CN109593835B - 用于微量ffpe rna样本评估的方法、试剂盒及应用 - Google Patents

用于微量ffpe rna样本评估的方法、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种用于微量FFPE RNA样本评估的方法、试剂盒及应用。本申请的用于微量FFPE RNA样本评估方法，包括选取靶标片段，采用靶标片段的特异性引物和探针，对微量FFPE RNA样本进行实时荧光PCR；并采用标准曲线进行相对定量，获得靶标片段的相对浓度和丰度，以此评估微量FFPE RNA样本的可用性。本申请的方法，打破目前主流检测工具2100Bioanalyzer的局限，采用实时荧光PCR和标准曲线进行相对定量，判断其样本质量，与2100Bioanalyzer方法相比，本申请的方法可直接展示靶标片段的丰度和可用性情况，并且，无需额外购买昂贵的毛细管电泳分析设备，成本更低，更易推广和普及。

Description

用于微量FFPE RNA样本评估的方法、试剂盒及应用
技术领域
本申请涉及核酸样本质量检测领域，特别是涉及一种微量FFPE RNA样本质量检测的方法、试剂盒及应用。
背景技术
随着新一代测序技术NGS的蓬勃发展，转录组测序技术已成为研究基因表达的主要手段。转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的必然纽带，是基因功能及结构研究的基础和出发点。通过新一代高通量测序，能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在特定状态下的几乎所有转录本序列信息，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。
疾病研究和病理分析中，经手术、穿刺及内窥镜钳取等方式获取的新鲜组织样本离开机体后，经固定、脱水、石蜡包埋等步骤制成石蜡块，称为***固定石蜡包埋(Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded，缩写FFPE)样本。FFPE样本再经切片、染色等步骤用于病理形态学诊断。制成的FFPE样本由于其性质稳定，在室温条件下可长期贮存，是病案存档及疾病诊断证据的最有效手段，也是疾病相关分析的主要材料来源。采用FFPE样本进行分子生物学检测是辅助诊断及实现个体化医疗的主要手段。但提取自FFPE样本的RNA样本，即FFPE RNA样本，其质量普遍不能达到转录组测序实验的基本要求。因此，对快速、准确、高通量的检测FFPE RNA样本的质量，提出了更高的要求。
在全世界范围内，***癌是第二常见的癌症，也是男性与癌症相关的第五大死因。***癌在84个国家是男性最常见的癌症，且更常发于发达国家，但发展中国家的患病率正在上升。研究显示并非死于***癌的60岁以上男性，约30％至70％已有***癌变。针对***癌的转录组研究需求旺盛，急需成熟、准确的FFPE RNA样本质量检测方法，推动转化大量珍贵的临床切片样本进入到下游的分子生物学研究。
RIN(RNA Integrity Number)是由Agilent Technologies开发的，用于指示RNA样本质量的工具。RIN适用于2100Bioanalyzer，其计算模型由近1300例人/大鼠/小鼠样本的数据建模得到。RIN的计算参数取自RNA样本电泳的完整轨迹，因此其准确性和可重复性均高于传统的28S/18S等质控方法；又由于RIN是单一的绝对的数值，可避免对于样本质量的因人而异的解读。RIN被认为是检测RNA样本完整性的金标准，然而其应用仍具有多种局限。
1)RIN有相对较高的检测浓度阈值，即便使用高敏感度的Agilent RNA 6000 PicoKit，也需要待测样本浓度达到250pg/μL以上，对于大量珍贵的临床样本实现分子生物学应用来说，无疑是一个巨大的制约因素；
