CN109563166A - 靶向egfr和her2的双特异性抗体 - Google Patents

Abstract

本公开涉及靶向EGFR和HER2的双特异性抗体，以及用于生产这些抗体的方法。双特异性抗体由一个完整的抗体组成，所述抗体上两个VH‑VL链经由接头与抗体的两个VH链的每个NH端区域附接。构建的双特异性抗体使用两种分别靶向EGFR和HER2的单克隆抗体，即西妥昔单抗和曲妥珠单抗的重链(VH)和轻链(VL)可变区的氨基酸序列。

Description

靶向EGFR和HER2的双特异性抗体

本发明涉及靶向EGFR和HER2的双特异性抗体，用于生产该抗体的方法，其组合物和用途。

发明背景

HER家族(其包括4种酪氨酸激酶受体(EGFR/HER1、HER2、HER3和HER4))激活参与细胞增殖的多重部分冗余互联下游信号级联反应(例如MAPK和PI3K/AKT途径)。已经在大量实体肿瘤(肺、结肠直肠、胰腺等)中观察到HER异常信号传导。EGFR和HER2是细胞表面受体酪氨酸激酶(TK)，其通过与HER家族受体的同源二聚化和异源二聚化来转导生长信号。与EGFR或HER2同源二聚化相比，EGFR与HER2的异源二聚体诱导更有效的TK信号传导的激活。当肿瘤细胞过表达EGFR和HER2两者时，由于EGFR/HER2异源二聚化和信号传导的潜力增加，它们表现出侵袭性肿瘤细胞生长。

胰腺癌是表达EGFR和HER2受体的具有很差的预后的实体瘤的实例。在胰腺肿瘤中，EGFR在45-95％的胰腺癌中表达，并且表达通常与切除的胰腺癌中较差的结果相关。HER2的过表达也已经描述于7-58％的胰腺癌中，并且HER2-扩增的胰腺癌显示非典型的转移模式，表明HER2可能也是胰腺癌中肿瘤发生的重要驱动因素。此外，已报道大约四分之一的EGFR+胰腺癌也额外地是HER2+(Dancer et al(2007)Oncology Reports 18,p.151)，使得它们具有双阳性EGFR+/HER2表型。

胰腺癌是欧洲中癌症死亡的第四最常见的原因，每年病例数增加(男性中+2％，女性中+10％)。即使早期得到诊断，它的预后也很差。它是过去40年中生存率几乎没有得到改善的唯一癌症之一：1年和5年后生存率分别低于20％和5％。尽管胰腺癌在2012年导致全世界超过230,000人死亡，但由于缺乏有效的治疗方法，它仍然是一种罕见的疾病，死亡人数与新诊断的患者一样多。目前，胰腺腺癌(90％的胰腺癌)通过手术、化学疗法或放射和化学疗法的组合进行治疗，结果有限。在1996年作为一线治疗的吉西他滨的推出将无复发的中值生存期提高1.3个月，并且一年的总生存率(overall survival，OS)从2％提高至18％。自2005年以来，尽管进行了各种临床试验，仅两种药物，(厄洛替尼(erlotinib))和(白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel))已被批准用于胰腺癌，主要涉及组合但很少有创新。厄洛替尼作为第一个靶向疗法，与吉西他滨联合仅将无复发的中值生存期提高1个月。

用直接靶向HER受体或下游激酶的治疗剂的方法的治疗通常面临获得性抗性或受信号转导网络的内在稳健性限制。

在此类情况下，联合治疗已显露为自然对策，尽管它们的最佳设计并不简单并且可以取决于肿瘤或其亚型，因此需要事先的患者分层(Fitzgerald JB,Schoeberl B,Nielsen UB,Sorger PK.Systems biology and combination therapy in the quest forclinical efficacy.Nat Chem Biol.2006；2:458–66.)。目前可用于抑制HER信号传导的武器库由小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)例如拉帕替尼(lapatinib)或厄洛替尼，和治疗性抗体例如西妥昔单抗或曲妥珠单抗组成。抗体确实代表了一种强有力的方法，其在信号传导减少之上诱导免疫效应以帮助清除肿瘤，与限于信号传导调节的TKI形成对比。

