CN109609647A - 基于二代测序的用于泛癌种靶向、化疗及免疫用药的检测Panel、检测试剂盒及其应用 - Google Patents

基于二代测序的用于泛癌种靶向、化疗及免疫用药的检测Panel、检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于二代测序的用于泛癌种靶向、化疗及免疫用药的检测panel、检测试剂盒及其应用。其中，该检测panel包括泛癌种分型、治疗、预后相关的基因突变，肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域和微卫星不稳定性位点。应用本发明的技术方案，检测panel包括泛癌种分型、治疗、预后相关的基因突变、肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域和微卫星不稳定性位点，其包括的基因信息全面，能够直接对多种肿瘤变异进行联合检测，应用于靶向药、化疗药或免疫药的伴随诊断可以得到精准的结果。

Description

基于二代测序的用于泛癌种靶向、化疗及免疫用药的检测 Panel、检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种基于二代测序的用于泛癌种靶向、化疗及免疫用药的检测panel、检测试剂盒及其应用。
背景技术
目前，癌症相关的检测技术很多，例如高通量测序、目标区域捕获测序、液体活检、肿瘤突变负荷和MSI检测等。
其中，高通量测序(High-Throughput Sequencing)又名下一代测序(NextGeneration Sequencing，NGS)，是相对于传统的桑格测序(Sanger Sequencing)而言的。
在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，将片段化的基因组DNA两侧连上接头,随后用不同的方法产生几百万个空间固定的PCR克隆阵列。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。然后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都在同一平面上(flowcell)，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，DNA序列延伸和成像检测不断重复，最后经过计算机分析就可以获得完整的DNA序列信息。一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定又称深度测序(Deep sequencing)。
NGS检测方法通量高，同一样本仅需要进行一个文库构建和捕获，就可以对大量的基因进行检测，满足临床检测的需求，不需要大量的样本量即可进行多个基因的检测，既可以对已知突变位点进行检测，也能对未知突变位点进行检测，此外NGS检测方法还可以对各种突变类型进行检测，对临床上的各类样本，如全血、组织、FFPE样本、cfDNA等其他样本类型均能够进行检测。
目标区域捕获测序，第二代测序结合微阵列技术而衍生出来的应用，目标序列捕获测序技术(Targeted Resequencing)。这项技术首先利用微阵列技术合成大量寡核苷酸探针，这些寡核苷酸探针能够与基因组上的特定区域互补结合，从而富集到特定区段，然后用第二代测序技术对这些区段进行测序。其测序原理是基于DNA杂交原理，利用目标基因组区域定制的探针与基因组DNA进行芯片杂交或溶液杂交，将目标基因区域DNA富集，再通过NGS技术进行测序。测序所选定的目标区域可以是连续的DNA序列，也可以是分布在同一个染色体不同区域或不同染色体上的片段。
液体活检就是通过采集血液或者尿液等对癌症等疾病做出诊断。与传统的手术活检和穿刺活检相比，液体活检的优势在于：1)操作简便，传统活检依赖于影像学的发现，定位肿瘤的准确位置和大小后进行手术或者穿刺操作，操作性难，而液体活检则不需要影像学支持；2)非侵入式，传统的方式由于其侵入式操作，往往带有并发症，肿瘤复发风险，液体活检则仅仅是抽取一定量的血液，风险小；3)取样方便。传统穿刺和手术取样本对患者伤害较大，而液体活检一般只需要5～10ml血液，支持重复多次取样；4)有效应对肿瘤异质性。传统取样受取样部位的原因可能出现取不到肿瘤组织的问题，而血液中可能包含不同突变肿瘤细胞的信息。5)成本低。较传统检测方法价格便宜。
肿瘤突变负荷(TMB)是评估基因的外显子编码区每兆碱基中发生置换和***/缺失突变的总数，具有良好前景的全新生物标志物，TMB可定量估计肿瘤样本中基因组编码区的突变总数。具有较高水平TMB的肿瘤细胞更容易被免疫***识别，其原因是体细胞的突变可转录/表达成RNA/蛋白水平，产生新的抗原、蛋白片段或多肽段等，这些新的蛋白被自身免疫***识别为非自身抗原，激活T细胞，引起免疫反应。因此，当每兆碱基中累积的基因变异数目增多时，就可以产生很多新的抗原，就越容易被免疫细胞识别。从而能对检查点抑制剂有更强的免疫应答，也就是说，TMB越高，患者或许熊免疫治疗中获益越多。目前，在很多研究中都证实TMB和肿瘤新生抗原与免疫检查点抑制剂的疗效是相关的，利用先进的二代测序技术，外显子测序方法检测肿瘤突变负荷，为临床个性化治疗提供解决方案。
微卫星(Microsatellite)是遍布于人类基因组中的短串联重复序列，有单核苷酸、双核苷酸或高位核苷酸的重复，重复次数10～50次。与正常细胞相比，肿瘤细胞内的微卫星由于重复单位的***或缺失而导致微卫星长度的改变，就叫做微卫星不稳定性(MSI，microsatellite instability)。大量研究表明，MSI是由错配修复(MMR)基因发生缺陷引起的，与肿瘤的发生密切相关。MMR***由一系列特异性修复DNA碱基错配的酶组成，它们能够查出并纠正DNA复制及损伤过程中出现的错配或未配的碱基，保证复制的精确性。当肿瘤细胞中存在MMR基因功能缺失(Mis-Match Repair deficiency，简称dMMR)时，标志肿瘤细胞失去对DNA复制错误的修复能力，肿瘤细胞内将积累大量突变，就会伴随出现微卫星不稳定性(MSI)特征，造成细胞增殖分化异常和肿瘤的发生。MSI是评价MMR***功能的标记。根据MSI不稳定性和程度，可分为微卫星高度不稳定型(MSI-H)、微卫星低度不稳定型(MSI-L)和微卫星稳定型(MSS)。MSI检测可用于：1)II期结直肠癌患者用药指导和预后预测；2)Lynch(林奇)综合征的筛查；2)PD-1免疫治疗的获益预测。检测方法：同时提取同一患者的正常组织和肿瘤组织样本DNA，采用多重荧光PCR的方法对检测位点进行扩增，再通过毛细管电泳对扩增产物进行检测，并利用专业软件对两种组织来源检测结果进行对比分析，能准确的给患者MSI状态进行分型。
但是每种检测方法各存不同的优势与缺点，目前市场上的产品并不能全面的对待测样本进行检测。
发明内容
本发明旨在提供一种基于二代测序的用于泛癌种靶向、化疗及免疫用药的检测panel、检测试剂盒及其应用，以解决现有技术中不能全面的待测样本进行检测的技术问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种基于二代测序的用于泛癌种靶向、化疗及免疫用药的检测panel。该检测panel包括用于进行联合检测的泛癌种分型、治疗、预后相关的基因突变，肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域和微卫星不稳定性位点。
进一步地，泛癌种分型、治疗、预后相关的基因突变、肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域包括ABCA13、ABCA8、ABL1、ACADSB、ACOT13、ADAMTS6、ADRB1、ADSS、AGPAT9、AK7、AKT1、AKT2、AKT3、ALG9、ALK、ALK_fus、ALOX12B、ALS2CR11、AMER1、ANKRA2、ANKRD46、ANO1、APC、APOPT1、AR、ARAF、ARHGAP4、ARHGAP6、ARID1A、ARID1B、ARID2、ARID4A、ARL6IP6、ARMC5、ARPC2、ASH1L、ASXL1、ATM、ATP9B、ATR、ATRX、AURKA、AURKB、AXIN1、AXL、B2M、BAP1、BARD1、BAT-25、BAT-26、BCL2、BCL2L1、BCOR、BCYRN1、BLM、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRIP1、BRS3、BTF3、BTG1、BTK、C20orf96、C22orf23、C5orf42、C9orf72、CAB39、CALD1、CALM2、CALR、CARD11、CASP8、CAST,ERAP1、CBFB、CBL、CBR4、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CCR4、CD274、CD40、CD74_fus、CD79A、CD79B、CDC25B、CDC73、CDH1、CDK12、CDK4、CDK6、CDK7、CDK8、CDKL3、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CDO1、CEBPA、CEP120、CHD1、CHEK1、CHEK2、CIC、CNKSR3、CNOT8、COSM1316144、COSM1316145、COSM1332498、COSM3676668、COSM3747491、COSM5045664、COX18、CREBBP、CRKL、CRLF2、CSF1R、CSF3R、CTAGE5、CTCF、CTNNB1、CUL3、CXCR4、CYFIP1、CYLD、DAXX、DBT、DDR2、DEPDC5、DIAPH1、DICER1、DIS3、DNMT3A、DOCK11、DOT1L、DROSHA、DSCAM、DXS6804、DXS7132、DXS7423、DYS391、DYS438、DYS458、EGFR、EGFR_fus、EIF4G3、EML4_fus、EP300、EPHA3、EPHA5、EPHA7、EPHB1、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC4、ERG、ERI1、ERRFI1、ESR1、ETV1、ETV6、ETV6_fus、EWSR1_fus、EXOSC8、EZH2、EZR_fus、F13A1、FAM149A、FAM153B、FAM46C、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCG、FANCI、FAS、FAT1、FBXW7、FGF16、FGF19、FGF3、FGF4、FGFR1、FGFR2、FGFR2_fus、FGFR3、FGFR4、FH、FLCN、FLOT1、FLT1、FLT3、FLT4、FMO1、FOLH1、FOXL2、FOXP1、FRAS1、FUBP1、FUS_fus、GABRP、GANC、GATA1、GATA2、GATA3、GLI1、GMEB1、GNA11、GNA13、GNAQ、GNAS、GPM6A、GRIN2A、GSK3B、GSTM1、H3F3A、HAUS2、HCAR2、HEY1_fus、HGF、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HNF1A、HNRNPH1、HRAS、HSPA1B、HSPA4、HYOU1、IARS、ID2、ID3、IDH1、IDH2、IGF1R、IGF2、IKBKE、IKZF1、IL7R、IL8、INHBA、INPP4B、IPO7、IRAK1、IRF4、IRF6、IRF8、IRS2、ITGAL、JAK1、JAK2、JAK3、JUN、KCNJ2、KDM5A、KDM5C、KDM6A、KDR、KEAP1、KIAA1210、KIAA1432、KIF5B_fus、KIR3DX1、KIT、KMT2A、KMT2C、KMT2D、KPNA4、KPNB1、KRAS、LAMA3、LEPR、LMO1、LOC100131626、LONRF3、LRRC34、LYN、MAGOHB、MALT1、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MAP3K4、MAP4K5、MAPK1、MAPKAP1、MARK2、MCL1、MDM2、MDM4、MED12、MED19、MEF2B、MEIS1、MEN1、MET、MIR1273H、MITF、MLH1、MMP16、MONO-27、MOV10L1、MPL、MRE11A、MRPL19、MSH2、MSH3、MSH6、MTF1、MTOR、MTRR、MUTYH、MYADM、MYC、MYCL、MYCN、MYD88、MYO10、NAB1、NAB2_fus、NBN、NCOA6、NDUFS1、NEO1、NF1、NF2、NFE2L2、NFKBIA、NFXL1