DNA副本或其部分也可以直接作为给药方式，随后DNA将在细胞内转录并制造出病毒颗粒或特异性SVV多肽。

具有治疗效果的病毒剂量可以显著改善患者的症状或延长患者的寿命。通过对细胞培养物或实验动物进行相关实验从而确定病毒的毒性和治疗效应。例如测定LD₅₀(导致试验动物或细胞出现半数死亡的病毒剂量，对病毒而言，剂量单位为vp/kg)和ED₅₀(对半数试验动物或细胞具有治疗效应的病毒剂量(vp/kg))或者是EC₅₀(对半数试验动物或细胞具有治疗效应的病毒浓度(病毒颗粒/细胞)，参见表1)。毒性效应和治疗剂量之间的剂量比便是治疗指数，它可以是LD₅₀与ED₅₀或EC₅₀之间的比值。应首选那些具有高效治疗作用的病毒。从细胞培养试验和动物研究得到的数据可以作为设定针对人体使用剂量范围的参考。在一定范围的循环浓度中，病毒剂量(包括ED₅₀和EC₅₀)少有或没有毒性。给药剂量在该范围内可以相应的变化，这取决于所采用的剂型和给药方式。

另一方面，这里也提供了另外一种治疗癌症患者的方法，包括针对宿主机体给予治疗的病毒药物的剂量。这里的新生物组织通常是异常增殖的组织，而这些组织很可能是恶性肿瘤组织。相应的，病毒是否能分布贯穿至整个肿瘤组织或肿块，取决于病毒在肿瘤组织中选择性复制的能力。适用于接受本发明所提供的方法进行治疗的肿瘤应具有嗜神经属性。

本发明中生产和制造病毒的方法：

生产和制造这种高滴度和高产量病毒的方法是本发明的另一个方面。正如前面所说的，可以纯化出高滴度的SVV病毒颗粒，而且在允许细胞株中的产量也可以超过200,000个病毒颗粒/细胞。具有生产出高产量病毒颗粒的细胞株包括一下几种(但不局限于此)：PER.C6(Fallaux et al，Human Gene Therapy.9：1909-1917，1998)、H446(ATCC# HTB-171)和表1种EC₅₀低于10的其它细胞株。

例如可以采取下列方法来培养微小RNA病毒：纯化感兴趣的病毒嗜菌斑，挑取单个嗜菌斑并在允许细胞系(例如PER.C6)中扩增。通过反复冻融从允许细胞中获得粗纯的病毒裂解物(CVL)，随后用于感染大量允许细胞。允许细胞可被培养在各种组织培养皿中，例如含有各种培养基的50 x 150cm²培养皿。这些培养基包括含有10％胎牛血清(Biowhitaker，Walkersvile，MD)和10mM MgCl₂(Sigma，St Louis，MO)的Dulbecco′s modified Eagle培养基(DMEM，Invitrogen，Carlsbad，CA)。在感染后12小时至48小时之间或者出现完全细胞病理学效应(CPE)的时候回收感染的细胞，4℃ 1500rpm离心10分钟。用细胞培养上清重悬细胞沉淀并进行反复冻融处理。通过4℃ 1500rpm离心10分钟时最终的CVL变得澄清。用密度梯度离心纯化病毒颗粒。例如两个循环的CsCl密度梯度离心可以有效的纯化SVV病毒颗粒：第一步密度梯度离心(CsCl密度分别为CsCl 1.24g/ml和1.4g/ml)和紧接着的第二轮密度梯度离心(CsCl密度为1.33g/ml)。用吸收光谱法检测纯化后的病毒颗粒的浓度：A260等以1时估算为9.5 x 10¹²个病毒颗粒(参见由R.G.Webseter和A.Granoff与1999年编著的《病毒学百科全书》(第二版)中“心病毒(微小RNA病毒)”这一章节(Scraba，D.等编写))。通过测定标准嗜菌斑和/或半数组织培养感染量(TCID₅₀)来确定纯化***的感染性滴度。而该方法适用于PER.C6或其它任何何时的细胞类型。从PER.C6细胞中得到的SVV病毒产量通常超过200,000病毒颗粒/细胞，而病毒颗粒与PFU的比值约为100。从其它允许细胞株(H446-ATCC# HTB-171)中得到的SVV病毒产量至少同上面一样甚至更高。也可以通过亲和层析柱的方式进行SVV纯化。

此外，也有许多商业化驱使的大规模良好生产工艺流程(GMP)中的相关步骤可被用于纯化SVV病毒。本发明同样也在参照纯化腺病毒的基础上，设计了纯化SVV的方法。这些方法包括利用SVV自身的密度来纯化，因为SVV的密度同腺病毒很相近，因此可以与腺病毒进行共纯化。

检测和研究肿瘤的方法

本发明也提供了利用发明中所涉及的病毒来对患者进行肿瘤细胞检测的方法。细胞样本可来自患者，通过将细胞样本与含有表位标签的SVV(或其它发明中所提及的具有肿瘤特异性的病毒，例如肿瘤特异性心病毒突变体)孵育，通过检测表位标签对那些结合了SVV的样本进行筛选。另外一种方法，通过检测SVV是否能引起细胞裂解从而完成筛选过程。如果SVV确实可以引起细胞裂解，或者SVV可以特异性的与样本中的细胞结合，这可能提示样品中可能含有可被SVV结合和/或感染的肿瘤

此外，SVV也可在体内被用于检测肿瘤细胞。在该方法中，首先将含有表位标签的SVV灭活，但灭活后的SVV仍可以与肿瘤细胞特异性的结合，只是丧失的复制能力。通过检测表位标签，从而检测肿瘤细胞是否与SVV发生结合。通过采用能特异性结合表位标签的抗体来完成表位标签的检测，同样，抗体本身也可以带上相应的某种标记(例如荧光标记)，或者用带有标记的二抗来进行检测。

现有的检测方法包括使用发明中提及的任何一种病毒来特异性的靶向检测任何一种类型的肿瘤细胞。特异性的肿瘤类型包括神经内分泌型肿瘤，例如视网膜母细胞瘤、SCLC、神经母细胞瘤、胶质细胞瘤和髓母细胞瘤。

本发明同样也提同了利用SVV研究肿瘤细胞的方法。SVV特异选择性的摧毁肿瘤细胞，而对非肿瘤细胞则毒性很小甚至没有毒性。正因为具有这些特点，SVV可以被用于研究肿瘤或者提供发现新的肿瘤特异性基因或信号通路的可能。换而言之，正因为肿瘤细胞具有某些特性是的SVV可以特异性的在其内服复制繁殖，而对正常细胞不表现任何毒性作用。通过鉴定出某一新的肿瘤特异性基因和/或信号通路，就有可能设计出相应的治疗性抗体或小分子药物，并通过筛选确定这些药物是否具有抗肿瘤作用。

本发明还提供了鉴定所有对SVV有反应得肿瘤细胞的方法。将采集的得到的细胞与相应的SVV进行孵育，通过检测细胞杀伤性或病毒的复制情况，从而鉴定出那些对SVV由反应的细胞。可用多种方法检测细胞杀伤情况，这同样也存在相应的技巧(例如MTS分析法(参见本文中介绍高通量筛选的相应章节))。检测病毒复制情况的方法也有很多，同样也有很多技巧(例如CPE观察法、嗜菌斑分析法、DNA定量分析法、FACS检测肿瘤细胞中的病毒量、RT-PCR检测病毒RNA等方法)。这里所提到的细胞都是癌细胞。实施例中的癌细胞包括建立的肿瘤细胞株或从哺乳动物体内分离的肿瘤细胞(但不局限于此)。这里的哺乳动物是指人，而细胞也来源于癌症患者。

鉴定对SVV有反应的癌细胞的方法可用于发现适用于SVV复制的允许性肿瘤细胞株或肿瘤组织。此外，通过检测允许型肿瘤细胞的特征，从而鉴定那些可被SVV感染并杀死的肿瘤细胞的特征。发现这些特种有助于指导寻找肿瘤药物新的靶点。同样，鉴定对SVV有反应性的肿瘤细胞也可被用于对癌症患者进行筛选，以确定那些患者适合于接受SVV治疗。

抗SVV或SVV样微小RNA病毒的抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)可被用于病毒结合试验，从而对适合接受SVV或SVV样微小RNA病毒治疗的患者进行预筛查。可按照下述过程进行预筛查：(1)从患者体内分离得到细胞样本，可以通过穿刺活检得到；(2)细胞样本用抗SVV或抗SVV样微小RNA病毒的抗体进行孵育染色；(3)用连有相应分子标记(荧光素或其他可用于检测的染料或荧光染料)的二抗进行检测。二抗可以特异性的识别并结合抗SVV或抗SVV样微小RNA的一抗。如果一抗是兔源的，那么二抗应该能特异性的识别并结合兔的免疫球蛋白；(4)检测分子标记。如果分子标记是荧光素，则可以用荧光显微镜进行检测。(第3步也可以选择将抗SVV或抗SVV样微小RNA病毒的一抗进行直接标记(适用于单克隆抗体)，如果一抗为多克隆抗体，则推荐使用间接标记的方法--利用带标记的二抗--进行检测)。如果患者的肿瘤细胞适于SVV或SVV样微小RNA病毒感染，则该患者适于接受SVV或SVV样微小RNA病毒进行治疗。在病毒结合试验中，如果抗体染色结果为阳性，则证明患者的肿瘤细胞为SVV的允许细胞。参见92B-92C的荧光图象，显示的是SVV的允许细胞且被SVV感染。

在用病毒结合试验对患者进行预筛查时，细胞样本可以来自于患者，也可以是怀疑含有肿瘤细胞的组织的切片。将组织切片切成若干段并与SVV孵育，随后用抗SVV或抗SVV样微小RNA病毒的抗体进行免疫组化分析。

本发明还提供了检测SVV的方法。该方法是建立在特异性抗SVV多肽标位的抗体基础之上的。除此之外，也可以是建立在核酸杂交的基础上的。从SVV中分离出RNA，并进行相应标记(例如放射性标记、化学法光标记、荧光标记等等)制备成探针。从待测样本中分离RNA，结合在醋酸纤维膜上(或者具有相同功能的相似材料)，用带标记的SVVRNA探针RNA进行检测，从而检测结合上的探针的量。在得到相应序列的基础上，可以通过PCR的方法，将RNA进行直接或间接的测序。所用的PCR为实时定量PCR。

改变病毒趋向性的方法：

本发明提供了构建SVV突变体(或者是变异株或衍生病毒)的方法，而这些突变株的细胞类型趋向性发生了改变。也可以将SVV样微小RNA病毒进行突变从而使其获得特殊的细胞类型趋向性。由于SVV和SVV样微小RNA病毒突变体具有特异性结合并杀伤肿瘤细胞的能力，因此可以用于治疗那些原本对野生型SVV或SVV样微小RNA病毒具有结合抗性的肿瘤细胞。

原始的或野生型SVV的简单基因组和结构可被用于进行改造，从而可以靶向结合其它肿瘤。因此这些衍生病毒的感染谱被扩大了，可以用于治疗非神经性的肿瘤而且仍然保持很高的治疗指数(同原始的SVV保持一致)。进行靶向治疗的一种可能的方式是将肿瘤特异性肽段或配体连接在病毒上。

为了选择能用于进行癌症治疗的病毒，本发明体统了构建和筛选肿瘤细胞裂解性病毒库的方法。将编码一段随机肽段序列的基因随机***到原始SVV基因组内编码衣壳蛋白的核酸序列中。随机肽段文库的差异性为10⁸，因此拥有足够的样本量，应该能够得到可以特异性结合肿瘤组织的肽段。

给中研究表明同正常细胞相比，肿瘤细胞有许多不同之处：(1)肿瘤细胞的膜通透性更高；(2)肿瘤具有特异性的基质细胞特性，例如血管内皮生成细胞可以表达细胞类型特异性的受体；(3)肿瘤细胞差异性表达某种受体、抗原和细胞外基质蛋白(Arap，W.et al，Nat.Med.，2002，8(2)：121-127；Kolonin，M.et al，Curr.Opin.Chem.Biol.，2001，5(3)：308-313；St.Croix，B.et al，Science.2000，289(5482)：1997-1202)。这些研究表明肿瘤组织和正常组织之间在分子水平上是有差异的，这位靶向输送药物进行抗癌治疗提供了可能。值得一提的是，通过在小鼠模型中利用归巢血管的方法，已有很多经过筛选的获得的肽段被用于进行靶向输送细胞毒性药物(Arap，W.et al，Science.1998，279(5349)：377-380)、促凋亡多肽(Ellerby，H.M.et al，Nat.Med..1999，17(8)：768-774)、金属蛋白酶抑制剂(Koivunen，E.et al，Nat.Biotechnol.1999，17(8)：768-774)、细胞因子(Curnis，F.Etal，Nat.Biotechnol..2000，18(11)：1185-1190)、荧光物质(Hong.F.D.and Clayman，G.L.，Cancer Res..2000，60(23)：6551-6556)和基因(Trepel，M.et al，Hum.Gene Ther.，2000，11(14)：1971-1981)。这些肿瘤靶向多肽被证明居于增加药物疗效并降低毒性的作用。

可以通过在病毒衣壳蛋白区域***一段随机多肽从购构建SVV衍生病毒文库。如图57所示，构陷构建含有编码SVV衣壳蛋白与曲序列的载体，例如“pSVV衣壳蛋白载体”。该衣壳蛋白载体随后通过突变的方法(例如使用限制性内切酶(例如CviJI---一种平端内切酶)在载体DNA上进行随机切割。载体可能有许多酶切位点，但随后用胶纯化的方法分离得到相应的仅被CviJI酶切一次的片段(参见图57)。分离的大量DNA含有许多种类，它们均在编码衣壳蛋白的区域内的不同位置发生断裂。将这些缺口载体与寡聚核苷酸以及连接酶一起孵育，一定数量的寡聚核苷酸会连接到缺口载体上，因此被随机***到编码衣壳蛋白区域的不同位置上。依照上述方法，并能构建出SVV衣壳蛋白突变体文库。

***到衣壳编码区的寡聚核苷酸可以是随机序列，也可以是非随即序列(例如是预先确定的序列)，或者是半随机序列(部分序列是预先确定的，另外一部分则是随机序列)。非随机序列可以含有编码表为标签的区域。这些预期的表位标签可以是以下几种标签(但不仅限于此)：c-myc标签(由人原癌基因myc产物中的10个氨基酸组成-EQKLISEEDL(SEQ ID NO：35))、HA标签源自人流感病毒红血球凝集素蛋白中的血红蛋白(YPYDVPDYA(SEQ ID NO：36))和His₆标签(SEQID NO：116)-编码6个组氨酸。

编码衣壳蛋白突变体的多聚核苷酸文库(例如图57所示的“pSVV”衣壳蛋白文库)可以被限制性内切酶消化，从而释放出编码衣壳蛋白的区域。编码衣壳蛋白突变体的核酸序列随后被连接到含有SVV全长基因组序列的载体中(该载体中仅缺少编码衣壳蛋白的区域)(参见图58)。连接产物便成为具有全长基因组序列的载体，大量编码衣壳蛋白突变体的载体便可构成突变体文库。在图58中，SVV突变体文库有许多不同的衣壳蛋白组成，并命名为“pSVVFLcapsid”。将pSVVFLcapsid载体文库进行线性化处理，随后在体外进行转录从而生成含有突变的SVV RNA(参见图59)。将这些突变体SVV RNA转染进允许细胞内，SVV的序列会在宿主细胞内被翻译从而产生大量SVV突变体颗粒。在图59中，这些SVV突变体颗粒被注明为“SVV衣壳蛋白文库”。

***到SVV衣壳编码区的寡聚核苷酸序列所编码的多肽可以作为靶向定位的辅助原件，从而协助病毒进行特异性感染。当某种特定类型的肿瘤细胞表面表达这种肽段的受体时，病毒可以特异性的靶向定位到该肿瘤细胞上，并在细胞内复制并杀伤肿瘤细胞，同时播散到同类细胞当中。该方法使鉴定新型肿瘤靶向肽段和配体、肿瘤特异性受体、治疗型SVV衍生病毒或其它病毒衍生病毒(包括微小RNA病毒衍生病毒)等设想成为可能。

