CN109354603A - 一种四肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种四肽，所述四肽的氨基酸序列为Gly‑Trp‑Trp‑Asp。本发明的四肽能够吸附抗体、特异性结合抗体，能够用于纯化抗体。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种四肽及其应用。
背景技术
功能性多肽是一类分子量介于氨基酸和蛋白质之间的化合物，具有一定的生物活性，可以作为治疗疾病的药物、反应的生物催化级和特性性结合的配体。在生物、医药和化工等领域中有着广泛的应用，具有重大的社会和经济效益。
亲和分离是利用某些亲和配体特异识别和可逆结合生物大分子的特性而建立起来的一种分离纯化方法。通常只需一步处理即可得到纯度较高的某种蛋白质。亲和配体是亲和分离的核心，因此开发相应的功能性多肽，对亲和分离纯化技术提高至关重要。
抗体是一种由浆细胞分泌，能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。目前工业中抗体的分离纯化采用Protein A/G亲和纯化介质，存在介质价格昂贵、Protein A/G易失活、清洗困难、配体脱落污染等一系列问题。抗体的分离纯化技术亟待提高。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种四肽，其可以与抗体特异性结合。
本发明提供一种四肽，所述四肽的氨基酸序列为Gly-Trp-Trp-Asp。
本发明还提供上述四肽在非疾病的诊断和治疗目的吸附抗体、特异性结合抗体或者纯化抗体中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
1)高效：新型分离短肽可以与抗体特异性结合。
2)安全：新型分离短肽无毒无免疫原性。
3)经济：多肽由固相合成而得，廉价易得。
4)具有唯一氨基端，可以定向交联，介质制备简单。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例1多肽合成
1)活化树脂：称取1000mg Fmoc Asp-wang Resin，在DMF中浸泡至完全溶胀。
2)脱保护：压滤除去DMF，加入含20％哌啶的DMF溶液氮气吹沸反应10min，压滤除去；用异丙醇/DMF分别洗涤树脂三次。
3)缩合反应：连接氨基酸Trp称取1.4mmol FMOC-Trp，以TBTU、HOBt和DIEA的DMF混合溶液为反应液，室温下氮气吹沸反应3h。反应后，用异丙醇/DMF分别洗涤树脂三次。Fmoc合成为C端开始，N端结束。
4)重复步骤2)～3)：按多肽的顺序自C端向N端延伸多肽。重复脱保护、洗涤、缩合的过程依次将Trp、Trp和Gly连接完毕，完成多肽的连接。得到的多肽自N端至C端的氨基酸序列为：Gly-Trp-Trp-Asp。
5)多肽切割：用氮气将多肽-树脂复合物吹干，采用TFA、phenol、H2O、thioanisole、EDT和TIS混合物为切割试剂，磁力搅拌2小时，除去树脂，滤液直接抽入冷冻***中，3000r/min离心收集沉淀，冻干至恒重即得粗肽。
6)粗肽用HPLC纯化至95％以上，纯化条件为：纯化条件为将粗肽复溶于10％乙腈溶液中，以乙腈为流动相，采用10％至100％的乙腈流动相梯度洗脱30分钟，收集最大的峰，得到纯化后的多肽，多肽序列为：Gly-Trp-Trp-Asp，多肽纯度为97％，质谱鉴定。
实施例2亲和介质制备
1)取10mg实施例1制备得到的多肽溶解于5mLHepes缓冲液，pH7.4。
2)取GE公司巯基活化后的Sephadex凝胶2mL。
3)上述两者混合反应8小时。
4)反应完毕后，以Hepes缓冲液洗涤凝胶颗粒，得到亲和介质。
实施例3抗体吸附肽分离纯化抗体
1)配制20mmol/L Hepes缓冲液，pH7.4，NaCl含量0.15M。设定流速1mL/min。
2)以1)中配制液体为流动相，运行AKTA蛋白纯化***。
3)取实施例2中亲和介质2mL填装分离柱。
4)上样抗体IgG发酵液2mL。
5)配制pH2的0.1M HCl-Gly缓冲液作为洗脱液。
6)分别上样洗脱液6mL，收集洗脱液。
7)分别测定抗体发酵液、新型分离短肽介质的洗脱液中抗体含量和纯度，计算提取率。
表1新型分离短肽介质吸附特性
由表1可知，本发明的多肽可以与抗体特异性结合。
实施例4吸附介质制备
1)取10mg实施例1制备得到的多肽溶解于5mL Hepes缓冲液，pH7.4。
2)取GE公司巯基活化后的Sepharose凝胶2mL。
3)上述两者混合反应8小时。
4)反应完毕后，以Hepes缓冲液洗涤凝胶颗粒，得到亲和介质。
实施例5抗体吸附肽分特异性吸附抗体
1)配制20mmol/L Hepes缓冲液，pH7.4，NaCl含量0.15M。设定流速1mL/min。
2)以1)中配制液体为流动相，运行AKTA蛋白纯化***。
3)取实施例4中亲和介质2mL和Protein A介质2mL分别填装分离柱。
4)分别上样血清2mL。
5)配制pH2的0.1M HCl-Gly缓冲液作为洗脱液。
6)分别上样洗脱液6mL，收集流出液、洗脱液。
7)分别测定血清、流出液和洗脱液中抗体IgG含量和纯度，计算提取率。
表2新型分离短肽介质吸附特性
由表2可知，本发明的多肽可以与抗体特异性结合。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南阳师范学院
<120> 一种四肽及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Trp Trp Asp
1
Claims (2)
1.一种四肽，其特征在于：所述四肽的氨基酸序列为Gly-Trp-Trp-Asp。
2.权利要求1所述的四肽在非疾病的诊断和治疗目的吸附抗体、特异性结合抗体或者纯化抗体中的应用。
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| CN201811311638.1A CN109354603B (zh) | 2018-11-06 | 2018-11-06 | 一种四肽及其应用 |
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| CN109354603A true CN109354603A (zh) | 2019-02-19 |
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| CN103087150A (zh) * | 2013-01-09 | 2013-05-08 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种小分子亲和肽及其应用 |
| CN104163850A (zh) * | 2013-05-15 | 2014-11-26 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种小分子抗体亲和肽及其应用 |
| CN104211769A (zh) * | 2013-05-30 | 2014-12-17 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种小分子抗体亲和肽及其应用 |
-
2018
- 2018-11-06 CN CN201811311638.1A patent/CN109354603B/zh active Active
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| CN104211769A (zh) * | 2013-05-30 | 2014-12-17 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种小分子抗体亲和肽及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| RONGZHU WANG ET AL: "New tetrapeptide ligands designed for antibody purification with biomimetic chromatography: Molecular simulation and experimental validation", 《BIOCHEMICAL ENGINEERING JOURNAL》 * |
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| CN109354603B (zh) | 2021-12-14 |
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