、NKX2-1、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NPM1、NR-21、NR-24、NR4A3_fus、NRAS、NSD1、NT5C2、NTRK1、NTRK1_fus、NTRK2、NTRK2_fus、NTRK3、NTRK3_fus、NUP85、NUP93、P2RY8、PALB2、PAPOLG、PAQR8、PARK2、PARP1、PAX5、PBRM1、PDCD1、PDCD1LG2、PDE6C、PDGFB_fus、PDGFRA、PDGFRB、PDPN、PIGF、PIK3C2G、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PLCG2、PLEKHA1、PLEKHH2、PMS2、PNO1、POLD1、POLE、PPARG、PPHLN1_fus、PPP2R1A、PRDM1、PREX2、PRKAR1A、PRKCI、PRPF39、PTCH1、PTEN、PTPN11、PTPRJ、PURA、RABGAP1L、RAC1、RAD21、RAD50、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD52、RAD54L、RAF1、RARA、RB1、RBM10、RBM27、REL、RET、RET_fus、RHOT1、RICTOR、RIPK2、RNF19A、RNF43、ROS1、ROS1_fus、RPA4、RPTOR、RRP1B、RUNX1、RYR2、SASH1、SDHA、SDHB、SDHC、SDHD、SEL1L3、SETD2、SF3B1、SHROOM3、SIPA1L2、SLC34A2_fus、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SMO、SNX6、SOCS1、SOX2、SOX9、SPC24、SPEN、SPOP、SRC、SS18_fus、STAG2、STAT3、STK11、STMN1、STRBP、SUCLG1、SUFU、SUGCT、SYK、TAF15、TAGAP、TBC1D8B、TBX3、TECPR2、TERT、TET2、TGFBR2、TMEM67、TMPRSS15、TMPRSS2、TNFAIP3、TNFRSF14、TNFSF13B、TNKS、TNRC18、TOP1、TOP2B、TP53、TPH1、TRA2A、TRIM24、TSC1、TSC2、TSHR、TSN、TXNRD1、U2AF1、UBE2E3、UBE3C、ULK4、UPF2、UTY、VEGFA、VHL、VSIG10、WHSC1、WHSC1L1、WT1、WWC3、XPO1、ZBBX、ZDHHC17、ZNF711、ZNF805和ZZZ3。
进一步地，微卫星不稳定性位点包括rs1045642、rs1052555、rs10981694、rs11045585、rs1105525、rs1130214、rs1138272、rs115232898、rs11572080、rs11598702、rs11615、rs12613732、rs12762549、rs13181、rs151264360、rs1517114、rs1570360、rs1650697、rs1650723、rs1695、rs1799793、rs1801019、rs1801131、rs1801133、rs1801265、rs1805087、rs183484、rs1934951、rs2032582、rs2072671、rs2075252、rs2228001、rs2273618、rs2291075、rs2291767、rs2297595、rs2494752、rs2501873、rs25487、rs2784917、rs28738963、rs316019、rs3212986、rs3745274、rs3892097、rs3918290、rs3957357、rs4148323、rs4244285、rs430397、rs442767、rs4646、rs4673、rs4673993、rs4728709、rs4880、rs50872、rs55886062、rs60369023、rs67376798、rs699947、rs716274、rs7779029、rs7851395、rs8133052、rs8175347、rs873478、rs9679162和rs9937。
根据本发明的另一个方面，提供一种基于二代测序的用于泛癌种靶向、化疗及免疫用药的检测试剂盒。该检测试剂盒包含检测探针，检测探针针对泛癌种分型、治疗、预后相关的基因突变，微卫星不稳定性位点和肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域。
进一步地，检测探针覆盖区域/目标区域>＝99％。
进一步地，泛癌种分型、治疗、预后相关的基因突变和肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域包括：ABCA13、ABCA8、ABL1、ACADSB、ACOT13、ADAMTS6、ADRB1、ADSS、AGPAT9、AK7、AKT1、AKT2、AKT3、ALG9、ALK、ALK_fus、ALOX12B、ALS2CR11、AMER1、ANKRA2、ANKRD46、ANO1、APC、APOPT1、AR、ARAF、ARHGAP4、ARHGAP6、ARID1A、ARID1B、ARID2、ARID4A、ARL6IP6、ARMC5、ARPC2、ASH1L、ASXL1、ATM、ATP9B、ATR、ATRX、AURKA、AURKB、AXIN1、AXL、B2M、BAP1、BARD1、BAT-25、BAT-26、BCL2、BCL2L1、BCOR、BCYRN1、BLM、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRIP1、BRS3、BTF3、BTG1、BTK、C20orf96、C22orf23、C5orf42、C9orf72、CAB39、CALD1、CALM2、CALR、CARD11、CASP8、CAST,ERAP1、CBFB、CBL、CBR4、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CCR4、CD274、CD40、CD74_fus、CD79A、CD79B、CDC25B、CDC73、CDH1、CDK12、CDK4、CDK6、CDK7、CDK8、CDKL3、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CDO1、CEBPA、CEP120、CHD1、CHEK1、CHEK2、CIC、CNKSR3、CNOT8、COSM1316144、COSM1316145、COSM1332498、COSM3676668、COSM3747491、COSM5045664、COX18、CREBBP、CRKL、CRLF2、CSF1R、CSF3R、CTAGE5、CTCF、CTNNB1、CUL3、CXCR4、CYFIP1、CYLD、DAXX、DBT、DDR2、DEPDC5、DIAPH1、DICER1、DIS3、DNMT3A、DOCK11、DOT1L、DROSHA、DSCAM、DXS6804、DXS7132、DXS7423、DYS391、DYS438、DYS458、EGFR、EGFR_fus、EIF4G3、EML4_fus、EP300、EPHA3、EPHA5、EPHA7、EPHB1、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC4、ERG、ERI1、ERRFI1、ESR1、ETV1、ETV6、ETV6_fus、EWSR1_fus、EXOSC8、EZH2、EZR_fus、F13A1、FAM149A、FAM153B、FAM46C、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCG、FANCI、FAS、FAT1、FBXW7、FGF16、FGF19、FGF3、FGF4、FGFR1、FGFR2、FGFR2_fus、FGFR3、FGFR4、FH、FLCN、FLOT1、FLT1、FLT3、FLT4、FMO1、FOLH1、FOXL2、FOXP1、FRAS1、FUBP1、FUS_fus、GABRP、GANC、GATA1、GATA2、GATA3、GLI1、GMEB1、GNA11、GNA13、GNAQ、GNAS、GPM6A、GRIN2A、GSK3B、GSTM1、H3F3A、HAUS2、HCAR2、HEY1_fus、HGF、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HNF1A、HNRNPH1、HRAS、HSPA1B、HSPA4、HYOU1、IARS、ID2、ID3、IDH1、IDH2、IGF1R、IGF2、IKBKE、IKZF1、IL7R、IL8、INHBA、INPP4B、IPO7、IRAK1、IRF4、IRF6、IRF8、IRS2、ITGAL、JAK1、JAK2、JAK3、JUN、KCNJ2、KDM5A、KDM5C、KDM6A、KDR、KEAP1、KIAA1210、KIAA1432、KIF5B_fus、KIR3DX1、KIT、KMT2A、KMT2C、KMT2D、KPNA4、KPNB1、KRAS、LAMA3、LEPR、LMO1、LOC100131626、LONRF3、LRRC34、LYN、MAGOHB、MALT1、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MAP3K4、MAP4K5、MAPK1、MAPKAP1、MARK2、MCL1、MDM2、MDM4、MED12、MED19、MEF2B、MEIS1、MEN1、MET、MIR1273H、MITF、MLH1、MMP16、MONO-27、MOV10L1、MPL、MRE11A、MRPL19、MSH2、MSH3、MSH6、MTF1、MTOR、MTRR、MUTYH、MYADM、MYC、MYCL、MYCN、MYD88、MYO10、NAB1、NAB2_fus、NBN、NCOA6、NDUFS1、NEO1、NF1、NF2、NFE2L2、NFKBIA、NFXL1、NKX2-1、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NPM1、NR-21、NR-24、NR4A3_fus、NRAS、NSD1、NT5C2、NTRK1、NTRK1_fus、NTRK2、NTRK2_fus、NTRK3、NTRK3_fus、NUP85、NUP93、P2RY8、PALB2、PAPOLG、PAQR8、PARK2、PARP1、PAX5、PBRM1、PDCD1、PDCD1LG2、PDE6C、PDGFB_fus、PDGFRA、PDGFRB、PDPN、PIGF、PIK3C2G、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PLCG2、PLEKHA1、PLEKHH2、PMS2、PNO1、POLD1、POLE、PPARG、PPHLN1_fus、PPP2R1A、PRDM1、PREX2、PRKAR1A、PRKCI、PRPF39、PTCH1、PTEN、PTPN11、PTPRJ、PURA、RABGAP1L、RAC1、RAD21、RAD50、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD52、RAD54L、RAF1、RARA、RB1、RBM10、RBM27、REL、RET、RET_fus、RHOT1、RICTOR、RIPK2、RNF19A、RNF43、ROS1、ROS1_fus、RPA4、RPTOR、RRP1B、RUNX1、RYR2、SASH1、SDHA、SDHB、SDHC、SDHD、SEL1L3、SETD2、SF3B1、SHROOM3、SIPA1L2、SLC34A2_fus、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SMO、SNX6、SOCS1、SOX2、SOX9、SPC24、SPEN、SPOP、SRC、SS18_fus、STAG2、STAT3、STK11、STMN1、STRBP、SUCLG1、SUFU、SUGCT、SYK、TAF15、TAGAP、TBC1D8B、TBX3、TECPR2、TERT、TET2、TGFBR2、TMEM67、TMPRSS15、TMPRSS2、TNFAIP3、TNFRSF14、TNFSF13B、TNKS、TNRC18、TOP1、TOP2B、TP53、TPH1、TRA2A、TRIM24、TSC1、TSC2、TSHR、TSN、TXNRD1、U2AF1、UBE2E3、UBE3C、ULK4、UPF2、UTY、VEGFA、VHL、VSIG10、WHSC1、WHSC1L1、WT1、WWC3、XPO1、ZBBX、ZDHHC17、ZNF711、ZNF805和ZZZ3。