同其它技术方法(例如多肽磁珠文库和噬菌体显示等)相比，在体外或货体内对SVV突变体文库进行筛选有许多有点。与其它方法不同，这里的受检对象(例如SVV衍生病毒可以选择性的与癌细胞结合，并在其内部进行复制。与先前传统的寻找新的细胞结合载体的方法(例如噬菌体显示)不同，这种以复制为基础的文库筛选方法具有许多不可比拟的优点。首先，SVV文库的筛选是建立在复制基础上的，只有感兴趣的病毒衍生病毒才能够在靶组织或某种特定癌细胞内进行复制。通过筛选/选择的过程可以得到特异性非常好的病毒株，它不仅可以作为靶向多肽的载体，自身也可以用于治疗癌症。于此不同的是，噬菌体显示的结果仅仅代表结合事件，得到的也仅仅只是靶向多肽载体。因此SVV文库筛选的方法更有效且更迅速。其次，在体内或体外噬菌体显示筛选的过程中，从靶细胞中回收得到的噬菌体可以在细菌中扩增，而SVV衍生病毒则可以直接在感染细胞中(或发生裂解的感染细胞培养上清)回收并进行纯化。再次，SVV的基因组更小因此更易于繁殖传代。这使得它有可能通过向衣壳编码区随机***遗传信息，从而确保得到最理想的***产物。因此构建和筛选SVV文库可以产生高效的病毒衍生病毒。这些衍生病毒可以通过设计和筛选从而具有特异性感染非神经源肿瘤的属性。

通过向衣壳蛋白编码区***寡聚核苷酸，可以产生许多缺陷型突变体。这些缺陷型突变体的出现可能是由于***序列中含有终止密码子，导致病毒的多肽不能正常合成。缺陷型突变体的出现也可能是由于***序列导致衣壳蛋白发生改变，不能正常组装。为了降低这种情况出现，通常采用TRIM的方法并在***序列的设计上注意不要含有终止密码子或者编码某一氨基酸。

为了检测***到衣壳编码区的寡聚核苷酸序列是否合适，可以通过RGD-SVV文库的方法来进行确定(实施例16)。将编码SVV衣壳的核酸序列进行随机切割，例如使用CviJI。将随机化线性的编码衣壳的核酸序列连接到编码氨基酸序列为RGD(精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸)的寡聚核苷酸上。随后将编码RGD-衣壳蛋白的核酸序列连接到含有SVV全部基因组序列但缺失编码衣壳蛋白序列的载体上。生产出来的RGD-SVV衍生病毒具有与表达整合素的细胞特异性结个的能力(RGD肽段可以与整合素受体相结合)。选取那些能成功感染表达整合素细胞的RGD-SVV衍生病毒，通过测序分析确定是否有RGD多核苷酸的***。该位点可随后被用于进行定点***随机、非随机或半随机序列。

除此之外，将SVV与其它微小RNA的衣壳蛋白的部分区域进行比较(参见图28)，病毒在该区域内含有许多非盒结构，而这些序列之间的相似度最低。这些区域可能在病毒之间的感染谱差异上起着非常重要的作用。因此这些区域可以作为寡聚核苷酸的***位点，从而进行SVV衣壳蛋白(或其它病毒衣壳蛋白)的突变。

将灭活的SVV用于肿瘤特异性治疗

既然SVV和SVV衣壳衍生病毒均可以靶向定位于肿瘤细胞和/或组织，因此SVV病毒颗粒本身也可以作为治疗的输送载体。在该方法中需要优化SVV的癌细胞裂解性能力，使得衍生病毒能够靶向杀伤肿瘤细胞。

当野生型SVV被灭活后便不再具有裂解被感染细胞的能力。但病毒仍可以特异性的与靶细胞结合并进入细胞内。各种著作中都有介绍相应的灭活具有复制能力的病毒的标准方法。全病毒疫苗用***或β-丙内酯灭活，使病毒丧失复制能力。野生型SVV可能自身就含有诱导凋亡的肽段。此外SVV也可以通过辐照灭活。尽管如此，经辐照的病毒也应首先进行检测以确保它们仍保持特异结合肿瘤细胞的能力，因为辐照可能会引起蛋白或衣壳活性或功能的改变。此外，生成的某些SVV突变体可能缺少包装信号。这些SVV病毒突变体能特异性的结合并进入靶细胞，但复制生成的SVV基因组RNA去不能被包装组成具有感染性的病毒颗粒。尽管如此，该方法被证明能有效的引起肿瘤细胞死亡，因为SVV突变体可以在进入宿主细胞后引起宿主蛋白合成的关闭。

含有衣壳蛋白突变的SVV衍生病毒也可以被灭活并用于杀伤癌细胞。SVV衍生病毒在编码衣壳蛋白的区域内有编码表位标签的寡聚核苷酸***，引起可以作为输送毒素的载体靶向定位到肿瘤细胞上。正如文中所描述的，可对SVV衍生病毒进行随机突变并筛选出具有肿瘤细胞类型趋向性的病毒株。可以将毒素连接到表位标签上，因此病毒便可敬爱能够毒素输送至肿瘤细胞。此外也可以将治疗性抗体特异性与表位标签相连接，从而通过病毒将治疗性抗体输送至肿瘤细胞。

高通量筛选：

本发明提供了筛选具有特异性感染不同细胞系的病毒株的高通量方法。通过检测细胞毒性效应从而检测病毒株是否具有特异性感染能力。例如，在多孔板中将不同细胞株接种于不同孔内进行培养。多孔板为进行高通量筛选提供了平台，多孔板可以是384孔板。将某种病毒样品加入到相应的空中，检测是否出现了病毒介导的溶细胞作用。随后回收空中的培养基，将培养基中的病毒感染允许细胞株(在培养瓶或大型组织培养皿中进行培养)，使其充分扩增。但病毒生长后分离提取RNA进行测序分析。根据测序结果判定序列突变是否与病毒感染谱的改变相关。

各种比色法和荧光法都可以用于迅速检测出细胞毒效应。这些方法包括以基于荧光染料的分析方法、基于ATP的分析方法、MTS分析法和LDH分析法。基于荧光染料的分析方中包括使用核酸染料来检测死亡细胞的数量，因为不具有细胞通透性的核酸染料可以特异性的用于检测死亡细胞的数量。如果想同时检测死亡细胞和活细胞的数目，则可以将不具细胞同透性的核酸染料同细胞内酯酶底物、某通透性核酸染料、膜电位敏感的探针、细胞器探针或其它膜通透性指示剂一起连用，便能检测活细胞的数目。例如Invitrogen公司(Carlsbad，CA)提供了各种SYTOX^TM核酸染料可以特异性的通过含有细胞膜的细胞。EB和PI则可被用于检测死细胞或即将死亡的细胞。这些染料与核酸之间有着非常高的亲和力，因此可被任何检测吸光值的仪器进行检测。

例如可以对细胞裂解物进行检测，确定受损细胞胞浆中具有活性的乳酸脱氢酶(LDH)释放到培养上清中。为了检测细胞培养上清中是否存在LDH，可以向上清中加入底物混合物，有活性的LDH可以通过一系列酶促反应将四唑盐I个核苷酸转化为甲臢。甲臢染料可在随后用检测吸光值的仪器进行检测。另外，利用PMS(吩嗪硫酸甲脂)作为电子偶联试剂的MTS([3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四氮唑，内盐])也可以被用于检测细胞毒性。Promega公司(Madison，WI)提供了一种名为CellTiter

AQ_Ueous的单溶液细胞增殖检测试剂盒，可以将溶液试剂直接加入到细胞培养孔中，孵育1-4小时后在波长490nm处检测吸光值。490nm的大小反映甲臢产物的量，且后者的大小与培养物中增殖细胞数目的多少相对应。

目前有许多检测光吸收值得高通量仪器，例如SpectraMax Plus384 Absorbance Platereader(Molecular Devices)能够检测波长在190-1000nm之间的光吸收值(增量为1nm)。该装置仅需5秒便可完成对96孔板的检测，而对384孔板的检测也仅需16秒，因此具有方便、快捷和高通量的特点。

同样也可以通过对成功的感染指征进行分析从而完成对病毒复制到鄂检测，且该检测手段也可以以高通量的方式来操作。例如使用实时定量RT-PCR来检测细胞培养上清中病毒转录的情况。当病毒RNA逆转录为cDNA后，PCR可以对cDNA进行扩增并利用双链DNA结合染料(例如

Green，Qiagen GmbH，Germany)进行检测。使用荧光剂可以对PCR产物的量进行直接测量。

将在孔中显示出细胞毒性效应的病毒进行培养，并在进行后续的体外试验(在肿瘤和正常细胞中进行再次检验)和体内模型试验(检测病毒是否能杀死小鼠体内的移植瘤)。

抗体：

本发明还提供了特异性针对专利中病毒以及病毒蛋白的抗体。发明中的抗体有的是利用天然工序产生的，也有的是利用非天然工序产生的(包括单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体以及抗原结合片段等)。这些非天然工序产生的抗体可以是利用固相肽合成法构建的，也可是通过重组产生的，或者是通过对由各种可变重链和可变轻链构成的文库进行筛选而得到的(Huse et al，Science 246：1275-1281，1989)。在相关著作中都有对构建嵌合抗体、人源化抗体、CDR移植抗体或单链抗体以及双功能抗体的方法有详尽的介绍(Winter and Harris，Immunol.Today 14：243-246，1993；Ward et al，Nature 341：544-546，1989；Harlow and Lane，Antibodies：A laboratory manual.冷泉港出版社，1988)；Hilyard et al，Protein Engineering：A practi calapproach，IRL Press 1992；Borrabeck，Antibody Engineering.2d ed.，Oxford University Press 1995)。本发明中的抗体既包括完整的抗体分子，也包括一些分子片段，例如Fab，F(ab′)2，和Fv，这些片段具有结合那些决定表位的肽段的能力。

本发明中的用于作为免疫原来生成抗体的SVV多肽的肽段(例如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：169中的任意片段)和其它病毒多肽的肽段，其实本身并不具有免疫源性。但当把这些半抗原与载体(例如牛血清白蛋白(BSA)或钥孔戚血蓝素(KLH))相连接后，或者表达为融合蛋白之后则具有免疫源性。各种其它的分子载体以及与半抗原偶联的方法在其它著作中均有很详尽的介绍(例如Harlow和Lane所著，supra，1988)。制造多克隆抗体(例如兔多抗、羊多抗、小鼠多抗或其它哺乳动物多抗)的方法在相应著作中也有介绍(例如Green等编著，＂Production of Polyclonal Antisera，＂in Immunochemical Protocols，Manson，ed.，Humana Press 1992，pages 1-5；Coligan等编著，＂Production of Polyclonal Antisera in Rabbits，Rats，Mice and Hamsters，＂in Curr.Protocols Immunol.(1992)，section2.4.1)。

也可参照相应著作中介绍的广为熟知的方法获得单克隆抗体(Kohler and Milstein，Nature 256：495，1975；Coligan et al，supra，1992，sections 2.5.1-2.6.7；Harlow and Lane，supra，1988)。从用病毒或病毒多肽片段免疫的小鼠体内分离脾脏细胞，与适当的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞。对用标记的SVV多肽对杂交瘤细胞进行筛选，鉴定克隆所分泌的抗体具有特异性。将那些能表达具有理想特异性和亲和力抗体的杂交瘤细胞分离培养，以作为生产抗体的来源。多克隆抗体也可以通过相类似的方法分离得到，例如从免疫动物的血清中得到。这些抗体除了在本发明中所介绍的方法中有应用之外，也可以有其它多种用途(例如制备标准试剂盒)。表达的重组相抗体，例如单链抗体也可以用作制备试剂盒。可以用各种成熟的办法从杂交瘤细胞的培养上清中分离纯化单克隆抗体。这些方法包括含有蛋白A-琼脂糖凝胶的亲和层析、分子筛层析和离子交换层析等(Barnes et al，inMeth.Mol.Biol. 10：79-104，Humana Press 1992)；Coligan et al，supra，1992，see sections 2.7.1-2.7.12 and sections2.9.1-2.9.3)。

可以将某一特定抗体进行蛋白水解，或者表达一段由DNA编码的片段。从而制备出具有结合抗原能力的抗体片段。采用最常用的方法，将完整的抗体分子用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶进行消化，从而得到抗体片段。例如将抗体用胃蛋白酶酶解产生大小为5S的抗体片段，命名为F(ab′)2。随后将该片段用去巯基试剂进行裂解，并将巯基基团进行随机封闭从而断裂二硫键，产生大小为3.5S的Fab′单价片段。此外，也可以利用木瓜蛋白酶水解抗体分子，直接生成两个单价的Fab′片段和Fc片段(see，for example，Goldenberg，U.S.Pat.NOS.4,036,945and 4,331,647；Nisonhoff et al，Arch.Biochem.Biophys.89：230.1960；Porter，Biochem.J. 73：119，1959；Edelman et al，Meth.Enzymol.，1：422(Academic Press 1967)；Coligan et al，supra，1992，see sections 2.8.1-2.8.10 and 2.10.1-2.10.4)。

抗体的另外一种抗原结合片段便是编码单一互补决定区(CDR)的肽段。CDR肽段可以通过构建编码目的抗体CDR的多核苷酸序列而获得。从产生抗体的细胞中分离RNA，再通过聚合酶链式反应(PCR)得到编码可变区的基因片段(例如，Larrick et al，Methods：A Companion to Methods in Enzymology 2：106，1991)。

本发明中的抗体适用于进行免疫分析，它们既可以是液相的，也可以是连接在固相载体上的。此外，也可以用各种方法对这些抗体进行相应的标记以便于进行检测。利用发明中的抗体可以开展竞争性和非竞争性免疫分析，包括直接或间接两种形式，此外还可以进行放射性免疫(RIA)和三明治(免疫测定)分析法。在免疫分析法(包括对生理样本进行免疫组化分析)中，用抗体检测相应的抗原分子有正向的、反向的和双向的这三种模式。在相应得著作中对这些方法都有很详尽的介绍。

能用于对抗体进行标记的标签和方法有很多，在相关著作中都有介绍。能用于标记抗体的类型有很多，例如酶、放射性同位素、荧光物质、胶体金、化学发光物质、磷光物质和生物发光物质等等。相关著作中介绍的常规方法也适用于其它的抗体标记物或抗原标记物，都需要用实验来证明。

只要不背离本发明所界定的范围和精神，允许队上述方法和配方进行各种改动。文中对上述所有内容，包括文字描述和附图，或者是注解都作了详尽的说明，但没有限定的意思。

实施例

下面提供的实施例都是用于对本发明作出解释，并没有限制发明的目的。

实施例1

病毒的扩增与纯化

将西尼卡谷病毒病毒培养在PER.C6细胞中：将西尼卡谷病毒进行一次嗜菌斑纯化，并选取分离良好的噬菌斑并在PER.C6细胞中扩增(Fallaux等人，1998)。通过三次冻融循环从西尼卡谷病毒感染的PER.C6细胞中制备粗纯的病毒裂解物(CVL)。PER.C6细胞在50 x 150cm² T.C.培养瓶中培养，使用的是含10％胎牛血清(Biowhitaker，Walkersvile，MD，美国)和10mM MgCl₂(Sigma，St Louis，MO，美国)的Dulbecco的修改的Eagle培养基(DMEM，Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)。在用病毒感染30个小时之后，当观察到出现完全CPE时收获被感染的细胞，并通过4℃ 1500rpm离心10分钟收集细胞。将细胞沉淀用细胞培养上清(30ml)重悬，随后进行三次冻融循环。得到的CVL通过4℃ 1500rpm离心10分钟进行澄清。经过两轮CsCl密度梯度离心纯化病毒颗粒：一步梯度(CsCl的密度分别为1.24g/ml和1.4g/ml)和随后的连续梯度离心(CsCl的密度为1.33g/ml)。用分光光度计测定纯化的病毒浓度，假定IA260＝9.5 x 10¹²个病毒颗粒(参见Scraba D.G.和Palmenberg，A.C.，1999.《病毒学百科全书》(第二版)中的“心病毒(微小RNA病毒)”，R.G.Webster和A GranoffEds))。使用PER.C6细胞通过标准嗜菌斑检测测定纯化的病毒的滴度。从PER.C6细胞中得到的西尼卡谷病毒的产量超过200,000病毒颗粒/细胞，而病毒颗粒与PFU的比值约大约为100。其它允许细胞株(H446-ATCC# HTB-171)的产量至少一样高甚至更高。

实施例2

电镜

使用直接敷贴法(application method)将西尼卡谷病毒包埋在经聚乙烯醇缩甲醛碳(formvar carbon)包被的载网上，用醋酸双氧铀染色，随后用透射电镜观察。在高放大倍数下拍照病毒颗粒的代表性的显微图像。为了透射电镜观察，从包埋块中切取西尼卡谷病毒感染的PER.C6细胞的超薄切片，并在透射电镜下检测所得切片。

