CN114480660A - 一种用于检测泛癌种的基因Panel、探针及应用 - Google Patents
一种用于检测泛癌种的基因Panel、探针及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测泛癌种的基因Panel、探针及应用。基因Panel包括肿瘤通路相关基因、肿瘤遗传易感基因、肿瘤高频突变基因、肿瘤靶向药相关基因、肿瘤驱动基因、免疫疗效相关基因、关键DDR通路相关基因、其他在癌症发生发展中起重要作用的基因。利用该基因Panel可一次性对目前已经被国家药品监督管理局（NMPA）/美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市的实体瘤靶向药物所对应的所有生物标志物进行检测，从而充分指导肿瘤的精准治疗。还可对受检者预后进行评估，对受检者的复发风险进行分层，指导术后辅助治疗；另外，还可以对受检者进行遗传性肿瘤的评估，用于提示家族遗传风险，做到早发现、早诊断、早治疗。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤多基因检测技术领域，尤其涉及一种用于检测泛癌种的基因Panel、探针及应用。
背景技术
根据国家癌症中心统计，2015年我国新发癌症病例为186.39/10万，死亡率为105.84/10万。临床研究将肿瘤归为一种基因病，主要是由于原癌基因的激活或抑制基因的失活所导致。随着高通量测序（NGS）和生物技术的巨大进步，已发现多个与癌症发生发展相关的驱动基因以及可用于指导肿瘤治疗的生物标志物，且针对驱动基因和生物标志物开发了多款药物，在临床治疗中可根据检测到的驱动基因突变或生物标志物进行精准治疗，至此肿瘤的治疗模式从传统治疗转变为精准治疗。
目前，用于精准治疗的基因检测技术包括Sanger测序（一代测序）、RT-PCR（聚合酶链式反应）、IHC（免疫组织化学法）、FISH（荧光原位杂交）和高通量测序（NGS）技术等。其中，Sanger测序虽然是测序的金标准，但由于该测序技术一个反应只能得到一条序列，因此测序通量低；虽然单个反应价格低廉，但是获得大量测序的成本高；检测灵敏度较低，一般只能检测突变丰度在20%以上的突变，对于一些低频突变存在漏检的可能。RT-PCR只能对已知位点进行检测，不能发现未知位点。IHC主要用于检测蛋白表达，不能检测基因的点突变（SNV）、小片段***缺失（Indel）等，因此，需要根据基因SNV/Indel指导用药的检测不能通过IHC实现。FISH检测虽是鉴定基因融合（Fusion）、扩增（CNV）的金标准，但同样不适用SNV/Indel的检测。而高通量测序（NGS）技术则具有如下优势：通量高（一次检测数个基因到数百个基因乃至全外显子组）、灵敏度高、检测限更低、探索能力更强，可发现未知突变、一次检测多种突变类型（SNV/Indel/Fusion/CNV）、还可以检测基因组生物标志物（肿瘤突变负荷/微卫星不稳定性）。仅通过一次检测可实现对精准治疗的全面指导。
发明内容
为了解决Sanger测序（一代测序）、RT-PCR（聚合酶链式反应）、IHC（免疫组织化学法）、FISH（荧光原位杂交）技术中存在的问题，本发明选择采用高通量测序（NGS）技术。本发明提供了如下技术方案。
本发明一方面提供了一种用于检测泛癌种的基因Panel，包括肿瘤通路相关基因、肿瘤遗传易感基因、肿瘤高频突变基因、肿瘤靶向药相关基因、肿瘤驱动基因、免疫疗效相关基因、关键DDR通路相关基因、其他在癌症发生发展中起重要作用的基因；所述关键DDR通路相关基因包括：ATM、ATR、BARD1、BLM、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CHEK1、CHEK2、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、FAM175A、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCL、MDC1、MLH1、MRE11A、MSH2、MSH3、MSH6、NBN、PALB2、PARP1、PMS1、PMS2、POLE、PRKDC、PTEN、RAD50、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD52、RAD54L、TP53、TP53BP1、XRCC2。
优选地，所述肿瘤通路相关基因包括：AKT1、AKT2、AKT3、ALK、APC、AR、ARAF、ASXL1、ATM、ATR、ATRX、AURKA、AURKB、AXIN1、BCL2、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRIP1、BTK、CASP8、CBL、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CD79A、CD79B、CDK12、CDK4、CDK6、CDK8、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CHEK1、CHEK2、CRKL、CRLF2、CSF1R、CTNNA1、CTNNB1、DDR1、DDR2、DNMT3A、DOT1L、EGFR、EPHA3、EPHA5、EPHB1、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ESR1、EZH2、FAM46C、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCL、FAS、FGF10、FGF14、FGF19、FGF23、FGF3、FGF4、FGF6、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FLT1、FLT3、FLT4、GNA11、GNA13、GNAQ、GNAS、GPR124、GSK3B、HGF、HRAS、IDH1、IDH2、IGF1R、JAK1、JAK2、JAK3、KAT6A、KDM5A、KDM5C、KDM6A、KDR、KIT、KLHL6、KRAS、LRP1B、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MAPK1、MDM2、MDM4、MET、MITF、MLH1、MPL、MRE11A、MSH2、MSH6、MTOR、MUTYH、MYD88、NF1、NFKBIA、NPM1、NRAS、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PALB2、PBRM1、PDGFRA、PDGFRB、PGR、PIK3CA、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PTCH1、PTEN、PTPN11、RAD50、RAD51、RB1、RET、RICTOR、RNF43、ROS1、RPTOR、SETD2、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMO、SOCS1、SRC、STAG2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、SUFU、TET2、TGFBR1、TGFBR2、TNFAIP3、TP53、TSC1、TSC2、TSHR、WISP3、WT1。