许多作者已经提出了基于抗体的联合疗法。通过mAb组合靶向HER二聚体，特别是EGFR/HER2异源二聚体被证明有利于抑制胰腺肿瘤生长。

结合两种mAb的靶物的双特异性抗体(BsAb)已得到进一步设计。一些双特异性抗EGFR/抗HER2抗体已得到更具体的描述。然而，它们遭受通常导致较差的可制造性和稳定性的复杂的设计，并且这些抗体的功效仍然可以得到改善，因为在体内胰腺癌模型中，即使在用双特异性抗体治疗时，肿瘤也得以继续生长。

例如，Liu及其同事(Liu et al.A Novel Antibody Engineering Strategy forMaking Monovalent Bispecific Heterodimeric IgG Antibodies by ElectrostaticSteering Mechanism.J Biol.Chem.2015；290(12):7535-62)描述了双特异性抗EGFR和抗HER2抗体的构建和特性，其中分别利用了帕尼单抗(panitumumab)和曲妥珠单抗序列。该抗体在体外和体内表现出针对EGFR+/HER2+细胞系的改善的活性，然而该抗体的活性仍需要改善。Lewis及其同事(Lewis et al.Generation of bispecific IgG antibodies bystructure-based design of an orthogonal Fab interface.NatureBiotechnology.2014；32；191–198)也描述了双特异性抗EGFR和抗HER2抗体，然而在这种情况下，分别使用了不同的抗体序列，马妥珠单抗(matuzumab)和帕妥珠单抗(pertuzumab)序列，以及不同的工程化设计。

国际专利申请WO2014/001324报道了通过使用转肽酶(例如分选酶A(Sortase A))选择和生产多特异性实体的方法，以及该方法用于生成新的定制多特异性抗体的用途。示例了含有帕妥珠单抗和曲妥珠单抗的双特异性抗体。国际专利申请WO2014/124326描述了含有例如曲妥珠单抗和西妥昔单抗的多特异性抗体构建体，以及多特异性抗体药物缀合物。

双特异性HER2/EGFR抗体也描述于欧洲专利申请EP2727940中(其中抗体在重链中携带六个突变以实现异源二聚体配对)以及欧洲专利申请EP2035456中。然而，这些抗体的结构可以导致去稳定化和免疫原性。

Wang S等人(Cancer Lett 2012Dec 28；325(2):214-9)使用曲妥珠单抗和西妥昔单抗工程化改造了抗EGFR/HER2双特异性抗体。然而，与两种抗原的结合是单价的而不像在天然抗体中是二价的，因此可以尚未达到EGFR和HER2抑制的全部效力。

鉴于上述情况，仍然需要用于***的改善的双特异性抗体构建体。

发明概述

本发明人现设计了靶向EGFR和HER2的新型双特异性抗体，在多种癌症的治疗中有用。

本发明更具体地提供了包含两条重链和四条轻链的双特异性抗体，

其中每条重链包含

a.包含铰链-CH2-CH3域的免疫球蛋白的Fc区，

b.所述Fc区通过所述铰链域连接至抗体1(Ab1)的Fab重链CH1-VH，

c.其继而通过多肽接头序列连接至抗体2(Ab2)的Fab重链CH1-VH，其中所述多肽接头序列将所述Ab1的Fab重链VH域的N-末端与所述Ab2的CH1域的C-末端连接，

并且所述四条轻链包含与其关联重链域结合的Ab1的Fab轻链和Ab2的Fab轻链；

其中不同的Ab1和Ab2独立地选自由在一方面上西妥昔单抗(cetuximab)或其突变衍生物以及在另一方面上曲妥珠单抗(trastuzumab)或其突变衍生物组成的组。

在第一实施方案中，Ab1为西妥昔单抗或其突变衍生物，并且Ab2为曲妥珠单抗或其突变衍生物。

在另一个实施方案中，Ab1为曲妥珠单抗或其突变衍生物，并且Ab2为西妥昔单抗或其突变衍生物。

更具体地描述双特异性抗体，其中Ab1或Ab2为西妥昔单抗或其突变衍生物，包含

οVH域，其由SEQ ID NO:4组成，

οCH1域，其选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22，

οVL域，其由SEQ ID NO:13组成，

οCL域，其选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25，

其中所述CH1和CL域结合如下

-SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:11，

-SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:23，

-SEQ ID NO:20与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:23，

-SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25，

-SEQ ID NO:22与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25。

在另一个实施方案中，描述了双特异性抗体，其中Ab1或Ab2为曲妥珠单抗或其突变衍生物，包含

οVH域，其由序列SEQ ID NO:1组成，

οCH1域，其选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22，

οVL域，其由序列SEQ ID NO:10组成，

οCL域，其选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25，

其中所述CH1和CL域结合如下

-SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:11，

-SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:23，

-SEQ ID NO:20与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:23，

-SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25，

-SEQ ID NO:22与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25。

优选地，所述Ab1的CH1和CL域具有与所述Ab2的CH1和CL域不同的序列的组合。

在有利的实施方案中，所述多肽接头序列由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:16或SEQ IDNO:34组成。