经纯化过的西尼卡谷病毒颗粒为球型，直径约为27nm，在载网上显示为单一存在，或少量聚集。西尼卡谷病毒的代表性图片如图2所示。在某些视野区域下还可看到染色渗透的受损的病毒颗粒或空壳体。对感染的PER.C6细胞进行超微结构分析可以看到胞浆内的晶状体包涵体。图3显示的是被西尼卡谷病毒感染的PER.C6细胞的代表性图像。被病毒感染的细胞内可见少量较大的包囊体(空囊泡)。

实施例3

西尼卡谷病毒核酸的分离

RNA的分离：用硫氰酸胍和酚抽提法使用Trizol(Invitrogeng公司，Carlsbad，CA)抽提西尼卡谷病毒的基因组RNA。分离过程依照供应商推荐的方法进行操作。简单的说，将250μl纯化的西尼卡谷病毒与3倍体积的TRIZOL和249μl的氯仿共同混合。水相中含有西尼卡谷病毒RNA，用600ul的异丙醇进行沉淀。将RNA沉淀用70％的乙醇清洗两遍，干燥并溶于经DEPC处理过的水中。通过260nm处的光密度检测来估算RNA的量。取一份RNA，在1.25的变性琼脂糖胶(CambrexBio Sciences Rockland Inc.，Rockland，ME美国)内进行电泳分析，用EB染色观察电泳条带并成像(图4)。

cDNA合成：通过RT-PCR合成西尼卡谷病毒基因组的cDNA。在标准条件下进行cDNA的合成，使用1μg RNA、AMV逆转录酶、随机的14mer的寡核苷酸或oligo-dT。扩增cDNA片段，克隆到质粒中并测序。

实施例4

西尼卡谷病毒序列分析和流行病学

部分i：西尼卡谷病毒SEQ ID NO：1

通过对SEQ ID NO：1的核苷酸序列进行分析来确定它与其它病毒的进化关系。该开放读码框的翻译产物(SEQ ID NO：2)与微小RNA病毒类似，从VP2的中段到达3D聚合酶的终止密码子，长度为1890个氨基酸残基(图5A-5E和7A-7B)。提供了位于开放读码框下游的64个核苷酸的3′非翻译区(UTR，核苷酸5671-5734)，含有终止密码子，而不包括18个残基的poly A尾(图5E)。

将西尼卡谷病毒的3部分基因组片段进行初期比较(结果未显示)，发现西尼卡谷病毒是与心病毒属(微小RNA病毒科)种族最近的成员。因此对西尼卡谷病毒、脑炎心肌炎病毒(EMCV；脑心肌炎病毒种)、Theiler′s鼠脑脊髓炎病毒(TMEV；Theilovirus种)、Vilyuisk人脑脊髓炎病毒(VHEV；Theilovirus种)和大鼠TMEV样病毒(TLV；Theilovirus种)的多聚蛋白进行了比对(图28)。根据这个比对，西尼卡谷病毒的多聚蛋白加工和与心病毒属种族最近成员的多聚蛋白加工相当。图28中多肽间的切割位点用＂/＂表示。

在微小RNA病毒科，绝大多数多聚蛋白的剪切过程是通过病毒编码的一个或多个蛋白酶来完成的。尽管在心病毒、鹅口疮病毒、马鼻病毒和铁氏古病毒中，P1-2A和2B之间的剪切是通过缺乏了解的和2A序列本身相关的反式作用(czs-acting)机制来实现的，并且“NPG/P”序列起了关键的作用，这里的“/”表示2A和2B多肽之间的断开(Donnelly等人，1997，J.Gen.Virol.78：13-21)。副肠孤病毒中的一种名为Ljungan的病毒，在典型的副肠孤病毒2A序列的上游有这种序列(NPGP)，并且或者是额外的2A或者是P1衣壳区域的C末端，所有9个已识别的微小RNA病毒属中，3C^pro执行除反式作用(czs-acting)外的所有自剪切反应。(即在肠道病毒和鼻病毒中2A在其N末端的剪切，在鹅口疮病毒和马鼻病毒中在C末端的L剪切)。而在衣壳多肽VP0组装后剪切为VP4和VP2的过程则不由3C^pro执行，而是通过一种未知的有可能有病毒RNA参与的机制完成。在副肠孤病毒和柯布病毒中不发生VP0的剪切。正常的心病毒3C^pro的剪切位点在-1位有谷氨酰胺(Q)或谷氨酸(E)，在+1位点有甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、丙氨酸(A)或天门冬氨酸(N)(表2)。西尼卡谷病毒多聚蛋白的剪切证实了这种模式，除了是组氨酸(H)/丝氨酸(S)的VP3/VP1位点以外(表2)；然而在至少一株马A型鼻病毒(ERAV；鹅口疮病毒属)中H/S有可能成为3A和3B^VPg之间的剪切位点(Wutz等人，1996，J.Gen. Virol 77：1719-1730)。

表2 西尼卡谷病毒和心病毒的剪切位点

●2A和2B之间断裂不属于剪切事件。

西尼卡谷病毒的初期切割(P1/P2和P2/P3)：这些初期切割事件与心病毒、鹅口疮病毒、马鼻病毒、铁氏古病毒的初期切割事件相似，包括P1-2A通过新机制从2B的分离，所述新机制包括NPG/P(SEQ ID NO：111)和在2BC和P3之间的传统的通过3Cpro的切割事件(表2)。

P1剪切：通过与EMCV和TMEV的序列进行比较，在西尼卡谷病毒P1衣壳编码区域内的剪切相对比较容易预测(表2)。

P2剪切：2C蛋白参与了RNA合成。西尼卡谷病毒的2C多肽在推测的解旋酶和所有微小RNA病毒2C中含有NTP结合基序GxxGxGKS/T(SEQ ID NO：112)(结构域A)和hyhyhyxxD(其中hy代表疏水氨基酸残基；结构域B)(图29)。

P3剪切：P3剪切位点的预测也相对直接。我们对3A多肽的功能了解的很少。但是，所有的微小RNA病毒3A蛋白都含有推测的跨膜α螺旋结构。西尼卡谷病毒和心病毒之间该蛋白的基本序列的一致性程度低(参见图28，第1612位到1701位之间)。

与基因组连接的多肽---VPg是由3B区域编码的，与其他心病毒在氨基酸组成上一致性很低，但是，第三位的氨基酸残基为酪氨酸，与其和病毒基因组5’端的联系是相符的(Rothberg等人，1978)。参见图28中第1703至1724位之间。

4个微小RNA病毒3C半胱氨酸蛋白酶的三维结构已经被解析，并且活性氨基酸残基的位点已被确定(HAV，Allaire等人，1994，Nature，369：72-76；Bergmann等人，1997，J.Virol.71：2436-2448；PV-1，Mosimann等人，1997，J.Mol.Biol..273：1032-1047；HRV-14，Matthews等人，1994，Cell，77：761-771；andHRV-2，Matthews等人，1999.Proc.Natl.Acad.Sci.美国.96：11000-11007)。图29中粗体标记的半胱氨酸是亲核基团，而第一个粗体标记的组氨酸为广义碱，并且已经确定第二个粗体标记的组氨酸对谷氨酸残基具有特异性；这三个氨基酸残基在西尼卡谷病毒序列中(图29)和所有其它已知的微小RNA病毒中都是保守的(图28；对于3C序列比较见第1726-1946位之间)。

3D多肽是RNA依赖的RNA聚合酶的主要组分，西尼卡谷病毒含有在微小RNA样病毒的RNA依赖的RNA聚合酶中保守的基序，即KDEL/IR(SEQ ID NO：113)、PSG、YGDD(SEQ ID NO：114)和FLKR(SEQ IDNO：115)(图3；图28中第1948-2410位之间)。

P1的N末端的豆蔻酰化：在大多数微小RNA病毒中，P1蛋前体多肽通过其N端的甘氨酸残基(当出现的N端甲硫氨酸被去除时)、通过酰胺键共价结合一个分子的豆蔻酸(Chow等人，1987，Nature.327：482-486)。因此含有P1N端的剪切产物VP0和VP4蛋也被豆蔻酰化。这种豆蔻酰化的过程通过豆蔻酰基转移酶来完成，该转移酶可以识别以甘氨酸开头的8个氨基酸残基信号序列。现已证明在微小RNA病毒中存在一个由5个氨基酸残基组成的保守基序序列：G-x-x-x-T/S(Palmenberg，1989，In Molecular Aspects ofPicornavirus Infection and Detection，pp.211-241，Ed.Semler& Ehrenfeld，Washington D.C.，Amer.Soc.for Micro.)。同样也没有VP0的成熟切割的副肠孤病毒(人副肠孤病毒和Ljungan病毒)也没有豆蔻酰化的迹象，但是对于这些病毒有一些类型的分子封闭VOP的N末端。

将个别西尼卡谷病毒的多肽序列与公共序列数据库进行比较

应用欧洲生物信息研究所(European BioinformaticsInstitute，EBI；http://www.ebi.ac.uk/)提供的FASTA在线程序，将每种西尼卡谷病毒多肽(SEQ ID NO：4，6，8，10，12，14，16，18，20和22)与公共蛋白序列数据库进行比较分析。这些比较得到的结果(最佳匹配)显示在表3中。衣壳蛋白(VP2、VP3和VP1)作为整体而言，和2C、3C^pro和3D^pol一起，与心病毒属的种族最近，但是，较短的预测的2A序列与Ljungan病毒(副肠孤病毒属)的相应序列种族更近。西尼卡谷病毒2A核酸序列和相近序列的更加详细的比较结果显示于图28(对于2A样NPG/P蛋白比较也可参见图70)。

表3 和西尼加谷病毒的个别的预测多肽相匹配的数据库

^*一种光和的、厌氧的、绿色硫细菌t

2-磷酸甘油酸脱水酶)(2-磷酸-D-甘油水裂解酶2)

西尼卡谷病毒2B与解脲支原体的多带抗原匹配或3A与绿硫菌(Chlorobium tepidum)endolase 2的匹配的意义都还不清楚，但是这些相关性有可能值得进一步的研究。

西尼卡谷病毒多肽与其它微小RNA病毒的***发育比较

能和心病毒校准(align)在一起的西尼卡谷病毒多肽(VP2，VP3，VP1，2C，3C和3D)和每种微小RNA病毒物种的典型成员的相同蛋白进行了比较(表4)。使用程序BioEdit v5.0.9(Hall，1999，Nucl. Acids.Symp.Ser.，41：95-98)和Clustal X vl.83(Thompson等人，1997，Nucl.Acids Res..25：4876-4882)进行校准(alignments)并构建距离矩阵(distance matrices)和无根邻接树(unrootedNeighbor-joining trees)，根据Saitou和Nei的算法(Satiou andNei，1987，Mol.Biol.Evol..4：406-425)。通过自举(bootstrap)重取样的方法(1000次假定重复)获得分支的置信界限。使用TreeView1.6.6画树形图(Page，1996)(图31-37)。用于构建树的距离矩阵使用多重替代校正的值，图38-44显示的是实际的氨基酸一致性百分比。表4显示的是目前的家族微小RNA病毒的分类情况以及在这些比较中使用的代表性的病毒序列。

表4 在和西尼卡谷病毒进行比较时使用的微小RNA病毒的分类学分类

*SV2和PEV-8目前分类情况将它们置于肠道病毒属中，然而，有建议认为可以将它们重新分为一个新属(Krumbholz等人，2002；0berste等人，2003)。

当来自于所有树结构中的多肽的数据联合起来时(图34)，个别衣壳蛋白的树结构(图31-33)并不能代表全部树结构。这有可能是校准(align)衣壳多肽时的难点，尤其是当它们并非全长序列时，例如VP2(图31)。尽管如此，P1，2C，3C^pro和3D^pol是一致的，并且西尼卡谷病毒显示同EMCV和TMEV聚类在一起。

西尼卡谷股病毒作为心病毒属的一员

现已明确西尼卡谷病毒的3D^pol与心病毒的3D^pol有几乎与EMCV和TMEV之间同样近的亲缘关系，(图37；图44)。在其它通常被认为在微小RNA病毒中相对保守的多肽中，2C和3C _SW也几乎和心病毒亲缘关系最近，但是它与心病毒的种族没有MECV和TMEV之间的那么近(分别为图42和43)。在提取衣壳蛋白(作为整体)中，西尼卡谷病毒也几乎和心病毒种族最近，并且其种族大约和两个鹅口疮病毒物种(手足口病毒和马鼻病毒A型)之间的种族相同(～33％)。西尼卡谷病毒在2B和3A多肽上与心病毒相差很大，并且没有和任何已知的微小RNA病毒的可检测的种族。然而这种情况不是没有先例；禽脑脊髓炎病毒在2A、2B和3A上与甲型肝炎病毒(HAV)相差很远，但仍暂时性同HAV划分在肝病毒属中(Marvil等人，1999，J.Gen.Virol.，80：653-662)。

如果将EMCV和TMEV作为标准，西尼加谷病毒显然不是典型的心病毒。但是，即使这两种病毒也存在差异，尤其在5’UTR(Pevear等人，1987，J.Gen.Virol..61：1507-1516)。但是，西尼卡谷病毒在其多数多肽(P1，2C，3C^pro和3D^pol区域)上与EMCV和TMEV***发生的聚类在一起。最终，西尼卡谷病毒在微小RNA病毒中的分类学位置将由国际病毒分类委员会(ICTV)执行委员会(EC)在微小RNA研究小组的建议和支持性的出版材料之后决定。有两种选择：i)将西尼卡谷病毒划分为心病毒属中的新种；或ii)为西尼卡谷病毒定为新的病毒属。

第二部分：西尼卡谷病毒SEQ ID NO：168

西尼卡谷病毒的全长基因组(图83A-83H；SEQ ID NO：168；实施例15)允许了进一步的流行病学研究。进一步的流行病学研究的结果如图86所示，其中西尼卡谷病毒显示与心病毒具有遗传亲缘关系，例如EMCV和TMEV，但在不同的分支上。

西尼卡谷病毒全长基因组非编码区和编码区的特征如上列于表A。全长西尼卡谷病毒和EMCV与TMEV-GDVII的比较的特征列于下方表中。

特征	西尼卡谷病毒	西尼卡谷病毒	EMCV	EMCV	TMEV-GDVII	TMEV-
特征	西尼卡谷病毒	西尼卡谷病毒	EMCV	EMCV	TMEV-GDVII	TMEV-	5′UTR	666	-	833	-	1068	-
导肽	237	79	201	67	228	76	5′UTR	666	-	833	-	1068	-
导肽	237	79	201	67	228	76	VP4	213	71	210	70	213	71
VP2	852	284	768	256	801	267	VP4	213	71	210	70	213	71
VP2	852	284	768	256	801	267	VP3	717	239	693	231	696	232
VP1	792	264	831	277	828	276	VP3	717	239	693	231	696	232
VP1	792	264	831	277	828	276	2A	27	9	429	143	426	142
2B	384	128	450	150	381	127	2A	27	9	429	143	426	142
2B	384	128	450	150	381	127	2C	966	322	975	325	978	326
3A	270	90	264	88	264	88	2C	966	322	975	325	978	326
3A	270	90	264	88	264	88	3B	66	22	60	20	60	20
3D	1386	462	1380	460	1383	461	3B	66	22	60	20	60	20
3D	1386	462	1380	460	1383	461	3′UTR	71	-	126	-	128	-

在下表中，西尼卡谷病毒(全长序列，也可参见图83A-83H中蛋白分界处用粗体标记的氨基酸)的剪切位点同其它心病毒的剪切位点进行比较。

在USDA发现了多个独特的病毒，他们同西尼卡谷病毒的相似程度超过了西尼卡谷病毒与其它心病毒的相似程度。这些USDA病毒分离株(此处被认为是“西尼卡谷病毒样微小RNA病毒”的成员)是：MN88-36695，NC 88-23626，IA 89-47552，NJ 90-10324，IL 92-48963，CA 131395；LA 1278；IL 66289；IL 94-9356；MN/GA 99-29256；MN99197和SC 363649。这些西尼卡谷病毒样微小RNA病毒和西尼卡谷病毒被认为包含了一种新的微小RNA病毒属。