优选地，所述肿瘤遗传易感基因包括：ALK、APC、ATM、AXIN2、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDKN2A、CHEK2、FH、FLCN、GREM1、KIT、MEN1、MET、MLH1、MSH2、MSH3、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RB1、SMAD4、STK11、TP53、TSC1、VHL、SDHD、TSC2、PDGFRA、BARD1、CDK4、RET、SMARCA4、SMARCB1、SDHA、PRKAR1A、HOXB13、BRAF、PTCH1、SDHAF2。
优选地，所述肿瘤高频突变基因包括：ACVR1B、AKT1、AKT2、AKT3、AMER1、APC、ARID1A、ARID1B、ARID2、ASXL2、ATM、ATRX、AXIN1、BAP1、BCL2L11、BCOR、BRAF、BRCA1、BRCA2、BTG2、CASP8、CBFB、CCND1、CCND3、CCNE1、CD274、CDH1、CDK12、CDK4、CDK6、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CHD4、CREBBP、CTNNA1、CTNNB1、EGFR、ELF3、EP300、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC2、ERG、FANCD2、FAT1、FBXW7、FGF19、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FOXA1、GABRA6、GATA3、GATA4、GATA6、GNAS、HLA-A、HLA-B、HRAS、IDH1、IGF1R、IGF2、JAK2、KAT6A、KDM5C、KDM6A、KEAP1、KMT2A、KMT2C、KMT2D、KRAS、LRP1B、MAP2K4、MAP3K1、MAPK1、MCL1、MDM2、MDM4、MED12、MET、MLH1、MSH2、MSH3、MSH6、MTOR、MYC、NCOA3、NCOR1、NF1、NF2、NFE2L2、NKX2-1、NOTCH1、NRAS、PBRM1、PDCD1LG2、PIK3CA、PIK3R1、PMS2、POLE、PPP2R1A、PTEN、PTPRD、RASA1、RB1、RBM10、RHOA、RIT1、RNF43、RUNX1、RXRA、SETD2、SF3B1、SMAD2、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SOX17、SOX9、SPOP、STAG2、STK11、TBX3、TCF7L2、TERC、TERT、TGFBR2、TMPRSS2、TNFAIP3、TP53、TSC1、TSC2、U2AF1、VEGFA、VHL、WHSC1L1。
优选地，所述肿瘤靶向药相关基因包括：ABL1、ABL2、ACVR1、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、AR、ARAF、ARID1A、ATM、ATR、ATRX、AXL、BAP1、BARD1、BCL2、BCL6、BLM、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRIP1、BTK、C11orf30、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CDK12、CDK4、CDK6、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CHEK1、CHEK2、CRKL、CRLF2、CSF1R、CTNNB1、CYP17A1、DAXX、DDR1、DDR2、DNMT3A、DOT1L、EGFR、EPAS1、EPHA3、ERBB2、ERBB4、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ERG、ERRFI1、ESR1、ESR2、ETV6、EZH2、FAM175A、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCL、FBXW7、FGF19、FGF3、FGF4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FLCN、FLT1、FLT3、FLT4、FOXA1、FYN、GATA2、GLI1、GNA11、GNAQ、GNAS、H3F3A、HRAS、HSD3B1、IDH1、IDH2、IGF1R、IKBKE、JAK1、JAK2、KDR、KEAP1、KIT、KMT2A、KRAS、LYN、MAP2K1、MAP2K2、MAPK1、MAPK3、MDM2、MDM4、MEN1、MET、MITF、MLH1、MPL、MRE11A、MSH2、MSH6、mTOR、MUTYH、MYC、MYD88、NBN、NF2、NOTCH1、NOTCH2、NPM1、NRAS、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PALB2、PDGFRA、PDGFRB、PGR、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG、PIK3R1、PMS2、POLD1、POLE、PTCH1、PTEN、RAB35、RAD50、RAD51、RAD52、RAF1、RARA、RB1、RET、RHEB、RICTOR、ROS1、SLX4、SMARCA4、SMARCB1、SMO、SRC、STK11、SYK、TMPRSS2、TOP2A、TP53、TSC1、TSC2、VHL、XRCC2。
优选地，所述肿瘤驱动基因包括：ABL1、ACVR1、ACVR1B、AKT1、ALK、AMER1、APC、AR、ARAF、ARID1A、ARID2、ARID5B、ASXL1、ASXL2、ATM、ATR、ATRX、AXIN1、AXIN2、B2M、BAP1、BCL2、BCL2L11、BCOR、BRAF、BRCA1、BRCA2、BTG2、CARD11、CASP8、CBFB、CCND1、CD70、CD79B、CDH1、CDK12、CDK4、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2C、CEBPA、CHD4、CHEK2、CIC、CREBBP、CSDE1、CTCF、CTNNB1、CUL3、CYLD、CYSLTR2、DICER1、DNMT3A、EGFR、EIF1AX、ELF3、EP300、EPAS1、EPHA3、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC2、ESR1、EZH2、FAT1、FBXW7、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLT3、FOXA1、FUBP1、GABRA6、GATA3、GNA11、GNA13、GNAQ、GNAS、GPS2、H3F3A、H3F3C、HGF、HIST1H1C、HLA-A、HLA-B、HRAS、IDH1、IDH2、IL7R、INPPL1、IRF2、JAK1、JAK2、JAK3、KDM5C、KDM6A、KEAP1、KEL、KIT、KMT2A、KMT2B、KMT2C、KMT2D、KRAS、LATS1、LATS2、LZTR1、MAP2K1、MAP2K4、MAP3K1、MAPK1、MED12、MEN1、MET、MGA、MLH1、MSH2、MSH3、MSH6、MTOR、MYC、MYCN、MYD88、NCOR1、NF1、NF2、NFE2L2、NOTCH1、NOTCH2、NPM1、NRAS、NSD1、NUP93、PAX5、PBRM1、PDGFRA、PGR、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PIM1、PMS1、PMS2、POLE、PPM1D、PPP2R1A、PPP6C、PRKAR1A、PTCH1、PTEN、PTPN11、PTPRD、RAC1、RAD21、RAF1、RARA、RASA1、RB1、RBM10、RET、RHEB、RHOA、RIT1、RNF43、RRAS2、RUNX1、RXRA、SETD2、SF3B1、SMAD2、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SOS1、SOX17、SOX9、SPOP、SPTA1、SRSF2、STAG2、STK11、TAF1、TBX3、TCEB1、TCF7L2、TET2、TGFBR2、TNFAIP3、TP53、TSC1、TSC2、U2AF1、VHL、WHSC1、WT1、XPO1、ZFHX3。