提供了具体的抗体，其由以下各项组成

a)两条重链，每条由连续序列组成，所述连续序列以N至C端次序包含：

·曲妥珠单抗重链VH，其由SEQ ID NO:1组成，

·CH1域，其由SEQ ID NO:2组成，

·多肽接头，其由以下各项组成：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:34，

·西妥昔单抗重链VH，其由SEQ ID NO:4组成，

·CH1域，其由SEQ ID NO:5组成，

·铰链域，其由SEQ ID NO:6组成，

·CH2域，其由SEQ ID NO:7组成，

·CH3域，其由SEQ ID NO:8组成，

b)两条曲妥珠单抗轻链，每条包含：

·VL域，其由SEQ ID NO:10组成，

·CL域，其由SEQ ID NO:11组成，

c)两条西妥昔单抗轻链，每条包含：

·VL域，其由SEQ ID NO:13组成，

·CL域，其由SEQ ID NO:14组成。

提供了另一个具体的抗体，其由以下各项组成

a)两条重链，每条由连续序列组成，所述连续序列以N至C端次序包含：

·西妥昔单抗重链VH，其由SEQ ID NO:4组成，

·CH1域，其由SEQ ID NO:5组成，

·多肽接头，其由以下各项组成：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:34，

·曲妥珠单抗重链VH，其由SEQ ID NO:1组成，

·CH1域，其由SEQ ID NO:2组成，

·铰链域，其由SEQ ID NO:6组成，

·CH2域，其由SEQ ID NO:7组成，

·CH3域，其由SEQ ID NO:8组成，

b)两条曲妥珠单抗轻链，每条包含SEQ ID NO:12，

c)两条西妥昔单抗轻链，每条包含SEQ ID NO:15。

本发明的优选双特异性抗体为具有西妥昔单抗VH序列的抗体，所述序列由序列SEQ ID NO 4、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27组成。

本发明还涵盖含有人源化版本的西妥昔单抗的轻链和/或重链的双特异性抗体。

在具体的实施方案中，本发明的双特异性抗体含有曲妥珠单抗的突变VH和VL序列。

本文还描述了包含编码本发明的蛋白质链的序列的多核苷酸。所述多核苷酸还可以包含另外的序列：特别是它可以有利地包含编码允许分泌所述蛋白质链的前导序列或信号肽的序列。

本发明还涵盖用所述多核苷酸转化的宿主细胞。

进一步描述了由如上所定义的所述双特异性抗体的重链组成的多肽，以及包含编码所述多肽的序列的多核苷酸。

还描述了用包含所述多核苷酸的表达载体转染的宿主细胞。

本发明的另一个目的是用于制备本发明的双特异性抗体的方法。

因此提供了用于生产本发明的双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：a)在适合的培养基和培养条件中培养宿主细胞，所述宿主细胞表达如上所定义的抗体重链，和如上所定义的抗体轻链；以及b)从所述培养基或从所述培养的细胞回收所述生产的抗体。

附图简述

图1是本发明的双特异性抗体的示意图。

图2A显示在还原和非还原条件下双特异性抗体BiXAb-3732SS和BiXAb-3489的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

图2B显示在还原和非还原条件下双特异性抗体BiXAb-3486的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

图2C显示在还原和非还原条件下双特异性抗体BiXAb-E06528的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