这些西尼卡谷病毒样微小RNA病毒的每种都是特别的，在核酸水平上与西尼卡谷病毒的一致性大约为95％-98％(对于西尼卡谷病毒同这些USDA分离株之间的核酸序列比较参见图87-89)。

第三部分：血清研究

猪是上述鉴定的USDA病毒分离株的允许宿主。将编号为MN88-36695的病毒分离株接种到gnobiotic猪体内并产生抗血清(GP102)。这些抗血清和上面列出的所有的其它USDA分离株结合，还可以同西尼卡谷病毒结合。该抗血清不和24种常见的猪病毒病原体发生反应，表明其具有特异性。同样也检测了猪血清的1278(普拉姆岛病毒)的中和抗体。在美国采集血清，在29个血清样本中有8个为阳性，滴度范围从1:57到1:36，500。

为了检测猪是否是西尼卡谷病毒的天然来源，从多种动物体内采集血清样本，检测它们作为针对西尼卡谷病毒感染允许细胞的中和抗体的能力。血清中和检测如下进行：(1)将多种血清按照1:2和1:4的比例进行稀释；(2)同100 TCID₅₀的病毒相混合(西尼卡谷病毒外；但是能检测任何病毒来测定血清是否能中和其感染)；(3)37℃孵育1个小时；(4)加入到1 x 10⁴ PER.C6细胞(或其它允许细胞类型)中；(5)37℃孵育3天；和(6)用MTS检测法测定CPE。中和滴度被定义为能够100％中和西尼卡谷病毒(或其它正在谈论的病毒)的最高稀释液。

血清中和的结果表明在人和灵长种群中只有少量或没有中和抗体。在一项试验中，22个人类血清中没有一个含有西尼卡谷病毒中和抗体。在另一项试验中，28个人类血清中只有1个含有中和抗体。在第三个试验中，来自Amish农民的50个血清中没有一例是中和的。在另一项试验中，来自4个物种的的52个灵长类的动物血清没有一个是中和的。

血清中和结果表明在农畜动物种群中普遍具有中和抗体。在一项试验中，来自农场的27/71例猪血清是中和的，在另一项试验中，来自无病农场的4/30例血清是中和的。在另一项试验中，10/50例牛血清是中和的，而另一个试验，5/35例野鼠血清是中和的。因为在猪、牛和小鼠中发现了抗体对西尼卡谷病毒和/或西尼卡谷病毒样微小RNA病毒有交叉反应，所以这些数据表明西尼卡谷病毒和/或西尼卡谷病毒样微小RNA病毒可能在非灵长类动物中传播。

检测MN 88-36695病毒的粗裂解物，来评价它对西尼卡谷病毒的两种允许细胞系(NCI-H446；HEK293)和西尼卡谷病毒的两种非允许细胞系(NCI-H460和S8)细胞毒性能力。MN 88-36695的细胞毒性谱和西尼卡谷病毒相同：NCI-H446的TCID₅₀为1.6 x 10^-6；HEK293的TCID₅₀为1.3 x 10^-2；而NCI-H460和S8是MN 88-36695的非允许细胞株。这些数据表明西尼卡谷病毒样微小RNA病毒具有应用于目前的指向癌症治疗的方法的潜力。在一个实施例中，发明提供了利用MN 88-36695 SVV样微小RNA病毒在任何指向癌症治疗、诊断或筛选的方法中的使用。

在血清中和试验中对针对MN 88-36694和西尼卡谷病毒的抗血清对每种病毒进行了检测。抗西尼卡谷病毒的小鼠血清能够中和MN88-36695和西尼卡谷病毒的感染(对于MN 88-36695和西尼卡谷病毒而言，感染中和滴度分别为1:640和1:1000)。抗MN88-36695的gnobiotic猪血清能够中和MN 88-36695和西尼卡谷病毒的感染(对于MN88-36695和西尼卡谷病毒而言，感染中和滴度分别为1:5120和1:100)。

这些数据表明西尼卡谷病毒同猪USDA病毒分离株在遗传学和血清学上相关联。

实施例4

西尼卡谷病毒衣壳蛋白的SDS-PAGE和N末端测序分析

使用NuPAGE预先灌制好的Bis-Tris聚丙烯酰胺微型凝胶电泳***(Novex，San Diego，Ca，美国)对纯化的西尼卡谷病毒进行电泳。一半凝胶通过银染进行观测，而另一半用于制备衣壳蛋白N端氨基酸测序的样品。在将蛋白转移至膜上之前，先将凝胶浸泡在10mM CAPS缓冲液中，pH11，1小时，并将PVDF膜(Amersham)在甲醇中浸湿。蛋白质被转移到PVDF膜上。转膜后通过品红染色大约1分钟来进行观测，用解剖刀切出感兴趣的条带，并空气干燥。使用脉冲相测序仪，通过Edman降解，对蛋白质进行自动的N末端测序。

图45显示了经纯化的西尼卡谷病毒的3个主要结构蛋白(大约36kDa、31kDa和27kDa)。

实施例5

在人血清样本中进行针对西尼卡谷病毒的中和抗体的检测

如果在血清中预先存在有针对特定病毒载体的抗体，那么有可能限制该载体的***给药应用，例如治疗转移性癌症，因为预先存在的抗体可以结合***给药的载体，并在载体有机会转导靶组织或器官之前将它们中和。因此需要确保人体内不携带有针对被选作***给药的病毒载体的中和抗体。为了检测人血清样本中是否含有西尼卡谷病毒特异性中和抗体，使用随机采集的人血清样本进行中和检测。

组织培养感染剂量50：在试验的前一天，取含有1 x 10⁴个细胞的180μl PER.C6细胞悬液，接中于96孔组织培养板中。将西尼卡谷病毒的粗病毒裂解物(CVL)按照对数步骤在DMEM(Dulbecco′s ModifiedEagle′s Medium)培养基中从10^-0稀释到10^-11，在每个稀释度下取20μl转移到含有PER.C6细胞的96孔板内的3个孔中。将培养板放置在37℃含5％CO₂的培养箱内培养，在第3天读数取得细胞病变效果(CPE)的显微证据，并计算组织培养物感染剂量50(TCID₅₀)。

中和检测：首先，向每个孔中加入40μl的培养基，随后向第一个孔中加入40μl热灭活的血清，并吸打混匀，进行1:4稀释用于筛选目的。随后取40μl转移到下一个孔中，来进行血清样品的两倍稀释。向含有稀释血清样品的孔中加入40μl的西尼卡谷病毒(含有100TCID₅₀)。培养板在37℃下孵育1小时。取40μl混合液转入到含有PER.C6的培养板中(1 x 10⁴个细胞/160μl/孔)。将培养板在37℃培养3天。随后，用显微镜观察得到CPE。

在如上述进行的代表性的中和检测中，从美国、欧洲和日本随机采集22个人血清样本，检测西尼卡谷病毒特异性中和抗体。将血清样本进行连续稀释，并且与含有100 TCID₅₀的固定量的西尼卡谷病毒混合。随后使用血清-病毒混合物感染PER.C6细胞，并孵育24小时。将能够阻断CPE形成的最大血清稀释度的倒数作为测定的中和抗体的滴度。在该项试验中，没有检测到阻断CPE形成的血清滴度，表明人血清样本中不含有中和西尼卡谷病毒的中和抗体。

与人血孵育也不能抑制PER.C6细胞的进一步西尼卡谷病毒感染(见实施例6)，表明西尼卡谷病毒的感染不被补体或血细胞凝集素抑制。结果，同其它溶瘤病毒相比，西尼卡谷病毒在体内的循环时间更长，而循环时间是使用溶瘤腺病毒的重要问题。

实施例6

西尼卡谷病毒与人红细胞和红细胞凝集素的结合

已经显示多种病毒血清型在体外引起分离自各种动物物种的血液的红细胞的红细胞凝集反应。在体内红细胞凝集反应或与红细胞结合可引发毒性，并且还在体内影响生物分布和病毒载体在体内的效力。因此，需要对那些选择用于***性给药来治疗转移性癌的病毒载体的红细胞凝集反应特性进行分析。

红细胞凝集检测：为了测定西尼卡谷病毒是否会引起人红细胞的红细胞凝集反应，在U型底96孔板中进行红细胞凝集检测。将纯化的西尼卡谷病毒在25μl的PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)中进行连续稀释，向每个孔中加入相等体积的1％的红细胞悬液。用于分离红细胞的血液样本来源于健康个体，肝素作为抗凝剂。通过在冷的PBS中将红细胞清洗3次以除去血浆和白细胞，从而制备出红细胞。最后一次清洗后，用PBS将红细胞重悬，制备1％(V/V)细胞悬液。将病毒和红细胞轻柔的混匀，将培养板放置室温中孵育1小时并监测红细胞凝集现象。

全血灭活检测：为了排除西尼卡谷病毒被血液中成分直接灭活的可能，在血浆分离前，在室温下将部分病毒与加有肝素的属于A型、B型、AB型和O血液组的人血或PBS孵育30分钟或1个小时，随后感染PER.C6细胞并计算病毒滴度。

在按照上述进行的有代表性的检测中，在任何检测的西尼卡谷病毒病毒滴度下，都未观察到不同血液组(A、B、AB和O)的红细胞的红细胞聚集反应。当西尼卡谷病毒与人血样本混合并在室温下孵育30分钟和1小时时，发现病毒的滴度稍有增加，提示病毒不被血液中的组分灭活，但在检测条件下感染性更强。

实施例7

体内清除

血液循环时间：为了测定血液循环时间以及病毒在肿瘤中的量，通过尾静脉注射将种植有H446肿瘤的裸鼠用西尼卡谷病毒处理。剂量为1 x 10¹²vp/kg。在注射后第0，1，3，6，24，48，72小时和第7天(189小时)采集小鼠血液，并在采集后立即从血液中分离血浆，在感染培养基中稀释，并用于感染PER.C6细胞。在注射后6，24，48，72小时和第7天处死注射的小鼠并收集肿瘤。将肿瘤组织切成小切片并悬于1ml的培养基中，随后通过三次冻融循环将病毒从感染细胞中释放出来。对上清进行连续对数稀释，并在PER.C6细胞中测定滴度。西尼卡谷病毒的滴度表示为pfu/ml。肿瘤切片还进行H&E染色和免疫组化分析，来检测肿瘤中的病毒衣壳蛋白。

推测小鼠体重的7.3％是血液，据此测定病毒颗粒在血液中的循环水平。在按照上述进行的有代表性的检测中，在给予病毒6小时内，西尼卡谷病毒的循环水平降到零颗粒，并且在随后的时间点均检测不到SVV(图46A)。在肿瘤中，注射后6小时内仍可以检测到西尼卡谷病毒，此后病毒的量稳定升高两个对数级(图46B)。在注射后第7天仍可以在肿瘤中检测到西尼卡谷病毒(图46B)。当进行免疫组化分析时，组织切片显示在肿瘤细胞内有西尼卡谷病毒蛋白(图47，上格)。当用H&E染色时，肿瘤切片显示有一些圆的肿瘤细胞(图47，下格)。

和静脉注射相似剂量的腺病毒相比，西尼卡谷病毒在血液中还表现出显著更长的驻留时间。在给予单次静脉注射后，西尼卡谷病毒可以在血液中存在6个小时(图46C；图46C是图46A的副本，用于和46D进行比较)，而腺病毒在大约1个小时后从血液中清除(图46D)。

实施例8

肿瘤细胞选择性

西尼卡谷病毒的体外细胞杀伤活性：为了检测人类、牛、猪和小鼠细胞的易感性，从各种来源的动物中获取正常细胞和肿瘤细胞，并用西尼卡谷病毒进行感染。所有细胞类型均按供应商的推荐条件在培养基中进行培养。原代人肝细胞可以购自In Vitro Technologies公司(Baltimore，MD)，并在肝细胞培养基(HCM^TM，BioWhittaker/Clonetics Inc.，San Diego，CA)中进行培养。

体外细胞病变检测：为了检测那种类型的细胞对西尼卡谷病毒感染易感，对单层正在增殖的正常细胞和肿瘤细胞用系列稀释的纯化的西尼卡谷病毒感染。监测细胞CPE，并和未感染细胞比较。在感染后第3天，进行MTS细胞毒检测，并计算每个细胞颗粒的有效浓度50(EC₅₀)。参见下面的表5和表6，以及上述表1A。

表5EC ₅₀ 小于100的细胞系

EC₅₀小于1的细胞株	EC50值
EC₅₀小于1的细胞株	EC50值	H446(人SCLC)	0.001197
PERC6	0.01996	H446(人SCLC)	0.001197
PERC6	0.01996	H69AR(SCLC-多药抗性)	0.03477
293(人肾细胞，经ad5E1转化)	0.03615	H69AR(SCLC-多药抗性)	0.03477
293(人肾细胞，经ad5E1转化)	0.03615	Y79(人视网膜母细胞瘤)	0.0003505
IMR32(人脑，神经母细胞瘤)	0.03509	Y79(人视网膜母细胞瘤)	0.0003505
IMR32(人脑，神经母细胞瘤)	0.03509	D283med(人脑；小脑髓母细胞瘤)	0.2503
SK-N-AS(人脑，神经母细胞瘤)	0.474	D283med(人脑；小脑髓母细胞瘤)	0.2503
SK-N-AS(人脑，神经母细胞瘤)	0.474	N1E-115(小鼠神经母细胞瘤)	0.002846
SK-NEP-1(肾脏，wilms氏肿瘤，腹膜渗出)	0.03434	N1E-115(小鼠神经母细胞瘤)	0.002846
SK-NEP-1(肾脏，wilms氏肿瘤，腹膜渗出)	0.03434	BEKPCB3E1(牛胚肾细胞，经ad5E1转化)	0.99
		BEKPCB3E1(牛胚肾细胞，经ad5E1转化)	0.99
		EC₅₀小于10的细胞株(1-10)	EC50值
H1299(人非sclc)	7.656	EC₅₀小于10的细胞株(1-10)	EC50值
H1299(人非sclc)	7.656	ST(猪睾丸)	5.929
DMS 153(人SCLC)	9.233	ST(猪睾丸)	5.929
DMS 153(人SCLC)	9.233

EC₅₀小于1的细胞株	EC50值
EC₅₀小于1的细胞株	EC50值	EC₅₀小于100的细胞株(10-100)	EC50值
BEK(牛胚肾组织)	17.55	EC₅₀小于100的细胞株(10-100)	EC50值

表6.EC ₅₀ 超过1000的细胞株

M059K(人脑；恶性胶质母细胞	HUVEC(人静脉内皮细胞)	CMT-64(小鼠SCLC)
M059K(人脑；恶性胶质母细胞	HUVEC(人静脉内皮细胞)	CMT-64(小鼠SCLC)	KK(人胶质母细胞瘤)	HAEC(人主动脉内皮细胞)	LLC-1(小鼠LCLC))
U-118MG(人胶质母细胞瘤)	WI38(人纤维母细胞)	RM-1(小鼠***)	KK(人胶质母细胞瘤)	HAEC(人主动脉内皮细胞)	LLC-1(小鼠LCLC))
U-118MG(人胶质母细胞瘤)	WI38(人纤维母细胞)	RM-1(小鼠***)	DMS 79(人SCLC)	MRC-5(人纤维母细胞)	RM-2(小鼠***)
H69(人SCLC)	IMR90(人纤维母细胞)	RM-9(小鼠***)	DMS 79(人SCLC)	MRC-5(人纤维母细胞)	RM-2(小鼠***)
H69(人SCLC)	IMR90(人纤维母细胞)	RM-9(小鼠***)	DMS 114(人SCLC)	HMVEC(人微血管内皮细胞-成人)	MLTC-1(小鼠睾丸)
DMS 53(人SCLC)	HMVEC(人微血管内皮细胞-新生)	KLN-205(小鼠sqcc)	DMS 114(人SCLC)	HMVEC(人微血管内皮细胞-成人)	MLTC-1(小鼠睾丸)
DMS 53(人SCLC)	HMVEC(人微血管内皮细胞-新生)	KLN-205(小鼠sqcc)	H460(人LCLC)	HCN-1A(人脑)	CMT-93(小鼠直肠)
A375-S2(人恶性黑色素瘤)	HRCE(人肾皮质内皮细胞)	B16F0(小鼠恶性黑色素瘤)	H460(人LCLC)	HCN-1A(人脑)	CMT-93(小鼠直肠)
A375-S2(人恶性黑色素瘤)	HRCE(人肾皮质内皮细胞)	B16F0(小鼠恶性黑色素瘤)	SK-MEL-28(人恶性黑色素瘤)		Neur0-2A(小鼠神经母细胞瘤)
PC3(人***)		C8D30(小鼠脑组织)	SK-MEL-28(人恶性黑色素瘤)		Neur0-2A(小鼠神经母细胞瘤)
PC3(人***)		C8D30(小鼠脑组织)	PC3M2AC6(人***)		PK15(猪肾)
LNCaP(人***)		FBRC(胎牛视网膜)	PC3M2AC6(人***)		PK15(猪肾)
LNCaP(人***)		FBRC(胎牛视网膜)	DU145(人***)		MDBK(牛肾)
Hep3B(人肝细胞癌)		CSL 503(羊肺细胞，经ad5E1转化)	DU145(人***)		MDBK(牛肾)
Hep3B(人肝细胞癌)		CSL 503(羊肺细胞，经ad5E1转化)	Hep2G(人肝细胞癌)		0FRC(胎羊视网膜细胞)
西尼卡谷病毒620(人结肠)			Hep2G(人肝细胞癌)		0FRC(胎羊视网膜细胞)
西尼卡谷病毒620(人结肠)			西尼卡谷病毒839(人肾)
5637(人膀胱)			西尼卡谷病毒839(人肾)
5637(人膀胱)			HeLaS3
S8			HeLaS3