优选地，所述免疫疗效相关基因包括：TSC2、ATM、B2M、BRCA1、BRCA2、CCND1、DNMT3A、EGFR、FGF19、FGF3、FGF4、JAK1、JAK2、KRAS、MDM2、MDM4、MLH1、MSH2、MYC、PBRM1、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、STK11、VHL、NF1、TP53。
优选地，所述其他在癌症发生发展中起重要作用的基因包括： DUSP4、ETV4、FOXP1、GID4、GRM3、HIST1H3B、HIST2H3D、ICOSLG、IL10、IRS1、KNSTRN、MAGI2、MAPKAP1、MSI1、NT5C2、PAK3、PMAIP1、PPP4R2、RFWD2、RRAGC、SOX10、TNFRSF14、ZNF703、ANKRD11、BABAM1、E2F3、EPCAM、ETV5、FGF12、FRS2、HIST1H3C、HIST3H3、ID3、IRS2、MALT1、MAX、MSI2、NTHL1、PAK5、RAC2、RANBP2、RRAS、SGK1、GSTM1、TOP1、TYRO3、WWTR1、BCORL1、BTG1、EED、HIST1H3D、INHA、MST1、MYOD1、NKX3-1、PRDM1、PTP4A1、SDHB、SH2B3、SOX2、TAP1、TET1、XIAP、BCR、CDC42、CUL4A、DIS3、EGFL7、EWSR1、H3F3B、HIST1H3E、INHBA、MKNK1、MST1R、PRKN、PDK1、PNRC1、PRDM14、RSPO2、SDHC、SH2D1A、TAP2、UPF1、AGO2、BBC3、BIRC3、CDC73、CXCR4、DNAJB1、EPHA7、ERF、EZH1、HIST1H3F、HLA-C、IFNGR1、INPP4A、KLF4、LMO1、MTAP、PDPK1、PREX2、RTEL1、SHOC2、SMARCD1、SPEN、ARFRP1、BCL10、DNMT1、GATA1、HDAC1、HIST1H3G、HNF1A、IGF1、INPP4B、JUN、NOTCH3、NUF2、PARP2、PTPRO、SESN1、SHQ1、TP63、YAP1、CALR、CD22、CENPA、EIF4A2、EPHB4、EZR、HIST1H3H、LTK、MAP3K13、NEGR1、NOTCH4、PARP3、PHOX2B、PIK3R3、PPARG、PRKCI、PTPRS、RECQL、SESN2、SLC34A2、SMYD3、SPRED1、STK19、TCF3、TIPARP、TRAF2、VTCN1、YES1、BCL2L1、CD74、CHD2、CSF3R、DNMT3B、EIF4E、HIST1H3I、INSR、MAP3K14、MEF2B、MYB、NUTM1、PIK3C2B、PRKD1、PTPRT、RECQL4、RPS6KA4、SESN3、SLIT2、SNCAIP、STK40、TMEM127、TRAF7、ZBTB2、CARM1、FOXL2、HIST1H2BD、HIST1H3J、P2RY8、PIK3C2G、PLCG2、QKI、REL、RPS6KB2、RYBP、TEK、ALOX12B、BCL2L2、CD276、CTLA4、DCUN1D1、DROSHA、ETV1、FAM58A、FOXO1、GRIN2A、HIST1H3A、HIST2H3C、HSP90AA1、IKZF1、IRF4、MAF、MERTK、MYCL、PAK1、PDCD1、PIK3C3、PLK2、PPP2R2A、PRSS8、SDC4、KMT5A、SUZ12、ZNF217、RUNX1T1。
本发明第二方面提供了一种用于检测泛癌种的探针Panel，所述探针Panel为针对第一方面所述的肿瘤通路相关基因、肿瘤遗传易感基因、肿瘤高频突变基因、肿瘤靶向药相关基因、肿瘤驱动基因、免疫疗效相关基因、关键DDR通路相关基因、其他在癌症发生发展中起重要作用的基因的检测探针。
本发明第三方面提供了第一方面所述的基因Panel或第二方面所述的探针Panel在制备泛癌种检测装置中的应用。
本发明的有益效果是：本发明是包含561基因的Panel，可一次性对目前已经国家药品监督管理局（NMPA）/美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市的实体瘤靶向药物所对应的所有生物标志物进行检测。通过采集受检者的肿瘤组织样本及全血样本，进行肿瘤含量评估、DNA提取、建库、捕获、测序、生物信息学分析、医学解读，从而找到可用于指导精准治疗的生物标志物。其次，还可以对患者的预后进行预测，结合患者的临床、病理特征对患者的复发风险进行分层，从而指导辅助治疗。最后，还可以对受检者进行遗传性肿瘤的评估，用于提示家族遗传风险，做到早发现、早诊断、早治疗。
具体实施方式
为了更好地理解上述技术方案，下面通过具体的实施方式对上述技术方案做详细的说明。
本发明旨在提供一种用于泛癌种靶向、免疫、化疗用药、分子分型以及遗传风险评估的检测Panel。本发明利用目标区域捕获二代测序技术，分析561个与肿瘤个体化用药及遗传风险相关基因的全部外显子区域、部分基因的热点区域，以及化疗药物相关SNP位点。从而检测与泛癌种（泛癌种包括但不限于：肺癌、胃癌、肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌、***癌、胰腺癌等）相关的有明确临床意义的基因点突变（SNV）、小片段***缺失（Indel）、拷贝数变异（CNV）、基因融合（Fusion）以及肿瘤突变负荷（TMB）、微卫星不稳定性（MSI）等生物标志物，进一步指导肿瘤的精准治疗。同时也可以根据肿瘤患者检测到的基因突变辅助入组相应的临床试验。对临床治疗、诊断以及新靶点的发现提供指导意义。
本发明实施例提供的基因Panel中主要包括如下类别的基因：
已经过国家药品监督管理局（NMPA）或美国食品药品监督管理局（FDA）批准或得到美国国立癌症综合网络（NCCN）指南认可的以及即将被获批或是关键性临床试验在研的实体瘤靶向用药疗效相关基因；
免疫检测点抑制剂疗效相关基因，包括与疗效正相关的基因以及与耐药和风险相关的基因；
根据美国国立癌症综合网络（NCCN）指南、美国妇科肿瘤学会（SGO）等挑选的DNA损伤修复（DDR）通路的核心基因；
癌症发生发展过程其他重要通路的核心基因；
实体瘤重要驱动基因；
常见癌种的高频突变基因。