2)RIN不能直接预测基因定量实验结果的准确性。RNA的降解是一个逐渐的、非均一的过程，因此RIN并不代表mRNA的完整情况。不同的研究人员或实验设计，会对RIN的要求亦不相同；如Illumina官方建议，在转录组实验中，仅选用RIN≥8的RNA样本；亦有其他研究团队认为，在样本采集过程中，RIN≥6的样本可以认为是高质量的。这种简单的cut-off，缺乏对样本前期处理方法和实验设计的充分了解，会对实验结果及预期造成偏差。
3)RIN基本不能对FFPE RNA样本质量提供有效的指示作用。由于FFPE RNA样本经常是高度碎片化的，RIN对于RNA降解程度的反馈并不灵敏，也因此无法预知所检测样本的建库成功率和数据可信程度。并且，由于FFPE RNA样本高度降解，18S和28S通常不可见，这也导致了RIN的参考价值变得局限。
4)RIN有严格的适用浓度范围，临床样本通常极为珍贵，常常提取所得RNA无法满足2100 Bioanalyzer的最低浓度需求。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的用于微量FFPE RNA样本质量检测的方法、试剂盒及应用。
本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种用于微量FFPE RNA样本评估的方法，包括选取靶标片段，采用靶标片段的特异性引物和探针，对待测的微量FFPE RNA样本进行实时荧光PCR检测；并采用标准曲线对实时荧光PCR检测的结果进行分析，获得微量FFPE RNA样本中，靶标片段的相对浓度和相对丰度，以此评估微量FFPE RNA样本的可用性。
其中，可用性是指微量FFPE RNA样本是否可用于后续的RNA测序分析，本申请的微量FFPE RNA样本评估，其目的就是判断微量样本是否适用于RNA测序，避免不合格的微量FFPE RNA样本进入RNA测序流程，造成不必要的人力和物力损失和浪费。可用性的评估，一方面，根据测定的相对浓度和相对丰度，判断微量FFPE RNA样本能否达到RNA测序的核酸量；另一方面，实时荧光PCR也展示了测序的PCR过程，直观的体现了RNA测序的可行性，因为，高度碎片化或存在分子损伤的RNA片段是无法被反转录并扩增产出荧光信号的，对此传统的Qubit分光光度计法或基于RIN的Agilent 2100方法都是做不到的，Qubit分光光度计法或Agilent 2100方法只能对样本的量和纯度进行检测，而对样本的碎片化或分子损伤则无法检出。可以理解，实时荧光PCR跟RNA测序都是PCR扩增过程，因此，本申请的评估方法如果能够获得较好的结果，证明PCR能够顺利进行，即能够反映化碎片化程度或分子损伤程度，在样本相对定量所测定的量能够满足RNA测序要求的情况，RNA测序也应该能够顺利的进行PCR扩增，即能够得到有效的RNA测序结果。而Qubit分光光度计法或Agilent 2100方法只能对样本的量和纯度进行检测评估，并不能展示PCR扩增过程，对于碎片化程度或分子损伤程度也无从检出；因此，即便Qubit分光光度计法或Agilent 2100方法检出有足够量的样本，也无法保障RNA测序的顺利进行。
其中，靶标片段的选择根据具体检测对象或者所需要评估的对象而定的，例如本申请的一种实现方式中，对***癌的微量FFPE RNA样本进行质量评估，其靶标片段就是***癌代表性的基因片段。需要说明的是，本申请的微量FFPE RNA样本评估方法，只是对微量FFPE RNA样本中靶标片段的相对浓度和相对丰度进行质量评估，至于靶标片段所代表的疾病，或者疾病及其相关信息的检测获取，还需要经过后续的RNA测序才能得到更为详细准确的信息。例如，本申请的一种实现方式中，通过检测***癌的两个关键基因GUSB基因和CDKN1A基因，评估***癌微量FFPE RNA样本的质量；但是，这个两个关键基因是否有致病突变，是否导致***癌，还需要进行RNA测序才能知悉。本申请的方法只是负责对微量FFPE RNA样本的质量进行评估。
可以理解，本申请的微量FFPE RNA样本评估的方法，其最终检验的是待测疾病，准确的说是待测疾病的靶标片段的质量；而相对于其它疾病，则需要针对其靶标片段或关键基因，设计特异性引物和探针，按照本申请的方法重新进行评估。