依照生产商提供的使用说明完成MTS检测(CellTiter

AQueousAssay，Promega，Madison，WI)。CellTiter

AQ_ueous Assay优选使用四唑盐化合物(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑盐，内盐；MTS)和电子耦合试剂吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate，PMS)。在实验中测定了接触抑制的正常人细胞，所述实验包括：HUVEC(人脐静脉内皮细胞)、HAEC(人主动脉内皮细胞，Clonetics/BioWhittaker # CC-2535)、Wi38(正常人胎肺成纤维细胞，ATCC # CCL-75)，IMR90(人正常肺成纤维细胞，ATCC CCL-186)，MRC-5(人正常肺成纤维细胞，ATCC，#C CL-171)和HRCE(人肾皮质上皮细胞，Clonetics/BioWhittaker # CC-2554)。在任意上述接触抑制的正常细胞中西尼卡谷病毒不产生CPE。

在下列人肿瘤细胞系中未见到病毒诱导的CPE：Hep3B(ATCC #HB-8064)，HepG2(人肝细胞癌，ATCC # HB-8065)，LNCaP(人***癌，ATCC # CRL-10995)，PC3M-2AC6，SW620(人结肠直肠腺癌，ATCC# CCL-227)，SW 839(人肾腺癌，ATCC # HTB-49)，5637(人膀胱癌，ATCC # HTB-9)，DMS-114(小细胞肺癌，ATCC # CRL-2066)，DMS 153(人小细胞肺癌，ATCC # CRL-2064)，A549(人肺癌，ATCC # CCL-185)，HeLa S3(人***，ATCC # CCL-2.2)，NCI-H460(人大细胞肺癌，ATCC # HTB-177)，KK(成胶质细胞瘤)，和U-118 MG(人成胶质细胞瘤，ATCC # HTB-15)。注意-表6中列出的EC₅₀大于1000的细胞系最有可能不允许西尼卡谷病毒的复制和/或病毒粒的产生；尽管西尼卡谷病毒仍有可能与这些细胞结合并进入细胞内，但没有观察到CPE，因为在细胞内不能发生西尼卡谷病毒的复制，或者虽然复制确实能发生，但因为其它一些进入后阻断造成观察不到CPE(即，复制的SVV基因组不能包装到病毒颗粒中)。但是，考虑到在这些细胞系中不会出现CPE，因此这些细胞系和它们潜在的肿瘤类型是良好的候选者，用于检测哪些细胞和肿瘤类型对西尼卡谷病毒的复制是允许或非允许的。尽管野生型西尼卡谷病毒是肿瘤特异性的，并已经显示靶向作用于神经内分泌肿瘤，包括小细胞肺癌和成神经细胞瘤，有可能存在个别的具有某些病因的肿瘤患者，例如他们的神经内分泌肿瘤的类型是西尼卡谷病毒不允许的。因此，发明设想了西尼卡谷病毒衍生代，能杀伤分离自个别患者的肿瘤细胞类型，在所述患者中肿瘤对野生型西尼卡谷病毒是不允许的，并且分离自这些个体的肿瘤类型可以包括，例如，成胶质细胞瘤、淋巴瘤、小细胞肺癌、大细胞肺癌、黑素瘤、***癌、肝癌、结肠癌、肾癌、膀胱癌、直肠癌和鳞状细胞肺癌。

通过LDH释放检测(

96 Non-Radioactive CytotoxicityAssay，Promega，# G1780)测定西尼卡谷病毒介导的对原代人肝细胞(In Vitro公司)的细胞毒作用。将原代人肝细胞铺板在胶原包被的12孔板中，用西尼卡谷病毒1、10、100和1000个病毒颗粒/细胞(ppc)进行感染。在感染3小时后，将感染培养基置换成2ml的生长培养基，在CO₂培养箱内孵育3天。分别检测细胞相关的乳酸脱氢酶(LDH)和培养上清中的LDH。将培养上清中的LDH量除以最大细胞LDH量与上清中LDH量之和，便得到细胞毒性百分数。

图48中显示的数据表明在所有检测的多种感染条件下都没有西尼卡谷病毒介导的肝细胞毒性。

实施例10

病毒产生检测

为了检测西尼卡谷病毒的复制能力，用西尼卡谷病毒以1个病毒颗粒/细胞(ppc)感染一些选择的接触抑制型正常细胞和活化***的肿瘤细胞。感染72小时之后，将细胞连同培养基一起进行三次反复冻融循环，随后离心回收上清。将上清进行连续对数稀释，在PER.C6细胞中检测病毒滴度。对于每个细胞系而言，西尼卡谷病毒的复制效率用“pfu/ml”来表示(图49)。

实施例10

毒性

最大耐受剂量(MTD)的定义是在SVV处理后，在动物(例如小鼠)出现剂量最大容许毒性(DLT)的剂量之前最近的剂量。DLT的定义是在研究的全过程中，因给予西尼卡谷病毒造成的动物出现体重减轻、症状、和死亡时的剂量。在基线、第15天和第21天测定了抗西尼卡谷病毒的中和抗体。如前所述进行中和检测。

扩大剂量(1 x 10⁸-1 x 10¹⁴vp/kg)的西尼卡谷病毒被静脉注射到免疫缺陷裸鼠和CD-1远系杂交有免疫活性小鼠(购自Harlan SpragueDawley，Indianapolis，IN，美国)，在每个剂量水平10只小鼠中检测MTD。试验结果表明，在所有检测剂量中病毒的耐受良好，没有出现任何临床症状，并且没有出现体重减轻(图50)。在第15天和第21天采集小鼠血液，并在中和检测中监测血清中有无西尼卡谷病毒特异性中和抗体。注射过西尼卡谷病毒的CD-1小鼠产生了中和抗体，且滴度范围为1/1024到1/4096以上。

另外一项毒性研究是在有免疫活性的小鼠种系(A/J)中进行的。已经发现西尼卡谷病毒表现出在N1E-115细胞中具有细胞杀伤活性和复制能力(参见表1)。小鼠细胞系N1E-115(成神经细胞瘤株，即神经内分泌瘤)源自A/J小鼠系。因此构建了同系基因型小鼠模型，其中N1E-115细胞被皮下种植到A/J小鼠体内来形成肿瘤，随后用西尼卡谷病毒处理小鼠来研究其效用和毒性。

在A/J研究中，对小鼠静脉注射西尼卡谷病毒以确定A/J小鼠是否对西尼卡谷病毒***性给药耐受。获得血液学结果来寻找毒性指征，并且还能获得血清化学结果。实验设计如下面表7所示：

表7：A/J实验设计

分组编号#	试验动物(雌性)	检测物质	剂量水平(病毒颗粒/千克)	剂量体积(mL/kg)	给药方式及给药次数	尸检天数
分组编号#	试验动物(雌性)	检测物质	剂量水平(病毒颗粒/千克)	剂量体积(mL/kg)	给药方式及给药次数	尸检天数	1	5	空白对照	0	10	在第-天进行静脉注射	第15天
2	5	西尼卡谷	10^s	10	在第-天进行静脉注射	第15天	1	5	空白对照	0	10	在第-天进行静脉注射	第15天
2	5	西尼卡谷	10^s	10	在第-天进行静脉注射	第15天	3	5	西尼卡谷	10¹¹	10	在第-天进行静脉注射	第15天
4	5	西尼卡谷	10¹⁴	10	在第-天进行静脉注射	第15天	3	5	西尼卡谷	10¹¹	10	在第-天进行静脉注射	第15天

8-10周龄的雌性A/J小鼠购自Jackson Laboratory公司(BarHarbor，Maine)。分离的西尼卡谷病毒粒保存在-80℃，用时取出。通过在冰上融化制备新鲜的SVV，并用HBSS(Hank’s平衡缓冲盐溶液)稀释。对于第二组，将西尼卡谷病毒稀释到10⁷个病毒颗粒/ml；对于第三组，为10¹⁰个病毒颗粒/ml；对于第四组，为10¹³个病毒颗粒/ml。对于第一组，使用HBSS作为载体对照。所有的给药溶液放在冰上，直到给药。

通过尾静脉以10ml/千克体重的剂量对动物静脉注射西尼卡谷病毒。在给药当天对动物进行称重，根据体重调整给药剂量(即，0.0200kg重的小鼠注射0.200ml的西尼卡谷病毒溶液)。每天监测两次小鼠的发病率和死亡率。每周称重两次。立即记录濒死动物和出现任何异常症状的动物的相关信息。

收集所有在最终处死时仍生存的小鼠的血液标本，死后观察并检测，用于标准血液学和血清化学分析(AST，ALT，BUN，CK，LDH)。在处死时采集下列器官：大脑、心脏、肺、肾脏、肝脏和生殖腺。每种器官样本一半迅速放至在干冰中冷冻，另一半则浸泡在***溶液中。

在注射西尼卡谷病毒二周后得到最初的血液学结果(CBC，差异的)，结果总结在下面的表8中。每个检测组检测5只小鼠(参见表7)：

Table 8：A/J毒性结果-血液学分析

这些结果显示，同未处理小鼠的血液学特征相比，接受低剂量、中等剂量和高剂量的西尼卡谷病毒处理的小鼠的血液学特征没有异常。从该项研究中可以得出结论，***性给予西尼卡谷病毒未发现可检测到的毒性指征，表明A/J小鼠在静脉注射西尼卡谷病毒后对其耐受良好。

实施例11

效果

6-7周龄的无胸腺雌性裸鼠(nu/nu)购自Harlan Sprague Dawley公司(Indianapolis，IN)，用于效果研究。使用手工限制器在小鼠腹部右侧皮下接种5 x 10⁶个H446细胞。定期测量肿瘤大小，按照下列公式计算肿瘤的体积：π/6 x W x L²，其中L＝长度，W＝肿瘤宽度。当肿瘤达到将近100-150mm³时，小鼠(n＝10)随机分组。按照10ml/kg剂量给小鼠尾静脉注射剂量增加的西尼卡谷病毒。对照组小鼠注射等量的HBSS。剂量增加范围从1 x 10⁷到1 x 10¹³病毒颗粒/千克体重。注射西尼卡谷病毒后每周测量两次肿瘤体积以确定抗肿瘤效果。完全响应的定义为异种移植物的完全消失；部分响应的定义为肿瘤体积减小50％或50％以上；而无响应的定义为象对照组那样肿瘤持续生长。

用HBSS处理的小鼠体内的肿瘤生长迅速，在实验的第20天肿瘤体积超过2000mm³(图51，见带有空菱形标记的线)。相反，给予所有剂量的西尼卡谷病毒的***注射的小鼠(除了最低剂量处理之外)在研究的第20天肿瘤均消失。在最低剂量组中，在实验的第31天，8只小鼠的肿瘤消失，1只小鼠具有很大的肿瘤，其余小鼠具有小的可触及的肿瘤(25mm³)。为了在大尺寸肿瘤中测定西尼卡谷病毒的抗肿瘤活性，在研究的第20天，对5只HBSS组荷瘤小鼠(>2000mm³)***性注射一次1 x 10¹¹vp/kg剂量的西尼卡谷病毒。在随诊期间(西尼卡谷病毒注射后11天)可以观察到肿瘤体积的剧烈降低(图51)。

检测单次静脉注射西尼卡谷病毒的效果的额外的实验是在表达神经内分泌标志物的小鼠肿瘤模型中完成的。用于检测的肿瘤模型包括H446(人SCLC)(参见图90A)，Y79(人视网膜母细胞瘤)(参见图90B)，H69AR(人多药抗性SCLC)(参见图90C)，H1299(人NSCLC)(参见图90D)和N1E-115(小鼠成神经细胞瘤)(参见图90E)。

结果显示，在所有的小鼠神经内分泌肿瘤模型中，单次静脉注射西尼卡谷病毒都有效果。结果还显示SVV在N1E-115免疫功能健全的小鼠神经内分泌肿瘤模型中也有效。

图52显示的是未经西尼卡谷病毒处理(即，用HBSS处理)或用西尼卡谷病毒处理的小鼠。如图所示，未处理小鼠具有非常大的肿瘤，而处理的小鼠没有肿瘤的可见体征。此外，对于用西尼卡谷病毒处理的未处死小鼠，在研究期间(200天)内未观察到肿瘤再生长。

表1、1A和5中显示的是西尼卡谷病毒对特异性的肿瘤细胞系的体外效果数据。数据显示，西尼卡谷病毒特异性的感染特定的肿瘤细胞类型，而不感染正常的成年细胞(猪的正常细胞除外)，明显优于其它任何已知的溶瘤病毒。西尼卡谷病毒的细胞杀伤特异性要高于化疗方法1000倍(西尼卡谷病毒的细胞杀伤特异性值已经显示超过10,000，而化疗的细胞杀伤特异性值大约为10)。

在H446人SCLC细胞中西尼卡谷病毒表现出特异性的细胞毒活性。将细胞与浓度逐渐升高的西尼卡谷病毒孵育两天，随后检测细胞活力，结果如图53所示。图53显示的是西尼卡谷病毒和H446 SCLC肿瘤细胞(上图)或和正常人H460细胞(下图)孵育后的细胞生存率。西尼卡谷病毒特异性杀伤肿瘤细胞，EC₅₀大约为10^-3个病毒颗粒/细胞。相反，任何浓度的西尼卡谷病毒都不能杀伤正常人细胞。此外，如表1、1A-3所总结的，西尼卡谷病毒对其它一些肿瘤细胞系也有细胞毒型，包括SCLC多药抗性肿瘤细胞，和一些胚胎细胞和细胞系。西尼卡谷病毒对于其它肿瘤细胞系的EC₅₀的范围在10^-3到20,000个病毒颗粒/细胞以上。而西尼卡谷病毒对于其它多种非神经肿瘤和正常人组织均没有细胞毒性。此外西尼卡谷病毒对原代人肝细胞也没有细胞毒性，在高达1000个病毒颗粒/细胞下通过LDH释放检测的(见图48)。

实施例12

在啮齿类动物中进行的生物分布和药物代谢动力学研究

在正常小鼠和荷有H446 SCLC肿瘤的免疫妥协的无胸腺裸鼠进行了西尼卡谷病毒的生物分布和药物动力学实验。该实验研究了对正常的和免疫妥协的荷瘤小鼠单次静脉注射后，西尼卡谷病毒的生物学分布、清除和持续情况。给各组小鼠单次静脉注射对照缓冲液或3种剂量的西尼卡谷病毒(10⁸，10¹⁰或10¹²vp/kg)，并监测临床指征。在给药后第1，6，24和48小时以及第1，2，4，和12周从5只小鼠的组中获取血液标本。剂量水平包括一个已知的低效剂量和两个较高剂量水平，来测定病毒清除的线性。在给药后第24小时和第2、4和12周处死各组小鼠。选择的组织包括：无菌采集肝脏、心脏、肺、脾、肾脏、***、骨髓、脑和脊髓组织，并使用验证的RT-PCR检测西尼卡谷病毒RNA的存在。