本发明提供的基因Panel，是一款包含561基因的Panel产品，包括目前已上市实体瘤靶向药物、免疫药物所对应的所有生物标志物。利用本发明的基因Panel可一次性对目前已经被国家药品监督管理局（NMPA）/美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市的实体瘤靶向药物所对应的所有生物标志物进行检测，从而充分指导肿瘤的精准治疗。还可对受检者预后进行评估，对受检者的复发风险进行分层，指导术后辅助治疗。
本发明提供的基因Panel还包括与泛癌种遗传性肿瘤相关基因，可充分评估遗传性肿瘤风险。当受检者存在致病或可能致病遗传易感基因突变，建议家族中尚未发病的健康人进行遗传评估，有助于提前了解相应肿瘤的发病风险。
此外，本发明提供的基因Panel还包括与泛癌种发生发展机制相关的基因，实用性要高于全外显子测序。在临床用药指导以及在后续生物标志物探索方面，都可以提供有价值的信息。
在具体应用过程中，可以通过采集受检者的肿瘤组织样本及全血样本，进行肿瘤含量评估、DNA提取、建库、捕获、测序、生物信息学分析、医学解读，从而找到可用于指导精准治疗的生物标志物。其次，还可以对患者的预后进行预测，结合患者的临床、病理特征对患者的复发风险进行分层，从而指导辅助治疗。最后，还可以对受检者进行遗传性肿瘤的评估，用于提示家族遗传风险，做到早发现、早诊断、早治疗。
在本发明实施例中，具体的可以采用如下方法进行检测：
提取检测样本DNA；
构建检测样本DNA文库；
构建如上所述的基因Panel的检测探针；
所述检测探针与所述DNA文库杂交捕获、洗脱、纯化并测序；
对测序结果进行生物信息学分析，得到检测样本的突变信息；
判断突变信息的致病性。
其中，所属样本DNA包括血液样本DNA，肿瘤组织样本DNA。构建DNA文库主要采用如下步骤：DNA打断、末端修复、接头连接、文库扩增、纯化。
另外，本发明实施例中，对可能影响检测结果的一些参量进行了验证和评估，具体的包括：
1、建库起始量评估
评估不同起始量对检测结果的影响。选取3例样本，分别使用30ng、50ng和100ng起始建库，每个样本做三次重复。对比起始量对检测结果的影响。从而评估不同起始量下样本质控是否通过及目标变异是否检出。结果显示30ng条件下样本质控通过且目标变异全部检出，因此最低投入量为30ng。
2、阳性符合率评估
检测22例样本，变异类型包含单核苷酸变异（SNV）、小片段***缺失（Indel）和拷贝数变异（CNV），样本来源均为临检样本。所有突变均用数字PCR或一代测序、QPCR等方法验证。结果显示所有目标变异全部检出，即阳性位点符合率为100%。
3、阴性符合率评估
检测20例阴性样本，样本来源为临床样本，评估有无目标阳性变异检出。结果显示目标变异均为检出，即阴性符合率为100%。
4、最低检测限评估
选择4例样本，变异类型包括单核苷酸变异（SNV）、小片段***缺失（Indel）、拷贝数变异（CNV）和融合（Fusion），样本来源为标准品和临床样本。每一个突变频率各做3次平行。突变频率设置：SNV和Indel设置的期望频率为1%、2%、5%，CNV设置的期望拷贝数为2.5拷贝数、3拷贝数、3.5拷贝数，Fusion设置期望频率为1%、2%、5%。最终以变异位点全部检出的最低期望频率作为最低检测限。
最终结果显示：
1）SNV变异位点频率在2%以上的位点全部检出，因此SNV的最低检测限为2%。
2）Indel变异位点频率在5%以上的位点全部检出，因此Indel的最低检测限为5%。
3）CNV变异拷贝数在3以上的全部检出，因此CNV最低检测限为3。
4）Fusion变异位点频率在5%以上的位点全部检出，因此Fusion的最低检测限为5%。
5、重复性验证
选择6例临床样本，进行3次批内重复及3次批间重复检测。结果显示同一样本批次内及批次间重复性检测结果一致。
6、干扰物分析
选取6例样本，分别添加干扰物质胆红素（浓度342μM/L）、甘油三酯（浓度37mM/L）、血红蛋白（浓度2g/L）及80%乙醇，每例样本每个处理做3个重复。结果显示：胆红素（浓度342μM/L）、甘油三酯（浓度342mM/L）、血红蛋白（浓度2g/L）、80%乙醇均对检测结果无影响。
7、DNA质量评估
选19例不同质量等级的样本，使用100ng DNA建库。从而评估不同质量的样本对突变检出的影响。DNA主条带＞500bp的样本，变异位点均可被检出。
8、肿瘤细胞占比评估
经验证的组织样本，肿瘤含量均在20%-90%之间，所有阳性位点均被检出。即本Panel可对肿瘤含量≥20%的样本进行检测。
9、样本稳定性评估
本次验证使用的组织样本，收样日期在2019年3月-2021年6月，所有阳性位点均被检出。即本Panel可对保存时间2年以内的组织样本进行检测。
具体实施例
以富集得到的561基因片段用于基于下一代测序技术对癌症患者进行突变检测，指导患者精准治疗为例，示例性地说明本发明。
该检测过程主要包含如下步骤：准备DNA样本库、DNA文库的构建、检测探针与DNA文库杂交并基于下一代测序技术进行检测、生信分析识别突变、突变解读并根据解读结果出具报告。
步骤一：提取检测样本DNA（所属样本DNA包括血液样本DNA，肿瘤组织样本DNA）。
步骤二：检测样本DNA文库的构建。主要步骤有：DNA打断、末端修复、接头连接、文库扩增、纯化。具体可以按照如下步骤进行实施：
1、样本制备
对于石蜡包埋组织样本，使用 QIAGEN 公司QIAamp DNA FFPE Tissue Kit，血液样本使用QIAamp DNA Blood Mini Kit，严格按照说明书步骤进行操作。所提 DNA 需要进行定量检测，提取后的 DNA 使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit 及配套仪器进行检测，提取总量应不少于 50ng。
2、DNA文库构建
2.1、取样打断
1)采用如表1所示打断体系：
2）FFPE DNA使用Covaris打断，血液细胞基因组DNA使用Covaris打断或Bioruptor打断。
① Covaris打断操作如下：
a. 准备Covaris打断管，在管盖标记DNA样本序号
b. 在打断管中加入TE Buffer pH 8.0和样本
c.对样本进行打断，打断仪打断参数如表2所示：
②Bioruptor打断操作如下：
a. 准备Bioruptor打断管，在管盖标记DNA样本序号
b. 在打断管中加入TE Buffer pH 8.0和样本
c.对样本进行打断，打断仪打断参数如表3所示：
d. 打断后的DNA用2%琼脂糖凝胶电泳质检，使用50bp DNA Ladder和D2000 DNAladder，电压150V，电泳条带在200bp-300bp为合格。
2.2、末端修复
1)按照表4配制End Repair Mix。
2）参照表5设置End Repair反应程序，调节热盖温度为40℃。
3) 将样本放入PCR仪，运行End Repair反应程序。
4) 将使用后的试剂放回原试剂盒中并-20℃保存。
2.3、配制Ligation1 Mix
按照表6配制Ligation 1 Mix。
2.4、末端修复后纯化
1)从4℃冰箱取出AMPure XP磁珠，室温平衡30min。
2)取147.5μL（2.5×）AMPure XP磁珠加入到末端修复样品中，充分混匀。
3)室温静置10min，转移至磁力架，静置5min至液体完全澄清，弃上清，注意勿吸到磁珠。
4)沿管侧壁缓慢加入160μL 80%乙醇，静置30s, 使用移液器移弃上清。
5)重复步骤4）一次。
6)用10μL移液器吸除残留的乙醇，室温放置3min晾干。
7)向样品管中加入30μL Ligation 1 Mix，震荡混匀，瞬时离心。
2.5、Ligation 1
1）参照表7设置Ligation 1反应程序，调节热盖温度为70℃。