进一步地，微卫星不稳定性位点包括rs1045642、rs1052555、rs10981694、rs11045585、rs1105525、rs1130214、rs1138272、rs115232898、rs11572080、rs11598702、rs11615、rs12613732、rs12762549、rs13181、rs151264360、rs1517114、rs1570360、rs1650697、rs1650723、rs1695、rs1799793、rs1801019、rs1801131、rs1801133、rs1801265、rs1805087、rs183484、rs1934951、rs2032582、rs2072671、rs2075252、rs2228001、rs2273618、rs2291075、rs2291767、rs2297595、rs2494752、rs2501873、rs25487、rs2784917、rs28738963、rs316019、rs3212986、rs3745274、rs3892097、rs3918290、rs3957357、rs4148323、rs4244285、rs430397、rs442767、rs4646、rs4673、rs4673993、rs4728709、rs4880、rs50872、rs55886062、rs60369023、rs67376798、rs699947、rs716274、rs7779029、rs7851395、rs8133052、rs8175347、rs873478、rs9679162和rs9937。
根据本发明的再一方面，提供了一种上述基于二代测序的用于泛癌种靶向、化疗及免疫用药的检测panel或上述基于二代测序的用于泛癌种靶向、化疗及免疫用药的检测试剂盒在制备用于泛癌种分型、治疗、预后相关的基因突变，微卫星不稳定性位点和肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域联合检测的装置中的应用。
进一步地，泛癌种包括但不限于：肺癌、肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌和子宫内膜癌等等。
进一步地，联合检测包括多种突变类型的检测，包括多种突变类型：点突变、融合、拷贝数变异、缺失和***突变；优选的，应用包括靶向药、化疗药或免疫药的伴随诊断。
本发明的检测panel的设计不是简单的将多个基因区域加和，而是通过设计整合不同突变类型信息的共有区域，提高panel均一性，降低panel整体数据量，减小成本。
检测panel包括泛癌种分型、治疗、预后相关的基因、肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域和微卫星不稳定性位点，其包括的基因信息量大，可以更好的进行联合检测，应用于靶向药、化疗药或免疫药的伴随诊断可以得到更加精准的结果。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了实施例4中关于实施例1的检测panel(P12)与全外探针的检测一致性结果图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
癌症发生的机制非常复杂，对于不同癌症甚至患有相同癌症的患者，导致癌症发生的分子机制和组织病理通路都不尽相同，即使是同一个部位的肿瘤，治疗效果和方法也应因人而异，这种因人、因病而采取的不同疾病治疗方法称为“个体化治疗”。因此在癌症治疗过程中，只有同病异治，因人而异，实施个体化治疗，才能针对不同类型的病人选择合适他们的药物。
随着基因分子水平研究的不断深入，越来越多的肿瘤细胞信号通路被发现，大量临床研究表明，通路中的特定基因的扩增/突变/表达状态与靶向、化疗药物的有效性密切相关。因此，临床上检测这些通路中特定基因的扩增/突变/表达情况，能针对性地为每位患者量身定做一套最适合的治疗方案，从而最大程度地提高治疗的有效率，减少药物的毒副作用，避免用药不当贻误治疗时机。
目前市场上的癌症相关的检测产品所涉及的技术各存不同的优势与缺点，并不能全面的待测样本进行检测。
针对此，本发明提供以下技术方案：根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种基于二代测序的用于泛癌种靶向、化疗及免疫用药的检测panel。该检测panel包括用于进行联合检测的泛癌种分型、治疗、预后相关的基因突变(此处的“基因突变”也可以说是与泛癌种分型、治疗、预后相关的突变基因)、肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域和微卫星不稳定性位点。
现有技术中的产品不能全面的对泛癌种的组织和血液样本同时进行多种肿瘤变异的联合检测。本发明的panel和试剂盒能够对泛癌种分型、治疗、预后相关的基因突变，肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域和微卫星不稳定性位点同时进行联合检测。且样本类型涵盖组织和血液。
本发明的panel设计不是简单的加和，而是根据需求对检测基因的类型进行了选择，避免panel区域冗余，减少无价值数据的产出，缩短数据分析周期，降低检测成本。
应用本发明的技术方案，检测panel包括泛癌种分型、治疗、预后相关的基因突变，肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域和微卫星不稳定性位点，其包括的基因信息量大，可以更好的进行联合检测，应用于靶向药、化疗药或免疫药的伴随诊断可以得到更加精准的结果。
优选的，泛癌种分型、治疗、预后相关的基因突变，肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域包括ABCA13、ABCA8、ABL1、ACADSB、ACOT13、ADAMTS6、ADRB1、ADSS、AGPAT9、AK7、AKT1、AKT2、AKT3、ALG9、ALK、ALK_fus、ALOX12B、ALS2CR11、AMER1、ANKRA2、ANKRD46、ANO1、APC、APOPT1、AR、ARAF、ARHGAP4、ARHGAP6、ARID1A、ARID1B、ARID2、ARID4A、ARL6IP6、ARMC5、ARPC2、ASH1L、ASXL1、ATM、ATP9B、ATR、ATRX、AURKA、AURKB、AXIN1、AXL、B2M、BAP1、BARD1、BAT-25、BAT-26、BCL2、BCL2L1、BCOR、BCYRN1、BLM、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRIP1、BRS3、BTF3、BTG1、BTK、C20orf96、C22orf23、C5orf42、C9orf72、CAB39、CALD1、CALM2、CALR、CARD11、CASP8、CAST,ERAP1、CBFB、CBL、CBR4、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CCR4、CD274、CD40、CD74_fus、CD79A、CD79B、CDC25B、CDC73、CDH1、CDK12、CDK4、CDK6、CDK7、CDK8、CDKL3、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CDO1、CEBPA、CEP120、CHD1、CHEK1、CHEK2、CIC、CNKSR3、CNOT8、COSM1316144、COSM1316145、COSM1332498、COSM3676668、COSM3747491、COSM5045664、COX18、CREBBP、CRKL、CRLF2、CSF1R、CSF3R、CTAGE5、CTCF、CTNNB1、CUL3、CXCR4、CYFIP1、CYLD、DAXX、DBT、DDR2、DEPDC5、DIAPH1、DICER1、DIS3、DNMT3A、DOCK11、DOT1L、DROSHA、DSCAM、DXS6804、DXS7132、DXS7423、DYS391、DYS438、DYS458、EGFR、EGFR_fus、EIF4G3、EML4_fus、EP300、EPHA3、EPHA5、EPHA7、EPHB1、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC4、ERG、ERI1、ERRFI1、ESR1、ETV1、ETV6、ETV6_fus、EWSR1_fus、EXOSC8、EZH2、EZR_fus、F13A1、FAM149A、FAM153B、FAM46C、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCG、FANCI、FAS、FAT1、FBXW7、FGF16、FGF19、FGF3、FGF4、FGFR1、FGFR2、FGFR2_fus、FGFR3、FGFR4、FH、FLCN、FLOT1、FLT1、FLT3、FLT4、FMO1、FOLH1、FOXL2、FOXP1、FRAS1、FUBP1、FUS_fus、GABRP、GANC、GATA1、GATA2、GATA3、GLI1、GMEB1、GNA11、GNA13、GNAQ、GNAS、GPM6A、GRIN2A、GSK3B、GSTM1、H3F3A、HAUS2、HCAR2、HEY1_fus、HGF、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HNF1A、HNRNPH1、HRAS、HSPA1B、HSPA4、HYOU1、IARS、ID2、ID3、IDH1、IDH2、IGF1R、IGF2、IKBKE、IKZF1、IL7R、IL8、INHBA、INPP4B、IPO7、IRAK1、IRF4、IRF6、IRF8、IRS2、ITGAL、JAK1、JAK2、JAK3、JUN、KCNJ2、KDM5A、KDM5C、KDM6A、KDR、KEAP1、KIAA1210、KIAA1432、KIF5B_fus、KIR3DX1、KIT、KMT2A、KMT2C、KMT2D、KPNA4、KPNB1、KRAS、LAMA3、LEPR、LMO1、LOC100131626、LONRF3、LRRC34、LYN、MAGOHB、MALT1、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MAP3K4、MAP4K5、MAPK1、MAPKAP1、MARK2、MCL1、MDM2、MDM4、MED12、MED19、MEF2B、MEIS1、MEN1、MET、MIR1273H、MITF、MLH1、MMP16、MONO-27、MOV10L1、MPL、MRE11A、MRPL19、MSH2、MSH3、MSH6、MTF1、MTOR、MTRR、MUTYH、MYADM、MYC、MYCL、MYCN、MYD88、MYO10、NAB1、NAB2_fus、NBN、NCOA6、NDUFS1、NEO1、NF1、NF2、NFE2L2、NFKBIA、NFXL1、NKX2-1、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NPM1、NR-21、NR-24、NR4A3_fus、NRAS、NSD1、NT5C2、NTRK1、NTRK1_fus、NTRK2、NTRK2_fus、NTRK3、NTRK3_fus、NUP85、NUP93、P2RY8、PALB2、PAPOLG、PAQR8、PARK2、PARP1、PAX5、PBRM1、PDCD1、PDCD1LG2、PDE6C、PDGFB_fus、PDGFRA、PDGFRB、PDPN、PIGF、PIK3C2G、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PLCG2、PLEKHA1、PLEKHH2、PMS2、PNO1、POLD1、POLE、PPARG、PPHLN1_fus、PPP2R1A、PRDM1、PREX2、PRKAR1A、PRKCI、PRPF39、PTCH1、PTEN、PTPN11、PTPRJ、PURA、RABGAP1L、RAC1、RAD21、RAD50、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD52、RAD54L、RAF1、RARA、RB1、RBM10、RBM27、REL、RET、RET_fus、RHOT1、RICTOR、RIPK2、RNF19A、RNF43、ROS1、ROS1_fus、RPA4、RPTOR、RRP1B、RUNX1、RYR2、SASH1、SDHA、SDHB、SDHC、SDHD、SEL1L3、SETD2、SF3B1、SHROOM3、SIPA1L2、SLC34A2_fus、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SMO、SNX6、SOCS1、SOX2、SOX9、SPC24、SPEN、SPOP、SRC、SS18_fus、STAG2、STAT3、STK11、STMN1、STRBP、SUCLG1、SUFU、SUGCT、SYK、TAF15、TAGAP、TBC1D8B、TBX3、TECPR2、TERT、TET2、TGFBR2、TMEM67、TMPRSS15、TMPRSS2、TNFAIP3、TNFRSF14、TNFSF13B、TNKS、TNRC18、TOP1、TOP2B、TP53、TPH1、TRA2A、TRIM24、TSC1、TSC2、TSHR、TSN、TXNRD1、U2AF1、UBE2E3、UBE3C、ULK4、UPF2、UTY、VEGFA、VHL、VSIG10、WHSC1、WHSC1L1、WT1、WWC3、XPO1、ZBBX、ZDHHC17、ZNF711、ZNF805和ZZZ3。上述基因联合检测能够使泛癌种分型、治疗、预后相关的基因突变，肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域的检测更加精准。