在处死时、在给药后24小时、第2周、第4周和第12周采集尿样和粪便，并检测感性性病毒的存在。这个实施例中的实验设计显示于下面的表9：

表9：西尼卡谷病毒在荷有SCLC肿瘤的CD-1小鼠和无胸腺裸鼠中的生物学分布

还在正常小鼠和荷有H446 SCLC肿瘤的免疫妥协的无胸腺裸鼠中进行了急性静脉注射毒性研究。在正常小鼠和荷有SCLC肿瘤的小鼠中进行的初步静脉实验表明，西尼卡谷病毒在高达10¹⁴vp/kg剂量下是安全的。在单次静脉注射10¹⁴vp/kg的西尼卡谷病毒两周之后未发现临床副作用或者体重减轻的迹象。

实施例13

在正常成年和怀孕小鼠中的病毒传播实验

该实验实施例的目的是检测，正常小鼠与注射有高浓度的西尼卡谷病毒的小鼠同居后，病毒是否会在传播。因为西尼卡谷病毒在正常和非荷瘤小鼠体内不复制，因此给荷瘤小鼠注射高浓度的西尼卡谷病毒，随后让它暴露在正常健康的动物中来模拟临床情况。第二个目的是检测西尼卡谷病毒从一只被感染的雌鼠传播到一只未被感染的怀孕DAM，和随后传播给发育中的胎儿的潜力。

将三组每组5只首次实验的雄性和雌性CD-1小鼠一只相同性别的感染有10⁸，10¹⁰或10¹²vp/kg西尼卡谷病毒的小鼠暴露在一起，并通过采集血液样本监测西尼卡谷病毒的存在。

相似的，一只西尼卡谷病毒暴露的雌鼠和一些定时怀孕的雌鼠混合，检测西尼卡谷病毒从被感染的雌鼠传播到一个未被感染的怀孕雌鼠，并随后传播给发育中的胎儿的能力。

实施例14

非人灵长类动物实验

还在非灵长类动物中对西尼卡谷病毒的安全性、毒性和毒物动力学进行了研究。在剂量范围发现期，对个体猴子单次静脉注射剂量为10⁸vp/kg的西尼卡谷病毒，并紧密监测感染和毒性临床指征。如果该剂量耐受性良好，则用加大剂量处理另外的实验动物，直到达到10¹²vp/kg。随后主要的实验包括3只雄猴和雌猴组成的多组动物，连续6周每周对每只猴给予一次单独载体或三种不同剂量的西尼卡谷病毒，并监测毒性指征。另外的两只不同性别的猴，给予单独载体和最高剂量水平的西尼卡谷病毒，连续6周，并在处死前允许额外4周的恢复时间。

在给药后第1周和第6周期间采集血液样本。在给予初始剂量和处死前采集临床病理学样本和血液学样本。每次给药后获取另外的血液样本，用于检测SVV的中和抗体的存在。

对存活的猴施行安乐死随后进行全面尸检，从主要实验和恢复猴中采集清单中的所有组织。对来自于对照组和高剂量组的组织进行组织病理学分析。在给药后第一周和第6周采集尿样和粪便样本，以检测感染性西尼卡谷病毒的存在。实施例的所有设计如下面的表10所示。

表10 西尼卡谷病毒在灵长类动物中的多剂量毒理研究

*剂量可以按照确定剂量范围的具体情况进行调整。

*剂量能根据剂量范围发现期的结果改变

实施例15

构建具有感染性的西尼卡谷病毒全长基因组和功能基因组质粒

除了西尼卡谷病毒基因组5’端长约1.5-2kb的序列尚没有被测序之外，SEQ ID NO：1的序列中包含有5’UTR、1A蛋白(VP4)、和1B蛋白的一部分(VP2)。为了克隆SEQ ID NO：1缺失的5’端序列，我们使用在高温下仍具有功能的DNA聚合酶以及可以协助DNA聚合酶顺利通过DNA二级结构的化学试剂。同时从ATCC保藏号为PTA-5343的西尼卡谷病毒病毒分离株中制备西尼卡谷病毒的cDNA。将西尼卡谷病毒感染允许细胞，例如PER.C6，随后分离出病毒颗粒。从分离出的病毒颗粒中提取病毒RNA并随后制备成cDNA。将单独的cDNA克隆进行测序，随后将挑选的cDNA拷贝连入到含有全长克隆的载体中。该载体在西尼卡谷病毒序列的上游5’端含有T7启动子。西尼卡谷病毒全长基因组序列已列在图83A-83H和SEQ ID NO：168中。通过T7聚合酶和体外转录***将含有西尼卡谷病毒全长序列的质粒进行反转录，得到全长RNA(参见图55)。将全长RNA转染进允许细胞中以检测该全长克隆是否具有感染性(参见图55)。

具体的方法如下：RNA的分离：用硫氰酸胍-酚抽提法(Trizol，购自Invitrogen公司)进行抽提得到西尼卡谷病毒基因组RNA。分离过程依照供应商推荐的说明进行操作。简单过程如下：将250μl纯化的西尼卡谷病毒(～3×10¹²个病毒颗粒)与3倍体积的TRIZOL和240μl的氯仿共同混合。水相中含有西尼卡谷病毒RNA，用600μl的异丙醇进行沉淀。将RNA沉淀用70％的乙醇清洗两遍干燥后溶于经DEPC处理过的水中。通过测定260nm处的光密度值来估算RNA的量。取一份RNA，在1.25％的变性琼脂糖胶(Cambrex Bio Sciences Rockland Inc.，Rockland，ME美国)内进行电泳分析，用EB染色观察电泳条带并成像。

cDNA合成：通过RT-PCR合成西尼卡谷病毒基因组的cDNA。在标准条件下进行cDNA的合成：1μgRNA、AMV逆转录酶、oligo-dT引物。同时也可以考虑使用随机的14核苷酸。将扩增得到的cDNA克隆到pGEM-3Z(Promega)质粒中，随后将克隆进行测序分析。病毒基因组5’端的序列通过RACE进行克隆并测序。回收整理所有的测序及过从而生成完整的西尼卡谷病毒基因组序列。

全长基因组的克隆：设计6对SVV引物，通过3个PCR反应扩增出西尼卡谷病毒全长基因组序列中三个具有代表性的cDNA片段。在PCR反应中使用Turbo pfu聚合酶(Stratagene)。首先用引物5′西尼卡谷病毒-A(SEQ ID NO：219)和西尼卡谷病毒1029RT-RI(SEQ IDNO：220)扩增出西尼卡谷病毒基因组的5’端。将得到的片段用ApaI和EcoRI进行双酶切并用凝胶回收纯化。将回收纯化的片段与Nde-ApaT7西尼卡谷病毒(SEQ ID NO：221)相连。后者在5’端含有预先设计好的NdeI酶切位点，在序列中间含有T7核心启动子，而西尼卡谷病毒序列3’端开始的17个核苷酸中含有Apal酶切位点。将连接产物通过3步连接定向克隆到pGEM-3Z(Promega)载体的Nde I和Eco RI位点上，生成p个核苷酸X-03。其次用引物西尼卡谷病毒6056(SEQ ID NO：222)和西尼卡谷病毒7309NsiB(SEQ ID NO：223)扩增出病毒基因组的3’端。反向引物西尼卡谷病毒7309NsiB用于引入长约30个核苷酸的polyA尾。Nsi I可以识别3′端的序列并克隆到pGEM-3Z载体的PstI位点中。将得到的PCR产物用BamHI进行酶切并用凝胶回收。用引物西尼卡谷病毒91 1L(SEQ ID NO：224)和西尼卡谷病毒6157R(SEQ ID NO：225)扩增出覆盖西尼卡谷病毒基因组内部序列的片段，随后将PCR产物用EcoRI和BamHI进行酶切并用凝胶回收。上述两个胶回收产物代表了西尼卡谷病毒基因组中部和3’端的序列。通过3步连接反应将这两个片段克隆到pGEM-4Z载体的EcoRI和SmaI位点上。生成p个核苷酸X-02。为了生成西尼卡谷病毒全长cDNA序列，将p个核苷酸X-02用EcoRI和NsiI进行双酶切，得到6.3kb的片段，胶回收纯化后克隆到p个核苷酸X-03的EcoRI和PstI酶切位点上。最后得到的西尼卡谷病毒全长质粒被命名为p个核苷酸X-04。

可以对西尼卡谷病毒全长质粒p个核苷酸X-04的5′和3′端进行改造以利于其在体外转录并在西尼卡谷病毒RNA转染进PER.C6细胞后协助病毒包装。首先在polyA尾的下游***一个SwaI酶切位点，从而可以再体外转录之前将西尼卡谷病毒cDNA的3’端从质粒骨架上释放出来。以p个核苷酸X-04为模板，利用引物西尼卡谷病毒6056(SEQIDNO：222)和SVVSwaRev(SEQ ID NO：226)进行PCR扩增并引入酶切位点。反向引物SVV3SwaRev含有能代表西尼卡谷病毒序列3’端的58个核苷酸序列，并含有SwaI和SphI限制性酶切位点。得的PCR产物用BamHI和SphI进行双酶切并置换p个核苷酸X-04中的相应片段，生成p个核苷酸X-06。其次在p个核苷酸X-06载体中，用退火寡聚核苷酸双向法去除了位于T7启动子转录起始位点和西尼卡谷病毒cDNA5’端序之间的额外4个核苷酸。双向寡聚核苷酸中含有KpnI的识别位点、T7核心启动子且在西尼卡谷病毒序列3’端(SEQ ID NO：227)开始的17个核苷酸中含有Apal酶切位点。利用KpnI和ApaI酶切位点将退火寡聚核苷酸用于置换p个核苷酸X-06中的相应部分，生成p个核苷酸X-07。最后用PCR从西尼卡谷病毒cDNA中扩增出含有BamHI和SphI酶切位点的片段，***到p个核苷酸X-07载体的相应位点中，恢复原本在聚合酶编码区缺失的两对碱基，从而生成p个核苷酸X-09。

体外转录：首先用SwaI消化p个核苷酸X-09载体，将西尼卡谷病毒序列的3’端从质粒骨架中释放出来，随后在体外检测转录RNA的传染性。在体外用T7聚合酶(Promega)在体外转录线性的质粒。

将体外转录的RNA转染PER.C6细胞：在转染的前一天，将PER.C6接种于6孔板中进行培养。在第二天，利用Lipofetamine转染试剂(Invitrogen)在体外转染经转录得到的RNA(1.5μg)，具体操作过程参照供应商提供的说明书。在转染后36小时可以观察到因病毒复制而引起的细胞毒效应(CPE)。将转染的细胞进行三次冻融循环从而制备病毒裂解物，将病毒裂解物进一步感染PER.C6细胞以确定病毒RNA的感染效率。因此，全长西尼卡谷病毒cDNA克隆被证明具有感染性。

如上所述，可以按照标准实验步骤将含有西尼卡谷病毒全长基因组的质粒进行逆转录。得到的病毒RNA(100ng)可用于转染任何对天然西尼卡谷病毒允许的细胞株。而在众多细胞株中可以凭经验判断哪些细胞株适用于病毒RNA的有效转染。

实施例16

RGD-西尼卡谷病毒文库的构建

为了寻找构建西尼卡谷病毒衣壳蛋白突变体的最佳***位点(用寡聚核苷酸随机***法构建突变体)，应选择一种简单的模型***(RGD)。RGD(精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸)是一条短肽配体，可以与整合素相结合。构建成功的RGD-西尼卡谷病毒衍生病毒应具有以下特点：(1)***的基因序列不会改变西尼卡谷病毒特有的和理想的特性；(2)构建成功的RGD-西尼卡谷病毒病毒衍生病毒可以感染表达αvβ5整合素的细胞株。

含有完整的衣壳蛋白编码区的西尼卡谷病毒质粒可以在随机位点上进行单一切割，随后在相应位点***编码RGD多肽的核酸序列。如图56和57所示，通过采用常用的方法从西尼卡谷病毒质粒文库中构建病毒西尼卡谷病毒-RGD文库。

在衣壳编码区随机***cRGD寡聚核苷酸的简单步骤如下：首先构建编码2.1Kb西尼卡谷病毒衣壳蛋白区域的质粒(参见图56，“p西尼卡谷病毒衣壳蛋白”)。利用相应得酶对“p西尼卡谷病毒衣壳蛋白载体”进行单一位点随机剪切。所用的酶既可以是CviJI，也可以是内切酶V(参见图57)，具体方法将在下面进行介绍。分离得到经单一酶切的质粒后，将RGD序列***到载体中构建成p西尼卡谷病毒衣壳蛋白-RGD文库。

与其它随机剪切(例如超声断裂或物理剪切断裂)的方法相比，限制性内切酶CviJI在进行随机剪切时有许多优点。首先CviJI是一种平端内切酶，酶切末端不需要进行修复；其次CviJI的剪切具有随机性，不会出现酶切热点的情况。整个酶切过程简单而快速，将CviJI的浓度和酶切时间逐渐缩短直到大多数DNA质粒发生剪切而线性化(单一酶切)。酶切结果可以在标准琼脂糖凝胶电泳中进行观察，参见图57。分离目的条带，纯化后与RGD寡聚核苷酸连接。

另外一种随机剪切DNA的方法是内切酶V法(Kiyazaki，K.，Nucleic Acids Res..2002，30(24)：e139)。内切酶V可以在含有脲嘧啶的DNA上断裂脲嘧啶的3’的第二个和第三个磷酸键。该方法同样也可以用于进行随机剪切DNA，剪切的频度取决于PCR反应中调整dUTP的浓度。尽管剪切位点通常位于胸腺嘧啶(被脲嘧啶替换)下游2到3个碱基处，但同其它方法相比，该方法可以生成较少的热断点或冷断点。

随机的线性化质粒可以与cRGD寡聚核苷酸相连，将得到的p西尼卡谷病毒衣壳文库进行扩增并纯化。得到的众多核酸序列中既含有编码西尼卡谷病毒衣壳蛋白的序列，也含有编码cRGD的序列(参见图57和58)。随后将上述核酸序列克隆到缺少衣壳编码区的西尼卡谷病毒全长序列载体中，从而生成含有西尼卡谷病毒全长序列的文库(因为有cRGD的随机***，所以文库中衣壳蛋白各不相同)。将该文库转录成相应的RNA，将得到的RNA转染进允许细胞株中产生不同衣壳蛋白的各种西尼卡谷病毒衍生病毒(参见图59)。一旦可以回收得到RGD-西尼卡谷病毒病毒颗粒(“RGD-SVV文库”)，便从这些病毒中随机挑选若干株病毒(i.e.10 or more)进行测序分析。通过测序分析结果确定由RGD序列的***以及衣壳蛋白的多样性。

RGD-西尼卡谷病毒文库的体外筛选：通过检测***位点是否扩大了西尼卡谷病毒的感染谱来对SVV-RGD文库进行筛选。用RGD-西尼卡谷病毒文库感染表达α_vβ₅整合素的NSCLC细胞株(非小细胞肺癌细胞株，例如A549表达α_vβ₅)。只有那些具有功能且表达RGD的西尼卡谷病毒衍生病毒才能感染允许细胞并在细胞内复制。

运用高通量自动分析***(TECAN)进行体外筛选。该***具有液体处理的能力，可以在384孔板中同时孵育20种细胞并进行检测(参见图62和63)。感染30小时后，当观察到完全细胞毒性反应(CPE)时回收细胞，4℃ 1500rpm离心10分钟，弃去上清。将细胞沉淀用细胞培养上清重悬并进行三次冻融循环。4℃ 1500rpm离心10分钟后得到澄清的上清。两个循环的CsCl密度梯度离心可以有效的纯化西尼卡谷病毒病毒颗粒：第一步密度梯度离心(CsCl密度分别为CsCl 1.24g/ml和1.4g/ml)和紧接着的第二轮密度梯度离心(CsCl密度为1.33g/ml)。用吸收光谱法检测纯化后的病毒颗粒的浓度：A₂₆₀等以1时估算为9.5 x 10¹²个病毒颗粒(Scraba，D.G.and Palmenberg，A.C.，1999)。可将上述步骤重复多次直至从α_vβ₅细胞中回收到足够数量的病毒。

对回收到的RGD-西尼卡谷病毒衍生病毒进行分析：对少量样本(大约10-50个)的不同RGD-西尼卡谷病毒衍生病毒进行分析。将病毒混合物进行稀释以便对单个病毒颗粒进行分析。对每一中病毒衍生病毒进行检测，判断其是否能有效和特异的感染那些表达α_vβ₅细胞。对具有上述属性的每个病毒衍生病毒的衣壳区域进行测序分析以确定RGD的***位点。得到的cRGD-西尼卡谷病毒衍生病毒应具有以下特点：(1)病毒最初的各项特性依旧完整；(2)因为RGD可以与整合素结合，因此衍生病毒具有感染高表达整合素的细胞的能力。该方法的目的是为了鉴定哪个或哪几个位点适于RGD的***，并能因此能够扩大病毒衍生病毒的感染谱，改变西尼卡谷病毒病毒衍生病毒的趋向性。