还需要说明的是，当使用FFPE RNA作为RNA测序的实验材料时，存在两点技术困难：1.FFPE处理会导致RNA高度碎片化，被高度碎片化的RNA片段无法参与下游建库过程；2.FFPE处理会导致RNA在随机位点被化学修饰，这些化学修饰会导致其作为模板时反转录酶或PCR酶的效率降低，进而导致文库构建失败或携带重要生物学意义的信息丢失。现有的核酸样本检测或评估方法，包括Qubit分光光度计法和基于RIN的Agilent 2100方法，除在定量结果准确度上存在偏差之外，也不能够展示或预测样本的核酸片段化程度或分子损伤程度。本申请的方法，针对FFPE RNA测序应用的实验方法及研究目的，通过对靶标片段进行相对定量检测，提供了一种快速、稳定的技术方案。靶标片段的相对定量结果，既是对分子量的评估，同时通过RT-qPCR实验判断待测RNA样本的片段化及分子损伤程度，高度碎片化或存在分子损伤的RNA片段是无法被反转录并扩增产出荧光信号的，展示了微量FFPE RNA样本可被用于下游NGS实验的可能性，提供了一种微量FFPE RNA样本特异的、以实验数据为导向的样本可用性评价方案。
优选的，标准曲线由RNA标准品采用与所述微量FFPE RNA样本相同的实时荧光PCR扩增获得。
优选的，RNA标准品为UHRR人标准品。
需要说明的是，实时荧光PCR的标准曲线采用常规的标准曲线构建方法获得，例如，对标准品进行梯度稀释后进行实时荧光PCR，从而获得标准曲线，在此不做具体限定。
本申请的另一面公开了本申请的方法在***癌的微量FFPE RNA样本的质量评估中的应用。
可以理解，本申请的微量FFPE RNA样本评估的方法，可以适用于各种癌症的RNA样本的评估检测，只要选取癌症相关的靶标片段或关键基因，并设计相应的特异性引物和探针进行实时荧光PCR检测即可。
本申请的再一面公开了一种***癌的微量FFPE RNA样本评估的方法，包括选取***癌的关键基因，采用关键基因的特异性引物和探针，对待测的微量FFPE RNA样本进行实时荧光PCR检测；并采用标准曲线对实时荧光PCR检测的结果进行分析，获得微量FFPERNA样本中，***癌关键基因的相对浓度和相对丰度，以此评估微量FFPE RNA样本的可用性。
优选的，***癌的关键基因包括GUSB基因和CDKN1A基因，实时荧光PCR检测为两个基因的多重实时荧光PCR。
需要说明的是，GUSB和CDKN1A这两个基因与***癌发生有较强的相关性，常作为***癌转录组测序研究的主要目的基因，因此，本申请将其作为***癌的关键基因。可以理解，根据不同的研究目的或者其它情况下，也可以选取其它关键基因，不仅限于GUSB基因和CDKN1A基因。
优选的，GUSB基因的特异性引物的上下游引物分别为Seq ID No.1所示序列和SeqID No.2所示序列，GUSB基因的特异性探针为Seq ID No.3所示序列；所述CDKN1A基因的特异性引物的上下游引物分别为Seq ID No.4所示序列和Seq ID No.5所示序列，CDKN1A基因的特异性探针为Seq ID No.6所示序列；
Seq ID No.1：5’-TGATCGCTCACACCAAATCC-3’
Seq ID No.2：5’-CCTTGTCTGCTGCATAGTTAGAGTTG-3’
Seq ID No.3：5’-FAM-CTCCCGGCCTGTGACCTTTGTGA-TAMRA-3’
Seq ID No.4：5’-CAAACACCTTCCAGCTCCTGTAA-3’
Seq ID No.5：5’-AACGGGAACCAGGACACATG-3’
Seq ID No.6：5’-VIC-ATACTGGCCTGGACTGTTTTCTCTCGGC-TAMRA-3’。
需要说明的是，本申请的引物和探针，是特别针对GUSB基因和CDKN1A基因的多重实时荧光PCR检测而设计的，两组引物和探针能够相互配合，作为一个有机结合的整体进行多重实时荧光PCR，实现GUSB基因和CDKN1A基因的同时检测，并且两组引物和探针，不会相互干扰影响各自的扩增效率或产生非特异性扩增。