注：此环节结束后，可将样本放于4℃保存，不超过2h！
2）运行Ligation 1反应程序。
2.6、Ligation 2
1)按照表8配制Ligation 2 Mix。
2) 从PCR仪上取出Ligation 1的PCR反应管，瞬时离心后置于冰上。向每个反应管中分装10μL Ligation 2 Mix，振荡混匀，瞬时离心。
3) 参照表9设置Ligation 2反应程序，调节热盖温度为70℃。
4) 将样本放入PCR仪，运行Ligation 2反应程序。
2.7、Adaptor连接后纯化
1)取100μL（2.5×）PEG/NaCl加入到Ligation 2反应后的样品中，充分混匀。
2)室温静置10min，转移至磁力架，静置5min至液体完全澄清，弃上清，注意勿吸到磁珠。
3)沿管侧壁缓慢加入160μL 80%乙醇，静置30s, 使用移液器移弃上清。
4)重复步骤3）一次。
5)用10μL移液器吸除残留的乙醇，室温放置3min晾干。
6)向样品管中加入20μL Nuclease-Free Water，震荡混匀，瞬时离心。
2.8、PCR扩增
1)按照表10体系在PCR管中配制PCR反应体系。
2)振荡混匀，瞬时离心使全部反应液置于PCR管底部。
PCR扩增程序如表11：
2.9、文库纯化与定量
1)从4℃冰箱取出AMPure XP磁珠，室温平衡30min。
2)将PCR产物从PCR仪中拿出，瞬时离心，放在磁力架上静置5min，将上清液转移至新管中。
3)取65μL（1.3×）AMPure XP磁珠加入到PCR产物中，用移液器（量程65μL）吹打20下，充分混匀。
4)室温静置10min，转移至磁力架，静置5min至液体完全澄清，弃上清，注意勿吸到磁珠。
5)沿管侧壁缓慢加入160μL 80%乙醇，静置30s, 使用移液器移弃上清。
注：若弃废液时吸到磁珠，需静置2min，待磁珠被吸附后，弃上清。
6)重复步骤5）一次。
7)用10μL移液器吸除残留的乙醇，室温放置3min晾干。
8)向样品管中加入32μL TE Buffer PH 8.0，震荡混匀，瞬时离心，室温孵育8min。
9)将样品管置于磁力架上5min，至液体完全澄清，使用移液器小心将30μL上清转移至新的1.5ml离心管中。
10) 使用Qubit 4.0对文库Qubit进行定量。
2.10、文库质检，结果如表12所示。
2.11、文库保存，将文库放入扩增区-20℃冰箱存放。
步骤三：构建本发明所述检测Panel的检测探针，与DNA文库杂交捕获、洗脱、纯化并测序。具体的，在本发明实施例中，具体采用Integrated DNA Technologies IDT 公司网站的 Target Capture Probe Design & Ordering Tool工具设计并制造了30465个IDT探针。
具体可以按照如下方法进行实施。
文库杂交步骤如下：
1、将 Human Cot DNA和xGen® Universal Blockers-TS Mix振荡混匀，瞬时离心。
2、按照表13配制杂交反应液Mix。
3、向离心管中加入7μL Mix以及500ng-1ug DNA文库，震荡混匀，瞬时离心。并放入真空浓缩仪中干燥，备用。
4、按照表14将xGen ® 2x Hybridization Buffer 和xGen ® 2x Hyb BufferEnhancer振荡混匀，瞬时离心，得到杂交反应液。
5、向蒸干后的样本中加入上述杂交反应液、4μL探针，于恒温混匀仪上25℃孵育10min。
6、放入PCR仪中，点击程序，开始运行。PCR程序如表15：
文库洗脱步骤如下：
1. 链霉亲和素磁珠清洗
1）将xGen® 2x Hybridization Buffer和xGen® 2X Hyb Buffer Enhancer振荡混匀，瞬时离心。
2）按照表16配制磁珠悬浮液Mix。
3) 将Dynabeads M-270 Streptavidin 振荡混匀。每个文库Dynabeads M-270Streptavidin 的用量为50μL。
4) 每个文库 1XBead Wash Buffer（Nuclease-Free Water和xGen® 2x BeadWash Buffer按1:1比例配制）的用量为100μL，向管中加入相应体积的1X Bead WashBuffer振荡混匀（n×100 μL），瞬时离心，置于磁力架1min，待液体完全澄清，使用移液器吸弃上清。
5) 重复步骤4）两次。
6) 用移液器将残留液体吸出。
7) 每个文库磁珠悬浮液的用量为17μL，向管中加入相应体积的磁珠悬浮液悬浮。
8) 准备相应个数的PCR管，每个管中分装17μL的磁珠与悬浮液的混合液。
9) 将含有磁珠悬浮液的PCR管放入PCR仪中孵育5min。
2.链霉亲和素磁珠捕获
1）4-16h杂交反应后，将重悬的链霉亲和素磁珠混匀后分两次加到杂交体系中。将样本管转移至正在运行PCR仪中，并点击下一步。
2）65℃孵育45min，每15min振荡混匀一次，确保磁珠完全重悬。
3. 热洗脱
1）按照表17打开PCR仪设置程序
2) 将分装好的装有1X Wash BufferⅠ（ Nuclease-Free Water和xGen®10x WashBufferⅠ按1:9比例配制）和1X Stringent Wash Buffer（Nuclease-Free Water和xGen®10xStringent Wash Buffer按1:9比例配制）的PCR管放在PCR仪中预热。
3) 45min 65℃孵育结束后，将与链霉亲和素磁珠捕获后的杂交样本转移至装有1X Wash BufferⅠ的PCR管中混匀。将PCR管置于磁力架上1min，待液体完全澄清后，用移液器彻底移弃上清。
4) 将1X Stringent Wash Buffer转移至装有样本磁珠的PCR管中，混匀，盖紧管盖，放入PCR仪中65℃孵育5min。到时间后将装有样本的PCR管置于磁力架上至澄清，用移液器彻底移弃上清。
5) 重复步骤4）一次。
4. 常温洗脱
1）将装有样本的PCR管从磁力架取下，用移液器从分装管中吸取150ul 1X WashBuffer Ⅱ（ Nuclease-Free Water和xGen®10x Wash BufferⅡ按1:9比例配制）加入装有磁珠的PCR管中，室温孵育2min，期间于恒温混匀仪上混匀30s后静置30s，交替进行，确保充分混匀。将PCR管瞬时离心后于磁力架静置1min，用移液器彻底移弃上清。
2）将装有样本的PCR管从磁力架取下，瞬时离心后上磁力架，用移液器移去少量残余Buffer。
3）向管中加入21μL Nuclease-Free Water，吹吸混匀。
4）提前15-20min将KAPA HiFi HotStart ReadyMix 、引物FCF（10μM）和FCR（10μM）置于4℃融解。
5）按照表18在置于冰盒上的PCR管或离心管进行反应体系配制。
6) 将配置好的MIX分装到标记样本序号的PCR管中。
7) 用移液器转移20μL带磁珠产物至对应关系的PCR管中，混匀。
8) 在PCR仪上启动如表19所示的程序：
文库纯化步骤如下：
1）将AMPure XP磁珠振荡混匀，吸取60μL加入至做好标记的PCR管中。
2）PCR扩增后，取出PCR管并置于磁力架2min，待液体完全澄清后，将上清转移至磁力架的PCR管中。
3）振荡混匀，室温孵育10min。
4）将PCR管瞬时离心后置于磁力架上5min，待液体完全澄清后，移弃上清（留5-10μL液体）。
5）沿PCR管侧壁缓慢加入200μL 80%乙醇，静置30s, 使用移液器移弃上清。
6）重复步骤5）一次。