根据与整合素结合的能力不同，将经过测序cRGD-西尼卡谷病毒衍生病毒进行编号和分类。为了检测结合活性，将重组的β₂整合素溶于PBS后固定于96孔板中，用PBS洗两次，用含有3％BSA的PBS封闭，随后与RGD孵育。将天然西尼卡谷病毒病毒(没有肽段***)孵育孔作为阴性对照。孵育1-5小时后用PBS至少洗三次，随后用抗西尼卡谷病毒的抗体检测有无西尼卡谷病毒的结合。RGD多肽或抗整合素的抗体具有和RGD-西尼卡谷病毒竞争结合整合素的能力。

将20个与整合素具有很强结合能力的cRGD-西尼卡谷病毒病毒衍生病毒进行分析，确定那些编码cRGD的寡聚核苷酸能够***成功的位点。对这些***位点进行研究可以对西尼卡谷病毒的趋向性有进一步的了解。在对***位点和其它已知结构进行分析的基础上，可以确定哪些位点适于随机序列的***(该方法也可用于制造西尼卡谷病毒衍生病毒)，而且***序列也可以是已知序列或随机序列。除了两种额外的和新的方法之外，构建有随机序列***SVV病毒衍生病毒的方法同上面构建RGD-西尼卡谷病毒文库的方法基本相同。为了避免在编码区域引入不必要的终止密码子或有害的氨基酸(例如半胱氨酸或脯氨酸)，Morphosys(Munich，Germany)发明了TRIM(三核苷酸诱变法)的技术，可用于生成***到编码衣壳蛋白的区域序列。TRIM可以在目的位置引入编码氨基酸的三个核苷酸(Virnekas，B.等人，Nucleic Acids Res.1994，22(25)：5600-5607)。西尼卡谷病毒显示的随机多肽的多样性为10⁸，该数量被认为是足够充分的，预期可以得到能特异性将病毒定位到肿瘤组织的多肽。按照前面介绍的方法在体外或建立有肿瘤模型的小鼠体内对西尼卡谷病毒显示的随机多肽进行检测。

实施例17：血清研究

猪是从USDA分离的病毒分离株的允许性宿主。将编号为MN88-36695的病毒分离株接种到无菌的猪体内从而产生抗血清(GP102)。该抗血清可以与其它所有USDA分离株和西尼卡谷病毒结合。该抗血清不会与24种常见的猪病毒结合，表明其有很好的特异性。同样也检测了该猪血清相对于1278(普拉姆岛病毒)的中和抗体作用。在美国采集血清，在29个血清样本中有8个为阳性，且滴度在1:57到1:36,500之间。

为了检测猪是否是西尼卡谷病毒的天然宿主，从各种动物体内采集血清样本，检测它们针对西尼卡谷病毒感染允许细胞而起中和抗体的能力。血清中和试验按照下述步骤进行：(1)将各种血清按照1:2和1:4的比例进行稀释；(2)同病毒的100 TCID₅₀相混合；(除了西尼卡谷病毒外，其它任何病毒也可以用于检测血清是否能中和其感染过程)；(3)37℃孵育1个小时；(4)将上述混合物加入到1 x 10⁴的PER.

细胞(或其它允许细胞)中；(5)37℃孵育3天；(6)用MTS法检测CPE。中和滴度的定义是能够100％中和西尼卡谷病毒(或其它感兴趣的病毒)感染过程的最高滴度。

血清中和试验的结果表明对于人和灵长动物群体而言，体内存在少量或没有中和抗体。在一项试验中，22个血清样本中没有一个表现出对西尼卡谷病毒有中和效应。而在另一项试验中，28个血清样本中只有1个含有中和抗体。在第三次试验中，来自Amish农民的50个血清样本中没有一例表现出中和效应。而另一项试验中，来自4个人种的52个血清样本中也没有一例表现出中和效应。

血清中和试验的结果表明农畜动物可以普遍产生SVV中和抗体。一项试验中，来自71种农畜动物的血清样本中有27个表现出中和效应，而另一项试验中，从无病农场采集的30例血清样本中有4例表现出中和效应。另一项试验中，50例牛血清样本中有10例表现出中和效应，而从野鼠采集的35个血清样本中有5例表现出中和效应。

将针对MN88-36694的抗血清进行血清中和试验，看其是否能够对西尼卡谷病毒起到中和作用(实施例2)。抗MN 88-36694的无菌猪血清能够中和西尼卡谷病毒的感染过程(SVV中和滴度为1:100)如前所述，该抗血清能与其USDA分离株和西尼卡谷病毒结合。因为采用间接免疫荧光的方法证明这些USDA病毒分离株同西尼卡谷病毒之间存在血清学交叉反应，所以认为这些病毒分离株属于西尼卡谷病毒样微小RNA病毒。

实施例18：西尼卡谷病毒和西尼卡谷病毒样微小RNA病毒

用间接免疫荧光试验检测下列病毒分离株：MN 88-36695，NC88-23626，IA 89-47552，NJ 90-10324，IL 92-48963，CA 131395；LA1278；IL 66289；IL 94-9356；MN/GA 99-29256；MN 99197和SC363649。GP102是针对MN 88-36695的抗血清，是通过将MN 88-36695接种到无菌猪体内后产生的。该抗血清可以与上述12种病毒分离株结合，提示它们之间在血清学上具有相关性。

将GP102抗血清用于西尼卡谷病毒的中和试验中。在该试验中，将不同稀释度的抗血清同已知剂量的西尼卡谷病毒(100TCID₅₀)相混合。将混合物置于37℃孵育1小时。随后取出一部分加入到1 x 10⁴个PER.

细胞中(或者是其它西尼卡谷病毒允许细胞株)，放置在37℃中孵育3天。随后检测孔中是否出现由病毒引起的细胞毒效应(CPE)。如果血清中含有中和抗体，则会中和并已知病毒感染PER.

细胞。用含有四唑盐的染料检测CPE，染料的吸光值的变化反应活细胞的数目。结果用血清在不同对数稀释度下活细胞占未感染对照细胞的百分比来表示(如图93所示)。数据表明西尼卡谷病毒同猪USDA病毒分离株在遗传学和血清学上相关联。

此外，在四种不同细胞株中检测MN88-36695病毒裂解物的细胞毒作用(如表4所示)。NCI-H446和HEK293细胞对MN 88-36695的允许性与其相对于西尼卡谷病毒的允许性相同，而NCI-H460和S8则不能被MN 88-36695感染。此外，MN88-36695同西尼卡谷病毒一样对PER.

细胞具有细胞毒性。从小鼠中提取的抗西尼卡谷病毒多克隆抗体也具有中和MN 88-36695的能力，结果如图94所示。能被抗西尼卡谷病毒的血清中和得MN 88-36695在血清学上与西尼卡谷病毒和其它分离株之间具有相关性。

表11：MN88-36695的细胞毒效应结果

细胞株	TCID₅₀(pfu/ml)	结果
细胞株	TCID₅₀(pfu/ml)	结果	NCI-H446	1.6 x 10-6	允许性
HEK293	1.3 x 10-2	收纳性	NCI-H446	1.6 x 10-6	允许性
HEK293	1.3 x 10-2	收纳性	NCI-H460	0	非允许性
S8	0	非允许性	NCI-H460	0	非允许性

对多个USDA分离株进行部分基因组序列分析发现，这些分离株与西尼卡谷病毒具有很高的种族(参见图87-89的序列比较结果)。表12显示的是西尼卡谷病毒与6个病毒株一致性序列所占的百分比。结果发现这些病毒在基因组3’端编码3D^pol和3’UTR区域(长约460个核苷酸)的一致性程度达到95-98％(参见图89)。每株USDA病毒都各有特点，且在核苷酸酸水平上与西尼卡谷病毒的一致性为95-98％。

表12：西尼卡谷病毒与6个USDA病毒株一致性序列所占的百分比

1	2	3	4	5	6	7		病毒名称
1	2	3	4	5	6	7		病毒名称	96.5	99.1	97.2	97.0	97.4	97.0	1	NJ 90-10324
		97.0	95.7	94.8	95.0	98.3*	2	CA 13195	96.5	99.1	97.2	97.0	97.4	97.0	1	NJ 90-10324
		97.0	95.7	94.8	95.0	98.3*	2	CA 13195			97.6	97.2	97.6	97.2	3	IA 89-47752
				95.4	96.1	96.3	4	IL 92-48963			97.6	97.2	97.6	97.2	3	IA 89-47752
				95.4	96.1	96.3	4	IL 92-48963					98.9	95.2	5	MN 88-36695
						95.4	6	NC 88-23626					98.9	95.2	5	MN 88-36695
						95.4	6	NC 88-23626							7	西尼卡谷病毒-001

在对两株病毒的P1(如图87所示)和2C(如图88所示)的部分基因进行测序分析后进一步确定了它们与西尼卡谷病毒之间具有很高的种族。相对于其它已知病毒而言(包括心病毒属)，这些USDA病毒分离株与西尼卡谷病毒的种族更高。将这些USDA病毒若干区域的序列与西尼卡谷病毒进行比较并构建邻近进化树(如图95A和95B所示)。构建的进化树分析结果进一步证实这些病毒之间高度相关，并且证明CA131395与西尼卡谷病毒的种族最近。

序列表

<110>Neotropix，Inc.

Hallenbeck，Paul L.

Police，Seshidar Reddy

Hales，Laura M.

<120>基于西尼加谷病毒的组合物和治疗疾病的方法

<130>287037.128W01

<140>TBD

<141>2006-03-13

<150>60/664,442

<151>2005-03-23

<150>60/726,313

<151>2005-10-13

<150>11/335,891

<151>2006-01-19

<160>227

<170>PatentIn Ver.3.2

<210>1

<211>5752

<212>DNA

<213>西尼卡谷病毒(Seneca Valley Virus)

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(1)..(2)

<223>a，t，c或g

<400>1

<210>2

<211>1890

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>可变氨基酸

<400>2

<210>3

<211>426

<212>DNA

<213>西尼卡谷病毒

<400>3

<210>4

<211>142

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>4

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<211>717

<212>DNA

<213>西尼卡谷病毒

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<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

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<212>DNA

<213>西尼卡谷病毒

<400>7

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<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

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<212>DNA

<213>西尼卡谷病毒

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<211>14

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

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<210>11

<211>384

<212>DNA

<213>西尼卡谷病毒

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<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>12

<210>13

<211>966

<212>DNA

<213>西尼卡谷病毒

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<210>14

<211>322

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

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<210>15

<211>270

<212>DNA

<213>西尼卡谷病毒

<400>15

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<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

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<212>DNA

<213>西尼卡谷病毒

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<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

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<211>633

<212>DNA

<213>西尼卡谷病毒

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<210>20

<211>211

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>20

<210>21

<211>1389

<212>DNA

<213>西尼卡谷病毒

<400>21

<210>22

<211>462

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>22

<210>23

<211>2292

<212>PRT

<213>脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus)

<400>23

<210>24

<211>2292

<212>PRT

<213>脑心肌炎病毒

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<211>2292

<212>PRT

<213>脑心肌炎病毒

<400>25

<210>26

<211>2292

<212>PRT

<213>脑心肌炎病毒

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<212>PRT

<213>脑心肌炎病毒

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<211>2292

<212>PRT

<213>脑心肌炎病毒

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<212>PRT

<213>脑心肌炎病毒

<400>29

<210>30

<211>2301

<212>PRT

<213>塞勒氏鼠脑脊髓炎病毒

<400>30

<210>31

<211>2303

<212>PRT

<213>塞勒氏鼠脑脊髓炎病毒

<400>31

<210>32

<211>2303

<212>PRT

<213>塞勒氏鼠脑脊髓炎病毒

<400>32

<210>33

<211>2307

<212>PRT

<213>塞勒氏鼠脑脊髓炎病毒

<400>33

<210>34

<211>930

<212>PRT

<213>塞勒氏鼠脑脊髓炎病毒

<220>

<221>MOD_RES

<222>(557)

<223>可变氨基酸

<400>34

<210>35

<211>142

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>35

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<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

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<211>259

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>37

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<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

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<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>39

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<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>40

<210>41

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<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

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<211>22

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>42

<210>43

<211>211

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>43

<210>44

<211>462

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>44

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<211>6

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>45

<210>46

<211>6

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>46

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<211>6

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>47

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<211>6

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

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<212>PRT

<213>猪捷申病毒(Porcine teschovirus)

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<211>22

<212>PRT

<213>猪捷申病毒

<400>50

<210>51

<211>22

<212>PRT

<213>猪捷申病毒

<400>51

<210>52

<211>22

<212>PRT

<213>猪捷申病毒

<400>52

<210>53

<211>22

<212>PRT

<213>猪捷申病毒

<400>53

<210>54

<211>22

<212>PRT

<213>猪捷申病毒

<400>54

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<211>22

<212>PRT

<213>猪捷申病毒

<400>55

<210>56

<211>22

<212>PRT

<213>猪捷申病毒

<400>56

<210>57

<211>22

<212>PRT

<213>猪捷申病毒

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<210>58

<211>22

<212>PRT

<213>猪捷申病毒

<400>58

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<211>22

<212>PRT

<213>猪捷申病毒

<400>59

<210>60

<211>22

<212>PRT

<213>猪捷申病毒

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<210>61

<211>19

<212>PRT

<213>***病毒(Foot and mouth disease virus)

<400>61

<210>62

<211>19

<212>PRT

<213>***病毒

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<211>19

<212>PRT

<213>***病毒

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<212>PRT

<213>***病毒

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<212>PRT

<213>***病毒

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<213>***病毒

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<213>***病毒

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<212>PRT

<213>***病毒

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<212>PRT

<213>***病毒

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<212>PRT

<213>***病毒

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<212>PRT

<213>***病毒

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<213>***病毒

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<212>PRT

<213>***病毒

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<213>***病毒

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<213>***病毒

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<213>***病毒

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<213>***病毒

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<213>***病毒

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<211>19

<212>PRT

<213>***病毒

<400>80

<210>81

<211>22

<212>PRT

<213>马鼻炎B病毒(Equine rhinitis virus)

<400>81

<210>82

<211>22

<212>PRT

<213>马鼻炎B病毒

<400>82

<210>83

<211>22

<212>PRT

<213>马鼻炎B病毒

<400>83

<210>84

<211>22

<212>PRT

<213>脑心肌炎病毒

<400>84

<210>85

<211>22

<212>PRT

<213>脑心肌炎病毒

<400>85

<210>86

<211>22

<212>PRT

<213>门哥病毒(Mengo virus)

<400>86

<210>87

<211>22

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>87

<210>88

<211>22

<212>PRT

<213>塞勒氏鼠脑脊髓炎病毒

<400>88

<210>89

<211>22

<212>PRT

<213>塞勒氏鼠脑脊髓炎病毒

<400>89

<210>90

<211>22

<212>PRT

<213>塞勒氏鼠脑脊髓炎病毒

<400>90

<210>91

<211>22

<212>PRT

<213>大鼠塞勒氏样病毒(Rat thei1er’s like virus)

<400>91

<210>92

<211>22

<212>PRT

<213>Ljungan病毒(Ljungan virus)

<400>92

<210>93

<211>22

<212>PRT

<213>Ljungan病毒

<400>93

<210>94

<211>22

<212>PRT

<213>Ljungan病毒

<400>94

<210>95

<211>22

<212>PRT

<213>Ljungan病毒

<400>95

<210>96

<211>22

<212>PRT

<213>布氏锥虫(Trypanosoma brucei)

<400>96

<210>97

<211>22

<212>PRT

<213>枯氏锥虫(Trypanosoma Cruzi)

<400>97

<210>98

<211>22

<212>PRT

<213>牛轮状病毒(Bovine rotavirus)

<400>98

<210>99

<211>22

<212>PRT

<213>人轮状病毒(Human rotavirus)

<400>99

<210>100

<211>23

<212>PRT

<213>猪轮状病毒(Porcine rotavirus)

<400>100

<210>101

<211>22

<212>PRT

<213>果蝇C病毒(Drosophila C virus)

<400>101

<210>102

<211>22

<212>PRT

<213>蟋蟀麻痹病毒(Cricket paralysis virus)

<400>102

<210>103

<211>22

<212>PRT

<213>急性蜜蜂麻痹病毒(Acute bee paralysis virus)