图3A显示BiXAb-3489的尺寸排阻色谱法分析。

图3B显示BiXAb-3732SS的尺寸排阻色谱法分析。

图3C显示BiXAb-E06528的尺寸排阻色谱法分析。

图4显示了通过数字扫描量热法测定的两种亲本抗体(抗HER2和抗EGFR)和BiXAb-3489的解链曲线。

图5显示BiXAb-3486和BiXAb-3489在双重抗原(HER2和EGFR)结合ELISA中的结合概况。

图6A显示在采用人胰腺癌细胞系BxPC-3作为靶细胞以及未分级的非预活化单核细胞作为效应细胞的ADCC测定中两种亲本抗体(抗HER2和抗EGFR)、它们的1:1混合物、BiXAb-3486、BiXAb-3489、BiXAb-3732SS、BiXAb-E06528以及阴性对照抗体抗CD20的细胞毒性活性概况。

图6B显示在采用人皮肤鳞状细胞癌细胞系A431作为靶细胞以及未分级的非预活化单核细胞作为效应细胞的ADCC测定中两种亲本抗体(抗HER2和抗EGFR)、它们的1:1混合物、BiXAb-3486、BiXAb-3489、BiXAb-3732SS、BiXAb-E06528以及阴性对照抗体抗CD20的细胞毒性活性概况。

图6C显示在采用人卵巢癌细胞系SKOV3作为靶细胞以及未分级的非预活化单核细胞作为效应细胞的ADCC测定中两种亲本抗体(抗HER2和抗EGFR)、它们的1:1混合物、BiXAb-3486、BiXAb-3489、BiXAb-3732SS、BiXAb-E06528以及阴性对照抗体抗CD20的细胞毒性活性概况。

图7A显示携带BxPC--3的裸鼠中在不同剂量(2mg/kg和10mg/kg)的BiXab-3486、BiXab-3489，以及总浓度为4mg/kg的亲本抗EGFR和抗HER2的组合，以及对照的作用(线性标度)。

图7B显示接受不同剂量(2mg/kg和10mg/kg)的BiXAb-3486和BiXAb-3489、总浓度为4mg/kg的抗HER2和抗EGFR的组合或对照的六个不同分组的小鼠的肿瘤生长抑制(T/C％)。肿瘤生长抑制(T/C％)定义为治疗组与对照组的中值肿瘤体积的比率并且计算为T/C％＝[(第X天的治疗组的中值肿瘤体积)/(第X天的对照组的中值肿瘤体积)]x 100。

图7C比较用不同剂量(2mg/kg和10mg/kg)的BiXAb-3486和BiXAb-3489、总浓度为4mg/kg的抗HER2和抗EGFR抗体的组合和对照治疗的小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。

图7D显示相对于未接受治疗的小鼠(对照)，在接受用BiXAb或亲本抗HER2和抗EGFR的组合治疗的小鼠中观察到的治疗益处。治疗益处定义为治疗组的中值生存期-对照组的中值生存期。

发明详述

定义

天然存在的抗体分子的基本结构是Y型四聚体四元结构，其由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，通过非共价相互作用以及通过链间二硫键结合在一起。

在哺乳动物物种中，有五种类型的重链：α、δ、ε、γ和μ，其决定了免疫球蛋白的类型(同种型)分别为：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。重链N-末端可变域(VH)之后，在重链γ、α和δ中是含有3个域(从N-末端至C-末端的编号为CH1、CH2和CH3)的恒定区，而重链μ和ε的恒定区由4个域(从N-末端至C-末端的编号为CH1、CH2、CH3和CH4)组成。IgA、IgG和IgD的CH1和CH2域由柔性铰链分隔，所述柔性铰链的长度在不同类型之间不同，在IgA和IgG的情况下，在不同亚型之间：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4分别具有15、12、62(或77)和12个氨基酸的铰链，而IgA1和IgA2分别具有20和7个氨基酸的铰链。

有两种类型的轻链：λ和κ，其可以与任意重链同种型结合，但在给定抗体分子中的两条轻链是相同类型。两条轻链在功能上是相同的。其N-末端可变域(VL)之后是由称为CL的单一域组成的恒定区。

重链和轻链通过CH1和CL域之间的蛋白质/蛋白质相互作用和通过VH/VL相互作用配对，以及两条重链通过其CH3域之间的蛋白质/蛋白质相互作用结合。免疫球蛋白分子的结构通常通过CH1和CL域之间以及铰链之间的链间二硫键来稳定。