优选的，微卫星不稳定性位点包括rs1045642、rs1052555、rs10981694、rs11045585、rs1105525、rs1130214、rs1138272、rs115232898、rs11572080、rs11598702、rs11615、rs12613732、rs12762549、rs13181、rs151264360、rs1517114、rs1570360、rs1650697、rs1650723、rs1695、rs1799793、rs1801019、rs1801131、rs1801133、rs1801265、rs1805087、rs183484、rs1934951、rs2032582、rs2072671、rs2075252、rs2228001、rs2273618、rs2291075、rs2291767、rs2297595、rs2494752、rs2501873、rs25487、rs2784917、rs28738963、rs316019、rs3212986、rs3745274、rs3892097、rs3918290、rs3957357、rs4148323、rs4244285、rs430397、rs442767、rs4646、rs4673、rs4673993、rs4728709、rs4880、rs50872、rs55886062、rs60369023、rs67376798、rs699947、rs716274、rs7779029、rs7851395、rs8133052、rs8175347、rs873478、rs9679162和rs9937。能够进一步丰富检测得到的有效信息，提高后续数据应用的准确性。
根据本发明的另一个方面，提供一种基于二代测序的用于泛癌种靶向、化疗及免疫用药的检测试剂盒。该检测试剂盒包含检测探针，检测探针针对泛癌种分型、治疗、预后相关的基因、微卫星不稳定性位点和肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域。优选的，检测探针覆盖区域/目标区域>＝99％。
根据本发明一种典型的实施方式，泛癌种分型、治疗、预后相关的基因突变和肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域包括：ABCA13、ABCA8、ABL1、ACADSB、ACOT13、ADAMTS6、ADRB1、ADSS、AGPAT9、AK7、AKT1、AKT2、AKT3、ALG9、ALK、ALK_fus、ALOX12B、ALS2CR11、AMER1、ANKRA2、ANKRD46、ANO1、APC、APOPT1、AR、ARAF、ARHGAP4、ARHGAP6、ARID1A、ARID1B、ARID2、ARID4A、ARL6IP6、ARMC5、ARPC2、ASH1L、ASXL1、ATM、ATP9B、ATR、ATRX、AURKA、AURKB、AXIN1、AXL、B2M、BAP1、BARD1、BAT-25、BAT-26、BCL2、BCL2L1、BCOR、BCYRN1、BLM、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRIP1、BRS3、BTF3、BTG1、BTK、C20orf96、C22orf23、C5orf42、C9orf72、CAB39、CALD1、CALM2、CALR、CARD11、CASP8、CAST,ERAP1、CBFB、CBL、CBR4、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CCR4、CD274、CD40、CD74_fus、CD79A、CD79B、CDC25B、CDC73、CDH1、CDK12、CDK4、CDK6、CDK7、CDK8、CDKL3、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CDO1、CEBPA、CEP120、CHD1、CHEK1、CHEK2、CIC、CNKSR3、CNOT8、COSM1316144、COSM1316145、COSM1332498、COSM3676668、COSM3747491、COSM5045664、COX18、CREBBP、CRKL、CRLF2、CSF1R、CSF3R、CTAGE5、CTCF、CTNNB1、CUL3、CXCR4、CYFIP1、CYLD、DAXX、DBT、DDR2、DEPDC5、DIAPH1、DICER1、DIS3、DNMT3A、DOCK11、DOT1L、DROSHA、DSCAM、DXS6804、DXS7132、DXS7423、DYS391、DYS438、DYS458、EGFR、EGFR_fus、EIF4G3、EML4_fus、EP300、EPHA3、EPHA5、EPHA7、EPHB1、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC4、ERG、ERI1、ERRFI1、ESR1、ETV1、ETV6、ETV6_fus、EWSR1_fus、EXOSC8、EZH2、EZR_fus、F13A1、FAM149A、FAM153B、FAM46C、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCG、FANCI、FAS、FAT1、FBXW7、FGF16、FGF19、FGF3、FGF4、FGFR1、FGFR2、FGFR2_fus、FGFR3、FGFR4、FH、FLCN、FLOT1、FLT1、FLT3、FLT4、FMO1、FOLH1、FOXL2、FOXP1、FRAS1、FUBP1、FUS_fus、GABRP、GANC、GATA1、GATA2、GATA3、GLI1、GMEB1、GNA11、GNA13、GNAQ、GNAS、GPM6A、GRIN2A、GSK3B、GSTM1、H3F3A、HAUS2、HCAR2、HEY1_fus、HGF、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HNF1A、HNRNPH1、HRAS、HSPA1B、HSPA4、HYOU1、IARS、ID2、ID3、IDH1、IDH2、IGF1R、IGF2、IKBKE、IKZF1、IL7R、IL8、INHBA、INPP4B、IPO7、IRAK1、IRF4、IRF6、IRF8、IRS2、ITGAL、JAK1、JAK2、JAK3、JUN、KCNJ2、KDM5A、KDM5C、KDM6A、KDR、KEAP1、KIAA1210、KIAA1432、KIF5B_fus、KIR3DX1、KIT、KMT2A、KMT2C、KMT2D、KPNA4、KPNB1、KRAS、LAMA3、LEPR、LMO1、LOC100131626、LONRF3、LRRC34、LYN、MAGOHB、MALT1、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MAP3K4、MAP4K5、MAPK1、MAPKAP1、MARK2、MCL1、MDM2、MDM4、MED12、MED19、MEF2B、MEIS1、MEN1、MET、MIR1273H、MITF、MLH1、MMP16、MONO-27、MOV10L1、MPL、MRE11A、MRPL19、MSH2、MSH3、MSH6、MTF1、MTOR、MTRR、MUTYH、MYADM、MYC、MYCL、MYCN、MYD88、MYO10、NAB1、NAB2_fus、NBN、NCOA6、NDUFS1、NEO1、NF1、NF2、NFE2L2、NFKBIA、NFXL1、NKX2-1、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NPM1、NR-21、NR-24、NR4A3_fus、NRAS、NSD1、NT5C2、NTRK1、NTRK1_fus、NTRK2、NTRK2_fus、NTRK3、NTRK3_fus、NUP85、NUP93、P2RY8、PALB2、PAPOLG、PAQR8、PARK2、PARP1、PAX5、PBRM1、PDCD1、PDCD1LG2、PDE6C、PDGFB_fus、PDGFRA、PDGFRB、PDPN、PIGF、PIK3C2G、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PLCG2、PLEKHA1、PLEKHH2、PMS2、PNO1、POLD1、POLE、PPARG、PPHLN1_fus、PPP2R1A、PRDM1、PREX2、PRKAR1A、PRKCI、PRPF39、PTCH1、PTEN、PTPN11、PTPRJ、PURA、RABGAP1L、RAC1、RAD21、RAD50、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD52、RAD54L、RAF1、RARA、RB1、RBM10、RBM27、REL、RET、RET_fus、RHOT1、RICTOR、RIPK2、RNF19A、RNF43、ROS1、ROS1_fus、RPA4、RPTOR、RRP1B、RUNX1、RYR2、SASH1、SDHA、SDHB、SDHC、SDHD、SEL1L3、SETD2、SF3B1、SHROOM3、SIPA1L2、SLC34A2_fus、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SMO、SNX6、SOCS1、SOX2、SOX9、SPC24、SPEN、SPOP、SRC、SS18_fus、STAG2、STAT3、STK11、STMN1、STRBP、SUCLG1、SUFU、SUGCT、SYK、TAF15、TAGAP、TBC1D8B、TBX3、TECPR2、TERT、TET2、TGFBR2、TMEM67、TMPRSS15、TMPRSS2、TNFAIP3、TNFRSF14、TNFSF13B、TNKS、TNRC18、TOP1、TOP2B、TP53、TPH1、TRA2A、TRIM24、TSC1、TSC2、TSHR、TSN、TXNRD1、U2AF1、UBE2E3、UBE3C、ULK4、UPF2、UTY、VEGFA、VHL、VSIG10、WHSC1、WHSC1L1、WT1、WWC3、XPO1、ZBBX、ZDHHC17、ZNF711、ZNF805和ZZZ3。
根据本发明一种典型的实施方式，微卫星不稳定性位点包括rs1045642、rs1052555、rs10981694、rs11045585、rs1105525、rs1130214、rs1138272、rs115232898、rs11572080、rs11598702、rs11615、rs12613732、rs12762549、rs13181、rs151264360、rs1517114、rs1570360、rs1650697、rs1650723、rs1695、rs1799793、rs1801019、rs1801131、rs1801133、rs1801265、rs1805087、rs183484、rs1934951、rs2032582、rs2072671、rs2075252、rs2228001、rs2273618、rs2291075、rs2291767、rs2297595、rs2494752、rs2501873、rs25487、rs2784917、rs28738963、rs316019、rs3212986、rs3745274、rs3892097、rs3918290、rs3957357、rs4148323、rs4244285、rs430397、rs442767、rs4646、rs4673、rs4673993、rs4728709、rs4880、rs50872、rs55886062、rs60369023、rs67376798、rs699947、rs716274、rs7779029、rs7851395、rs8133052、rs8175347、rs873478、rs9679162和rs9937。