<400>103

<210>104

<211>22

<212>PRT

<213>蟋蟀麻痹病毒

<400>104

<210>105

<211>22

<212>PRT

<213>榕树透翅毒蛾微小RNA样病毒(Perina nuda picorna like virus)

<400>105

<210>106

<211>22

<212>PRT

<213>茶尺蠖核型微小RNA样病毒(Ectropis obliqua picorna like virus)

<400>106

<210>107

<211>22

<212>PRT

<213>榕树透翅毒蛾微小RNA样病毒

<400>107

<210>108

<211>22

<212>PRT

<213>茶尺蠖核型微小RNA样病毒

<400>108

<210>109

<211>22

<212>PRT

<213>残翅病毒(Deformed wing virus)

<400>109

<210>110

<211>22

<212>PRT

<213>Kakugo病毒

<400>110

<210>111

<211>4

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>111

<210>112

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：例示性的保守基序

<220>

<221>MOD_RES

<222>(2)..(3)

<223>可变残基

<220>

<221>MOD_RES

<222>(5)

<223>可变残基

<400>112

<210>113

<211>6

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>113

<210>114

<211>4

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>114

<210>115

<211>4

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>115

<210>116

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的

6-His标签肽

<400>116

<210>117

<211>4

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>117

<210>118

<211>4

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>118

<210>119

<211>4

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>119

<210>120

<211>4

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>120

<210>121

<211>4

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>121

<210>122

<211>4

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>122

<210>123

<211>4

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>123

<210>124

<211>4

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>124

<210>125

<211>4

<212>PRT

<213>脑心肌炎病毒

<400>125

<210>126

<211>4

<212>PRT

<213>脑心肌炎病毒

<400>126

<210>127

<211>4

<212>PRT

<213>脑心肌炎病毒

<400>127

<210>128

<211>4

<212>PRT

<213>脑心肌炎病毒

<400>128

<210>129

<211>4

<212>PRT

<213>脑心肌炎病毒

<400>129

<210>130

<211>4

<212>PRT

<213>脑心肌炎病毒

<400>130

<210>131

<211>4

<212>PRT

<213>脑心肌炎病毒

<400>131

<210>132

<211>4

<212>PRT

<213>脑心肌炎病毒

<400>132

<210>133

<211>4

<212>PRT

<213>脑心肌炎病毒

<400>133

<210>134

<211>4

<212>PRT

<213>脑心肌炎病毒

<400>134

<210>135

<211>4

<212>PRT

<213>脑心肌炎病毒

<400>135

<210>136

<211>4

<212>PRT

<213>脑心肌炎病毒

<400>136

<210>137

<211>4

<212>PRT

<213>脑心肌炎病毒

<400>137

<210>138

<211>4

<212>PRT

<213>塞勒氏鼠脑脊髓炎病毒(Theiler’s encephalomyelitis virus)

<400>138

<210>139°

<211>4

<212>PRT

<213>塞勒氏鼠脑脊髓炎病毒

<400>139

<210>140

<211>4

<212>PRT

<213>塞勒氏鼠脑脊髓炎病毒

<400>140

<210>141

<211>4

<212>PRT

<213>塞勒氏鼠脑脊髓炎病毒

<400>141

<210>142

<211>4

<212>PRT

<213>塞勒氏鼠脑脊髓炎病毒

<400>142

<210>143

<211>4

<212>PRT

<213>塞勒氏鼠脑脊髓炎病毒

<400>143

<210>144

<211>4

<212>PRT

<213>塞勒氏鼠脑脊髓炎病毒

<400>144

<210>145

<211>4

<212>PRT

<213>塞勒氏鼠脑脊髓炎病毒

<400>145

<210>146

<211>4

<212>PRT

<213>塞勒氏鼠脑脊髓炎病毒

<400>146

<210>147

<211>4

<212>PRT

<213>塞勒氏鼠脑脊髓炎病毒

<400>147

<210>148

<211>4

<212>PRT

<213>塞勒氏鼠脑脊髓炎病毒

<400>148

<210>149

<211>4

<212>PRT

<213>塞勒氏鼠脑脊髓炎病毒

<400>149

<210>150

<211>4

<212>PRT

<213>塞勒氏鼠脑脊髓炎病毒

<400>150

<210>151

<211>4

<212>PRT

<213>塞勒氏鼠脑脊髓炎病毒

<400>151

<210>152

<211>4

<212>PRT

<213>大鼠Theilo病毒(Rat Theilovirus)

<400>152

<210>153

<211>4

<212>PRT

<213>大鼠Theilo病毒

<400>153

<210>154

<211>4

<212>PRT

<213>大鼠Theilo病毒

<400>154

<210>155

<211>4

<212>PRT

<213>大鼠Theilo病毒

<400>155

<210>156

<211>4

<212>PRT

<213>大鼠Theilo病毒

<400>156

<210>157

<211>4

<212>PRT

<213>大鼠Theilo病毒

<400>157

<210>158

<211>4

<212>PRT

<213>大鼠Theilo病毒

<400>158

<210>159

<211>4

<212>PRT

<213>大鼠Theilo病毒

<400>159

<210>160

<211>4

<212>PRT

<213>大鼠Theilo病毒

<400>160

<210>161

<211>4

<212>PRT

<213>大鼠Theilo病毒

<400>161

<210>162

<211>4

<212>PRT

<213>大鼠Theilo病毒

<400>162

<210>163

<211>4

<212>PRT

<213>Vilyuisk人脑脊髓炎病毒(Vilyuisk human encephalomyelitis virus)

<400>163

<210>164

<211>4

<212>PRT

<213>Vilyuisk人脑脊髓炎病毒

<400>164

<210>165

<211>4

<212>PRT

<213>Vilyuisk人脑脊髓炎病毒

<400>165

<210>166

<211>4

<212>PRT

<213>Vilyuisk人脑脊髓炎病毒

<400>166

<210>167

<211>4

<212>PRT

<213>Vilyuisk人脑脊髓炎病毒

<400>167

<210>168

<211>7310

<212>DNA

<213>西尼卡谷病毒

<400>168

<210>169

<211>2181

<212>PRT

<213>西尼卡谷病毒

<400>169

<210>170

<211>1560

<212>DNA

<213>西尼卡谷病毒

<400>170

<210>171

<211>1560

<212>DNA

<213>微小RNA病毒

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>n是a，c，g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(51)..(51)

<223>n是a，c，g或t

<400>171

<210>172

<211>1560

<212>DNA

<213>微小RNA病毒

<400>172

<210>173

<211>936

<212>DNA

<213>微小RNA病毒

<400>173

<210>174

<211>936

<212>DNA

<213>微小RNA病毒

<400>174

<210>175

<211>936

<212>DNA

<213>微小RNA病毒

<400>175

<210>176

<211>936

<212>DNA

<213>微小RNA病毒

<400>176

<210>177

<211>936

<212>DNA

<213>微小RNA病毒

<400>177

<210>178

<211>1421

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>来自SVV和SVV样微小RNA病毒的在的VP2(部分)，VP3，VP1和2A(部分)的编码区

序列中的一致序列

<400>178

<210>179

<211>551

<212>DNA

<213>西尼卡谷病毒

<400>179

<210>180

<211>551

<212>DNA

<213>微小RNA病毒

<400>180

<210>181

<211>551

<212>DNA

<213>微小RNA病毒

<400>181

<210>182

<211>523

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>来自SVV和SVV样微小RNA病毒的在2C的部分编码区序列的一致序列

<400>182

<210>183

<211>460

<212>DNA

<213>西尼卡谷病毒

<400>183

<210>184

<211>460

<212>DNA

<213>微小RNA病毒

<220>

<221>misc_feature

<222>(19)..(19)

<223>n是a，c，g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(22)

<223>n是a，c，g或t

<400>184

<210>185

<211>460

<212>DNA

<213>微小RNA病毒

<220>

<221>misc_feature

<222>(40)..(40)

<223>n是a，c，g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(388)..(388)

<223>n是a，c，g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(403)..(403)

<223>n是a，c，g或t

<400>185

<210>186

<211>460

<212>DNA

<213>微小RNA病毒

<400>186

<210>187

<211>460

<212>DNA

<213>微小RNA病毒

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>n是a，c，g或t

<400>187

<210>188

<211>460

<212>DNA

<213>微小RNA病毒

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)..(11)

<223>n是a，c，g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(19)..(19)

<223>n是a，c，g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(28)..(28)

<223>n是a，c，g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(420)..(420)

<223>n是a，c，g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(422)..(422)

<223>n是a，c，g或t

<400>188

<210>189

<211>460

<212>DNA

<213>微小RNA病毒

<400>189

<210>190

<211>460

<212>DNA

<213>微小RNA病毒

<400>190

<210>191

<211>420

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>来自SVV和SVV样微小RNA病毒的在3D聚合酶和3’UTR区的部分编码区序列的一致

序列

<400>191

<210>192

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>192

<210>193

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>193

<210>194

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>194

<210>195

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>195

<210>196

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>196

<210>197

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>197

<210>198

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>198

<210>199

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>199

<210>200

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>200

<210>201

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>201

<210>202

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>202

<210>203

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>203

<210>204

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>204

<210>205

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>205

<210>206

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>206

<210>207

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>207

<210>208

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>208

<210>209

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>209

<210>210

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>210

<210>211

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>211

<210>212

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>212

<210>213

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>213

<210>214

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>214

<210>215

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>215

<210>216

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>216

<210>217

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>217

<210>218

<211>4

<212>PRT

<213>微小RNA病毒

<400>218

<210>219

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于西尼卡谷病毒的引物序列

<400>219

<210>220

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于西尼卡谷病毒的引物序列

<400>220

<210>221

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于生成西尼卡谷病毒的感染性质粒克隆的引物序列

<400>221

<210>222

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于生成西尼卡谷病毒的感染性质粒克隆的引物序列

<400>222

<210>223

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于生成西尼卡谷病毒的感染性质粒克隆的引物序列

<400>223

<210>224

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于生成西尼卡谷病毒的感染性克隆的引物序列

<400>224

<210>225

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于生成西尼卡谷病毒的感染性质粒克隆的引物序列

<400>225

<210>226

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于生成西尼卡谷病毒的感染性质粒克隆的引物序列

<400>226

<210>227

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于生成西尼卡谷病毒的感染性质粒克隆的引物序列

<400>227

Claims

1.分离的核酸，包括：与(i)SEQ ID NO：168或(ii)SEQ ID NO：168的长度至少为20个核苷酸的连续部分具有至少75％一致性的核酸序列。

2.权利要求1的分离的核酸，其中该核酸是RNA或DNA。

3.分离的多肽，包括：与(i)SEQ ID NO：169或(ii)SEQ IDNO：169的长度至少为10个氨基酸的连续部分具有至少75％一致性的氨基酸序列。

4.分离的西尼加谷病毒、或其衍生病毒或其相关病毒，其具有下述基因组，所述基因组包含与SEQ ID NO：168具有至少95％、90％、85％、80％、75％、70％或65％一致性的序列。

5.权利要求4的病毒，其具有下述特征：在肿瘤细胞中的复制能力、肿瘤细胞趋向性和在正常细胞中没有细胞裂解性。

6.权利要求5的病毒，其中所述病毒在具有神经内分泌特性的肿瘤细胞类型中具有复制能力。

7.药物组合物，其包括有效量的权利要求4-6中任一项的病毒和药学上可接受的载体。

8.分离的抗体，其特异性地结合权利要求3的多肽，或权利要求4或5任一项的分离的病毒的表位。

9.病毒在癌症治疗中的用途，所述病毒具有下述基因组，所述基因组包含与SEQ ID NO：168的至少为100个核苷酸的连续序列具有至少75％一致性的序列。

10.权利要求9的方法，其中该病毒为微小RNA病毒。

11.权利要求10的方法，其中该微小RNA病毒是心病毒。

12.权利要求11的方法，其中该心病毒选自：vilyuisk人脑脊髓炎病毒、塞勒氏鼠脑脊髓炎病毒和脑心肌炎病毒。

13.权利要求12的方法，其中该微小RNA病毒是西尼加谷病毒所属的属的成员。

14.权利要求10的方法，其中该微小RNA病毒是西尼卡谷病毒。

15.权利要求10的方法，其中该微小RNA病毒是西尼卡谷病毒样微小RNA病毒。

16.权利要求15的方法，其中该西尼卡谷病毒样微小RNA病毒选自：MN 88-36695、NC 88-23626、IA 89-47552、NJ 90-10324、IL 92-48963、CA 131395、LA 1278、IL 66289、IL 94-9356、MN/GA 99-29256、MN99197和SC 363649。

17.杀死异常增殖的细胞的方法，包括使该细胞与权利要求4-6中任一项的病毒接触。

18.制备肿瘤细胞裂解性病毒的方法，该方法包括：

(a)比较西尼卡谷病毒的基因组序列与待测病毒的基因组序列，其中西尼卡谷病毒的基因组包含与SEQ ID NO：168具有至少95％一致性的序列；

(b)鉴定至少第一个在西尼卡谷病毒的基因组序列编码的多肽和待测病毒的基因组序列编码的多肽之间的氨基酸的差异；

(c)突变待测病毒的基因组序列，使得由待测病毒的基团组序列编码的多肽与西尼卡谷病毒的基因组编码的多肽之间的氨基酸的差异至少减少1个；

(d)将突变后的待测病毒的基因组序列转染进肿瘤细胞中；和

(e)测定肿瘤细胞是否被突变后的待测病毒的基因组序列裂解性地感染。

19.权利要求18的方法，其中该待测病毒为微小RNA病毒。

20.权利要求19的方法，其中该待测病毒为西尼卡谷病毒样微小RNA病毒。

21.权利要求18的方法，其中该氨基酸差异是西尼卡谷病毒衣壳蛋白和待测病毒衣壳蛋白之间的氨基酸差异。

22.权利要求18的方法，其中突变待测病毒的基因组序列包括对具有待测病毒的基因组序列的cDNA进行突变。

23.权利要求18的方法，其中转染突变后的待测病毒的基因组序列包括转染RNA，其中RNA产生自具有突变后的待测病毒的基因组序列的cDNA。

24.制备具有改变的细胞类型趋向性的突变体病毒，该方法包括：

(a)创建含有多种核酸序列的病毒突变体文库，其中该病毒突变体文库创建自下述亲本序列，所述亲本序列包含与的SEQ ID NO：168的长度至少为100个核苷酸的连续部分具有至少75％一致性的核苷酸序列；

(b)将该病毒突变体文库转染到允许细胞中，从而产生多种突变体病毒；

(c)分离多种突变体病毒；

(d)将非允许细胞与分离的多种突变体病毒孵育；和

(e)回收非允许细胞中产生的突变体病毒，据此制备具有改变的趋向性的突变体病毒。

25.权利要求24的方法，其还包括：

(f)将回收的突变体病毒在非允许细胞中孵育；和

(g)回收在非允许细胞中产生的突变体病毒。

26.权利要求25的方法，其还包括反复重复步骤(f)和(g)。

27.权利要求25的方法，其中在多孔高通量平台中进行孵育，其中该平台在每个孔内含有不同的非允许细胞类型。

28.权利要求27的方法，其还包括筛选该平台以鉴定含有杀死细胞的突变体病毒的孔。

29.权利要求28的方法，其中通过分析每个孔的光吸收度进行筛选。

30.权利要求24的方法，其中非允许细胞是肿瘤细胞。

31.权利要求24的方法，其中创建病毒突变体文库包括：

(i)提供具有与亲本序列的部分相一致的序列的多核苷酸；

(ii)为了生成多种不同的突变体多核苷酸序列而突变该多核苷酸；和

(iii)将多种突变的多核苷酸连接到具有除了步骤(i)的多核苷酸所含的病毒基因组序列部分之外的病毒基因组序列的载体中，据此创建病毒突变体文库。

32.权利要求31的方法，其中在步骤(i)中，该病毒基因组序列来自微小RNA病毒。

33.权利要求32的方法，其中微小RNA病毒是西尼加谷病毒样微小RNA病毒。

34.权利要求31的方法，其中通过将核苷酸随机***到多核苷酸中进行步骤(ii)的突变。

35.权利要求34的方法，其中在多核苷酸的衣壳编码区域中进行步骤(ii)的突变。

36.权利要求34的方法，其中通过三核苷酸诱变法(TRIM)进行核苷酸的随机***。

37.权利要求36的方法，其中***多核苷酸中的核苷酸的至少一部分编码表位标签。