7）将PCR管从磁力架取出，瞬时离心后置于磁力架上，使用移液器移去少量残留乙醇，注意勿吸到磁珠。
8）打开PCR管盖，使磁珠置于室温干燥，磁珠表面无液体反光，注意不能过度干燥。
9）向PCR管加入31μL TE Buffer pH 8.0，振荡混匀，室温孵育5min。
10）将PCR管瞬时离心后置于磁力架上1-2min，至液体完全澄清，用移液器小心将30μL上清转移至新的1.5mL离心管中，注意勿吸到磁珠。
11）进行文库质检，合格后上机测序。
步骤四：对测序结果进行生物信息学分析，获得检测样本的突变结果。具体可以采用如下方法进行实施：
使用fastp（v0.19.4）软件去除实验及测序环节引入的接头序列及低质量碱基序列获得高质量测序数据。其中，要求数据质量满足Q30≥80%，否则判定为质控不通过。
使用bwa（0.7.17）序列比对软件将上述满足要求的数据比对至hg19（GRCh37）参考基因组上，生成记录比对结果的BAM格式文件。然后使用Samtools（v1.9）和GenomeAnalysisTK（v4.1.0）工具对BAM文件进行排序、去重及碱基质量校正，获得最终BAM文件，并基于此文件进行后续突变分析。
其中，参考基因组比对率需≥90%，对照样本目标区域平均测序深度需≥100×，肿瘤样本目标区域平均测序深度需≥500×，目标区域内深度大于平均深度×0.2的位点比例需≥90%，肿瘤和对照样本配对一致性需≥90%。以上任一条件不满足均判定质控不通过，需要重新实验。
使用GenomeAnalysisTK（v4.1.0）的变异鉴定模块对样本中的点突变、***缺失突变进行分析；使用融合分析模块对样本中的基因融合事件进行分析；使用拷贝数变异分析模块（包含cnvkit（v 0.9.6）软件和过滤模块）对样本中的拷贝数变异进行分析。得到最终能够进入注释流程的突变。
对得到的突变采用如下方法进行注释：使用基于Annovar（v2018.04.16）搭建的变异注释模块对点突变、小片段***缺失、基因融合及拷贝数变异进行注释，注释使用的数据库包括clinvar、cosmic、1000genomes等。
另外，计算TMB（肿瘤突变负荷）值以及使用微卫星不稳定分析模块对样本的微卫星不稳定性（MSI）进行分析。
步骤五：对突变结果进行解读，判断突变的致病性。基于步骤四中对变异的注释结果，针对检出的非良性/可能良性变异，根据《ACMG遗传变异分类标准与指南》规定的变异分类标准以及美国病理协会（AMP）/美国临床肿瘤学会（ACSO）/美国病理学家协会（CAP）联合发布的癌症变异解读指南（Standards and Guidelines for the Interpretation andReporting of Sequence Variants in Cancer）将变异进行分类。作为一个示例，比如：下方结直肠癌样本中，检测到KRAS c.35G>A p.G12D变异，该变异位于KRAS基因的2号外显子上，根据结直肠癌美国国立癌症综合网络（NCCN）指南以及中国临床肿瘤学会（CSCO）结直肠癌诊疗指南，存在该变异的患者不能使用西妥昔单抗和帕尼单抗进行治疗。根据美国病理协会（AMP）/美国临床肿瘤学会（ACSO）/美国病理学家协会（CAP）联合发布的癌症变异解读指南（Standards and Guidelines for the Interpretation and Reporting ofSequence Variants in Cancer），最终将该变异分类为I类变异，从而出具报告，并在报告中提示该患者对西妥昔单抗和帕尼单抗耐药。
在实际应用中，采用上述步骤对子宫内膜癌患者的样本进行检测，结果为：微卫星不稳定性高（MSI-H），肿瘤突变负荷（TMB）为298.520 mut/Mb，属于TMB高。根据美国食品药品监督管理局（FDA）批准，TMB高或微卫星不稳定性高的实体瘤患者可以从可瑞达（帕博丽珠单抗）中获益。患者按照检测结果提示，于2018年3月选择可瑞达进行治疗，每21天注射一次，结果在使用两个疗程后CA125水平降到正常范围内，之后也一直保持在正常范围内。2018-3-30、2018-5-9、2019-3-11三个阶段的腹部超声对比结果显示从病灶清晰可见到病灶较前缩小再到病灶消失。
采用上述步骤对卵巢癌患者的样本进行检测，结果为：肿瘤突变负荷（TMB）为15.162mut/Mb，属于TMB高。根据美国食品药品监督管理局（FDA）批准，TMB高实体瘤患者可以从可瑞达（帕博丽珠单抗）中获益。患者按照检测结果提示，选择可瑞达进行治疗，在治疗过程中，CA125回到正常水平（从179.2U/ml降到18.7U/ml），转移灶明显缩小（缩小超过30%），达到部分缓解（PR）。
采用上述步骤对结直肠癌患者的样本进行检测，结果为：检测到变异KRAS c.35G>A p.G12D，变异丰度为17.92%。根据结直肠癌美国国立癌症综合网络（NCCN）指南以及中国临床肿瘤学会（CSCO）结直肠癌诊疗指南，存在该变异的患者不能使用西妥昔单抗和帕尼单抗进行治疗。患者可考虑其余方式进行治疗，例如常规化疗。
可见，采用本发明提供的技术方案可以用于泛癌种的检测，检测结果对精准治疗具有积极的指导作用。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (9)
1.一种用于检测泛癌种的基因Panel，其特征在于，包括肿瘤通路相关基因、肿瘤遗传易感基因、肿瘤高频突变基因、肿瘤靶向药相关基因、肿瘤驱动基因、免疫疗效相关基因、关键DDR通路相关基因、其他在癌症发生发展中起重要作用的基因；所述关键DDR通路相关基因包括：ATM、ATR、BARD1、BLM、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CHEK1、CHEK2、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、FAM175A、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCL、MDC1、MLH1、MRE11A、MSH2、MSH3、MSH6、NBN、PALB2、PARP1、PMS1、PMS2、POLE、PRKDC、PTEN、RAD50、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD52、RAD54L、TP53、TP53BP1、XRCC2；所述其他在癌症发生发展中起重要作用的基因包括：DUSP4、ETV4、FOXP1、GID4、GRM3、HIST1H3B、HIST2H3D、ICOSLG、IL10、IRS1、KNSTRN、MAGI2、MAPKAP1、MSI1、NT5C2、PAK3、PMAIP1、PPP4R2、RFWD2、RRAGC、SOX10、TNFRSF14、ZNF703、ANKRD11、BABAM1、E2F3、EPCAM、ETV5、FGF12、FRS2、HIST1H3C、HIST3H3、ID3、IRS2、MALT1、MAX、MSI2、NTHL1、PAK5、RAC2、RANBP2、RRAS、SGK1、GSTM1、TOP1、TYRO3、WWTR1、BCORL1、BTG1、EED、HIST1H3D、INHA、MST1、MYOD1、NKX3-1、PRDM1、PTP4A1、SDHB、SH2B3、SOX2、TAP1、TET1、XIAP、BCR、CDC42、CUL4A、DIS3、EGFL7、EWSR1、H3F3B、HIST1H3E、INHBA、MKNK1、MST1R、PRKN、PDK1、PNRC1、PRDM14、RSPO2、SDHC、SH2D1A、TAP2、UPF1、AGO2、BBC3、BIRC3、CDC73、CXCR4、DNAJB1、EPHA7、ERF、EZH1、HIST1H3F、HLA-C、IFNGR1、INPP4A、KLF4、LMO1、MTAP、PDPK1、PREX2、RTEL1、SHOC2、SMARCD1、SPEN、ARFRP1、BCL10、DNMT1、GATA1、HDAC1、HIST1H3G、HNF1A、IGF1、INPP4B、JUN、NOTCH3、NUF2、PARP2、PTPRO、SESN1、SHQ1、TP63、YAP1、CALR、CD22、CENPA、EIF4A2、EPHB4、EZR、HIST1H3H、LTK、MAP3K13、NEGR1、NOTCH4、PARP3、PHOX2B、PIK3R3、PPARG、PRKCI、PTPRS、RECQL、SESN2、SLC34A2、SMYD3、SPRED1、STK19、TCF3、TIPARP、TRAF2、VTCN1、YES1、BCL2L1、CD74、CHD2、CSF3R、DNMT3B、EIF4E、HIST1H3I、INSR、MAP3K14、MEF2B、MYB、NUTM1、PIK3C2B、PRKD1、PTPRT、RECQL4、RPS6KA4、SESN3、SLIT2、SNCAIP、STK40、TMEM127、TRAF7、ZBTB2、CARM1、FOXL2、HIST1H2BD、HIST1H3J、P2RY8、PIK3C2G、PLCG2、QKI、REL、RPS6KB2、RYBP、TEK、ALOX12B、BCL2L2、CD276、CTLA4、DCUN1D1、DROSHA、ETV1、FAM58A、FOXO1、GRIN2A、HIST1H3A、HIST2H3C、HSP90AA1、IKZF1、IRF4、MAF、MERTK、MYCL、PAK1、PDCD1、PIK3C3、PLK2、PPP2R2A、PRSS8、SDC4、KMT5A、SUZ12、ZNF217、RUNX1T1。
2.如权利要求1所述的用于检测泛癌种的基因Panel，其特征在于，所述肿瘤通路相关基因包括：AKT1、AKT2、AKT3、ALK、APC、AR、ARAF、ASXL1、ATM、ATR、ATRX、AURKA、AURKB、AXIN1、BCL2、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRIP1、BTK、CASP8、CBL、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CD79A、CD79B、CDK12、CDK4、CDK6、CDK8、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CHEK1、CHEK2、CRKL、CRLF2、CSF1R、CTNNA1、CTNNB1、DDR1、DDR2、DNMT3A、DOT1L、EGFR、EPHA3、EPHA5、EPHB1、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ESR1、EZH2、FAM46C、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCL、FAS、FGF10、FGF14、FGF19、FGF23、FGF3、FGF4、FGF6、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FLT1、FLT3、FLT4、GNA11、GNA13、GNAQ、GNAS、GPR124、GSK3B、HGF、HRAS、IDH1、IDH2、IGF1R、JAK1、JAK2、JAK3、KAT6A、KDM5A、KDM5C、KDM6A、KDR、KIT、KLHL6、KRAS、LRP1B、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MAPK1、MDM2、MDM4、MET、MITF、MLH1、MPL、MRE11A、MSH2、MSH6、MTOR、MUTYH、MYD88、NF1、NFKBIA、NPM1、NRAS、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PALB2、PBRM1、PDGFRA、PDGFRB、PGR、PIK3CA、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PTCH1、PTEN、PTPN11、RAD50、RAD51、RB1、RET、RICTOR、RNF43、ROS1、RPTOR、SETD2、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMO、SOCS1、SRC、STAG2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、SUFU、TET2、TGFBR1、TGFBR2、TNFAIP3、TP53、TSC1、TSC2、TSHR、WISP3、WT1。
3.如权利要求1所述的用于检测泛癌种的基因Panel，其特征在于，所述肿瘤遗传易感基因包括：ALK、APC、ATM、AXIN2、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDKN2A、CHEK2、FH、FLCN、GREM1、KIT、MEN1、MET、MLH1、MSH2、MSH3、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RB1、SMAD4、STK11、TP53、TSC1、VHL、SDHD、TSC2、PDGFRA、BARD1、CDK4、RET、SMARCA4、SMARCB1、SDHA、PRKAR1A、HOXB13、BRAF、PTCH1、SDHAF2。
4.如权利要求1所述的用于检测泛癌种的基因Panel，其特征在于，所述肿瘤高频突变基因包括：ACVR1B、AKT1、AKT2、AKT3、AMER1、APC、ARID1A、ARID1B、ARID2、ASXL2、ATM、ATRX、AXIN1、BAP1、BCL2L11、BCOR、BRAF、BRCA1、BRCA2、BTG2、CASP8、CBFB、CCND1、CCND3、CCNE1、CD274、CDH1、CDK12、CDK4、CDK6、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CHD4、CREBBP、CTNNA1、CTNNB1、EGFR、ELF3、EP300、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC2、ERG、FANCD2、FAT1、FBXW7、FGF19、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FOXA1、GABRA6、GATA3、GATA4、GATA6、GNAS、HLA-A、HLA-B、HRAS、IDH1、IGF1R、IGF2、JAK2、KAT6A、KDM5C、KDM6A、KEAP1、KMT2A、KMT2C、KMT2D、KRAS、LRP1B、MAP2K4、MAP3K1、MAPK1、MCL1、MDM2、MDM4、MED12、MET、MLH1、MSH2、MSH3、MSH6、MTOR、MYC、NCOA3、NCOR1、NF1、NF2、NFE2L2、NKX2-1、NOTCH1、NRAS、PBRM1、PDCD1LG2、PIK3CA、PIK3R1、PMS2、POLE、PPP2R1A、PTEN、PTPRD、RASA1、RB1、RBM10、RHOA、RIT1、RNF43、RUNX1、RXRA、SETD2、SF3B1、SMAD2、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SOX17、SOX9、SPOP、STAG2、STK11、TBX3、TCF7L2、TERC、TERT、TGFBR2、TMPRSS2、TNFAIP3、TP53、TSC1、TSC2、U2AF1、VEGFA、VHL、WHSC1L1。