根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种上述基于二代测序的用于泛癌种靶向、化疗及免疫用药的检测panel或上述基于二代测序的用于泛癌种靶向、化疗及免疫用药的检测试剂盒在制备用于泛癌种分型、治疗、预后相关的基因突变，微卫星不稳定性位点和肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域联合检测的装置中的应用。典型的，泛癌种包括但不限于：肺癌、肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌和子宫内膜癌等。联合检测可以包括多种突变类型的检测，包括：点突变、融合、拷贝数变异、缺失和***突变；优选的，应用包括靶向药、化疗药或免疫药的伴随诊断。
下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1
本实施例的panel包括泛癌种分型、治疗、预后相关的基因突变，微卫星不稳定性位点和肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域。对应的，本实施例的试剂盒包含检测探针，检测探针针对泛癌种分型、治疗、预后相关的基因突变，微卫星不稳定性位点和肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域，检测探针覆盖区域/目标区域>＝99％。检测探针根据本领域的常规设计规则设计而成。
其中，泛癌种分型、治疗、预后相关的基因突变和肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域包括：ABCA13、ABCA8、ABL1、ACADSB、ACOT13、ADAMTS6、ADRB1、ADSS、AGPAT9、AK7、AKT1、AKT2、AKT3、ALG9、ALK、ALK_fus、ALOX12B、ALS2CR11、AMER1、ANKRA2、ANKRD46、ANO1、APC、APOPT1、AR、ARAF、ARHGAP4、ARHGAP6、ARID1A、ARID1B、ARID2、ARID4A、ARL6IP6、ARMC5、ARPC2、ASH1L、ASXL1、ATM、ATP9B、ATR、ATRX、AURKA、AURKB、AXIN1、AXL、B2M、BAP1、BARD1、BAT-25、BAT-26、BCL2、BCL2L1、BCOR、BCYRN1、BLM、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRIP1、BRS3、BTF3、BTG1、BTK、C20orf96、C22orf23、C5orf42、C9orf72、CAB39、CALD1、CALM2、CALR、CARD11、CASP8、CAST,ERAP1、CBFB、CBL、CBR4、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CCR4、CD274、CD40、CD74_fus、CD79A、CD79B、CDC25B、CDC73、CDH1、CDK12、CDK4、CDK6、CDK7、CDK8、CDKL3、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CDO1、CEBPA、CEP120、CHD1、CHEK1、CHEK2、CIC、CNKSR3、CNOT8、COSM1316144、COSM1316145、COSM1332498、COSM3676668、COSM3747491、COSM5045664、COX18、CREBBP、CRKL、CRLF2、CSF1R、CSF3R、CTAGE5、CTCF、CTNNB1、CUL3、CXCR4、CYFIP1、CYLD、DAXX、DBT、DDR2、DEPDC5、DIAPH1、DICER1、DIS3、DNMT3A、DOCK11、DOT1L、DROSHA、DSCAM、DXS6804、DXS7132、DXS7423、DYS391、DYS438、DYS458、EGFR、EGFR_fus、EIF4G3、EML4_fus、EP300、EPHA3、EPHA5、EPHA7、EPHB1、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC4、ERG、ERI1、ERRFI1、ESR1、ETV1、ETV6、ETV6_fus、EWSR1_fus、EXOSC8、EZH2、EZR_fus、F13A1、FAM149A、FAM153B、FAM46C、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCG、FANCI、FAS、FAT1、FBXW7、FGF16、FGF19、FGF3、FGF4、FGFR1、FGFR2、FGFR2_fus、FGFR3、FGFR4、FH、FLCN、FLOT1、FLT1、FLT3、FLT4、FMO1、FOLH1、FOXL2、FOXP1、FRAS1、FUBP1、FUS_fus、GABRP、GANC、GATA1、GATA2、GATA3、GLI1、GMEB1、GNA11、GNA13、GNAQ、GNAS、GPM6A、GRIN2A、GSK3B、GSTM1、H3F3A、HAUS2、HCAR2、HEY1_fus、HGF、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HNF1A、HNRNPH1、HRAS、HSPA1B、HSPA4、HYOU1、IARS、ID2、ID3、IDH1、IDH2、IGF1R、IGF2、IKBKE、IKZF1、IL7R、IL8、INHBA、INPP4B、IPO7、IRAK1、IRF4、IRF6、IRF8、IRS2、ITGAL、JAK1、JAK2、JAK3、JUN、KCNJ2、KDM5A、KDM5C、KDM6A、KDR、KEAP1、KIAA1210、KIAA1432、KIF5B_fus、KIR3DX1、KIT、KMT2A、KMT2C、KMT2D、KPNA4、KPNB1、KRAS、LAMA3、LEPR、LMO1、LOC100131626、LONRF3、LRRC34、LYN、MAGOHB、MALT1、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MAP3K4、MAP4K5、MAPK1、MAPKAP1、MARK2、MCL1、MDM2、MDM4、MED12、MED19、MEF2B、MEIS1、MEN1、MET、MIR1273H、MITF、MLH1、MMP16、MONO-27、MOV10L1、MPL、MRE11A、MRPL19、MSH2、MSH3、MSH6、MTF1、MTOR、MTRR、MUTYH、MYADM、MYC、MYCL、MYCN、MYD88、MYO10、NAB1、NAB2_fus、NBN、NCOA6、NDUFS1、NEO1、NF1、NF2、NFE2L2、NFKBIA、NFXL1、NKX2-1、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NPM1、NR-21、NR-24、NR4A3_fus、NRAS、NSD1、NT5C2、NTRK1、NTRK1_fus、NTRK2、NTRK2_fus、NTRK3、NTRK3_fus、NUP85、NUP93、P2RY8、PALB2、PAPOLG、PAQR8、PARK2、PARP1、PAX5、PBRM1、PDCD1、PDCD1LG2、PDE6C、PDGFB_fus、PDGFRA、PDGFRB、PDPN、PIGF、PIK3C2G、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PLCG2、PLEKHA1、PLEKHH2、PMS2、PNO1、POLD1、POLE、PPARG、PPHLN1_fus、PPP2R1A、PRDM1、PREX2、PRKAR1A、PRKCI、PRPF39、PTCH1、PTEN、PTPN11、PTPRJ、PURA、RABGAP1L、RAC1、RAD21、RAD50、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD52、RAD54L、RAF1、RARA、RB1、RBM10、RBM27、REL、RET、RET_fus、RHOT1、RICTOR、RIPK2、RNF19A、RNF43、ROS1、ROS1_fus、RPA4、RPTOR、RRP1B、RUNX1、RYR2、SASH1、SDHA、SDHB、SDHC、SDHD、SEL1L3、SETD2、SF3B1、SHROOM3、SIPA1L2、SLC34A2_fus、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SMO、SNX6、SOCS1、SOX2、SOX9、SPC24、SPEN、SPOP、SRC、SS18_fus、STAG2、STAT3、STK11、STMN1、STRBP、SUCLG1、SUFU、SUGCT、SYK、TAF15、TAGAP、TBC1D8B、TBX3、TECPR2、TERT、TET2、TGFBR2、TMEM67、TMPRSS15、TMPRSS2、TNFAIP3、TNFRSF14、TNFSF13B、TNKS、TNRC18、TOP1、TOP2B、TP53、TPH1、TRA2A、TRIM24、TSC1、TSC2、TSHR、TSN、TXNRD1、U2AF1、UBE2E3、UBE3C、ULK4、UPF2、UTY、VEGFA、VHL、VSIG10、WHSC1、WHSC1L1、WT1、WWC3、XPO1、ZBBX、ZDHHC17、ZNF711、ZNF805和ZZZ3。
微卫星不稳定性位点包括rs1045642、rs1052555、rs10981694、rs11045585、rs1105525、rs1130214、rs1138272、rs115232898、rs11572080、rs11598702、rs11615、rs12613732、rs12762549、rs13181、rs151264360、rs1517114、rs1570360、rs1650697、rs1650723、rs1695、rs1799793、rs1801019、rs1801131、rs1801133、rs1801265、rs1805087、rs183484、rs1934951、rs2032582、rs2072671、rs2075252、rs2228001、rs2273618、rs2291075、rs2291767、rs2297595、rs2494752、rs2501873、rs25487、rs2784917、rs28738963、rs316019、rs3212986、rs3745274、rs3892097、rs3918290、rs3957357、rs4148323、rs4244285、rs430397、rs442767、rs4646、rs4673、rs4673993、rs4728709、rs4880、rs50872、rs55886062、rs60369023、rs67376798、rs699947、rs716274、rs7779029、rs7851395、rs8133052、rs8175347、rs873478、rs9679162和rs9937。
实施例2
采用本实施例1中的试剂盒对模拟组织DNA的标准品进行检测。
一、制备验证标准品
通过按比例混合含有已知突变的肿瘤细胞系DNA和野生型细胞系GM12878DNA，配制出20种突变标准品DNA。并通过ddPCR确定标准品中每种突变的频率。肿瘤细胞系DNA如表1所示。
表1
二、DNA打断：
使用Qubit 3.0和dsDNA HS Assay Kit对DNA进行定量。
将聚四氟乙烯线用紫外灭菌后的医用剪刀剪至1cm左右的长度，并且保证打断棒的长度均一性良好，置于干净容器中，紫外灭菌3～4小时。灭菌完成后，将1cm的聚四氟乙烯线，用灭菌后的镊子装进96孔板内。每个孔装入2根打断棒，完成后再将96孔板紫外灭菌3～4小时。
按照qubit定量结果取300ng DNA样本，使用TE稀释到50μl，转移到96孔板中，将锡箔纸膜放在96孔板上，四边对齐，使用热封膜仪180℃5s封膜2次，使用微孔板离心机离心。
选择预先设定的程序Peak Power：450，Duty Factor：30，Cycles/Burst：200，Treatment time：40s，3cycles，点击“Start position”。在Run界面点”Run”按钮，运行程序。在该程序运行完成后，取出样品板，使用微孔板离心机离心，再将样品板放到样品架上，选择程序Peak Power：450，Duty Factor：30，Cycles/Burst：200，Treatment time：40s，4cycles。在Run界面点“Run”按钮，运行程序。在该程序运行完成后，取出样品板，使用微孔板离心机离心。打断后取1μl进行质检。
三、文库构建
1.末端修复并在3’末端加A尾：