抗原结合区对应于Y型结构的臂，其由每一个与重链的VH和CH1域配对的完整轻链组成，并且称为Fab片段(相当于抗原结合片段)。Fab片段最初由木瓜蛋白酶消化天然免疫球蛋白分子生成，其在铰链区链间二硫键的氨基末端侧切割抗体分子，从而释放两个相同的抗原结合臂。其他蛋白酶例如胃蛋白酶也在铰链区切割抗体分子，但在链间二硫键的羧基末端侧，释放由两个相同Fab片段组成的片段，并且其仍通过二硫键保持连接；在F(ab')2片段中的二硫键的还原生成Fab'片段。

与VH和VL域对应的抗原结合区的部分称为Fv片段(相当于可变片段)；其含有CDR(互补决定区)，所述CDR形成抗原结合位点(也称为互补位)。

负责其与效应分子或细胞结合的抗体的效应区对应于Y型结构的茎，并且含有重链的成对的CH2和CH3域(或者CH2、CH3和CH4域，取决于抗体的类型)，并且称为Fc(相当于可结晶片段)区。

由于两条重链以及两条轻链是相同的，天然存在的抗体分子具有两个相同的抗原结合位点，并且因此同时与两个相同的表位结合。

如果相比于其与其他物质结合，抗体以更高的亲和力、亲合力、更容易和/或以更长的持续时间结合，则抗体“特异性结合”至其靶抗原。“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管其可以包括)排他性结合。通常但不是必须地，提及结合是指优先结合。

西妥昔单抗(ImClone/Lilly、Merck-Serono)是靶向表皮生长因子受体(EGFR)的嵌合小鼠-人单克隆抗体(ATCC HB-9764和ATCC-97-63)。也参见EP0359282、EP0667165和US6217866。西妥昔单抗被批准用于治疗结肠直肠癌以及头颈部的鳞状细胞癌。

曲妥珠单抗(Genentech/Roche)是干扰HER2/neu受体的人源化IgG1。也参见EP0590058、US5821337、US8075890、US6407213、US6054297、US5772997、US6165464、US6399063和US6639055。其适应症为治疗佐剂性以及转移性乳腺癌和转移性胃癌。

在本发明的上下文中，术语“多肽接头序列”是约20至80个氨基酸的多肽，优选在30和60个氨基酸之间，更优选在30和40个氨基酸之间。有利地，接头序列是“铰链衍生的”，这意味着多肽接头包含选自IgA、IgG和IgD(优选人源的)的一种或多种免疫球蛋白的铰链区的全部或部分序列。所述多肽接头可以包含仅一种免疫球蛋白的铰链区的全部或部分序列。在这种情况下，所述免疫球蛋白可以属于与衍生相邻CH1域的免疫球蛋白相同的同种型和亚类，或属于不同的同种型或亚类。或者，所述多肽接头可以包含至少两种不同的同种型或亚类的免疫球蛋白的铰链区的全部或部分序列。在这种情况下，直接在CH1域之后的多肽接头的N-末端部分优选由免疫球蛋白的全部或部分铰链区组成，所述免疫球蛋白属于与衍生所述CH1域的免疫球蛋白相同的同种型和亚类。任选地，所述多肽接头可以进一步包含免疫球蛋白的CH2域的2至15个，优选5至10个N-末端氨基酸的序列。在一些情况下，可以使用来自天然铰链区的序列；在其他情况下，可以对这些序列进行点突变，特别是用丙氨酸或丝氨酸取代天然IgG1、IgG2或IgG3铰链序列中的一个或多个半胱氨酸残基，以避免不需要的链内或链间二硫键。

可以用于本发明的双特异性抗体的多肽接头的非限制性实例是具有以下序列的多肽：

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQ ID NO:3)。

所述多肽由人IgG1铰链的全长序列，其后是人IgG1CH2的9个N-末端氨基酸(APELLGGPS(SEQ ID NO:28))、其后是人IgA1铰链的部分序列(TPPTPSPS(SEQ ID NO:29))以及其后是二肽GG组成，添加二肽GG以便为接头提供补充的柔性。在另一个优选的实施方案中，铰链衍生的多肽接头序列是SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:34。

术语“受试者”、“个体”和“患者”在本申请中可以互换使用，并且是指针对治疗进行评估的和/或所治疗的哺乳动物。受试者可以是人，但还包括其他哺乳动物，特别是作为用于人类疾病的实验室模型使用的那些哺乳动物，例如小鼠、大鼠、家兔、犬等。