优选的，标准曲线由RNA标准品采用与微量FFPE RNA样本相同的实时荧光PCR扩增获得。
优选的，RNA标准品为UHRR人标准品。
本申请的再一面公开了一种用于***癌的微量FFPE RNA样本评估的试剂盒，该试剂盒中包含有检测GUSB基因和CDKN1A基因的特异性引物和探针，具体的，GUSB基因的特异性引物的上下游引物分别为Seq ID No.1所示序列和Seq ID No.2所示序列，GUSB基因的特异性探针为Seq ID No.3所示序列；CDKN1A基因的特异性引物的上下游引物分别为SeqID No.4所示序列和Seq ID No.5所示序列，CDKN1A基因的特异性探针为Seq ID No.6所示序列。
需要说明的是，本申请的***癌微量FFPE RNA样本评估，其实现有赖于本申请的两组高效扩增的引物和探针，因此，为了使用方便，本申请将其作为试剂盒单独使用；当然，试剂盒中也可以包含实时荧光PCR所需的其它试剂，在此不做具体限定。
本申请的有益效果在于：
本申请的用于微量FFPE RNA样本评估的方法，根据对待测疾病的靶标片段进行实时荧光PCR检测，并采用标准曲线进行相对定量，判断其样本质量，为微量FFPE RNA样本能否用于后续的RNA测序研究，提供了准确的可行性分析和指导。本申请的微量FFPE RNA样本评估方法，打破了目前的主流检测工具2100Bioanalyzer的应用局限，其可检测的样本总量下限可达50pg/μL，检测结果可重复性更高。与传统的2100Bioanalyzer等检测方法相比，本申请的方法可直接展示靶标片段的丰度和可用性，特别适用于临床FFPE样本的转录组测序实验。此外，本申请的方法，无需额外购买昂贵的毛细管电泳分析设备，成本更低，更易推广和普及。
附图说明
图1为本申请对比例中2100 Bioanalyzer的检测结果图；
图2为本申请实施例中基因GUSB的标准曲线；
图3为本申请实施例中基因CDKN1A的标准曲线。
具体实施方式
核酸样本质量检测，通常是检测待测样本中总的核酸的量，及其完整性和纯度。但是，在针对某个疾病的基因检测时，更注重的是该待测疾病的基因的量和完整性。因此，本申请创造性的提出，对于微量FFPE RNA样本，设计待测疾病的关键基因的特异性引物和探针，通过实时荧光PCR的相对定量，对关键基因进行质量检测，以方便后续的试验和研究。
实时荧光PCR可以对待测对象进行相对定量，并且检测灵敏度高、特异性强，能够对一些珍贵的微量样本进行快速、准确的质量评估，检测下限达到50pg/μL，为FFPE RNA样本的质量检测提供了一种快速、成本低、通量高的质量评估方法，也为后续的转录组测序实验分析提供了更精准的参考依据。
本申请的实施例中，以***癌的微量FFPE RNA样本为了进行了质量检测，可以理解，本申请的微量FFPE RNA样本的质量检测方法，并不只限于***癌，其它癌症的微量FFPE RNA样本也适用于本申请的方法。此外，本申请的微量RNA样本的质量检测方法，也不只限于微量FFPE RNA样本，其它微量的待测样本，同样可以采用本申请的方法进行质量检测，在此不做具体限定。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例
本例以***癌的微量FFPE RNA样本为例进行样本质量检测，***癌的待测样本包括24份珍贵的***癌组织FFPE切片的微量FFPE RNA样本，标准品采用购自AgilentTechnologies的货号为740000的UHRR标准品，UHRR为Universal Human Reference RNA的缩写。详细如下：
一、引物和探针的设计
本例选取与***癌发生有较强的相关性，常作为***癌转录组测序研究的主要目的两个基因作为其关键基因，即GUSB基因和CDKN1A基因。针对这两个基因设计多重实时荧光PCR引物和探针，其序列如表1所示。
表1GUSB基因和CDKN1A基因的引物和探针
名称 序列(5’→3’) Seq ID No.