1.1取50μL上述步骤二中得到的DNA，不足50μL的用无核酸酶水补齐至50μL，按照下表2加入反应体系：
表2
组分 体积
末端修复和加A缓冲液 7μL
末端修复和加A酶 3μL
DNA 50μL
总体积 60μL
1.2涡旋混匀，微离心，放置于PCR仪中，反应程序如下表3：
表3
2.连接接头：
2.1接头准备：接头2.5μL，加2.5ul水稀释到5μL。
2.2按下表4向上述反应管中加入相应试剂：
表4
组分 体积
水 5μL
连接缓冲液 30μL
DNA连接酶 10μL
末端修复和加A产物 60μL
总体积 110μL
2.3涡旋混匀，微离心，放置于PCR仪中，反应程序如下表5：
表5
步骤 温度 时间
连接接头 20℃ 30min
终止 20℃ ∞
注意：热盖温度为50℃
3.连接后纯化：
3.1分装Beckman Agencourt AMPure XP磁珠至新的八连管中，每管88μL。上一步PCR结束后即2.3结束，取出样本，短暂离心，转入已分装的88μL磁珠离心管中。
3.2震荡混匀，室温孵育15min，使DNA与磁珠充分结合。注意：震荡时按紧管盖。短暂离心，离心管置于磁力架上待液体澄清，弃去上清(保证残余量不得超过5μL)。注意：不要吸到磁珠。
3.3加入200μL 80％乙醇孵育30sec后弃去。重复一次200μL 80％乙醇清洗步骤。注意：80％乙醇现用现配。
3.4用10μL枪头吸尽离心管底部的残留乙醇，室温干燥3-5min至乙醇完全挥发(正面看不在反光，背面看已经干燥)。注意：磁珠过分干燥DNA产量会减少。
3.5从磁力架取下离心管，加入21μL超纯水，震荡混匀。注意：震荡时按紧管盖。室温孵育5min。
3.6短暂离心，离心管置于磁力架上待液体澄清。剩余的20μL清液转移至新的PCR管进行下一步扩增试验。
4.文库扩增：
4.1按照下表6加入反应体系：
表6
组分 体积
热启动酶 25μL
引物和反应缓冲液混合物 5μL
接头连接产物 20μL
总体积 50μL
4.2涡旋混匀，微离心，放置于PCR仪中，反应程序如下表7：
表7
5.DNA的获得
5.1分装25μL Beckman Agencourt AMPure XP磁珠至新的八连管中。
5.2待上一步(4.2)PCR结束后，取出样本。
5.3短暂离心，转入已分装的25μL Beckman Agencourt AMPure XP磁珠中。
5.4震荡混匀，室温孵育15min，使DNA与磁珠充分结合。注意震荡时按紧管盖。
5.5短暂离心，离心管置于磁力架上待液体澄清，将上清转移至另一管已分装的25μL Beckman Agencourt AMPure XP磁珠中。注意：不要吸到磁珠。
5.6震荡混匀，室温孵育15min，使DNA与磁珠充分结合，注意震荡时按紧管盖。
5.7短暂离心，离心管置于磁力架上待液体澄清，弃上清。注意：不要吸到磁珠。
5.8加入200μL 80％乙醇孵育30sec后弃去。注意：80％乙醇现用现配。重复一次200μL80％乙醇清洗步骤。
5.9用10μL枪头吸尽离心管底部的残留乙醇，室温干燥3-5min至乙醇完全挥发(正面看不在反光，背面看已经干燥)。注意：磁珠过分干燥DNA产量会减少。
5.10从磁力架取下离心管，加入40μL超纯水，振荡混匀。
5.11室温孵育5min洗脱DNA。
5.12短暂离心，离心管置于磁力架上待液体澄清，将文库转移至新的离心管中。保存于-20℃。
6.文库质检
取1μL DNA文库用dsDNA HS Assay Kit检测其浓度。
四.文库杂交捕获
利用本发明检测panel和杂交捕获试剂进行文库杂交捕获，操作过程按照产品说明书进行。
1.取总量1μg的等量文库于1.5mL离心管中，根据每个文库的浓度和捕获文库个数计算每个文库加入的体积。文库加入的体积是：(1000ng/捕获文库个数/文库浓度)μL。向上述体系中加入2.5μL封闭寡聚核苷酸，加入5μL COT Human DNA，震荡混匀，短暂离心。用封口膜封住EP管，放入真空离心浓缩仪中蒸干(60℃，约20min～1hr)。注意随时查看是否已蒸干。
2.文库与探针杂交
2.1向上步含文库等干粉中加入下表8所示反应体系，涡旋混匀，短暂离心，置于95℃加热模块变性10min。
表8
组分 体积
杂交缓冲液 7.5μL
杂交增强剂 3μL
总体积 10.5μL
2.2取出4.5ul探针，短暂离心；探针短暂离心后置于47℃PCR仪中，迅速将变性的DNA从95℃转移至含有探针的PCR管中，震荡混匀，短暂离心。置于PCR仪中，47℃杂交，杂交时间应不少于16hr。
3.文库捕获
3.1配制洗脱工作液，一个捕获所需缓冲液的配制方法如下表，根据捕获的个数按下表9配制缓冲液。
表9
3.2准备捕获磁珠和洗脱工作液1和4，捕获磁珠使用前须室温平衡30min；洗脱工作液1和4使用前须47℃孵育2hr。
3.3每个捕获分装100μL捕获磁珠，将100μL捕获磁珠置于磁力架上至液体澄清，弃去上清。加入200μL 1X磁珠洗涤液，震荡混匀。置于磁力架上至液体澄清，弃去上清。加入200μL1X磁珠洗涤液，震荡混匀。置于磁力架上至液体澄清，弃去上清。加入100μL 1X磁珠洗涤液，震荡混匀。置于磁力架上至液体澄清，弃去上清。此时磁珠预处理完成，立即进行下一步试验。
3.4将捕获过夜的杂交液体转入清洗好的磁珠中，移液器吹打十次。置于PCR仪中47℃孵育45min(PCR热盖温度设为57℃)，每隔15min震荡一次保证磁珠悬浮。
3.5清洗：
3.5.1孵育完成后，每管加入100μL 47℃预热的1×洗脱工作液1，震荡混匀。置于磁力架上至液体澄清，弃去上清。
3.5.2加入200μL 47℃预热的1×洗脱工作液4，移液器吹打十次混匀。47℃孵育5min，置于磁力架上至液体澄清，弃去上清。注意操作过程尽量避免温度低于47℃。
3.5.3加入200μL 47℃预热的1×洗脱工作液4，移液器吹打十次混匀。47℃孵育5min，置于磁力架上至液体澄清，弃去上清。注意操作过程尽量避免温度低于47℃。
3.5.4加入200μL室温放置的1×洗脱工作液1，振荡2min，短暂离心，置于磁力架上至液体澄清，弃去上清。
3.5.5加入200μL室温放置的1×洗脱工作液2，震荡1min，短暂离心，放置磁力架上至液体澄清，弃去上清。
3.5.6加入200μL室温放置的1×洗脱工作液3，震荡30sec，短暂离心，放置磁力架上至液体澄清，弃去上清。
3.5.7向离心管中加入18μL超纯水洗脱，震荡混匀，进行下一步扩增试验。
4.捕获后PCR：
4.1按下表10加入反应体系。
表10
组分 体积
热启动酶 50μL
引物,5μM 10μL
上一步洗脱的DNA 40μL
总体积 100μL
4.2涡旋混匀，微离心，放置于PCR仪中，反应程序如下表11：
表11
4.3扩增后纯化：
4.3.1取出纯化磁珠，室温平衡30min备用。
4.3.2取180μL纯化磁珠于1.5mL离心管中，加入100μL扩增后的捕获DNA文库，振荡混匀，室温孵育15min。
4.3.3置于磁力架上至液体澄清，弃去上清。
4.3.4加入200μL 80％乙醇孵育30sec后弃去。注意：80％乙醇现用现配。重复一次200μL80％乙醇清洗步骤。
4.3.5用10μL枪头弃去离心管底部的残留乙醇，室温干燥至乙醇完全挥发(前面看磁珠不反光，背面看干燥)。注意：磁珠过分干燥DNA产量会减少。
4.3.6从磁力架取下离心管，加入50μL超纯水，振荡混匀。室温孵育2min。
4.3.7短暂离心，置于磁力架上至液体澄清，将capture样本转入新的离心管中。
4.3.8质检：取1μL capture样本用于Qubit浓度检测。capture浓度检测使用QubitHS检测试剂盒。
五.检测结果
检测结果详见表12。
表12
根据上表12结果可知，以ddPCR检测结果为金标准，实施例1的检测panel对组织样本的点突变、***缺失、融合和拷贝数变异的检测性能优越。
实施例3
采用本发明实施例1的试剂盒进行cfDNA样本的建库及捕获。
一、制备验证标准品
通过按比例混合含有已知突变的肿瘤细胞系DNA和野生型细胞系GM12878DNA，配制出20种突变标准品DNA。并通过ddPCR确定标准品中每种突变的频率。肿瘤细胞系DNA如表1所示。将标准品DNA打断，模拟cfDNA的片段长度(～165bp)。
二.文库构建
1.末端修复并在3’末端加A尾：
1.1取50μL cfDNA，不足50μL的用无核酸酶水补齐至50μL，按照实施例2中的表2加入反应体系。
1.2涡旋混匀，微离心，放置于PCR仪中，反应程序如实施例2中的表3。
2.连接接头：
2.1稀释接头(浓度15μM的接头)，接头的使用体积是5μL。接头的保存浓度是15μM，根据DNA的起始量，按下表13对接头的使用浓度进行稀释，稀释后置于4℃冰箱保存。
表13
建库起始量(ng) 接头体积(μL) Nuclease-Free ddH2O体积(μL)
25-50 5 0
10-25 2.5 2.5
5-10 1 4
2.2按实施例2中的表4向上述反应管中加入相应试剂。
2.3涡旋混匀，微离心，放置于PCR仪中，反应程序如实施例2中的表5所示。
3.连接后纯化(具体步骤参见实施例2中的连接后纯化)。
4.文库扩增(具体步骤参见实施例)。
5.DNA的获得(1×Beads回收)
5.1分装50μL Beckman Agencourt AMPure XP磁珠至新的八连管中。
5.2待上一步(4.2)PCR结束后，取出样本。
5.3短暂离心，转入已分装的50μL Beckman Agencourt AMPure XP磁珠中。
5.4震荡混匀，室温孵育15min，使DNA与磁珠充分结合。注意震荡时按紧管盖。
5.5短暂离心，离心管置于磁力架上待液体澄清，弃去上清。注意：不要吸到磁珠。
5.6加入200μL 80％乙醇孵育30sec后弃去。注意：80％乙醇现用现配。重复一次200μL80％乙醇清洗步骤。
5.7用10μL枪头吸尽离心管底部的残留乙醇，室温干燥3-5min至乙醇完全挥发(正面看不在反光，背面看已经干燥)。注意：磁珠过分干燥DNA产量会减少。
5.8从磁力架取下离心管，加入40μL超纯水，振荡混匀。
5.9室温孵育5min洗脱DNA。
5.10短暂离心，离心管置于磁力架上待液体澄清，将文库转移至新的离心管中。保存于-20℃。
6.文库质检
取1μL DNA文库用dsDNA HS Assay Kit检测其浓度。
四.文库杂交捕获
具体操作同实施例2。
五.检测结果
检测结果详见表14。
表14
根据上表结果，以ddPCR检测结果为金标准，实施例1的检测试剂盒对cfDNA样本的点突变、***缺失、融合和拷贝数变异的检测性能优越。
实施例4
采用实施例1的试剂盒检测组织TMB和全外显子试剂盒的一致性
1.患者基因组DNA的提取、文库制备和探针杂交捕获
本实施例选取了40位患者的配对样本进行检测，使用天根血细胞和组织提取试剂盒提取血细胞、肿瘤新鲜组织DNA，使用耶拿FFPE DNA提取试剂盒提取肿瘤FFPE DNA，操作过程按照产品说明书进行。按照实施例2进行DNA打断和文库制备，分别采用实施例1的试剂盒和全外探针进行杂交捕获和上机测序。样本信息如表15所示：
表15
癌种包括：子宫内膜癌、低级别浆液性腺癌、结肠癌、直肠癌、卵巢癌、胃癌、乙状结肠癌、乳腺癌、胆管癌、肺癌、肠癌、胃癌和胶质瘤。
2.下机数据分析
计算TMB公式：突变数量*1000000/全外碱基数(去重后深度>100X)即每兆碱基中发生置换和***/缺失突变的总数
以下情况将排除TMB计算：
(1)胚系突变；
(2)突变频率低于5％的突变；
(3)同义突变；
(4)FFPE样本去重后深度低于100X；
(5)重复区域突变；
(6)黑名单突变；
(7)驱动突变；
(8)人群数据库遗传性突变位点。
3.检测结果
本实施例共检测了163例患者的配对血细胞和FFPE，确定了TMB临界值，临界值结果如表16所示：
表16
TMB-Moderate TMB-High TMB-Extra High
3.804 8.4278 13.7693
由表16验证结果可知，突变个数大于13.7693，TMB水平判断为Extra High；突变个数介于8.4278-13.7693之间，判断为High。
本实施例分别采用了实施例1的检测panel和全外显子探针，共检测了40例患者的配对血细胞和FFPE，确定了实施例1的检测panel和全外显子探针的一致性，一致性结果如图1所示。
由图1结果可知，实施例1的检测panel(P12)与全外显子探针的一致性好，二者一致性R2＝0.9411。
本实施例针对肿瘤突变负荷(TMB)设计的外显子区域同时覆盖20个点突变、4个***和8个融合，通过整合不同突变类型信息的共有区域，提高panel均一性，降低panel整体数据量，缩短分析周期，减少成本。
实施例5
实施例1的检测panel检测MSI与一代方法的一致性
1.患者基因组DNA的提取、文库制备和探针杂交捕获
穿刺组织、手术组织或者石蜡切片提取DNA，取200ng DNA进行covaris打断，打断后的样本构建文库，使用panel 12杂交捕获文库，捕获完成后的样本在Illumina NovaSeq平台上进行测序。分析处理序列数据，该流程旨在准确检测微卫星不稳定性(MSI)。