术语“治疗”或“处理”是指行动、应用或疗法，其中包括人在内的受试者受到以直接地或间接地改善受试者的状况为目的的医疗救助。特别地，在一些实施方案中该术语是指降低发病率或减轻症状、消除复发、预防复发、预防发病、改善症状、改善预后或其组合。本领域技术人员将理解的是治疗不一定导致症状的完全消除或除去。例如，对于癌症而言，“治疗”或“处理”可以指延缓赘生物或恶性细胞生长、增殖或转移，阻止或推迟赘生物或恶性细胞生长、增殖或转移的进展或其一些组合。

双特异性抗体的设计

本发明人现提供了双特异性四价抗体，其包含针对每个其靶点的两个结合位点，以及允许激活效应功能(例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用和补体依赖性细胞毒性(CDC))的功能性Fc域。

本发明具体涉及使用靶向EGFR和HER2的两种单克隆抗体(即分别为西妥昔单抗和曲妥珠单抗)的重链(VH)和轻链(VL)可变区的氨基酸序列构建的双特异性抗体。

本发明的抗体为全长抗体。其优选地包含来自人免疫球蛋白优选IgG更优选IgG1的重链和轻链。

轻链优选为Kappa轻链。

具有IgG样结构的本发明的抗体的实例示于图1中。

本发明的双特异性抗体通常包含

-由Fc(铰链-CH2-CH3)构成的连续重链，

-其后是抗体1Fab重链(CH1-VH)和抗体2的连续Fab重链(CH1-VH)，后者通过铰链衍生的多肽接头序列连接，

-并且在蛋白质表达过程中，得到的重链组装成二聚体，而共表达的抗体1和抗体2轻链(VL-CL)与其关联重链结合，以形成最终的串联F(ab)’2-Fc分子，

抗体1(Ab1)和抗体2(Ab2)是不同的并且选自由西妥昔单抗、曲妥珠单抗和其突变的或人源化的衍生物组成的组。

在一个本发明的实施方案中，双特异性抗体包含

-由Fc(铰链-CH2-CH3)构成的连续重链，

-其后是曲妥珠单抗Fab重链(CH1-VH)和西妥昔单抗的连续Fab重链(CH1-VH)，后者通过铰链衍生的多肽接头序列连接，

-并且在蛋白质表达过程中，得到的重链组装成二聚体，而共表达的野生型或突变的曲妥珠单抗以及野生型或突变的或人源化的西妥昔单抗的轻链(VL-CL)与其关联重链结合，以形成最终的串联F(ab)’2-Fc分子。

在本发明的另一个实施方案中，双特异性抗体包含

-由Fc(铰链-CH2-CH3)构成的连续重链，

-其后是西妥昔单抗Fab重链(CH1-VH)和曲妥珠单抗的连续Fab重链(CH1-VH)，后者通过铰链衍生的多肽接头序列连接，

-并且在蛋白质表达过程中，得到的重链组装成二聚体，而共表达的野生型或突变的西妥昔单抗以及野生型或突变的曲妥珠单抗的轻链(VL-CL)与其同源重链结合，以形成最终的串联F(ab)’2-Fc分子。

在优选的实施方案中，描述了双特异性抗体，其包含

·具有不同的CH1和CL域的两个Fab片段，其由以下各项组成

a)具有衍生自人IgG1/Kappa的CH1和C-Kappa域以及Ab1的VH和VL域的Fab片段，

b)具有衍生自人IgG1/Kappa的CH1和C-Kappa域以及Ab2的VH和VL域的Fab片段，

c)衍生自人Kappa恒定域的突变的轻链恒定域，

Fab片段按以下顺序串联排列

-将Ab1Fab片段的CH1域的C-末端通过多肽接头连接至Ab2Fab片段的VH域的N-末端，

-将Ab2片段的CH1域的C-末端连接至CH2域的N-末端的人IgG1的铰链区，

-人IgG1的二聚化CH2和CH3域。

在更优选的实施方案中，

-Ab1为曲妥珠单抗，其具有

οVH区，其对应于序列SEQ ID NO:1，

οCH1区，其对应于选自由以下各项组成的组的序列之一：SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22，

οVL区，其对应于序列SEQ ID NO:10，

οC-Kappa区，其对应于选自由以下各项组成的组的序列之一：SEQ ID NO:11、SEQID NO:14、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25，