GUSB上游引物 TGATCGCTCACACCAAATCC 1
GUSB下游引物 CCTTGTCTGCTGCATAGTTAGAGTTG 2
GUSB探针 FAM-CTCCCGGCCTGTGACCTTTGTGA-TAMRA 3
CDKN1A上游引物 CAAACACCTTCCAGCTCCTGTAA 4
CDKN1A下游引物 AACGGGAACCAGGACACATG 5
CDKN1A探针 VIC-ATACTGGCCTGGACTGTTTTCTCTCGGC-TAMRA 6
表1的两个探针中，FAM和VIC分别为荧光基团，TAMRA为荧光淬灭基团。
二、标准曲线和实时荧光PCR检测
将GUSB基因和CDKN1A基因的引物和探针混合，配制成20×PCR Assay，其中各上游引物的终浓度为600nM，各下游引物的终浓度为600nM，各探针的终浓度为300nM。
实时荧光PCR采用购自Thermo Scientific的Taqman Fast Virus 1-step MasterMix，反应体系为：Taqman Fast Virus 1-step Master Mix 8.75μL、20×PCR Assay 1.75μL、核酸样本3.5μL、NF H2O 21μL，混匀后转移到PCR板上，每孔10μL，每个样本设置3个重复。96孔PCR板点样方案如表2所示。
表2 96孔PCR板点样方案
反应条件为，50℃20min，95℃2min，然后进入40个循环：95℃5s、60℃60s。在60℃时收集荧光，分别收集FAM和VIC两个荧光通道的荧光。
三、结果和分析
结果显示，基因GUSB的标准曲线斜率＝-3.298，R平方＝0.999，扩增效率＝101.013，如图2所示。基因CDKN1A的标准曲线斜率＝-3.327，R平方＝0.999，扩增效率＝99.776％，如图3所示。由Ct值换算所得24个待测样本的相对浓度如表3所示。
表3待测样本相对浓度
表3中，样本7、14、17、18、19、23由于待测基因不能被检出或浓度低于检测范围下限，无法用于下游的RNA测序实验。
对比例
本例采用相同的待测样本，进行2100 Bioanalyzer检测，详细步骤如下：
(1)取待检样本1μL，PCR仪上70℃孵育2min，将样本立即置于冰上；
(2)取出芯片，向Gel孔底加入9.0μL gel-dye mix并使用注射活塞注入芯片；
(3)向芯片上剩余的13个孔中分别加入5.0μL marker，向ladder孔底加入1μLladder；
(4)向样本孔底加入1μL待检样本，将芯片震荡混匀；
(5)将芯片放入2100生物分析仪，选择对应的检测程序，运行程序；导出实验结果，如图1和表4所示。
表4待测样本使用2100 Bioanalyzer的检测结果
序号 样本名称 浓度ng/μL RIN 序号 样本名称 浓度ng/μL RIN
1 4964443 3.89 2.2 13 5266686 1.444 1
2 5260030 1.89 1.8 14 5266783 1.111 3.4
3 5260173 1.61 2 15 5266886 0.556 2.5
4 5262886 0.67 1 16 5266930 2.889 1.3
5 5263033 1.00 2.1 17 5267060 2.778 1
6 5263040 1.67 1.1 18 5267070 2.627 1.1
7 5263073 0.45 2.2 19 5267110 1.222 1
8 5263116 1.11 1 20 5293990 2.000 1.9
9 5263130 1.22 2.8 21 5294050 1.914 2.1
10 5263140 1.33 1.1 22 5294110 1.778 1
11 5266650 1.00 3.9 23 5294120 3.667 2.3
12 5266673 2.11 2.2 24 5294130 0.631 2.3
图1的结果所示，胶图轨迹狭窄，18S及28S RNA不可见。由于样本浓度低于检测阈值，其定量结果不可信；这也显示了，本申请的评估方法灵敏度更高，能够对更低浓度的样本进行评估。而表4中，RIN则远低于8，并且，仅是对核酸总量的描述，无法用于指导下游NGS实验的开展。以样本23为例，其2100浓度定量较高，但应用本申请的方法进行评估时，GUSB未检出，CDKN1A相对浓度较低，因此即使开展下游NGS实验，检出以GUSB和CDKN1A为代表的癌症相关信息的可能性极低。