2.下机数据分析
MSI QC标准：每个MSI marker去重后深度>100X。
24个单核苷酸重复标记物用于实施例1的panel MSI测定。如果一个样本通过QC的标记物数量少于8个，则MSI状态为QNS。如果不稳定的基因座/通过基因座>＝0.3，则MSI状态为HSI-H；如果不稳定的基因座/通过位点<0.3，则MSI状态为HSI-L/MSS。MSI标志物见表17。
表17
3.检测结果
实施例1的检测panel适用于MSI检测，140个血细胞样品用于MSI标记物选择。来自健康供体的30个血细胞样品用于p12MSI baseline建立。通过荧光pcr-毛细管电泳(MSIAnalysis System,Version 1.2,Promega)，40例临床肿瘤组织MSI状态已知，对这40例样本进行GeneCast Panel 12MSI验证。验证结果显示，有14个MSI-High，25个MSI-Low/MSS和1个QNS。具体信息见表18。
表18
表19
NGS/PCR MSI-H_PCR MSI-L/MSS_PCR
MSI-H_NGS 14 0
MSI-L/MSS_NGS 0 25
QNS_NGS 1 0
表20
TP TN FP FN 灵敏度 特异性
14 25 0 0 100％ 100％
对于实施例1的检测panel的MSI验证方法与荧光PCR-毛细管电泳方法的一致性总结如表19和表20。灵敏度为100％，特异性为98.2％，PPV为94.7％，准确度为98.7％。
实施例6
实施例1的检测panel检测突变与室间质评结果的一致性
1.室间质评样本信息表如表21所示：
表21
2.室间质评样本的文库制备和探针杂交捕获
本实施例的23例样本(14例CF和9例FFPE)按照实施例2和实施例3进行DNA提取、打断(FFPE样本进行打断，CF样本不打断)、文库制备、探针杂交捕获及上机测序。
3.检测结果见表22。
表22
续表22
根据上表22结果，所有突变均已检出，符合验证结果。说明实施例1的检测panel准确度高。
实施例7
本发明的试剂盒能一次检测多种肿瘤变异，检测结果准确，提供患者靶向药、化疗药和免疫药三类药物的用药选择，降低费用。
实施例1的检测panel临床应用-靶向药的伴随诊断。
1.本实施例的3例配对临床样本按照实施例2和实施例3进行DNA提取、打断(FFPE或新鲜组织样本进行打断，CF样本不打断)、文库制备、探针杂交捕获及上机测序。
2.检测结果见
表24
根据上表24结果，该患者TMB水平为LOW，但组织DNA中检测到EGFR基因p.L858R突变，厄洛替尼、阿法替尼、吉非替尼、埃克替尼、奥希替尼可能适用于受检者。说明实施例1的检测panel可用于靶向药的伴随诊断。
实施例8
实施例1的检测panel临床应用-免疫用药结果见表25。
1.本实施例的临床样本按照实施例2和实施例3进行DNA提取、打断(FFPE或新鲜组织样本进行打断，CF样本不打断)、文库制备、探针杂交捕获及上机测序。
2.检测结果见表25和表26。
表25
根据上表25结果，血浆游离DNA和组织DNA中未检测到EGFR、KRAS、BRAF和ERBB2等敏感和耐药突变；未检测到MET基因拷贝数增加及敏感/耐药突变；未检测到ALK、ROS1和RET基因等融合及敏感和耐药位点突变。但该患者TMB水平为Extra High，mTORC1/2抑制剂、雷莫芦单抗、necitumumab、阿法替尼、安罗替尼可能适用于受检者。
表26
根据上表26结果，血浆游离DNA和组织DNA中未检测到EGFR、KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、KIT、PDGFRA、MTOR基因等敏感和耐药突变；未检测到ALK、ROS1、RET基因的融合和敏感/耐药突变；未检测到ERBB2、MET基因拷贝数增加及敏感/耐药突变。但该患者TMB水平为Extra High。
本实施例的2例临床样本检测结果证明实施例1的检测panel能够用于免疫用药的指导。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于二代测序的用于泛癌种靶向、化疗及免疫用药的检测panel，其特征在于，所述检测panel包括用于进行联合检测的泛癌种分型、治疗、预后相关的基因突变，肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域和微卫星不稳定性位点。
2.根据权利要求1所述的检测panel，其特征在于，所述泛癌种分型、治疗、预后相关的基因突变和所述肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域包括ABCA13、ABCA8、ABL1、ACADSB、ACOT13、ADAMTS6、ADRB1、ADSS、AGPAT9、AK7、AKT1、AKT2、AKT3、ALG9、ALK、ALK_fus、ALOX12B、ALS2CR11、AMER1、ANKRA2、ANKRD46、ANO1、APC、APOPT1、AR、ARAF、ARHGAP4、ARHGAP6、ARID1A、ARID1B、ARID2、ARID4A、ARL6IP6、ARMC5、ARPC2、ASH1L、ASXL1、ATM、ATP9B、ATR、ATRX、AURKA、AURKB、AXIN1、AXL、B2M、BAP1、BARD1、BAT-25、BAT-26、BCL2、BCL2L1、BCOR、BCYRN1、BLM、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRIP1、BRS3、BTF3、BTG1、BTK、C20orf96、C22orf23、C5orf42、C9orf72、CAB39、CALD1、CALM2、CALR、CARD11、CASP8、CAST,ERAP1、CBFB、CBL、CBR4、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CCR4、CD274、CD40、CD74_fus、CD79A、CD79B、CDC25B、CDC73、CDH1、CDK12、CDK4、CDK6、CDK7、CDK8、CDKL3、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CDO1、CEBPA、CEP120、CHD1、CHEK1、CHEK2、CIC、CNKSR3、CNOT8、COSM1316144、COSM1316145、COSM1332498、COSM3676668、COSM3747491、COSM5045664、COX18、CREBBP、CRKL、CRLF2、CSF1R、CSF3R、CTAGE5、CTCF、CTNNB1、CUL3、CXCR4、CYFIP1、CYLD、DAXX、DBT、DDR2、DEPDC5、DIAPH1、DICER1、DIS3、DNMT3A、DOCK11、DOT1L、DROSHA、DSCAM、DXS6804、DXS7132、DXS7423、DYS391、DYS438、DYS458、EGFR、EGFR_fus、EIF4G3、EML4_fus、EP300、EPHA3、EPHA5、EPHA7、EPHB1、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC4、ERG、ERI1、ERRFI1、ESR1、ETV1、ETV6、ETV6_fus、EWSR1_fus、EXOSC8、EZH2、EZR_fus、F13A1、FAM149A、FAM153B、FAM46C、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCG、FANCI、FAS、FAT1、FBXW7、FGF16、FGF19、FGF3、FGF4、FGFR1、FGFR2、FGFR2_fus、FGFR3、FGFR4、FH、FLCN、FLOT1、FLT1、FLT3、FLT4、FMO1、FOLH1、FOXL2、FOXP1、FRAS1、FUBP1、FUS_fus、GABRP、GANC、GATA1、GATA2、GATA3、GLI1、GMEB1、GNA11、GNA13、GNAQ、GNAS、GPM6A、GRIN2A、GSK3B、GSTM1、H3F3A、HAUS2、HCAR2、HEY1_fus、HGF、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HNF1A、HNRNPH1、HRAS、HSPA1B、HSPA4、HYOU1、IARS、ID2、ID3、IDH1、IDH2、IGF1R、IGF2、IKBKE、IKZF1、IL7R、IL8、INHBA、INPP4B、IPO7、IRAK1、IRF4、IRF6、IRF8、IRS2、ITGAL、JAK1、JAK2、JAK3、JUN、KCNJ2、KDM5A、KDM5C、KDM6A、KDR、KEAP1、KIAA1210、KIAA1432、KIF5B_fus、KIR3DX1、KIT、KMT2A、KMT2C、KMT2D、KPNA4、KPNB1、KRAS、LAMA3、LEPR、LMO1、LOC100131626、LONRF3、LRRC34、LYN、MAGOHB、MALT1、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MAP3K4、MAP4K5、MAPK1、MAPKAP1、MARK2、MCL1、MDM2、MDM4、MED12、MED19、MEF2B、MEIS1、MEN1、MET、MIR1273H、MITF、MLH1、MMP16、MONO-27、MOV10L1、MPL、MRE11A、MRPL19、MSH2、MSH3、MSH6、MTF1、MTOR、MTRR、MUTYH、MYADM、MYC、MYCL、MYCN、MYD88、MYO10、NAB1、NAB2_fus、NBN、NCOA6、NDUFS1、NEO1、NF1、NF2、NFE2L2、NFKBIA、NFXL1、NKX2-1、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NPM1、NR-21、NR-24、NR4A3_fus、NRAS、NSD1、NT5C2、NTRK1、NTRK1_fus、NTRK2、NTRK2_fus、NTRK3、NTRK3_fus、NUP85、NUP93、P2RY8、PALB2、PAPOLG、PAQR8、PARK2、PARP1、PAX5、PBRM1、PDCD1、PDCD1LG2、PDE6C、PDGFB_fus、PDGFRA、PDGFRB、PDPN、PIGF、PIK3C2G、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PLCG2、PLEKHA1、PLEKHH2、PMS2、PNO1、POLD1、POLE、PPARG、PPHLN1_fus、PPP2R1A、PRDM1、PREX2、PRKAR1A、PRKCI、PRPF39、PTCH1、PTEN、PTPN11、PTPRJ、PURA、RABGAP1L、RAC1、RAD21、RAD50、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD52、RAD54L、RAF1、RARA、RB1、RBM10、RBM27、REL、RET、RET_fus、RHOT1、RICTOR、RIPK2、RNF19A、RNF43、ROS1、ROS1_fus、RPA4、RPTOR、RRP1B、RUNX1、RYR2、SASH1、SDHA、SDHB、SDHC、SDHD、SEL1L3、SETD2、SF3B1、SHROOM3、SIPA1L2、SLC34A2_fus、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SMO、SNX6、SOCS1、SOX2、SOX9、SPC24、SPEN、SPOP、SRC、SS18_fus、STAG2、STAT3、STK11、STMN1、STRBP、SUCLG1、SUFU、SUGCT、SYK、TAF15、TAGAP、TBC1D8B、TBX3、TECPR2、TERT、TET2、TGFBR2、TMEM67、TMPRSS15、TMPRSS2、TNFAIP3、TNFRSF14、TNFSF13B、TNKS、TNRC18、TOP1、TOP2B、TP53、TPH1、TRA2A、TRIM24、TSC1、TSC2、TSHR、TSN、TXNRD1、U2AF1、UBE2E3、UBE3C、ULK4、UPF2、UTY、VEGFA、VHL、VSIG10、WHSC1、WHSC1L1、WT1、WWC3、XPO1、ZBBX、ZDHHC17、ZNF711、ZNF805和ZZZ3。