5.如权利要求1所述的用于检测泛癌种的基因Panel，其特征在于，所述肿瘤靶向药相关基因包括：ABL1、ABL2、ACVR1、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、AR、ARAF、ARID1A、ATM、ATR、ATRX、AXL、BAP1、BARD1、BCL2、BCL6、BLM、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRIP1、BTK、C11orf30、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CDK12、CDK4、CDK6、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CHEK1、CHEK2、CRKL、CRLF2、CSF1R、CTNNB1、CYP17A1、DAXX、DDR1、DDR2、DNMT3A、DOT1L、EGFR、EPAS1、EPHA3、ERBB2、ERBB4、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ERG、ERRFI1、ESR1、ESR2、ETV6、EZH2、FAM175A、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCL、FBXW7、FGF19、FGF3、FGF4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FLCN、FLT1、FLT3、FLT4、FOXA1、FYN、GATA2、GLI1、GNA11、GNAQ、GNAS、H3F3A、HRAS、HSD3B1、IDH1、IDH2、IGF1R、IKBKE、JAK1、JAK2、KDR、KEAP1、KIT、KMT2A、KRAS、LYN、MAP2K1、MAP2K2、MAPK1、MAPK3、MDM2、MDM4、MEN1、MET、MITF、MLH1、MPL、MRE11A、MSH2、MSH6、mTOR、MUTYH、MYC、MYD88、NBN、NF2、NOTCH1、NOTCH2、NPM1、NRAS、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PALB2、PDGFRA、PDGFRB、PGR、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG、PIK3R1、PMS2、POLD1、POLE、PTCH1、PTEN、RAB35、RAD50、RAD51、RAD52、RAF1、RARA、RB1、RET、RHEB、RICTOR、ROS1、SLX4、SMARCA4、SMARCB1、SMO、SRC、STK11、SYK、TMPRSS2、TOP2A、TP53、TSC1、TSC2、VHL、XRCC2。
6.如权利要求1所述的用于检测泛癌种的基因Panel，其特征在于，所述肿瘤驱动基因包括：ABL1、ACVR1、ACVR1B、AKT1、ALK、AMER1、APC、AR、ARAF、ARID1A、ARID2、ARID5B、ASXL1、ASXL2、ATM、ATR、ATRX、AXIN1、AXIN2、B2M、BAP1、BCL2、BCL2L11、BCOR、BRAF、BRCA1、BRCA2、BTG2、CARD11、CASP8、CBFB、CCND1、CD70、CD79B、CDH1、CDK12、CDK4、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2C、CEBPA、CHD4、CHEK2、CIC、CREBBP、CSDE1、CTCF、CTNNB1、CUL3、CYLD、CYSLTR2、DICER1、DNMT3A、EGFR、EIF1AX、ELF3、EP300、EPAS1、EPHA3、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC2、ESR1、EZH2、FAT1、FBXW7、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLT3、FOXA1、FUBP1、GABRA6、GATA3、GNA11、GNA13、GNAQ、GNAS、GPS2、H3F3A、H3F3C、HGF、HIST1H1C、HLA-A、HLA-B、HRAS、IDH1、IDH2、IL7R、INPPL1、IRF2、JAK1、JAK2、JAK3、KDM5C、KDM6A、KEAP1、KEL、KIT、KMT2A、KMT2B、KMT2C、KMT2D、KRAS、LATS1、LATS2、LZTR1、MAP2K1、MAP2K4、MAP3K1、MAPK1、MED12、MEN1、MET、MGA、MLH1、MSH2、MSH3、MSH6、MTOR、MYC、MYCN、MYD88、NCOR1、NF1、NF2、NFE2L2、NOTCH1、NOTCH2、NPM1、NRAS、NSD1、NUP93、PAX5、PBRM1、PDGFRA、PGR、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PIM1、PMS1、PMS2、POLE、PPM1D、PPP2R1A、PPP6C、PRKAR1A、PTCH1、PTEN、PTPN11、PTPRD、RAC1、RAD21、RAF1、RARA、RASA1、RB1、RBM10、RET、RHEB、RHOA、RIT1、RNF43、RRAS2、RUNX1、RXRA、SETD2、SF3B1、SMAD2、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SOS1、SOX17、SOX9、SPOP、SPTA1、SRSF2、STAG2、STK11、TAF1、TBX3、TCEB1、TCF7L2、TET2、TGFBR2、TNFAIP3、TP53、TSC1、TSC2、U2AF1、VHL、WHSC1、WT1、XPO1、ZFHX3。
7.如权利要求1所述的用于检测泛癌种的基因Panel，其特征在于，所述免疫疗效相关基因包括：TSC2、ATM、B2M、BRCA1、BRCA2、CCND1、DNMT3A、EGFR、FGF19、FGF3、FGF4、JAK1、JAK2、KRAS、MDM2、MDM4、MLH1、MSH2、MYC、PBRM1、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、STK11、VHL、NF1、TP53。
8.一种用于检测泛癌种的探针Panel，其特征在于，所述探针Panel为针对权利要求1-7任一项所述的肿瘤通路相关基因、肿瘤遗传易感基因、肿瘤高频突变基因、肿瘤靶向药相关基因、肿瘤驱动基因、免疫疗效相关基因、关键DDR通路相关基因、其他在癌症发生发展中起重要作用的基因的检测探针。
9.权利要求1-7任一项所述的基因Panel或权利要求8所述的探针Panel在制备泛癌种检测装置中的应用。
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