这是因为，微量FFPE RNA样本本身被高度碎片化，虽然2100生物分析仪的结果显示第23号FFPE RNA样本的浓度足够高，可以用于后续的RNA测序，但是，2100生物分析仪不能反应碎片化程度，根据2100生物分析仪的结果，进行后续的RNA测序，检测以GUSB和CDKN1A为代表的***癌相关信息，其检出率是极低的，甚至可能根本无法检出。而本申请的微量FFPE RNA样本评估方法，如果GUSB或CDKN1A高度碎片化，则无法检出荧光信号，如果获得了较高的相对定量信号，则表明GUSB和CDKN1A基因具有一定的完整性，当然可以用于后续的RNA测序检测。可见，本申请的评估方法，能够提供并展示更准确的样本质量评估，更适用于对用于RNA测序的微量FFPE RNA样本进行质量评估。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大生命科学研究院
<120> 用于微量FFPE RNA样本评估的方法、试剂盒及应用
<130> 17I24583
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgatcgctca caccaaatcc 20
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccttgtctgc tgcatagtta gagttg 26
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctcccggcct gtgacctttg tga 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
caaacacctt ccagctcctg taa 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aacgggaacc aggacacatg 20
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atactggcct ggactgtttt ctctcggc 28

Claims (3)

1.一种***癌的微量FFPE RNA样本评估的方法，其特征在于：包括选取***癌的关键基因，采用所述关键基因的特异性引物和探针，对待测的微量FFPE RNA样本进行实时荧光PCR检测；
并采用标准曲线对所述实时荧光PCR检测的结果进行分析，获得所述微量FFPE RNA样本中，***癌相关的基因的相对浓度和相对丰度，以此评估所述微量FFPE RNA样本的可用性；
所述***癌的关键基因包括GUSB基因和CDKN1A基因，所述实时荧光PCR检测为两个基因的多重实时荧光PCR；
所述GUSB基因的特异性引物的上下游引物分别为Seq ID No.1所示序列和Seq IDNo.2所示序列，GUSB基因的特异性探针为Seq ID No.3所示序列；所述CDKN1A基因的特异性引物的上下游引物分别为Seq ID No.4所示序列和Seq ID No.5所示序列，CDKN1A基因的特异性探针为Seq ID No.6所示序列；
Seq ID No.1：5’- TGATCGCTCACACCAAATCC -3’
Seq ID No.2：5’- CCTTGTCTGCTGCATAGTTAGAGTTG -3’
Seq ID No.3：5’- FAM-CTCCCGGCCTGTGACCTTTGTGA-TAMRA -3’
Seq ID No.4：5’- CAAACACCTTCCAGCTCCTGTAA -3’
Seq ID No.5：5’- AACGGGAACCAGGACACATG -3’
Seq ID No.6：5’- VIC-ATACTGGCCTGGACTGTTTTCTCTCGGC-TAMRA -3’。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述标准曲线由RNA标准品采用与所述微量FFPE RNA样本相同的实时荧光PCR扩增获得。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述RNA标准品为UHRR人标准品。
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