3.根据权利要求1所述的检测panel，其特征在于，所述微卫星不稳定性位点包括rs1045642、rs1052555、rs10981694、rs11045585、rs1105525、rs1130214、rs1138272、rs115232898、rs11572080、rs11598702、rs11615、rs12613732、rs12762549、rs13181、rs151264360、rs1517114、rs1570360、rs1650697、rs1650723、rs1695、rs1799793、rs1801019、rs1801131、rs1801133、rs1801265、rs1805087、rs183484、rs1934951、rs2032582、rs2072671、rs2075252、rs2228001、rs2273618、rs2291075、rs2291767、rs2297595、rs2494752、rs2501873、rs25487、rs2784917、rs28738963、rs316019、rs3212986、rs3745274、rs3892097、rs3918290、rs3957357、rs4148323、rs4244285、rs430397、rs442767、rs4646、rs4673、rs4673993、rs4728709、rs4880、rs50872、rs55886062、rs60369023、rs67376798、rs699947、rs716274、rs7779029、rs7851395、rs8133052、rs8175347、rs873478、rs9679162和rs9937。
4.一种基于二代测序的用于泛癌种靶向、化疗及免疫用药的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含检测探针，所述检测探针针对泛癌种分型、治疗、预后相关的基因突变，微卫星不稳定性位点和肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测探针覆盖区域/目标区域>＝99％。
6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述泛癌种分型、治疗、预后相关的基因突变和所述肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域包括：ABCA13、ABCA8、ABL1、ACADSB、ACOT13、ADAMTS6、ADRB1、ADSS、AGPAT9、AK7、AKT1、AKT2、AKT3、ALG9、ALK、ALK_fus、ALOX12B、ALS2CR11、AMER1、ANKRA2、ANKRD46、ANO1、APC、APOPT1、AR、ARAF、ARHGAP4、ARHGAP6、ARID1A、ARID1B、ARID2、ARID4A、ARL6IP6、ARMC5、ARPC2、ASH1L、ASXL1、ATM、ATP9B、ATR、ATRX、AURKA、AURKB、AXIN1、AXL、B2M、BAP1、BARD1、BAT-25、BAT-26、BCL2、BCL2L1、BCOR、BCYRN1、BLM、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRIP1、BRS3、BTF3、BTG1、BTK、C20orf96、C22orf23、C5orf42、C9orf72、CAB39、CALD1、CALM2、CALR、CARD11、CASP8、CAST,ERAP1、CBFB、CBL、CBR4、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CCR4、CD274、CD40、CD74_fus、CD79A、CD79B、CDC25B、CDC73、CDH1、CDK12、CDK4、CDK6、CDK7、CDK8、CDKL3、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CDO1、CEBPA、CEP120、CHD1、CHEK1、CHEK2、CIC、CNKSR3、CNOT8、COSM1316144、COSM1316145、COSM1332498、COSM3676668、COSM3747491、COSM5045664、COX18、CREBBP、CRKL、CRLF2、CSF1R、CSF3R、CTAGE5、CTCF、CTNNB1、CUL3、CXCR4、CYFIP1、CYLD、DAXX、DBT、DDR2、DEPDC5、DIAPH1、DICER1、DIS3、DNMT3A、DOCK11、DOT1L、DROSHA、DSCAM、DXS6804、DXS7132、DXS7423、DYS391、DYS438、DYS458、EGFR、EGFR_fus、EIF4G3、EML4_fus、EP300、EPHA3、EPHA5、EPHA7、EPHB1、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC4、ERG、ERI1、ERRFI1、ESR1、ETV1、ETV6、ETV6_fus、EWSR1_fus、EXOSC8、EZH2、EZR_fus、F13A1、FAM149A、FAM153B、FAM46C、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCG、FANCI、FAS、FAT1、FBXW7、FGF16、FGF19、FGF3、FGF4、FGFR1、FGFR2、FGFR2_fus、FGFR3、FGFR4、FH、FLCN、FLOT1、FLT1、FLT3、FLT4、FMO1、FOLH1、FOXL2、FOXP1、FRAS1、FUBP1、FUS_fus、GABRP、GANC、GATA1、GATA2、GATA3、GLI1、GMEB1、GNA11、GNA13、GNAQ、GNAS、GPM6A、GRIN2A、GSK3B、GSTM1、H3F3A、HAUS2、HCAR2、HEY1_fus、HGF、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HNF1A、HNRNPH1、HRAS、HSPA1B、HSPA4、HYOU1、IARS、ID2、ID3、IDH1、IDH2、IGF1R、IGF2、IKBKE、IKZF1、IL7R、IL8、INHBA、INPP4B、IPO7、IRAK1、IRF4、IRF6、IRF8、IRS2、ITGAL、JAK1、JAK2、JAK3、JUN、KCNJ2、KDM5A、KDM5C、KDM6A、KDR、KEAP1、KIAA1210、KIAA1432、KIF5B_fus、KIR3DX1、KIT、KMT2A、KMT2C、KMT2D、KPNA4、KPNB1、KRAS、LAMA3、LEPR、LMO1、LOC100131626、LONRF3、LRRC34、LYN、MAGOHB、MALT1、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MAP3K4、MAP4K5、MAPK1、MAPKAP1、MARK2、MCL1、MDM2、MDM4、MED12、MED19、MEF2B、MEIS1、MEN1、MET、MIR1273H、MITF、MLH1、MMP16、MONO-27、MOV10L1、MPL、MRE11A、MRPL19、MSH2、MSH3、MSH6、MTF1、MTOR、MTRR、MUTYH、MYADM、MYC、MYCL、MYCN、MYD88、MYO10、NAB1、NAB2_fus、NBN、NCOA6、NDUFS1、NEO1、NF1、NF2、NFE2L2、NFKBIA、NFXL1、NKX2-1、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NPM1、NR-21、NR-24、NR4A3_fus、NRAS、NSD1、NT5C2、NTRK1、NTRK1_fus、NTRK2、NTRK2_fus、NTRK3、NTRK3_fus、NUP85、NUP93、P2RY8、PALB2、PAPOLG、PAQR8、PARK2、PARP1、PAX5、PBRM1、PDCD1、PDCD1LG2、PDE6C、PDGFB_fus、PDGFRA、PDGFRB、PDPN、PIGF、PIK3C2G、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PLCG2、PLEKHA1、PLEKHH2、PMS2、PNO1、POLD1、POLE、PPARG、PPHLN1_fus、PPP2R1A、PRDM1、PREX2、PRKAR1A、PRKCI、PRPF39、PTCH1、PTEN、PTPN11、PTPRJ、PURA、RABGAP1L、RAC1、RAD21、RAD50、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD52、RAD54L、RAF1、RARA、RB1、RBM10、RBM27、REL、RET、RET_fus、RHOT1、RICTOR、RIPK2、RNF19A、RNF43、ROS1、ROS1_fus、RPA4、RPTOR、RRP1B、RUNX1、RYR2、SASH1、SDHA、SDHB、SDHC、SDHD、SEL1L3、SETD2、SF3B1、SHROOM3、SIPA1L2、SLC34A2_fus、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SMO、SNX6、SOCS1、SOX2、SOX9、SPC24、SPEN、SPOP、SRC、SS18_fus、STAG2、STAT3、STK11、STMN1、STRBP、SUCLG1、SUFU、SUGCT、SYK、TAF15、TAGAP、TBC1D8B、TBX3、TECPR2、TERT、TET2、TGFBR2、TMEM67、TMPRSS15、TMPRSS2、TNFAIP3、TNFRSF14、TNFSF13B、TNKS、TNRC18、TOP1、TOP2B、TP53、TPH1、TRA2A、TRIM24、TSC1、TSC2、TSHR、TSN、TXNRD1、U2AF1、UBE2E3、UBE3C、ULK4、UPF2、UTY、VEGFA、VHL、VSIG10、WHSC1、WHSC1L1、WT1、WWC3、XPO1、ZBBX、ZDHHC17、ZNF711、ZNF805和ZZZ3。
7.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述微卫星不稳定性位点包括rs1045642、rs1052555、rs10981694、rs11045585、rs1105525、rs1130214、rs1138272、rs115232898、rs11572080、rs11598702、rs11615、rs12613732、rs12762549、rs13181、rs151264360、rs1517114、rs1570360、rs1650697、rs1650723、rs1695、rs1799793、rs1801019、rs1801131、rs1801133、rs1801265、rs1805087、rs183484、rs1934951、rs2032582、rs2072671、rs2075252、rs2228001、rs2273618、rs2291075、rs2291767、rs2297595、rs2494752、rs2501873、rs25487、rs2784917、rs28738963、rs316019、rs3212986、rs3745274、rs3892097、rs3918290、rs3957357、rs4148323、rs4244285、rs430397、rs442767、rs4646、rs4673、rs4673993、rs4728709、rs4880、rs50872、rs55886062、rs60369023、rs67376798、rs699947、rs716274、rs7779029、rs7851395、rs8133052、rs8175347、rs873478、rs9679162和rs9937。
8.一种如权利要求1至3中任一项所述的基于二代测序的用于泛癌种靶向、化疗及免疫用药的检测panel或如权利要求4至7中任一项所述的基于二代测序的用于泛癌种靶向、化疗及免疫用药的检测试剂盒在制备用于泛癌种分型、治疗、预后相关的基因突变、微卫星不稳定性位点和肿瘤突变负荷计算相关的外显子区域联合检测的装置中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述泛癌种包括：肺癌、肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌和子宫内膜癌。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述联合检测包括多种突变类型的检测，所述包括多种突变类型：点突变、融合、拷贝数变异、缺失和***突变；
优选的，所述应用包括靶向药、化疗药或免疫药的伴随诊断。
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