οCH1和C-Kappa区，其仅可以按以下组合结合：

-SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:11，

-SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:23，

-SEQ ID NO:20与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:23，

-SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25，

-SEQ ID NO:22与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25，

-Ab2为西妥昔单抗，其具有

οVH区，其对应于序列SEQ ID NO:4，

οCH1区，其对应于选自由以下各项组成的组的序列之一：SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22，

οVL区，其对应于序列SEQ ID NO:13，

οC-Kappa区，其对应于选自由以下各项组成的组的序列之一：SEQ ID NO:11、SEQID NO:14、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25，

οCH1和C-Kappa区，其仅可以按以下组合结合：

-SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:11，

-SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:23，

-SEQ ID NO:20与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:23，

-SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25，

-SEQ ID NO:22与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25，

-Ab1和Ab2各自具有不同的CH1和C-Kappa序列组合。

在另一个方面，

Ab1为西妥昔单抗，其具有

οVH区，其对应于序列SEQ ID NO:4，

οCH1区，其对应于选自由以下各项组成的组的序列之一：SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22，

οVL区，其对应于序列SEQ ID NO:13，

οC-Kappa区，其对应于选自由以下各项组成的组的序列之一：SEQ ID NO:11、SEQID NO:14、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25，

οCH1和C-Kappa区，其仅可以按以下组合结合：

-SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:11，

-SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:23，

-SEQ ID NO:20与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:23，

-SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25，

-SEQ ID NO:22与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25，

并且Ab2为曲妥珠单抗，其具有

οVH区，其对应于序列SEQ ID NO:1，

οCH1区，其对应于选自由以下各项组成的组的序列之一：SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22，

οVL区，其对应于序列SEQ ID NO:10，

οC-Kappa区，其对应于选自由以下各项组成的组的序列之一：SEQ ID NO:11、SEQID NO:14、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25，

οCH1和C-Kappa区，其仅可以按以下组合结合：

-SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:11，

-SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:23，

-SEQ ID NO:20与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:23，

-SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25，

-SEQ ID NO:22与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25，

-Ab1和Ab2各自具有序列的不同的CH1和C-Kappa组合。

在整个本说明书中，氨基酸序列根据Kabat et al,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991)定义。

在具体的实施方案中，双特异性抗体具有以下结构：

a)连续重链，其由以下各项组成：

·曲妥珠单抗重链可变区(VH)，其对应于SEQ ID NO:1，

·来自人IgG1的野生型CH1恒定域(Kabat位置192处的残基为苏氨酸，T)，其对应于SEQ ID NO:2，

·连接两个Fab重链的多肽接头，其对应于SEQ ID NO:3，

·西妥昔单抗重链可变区(VH)，其对应于SEQ ID NO:4，

·来自人IgG1的突变的CH1恒定域(Kabat位置192处的残基已从苏氨酸突变为谷氨酸，E)，其对应于SEQ ID NO:5，

·来自人IgG1的野生型铰链区，其对应于SEQ ID NO:6，

·人IgG1的野生型CH2域，其对应于SEQ ID NO:7，

·人IgG1同种异型G1m(3)的野生型CH3域，其对应于SEQ ID NO:8，

b)曲妥珠单抗轻链，其由以下各项组成：

·野生型可变区(VL)，其对应于SEQ ID NO:10，

·野生型人Kappa恒定域(Kabat位置114和137处的残基分别为丝氨酸(S)和天冬酰胺(N))，其对应于SEQ ID NO:11，

c)西妥昔单抗轻链，其由以下各项组成：

·野生型可变区(VL)，其对应于SEQ ID NO:13，

·突变的人Kappa恒定域(Kabat位置114和137处的残基分别为丙氨酸(A)和赖氨酸(K))，其对应于SEQ ID NO:14。

在另一个实施方案中，双特异性抗体具有以下结构：

a)连续重链，其由以下各项组成：

·曲妥珠单抗重链可变区(VH)，其对应于SEQ ID NO:1，

·来自人IgG1的野生型CH1恒定域(Kabat位置192处的残基为苏氨酸，T)，其对应于SEQ ID NO:2，

·连接两个Fab重链的多肽接头，其对应于SEQ ID NO:16或SEQ IDNO:34，

·西妥昔单抗重链可变区(VH)，其对应于SEQ ID NO:4，

·来自人IgG1的突变的CH1恒定域(Kabat位置192处的残基已从苏氨酸突变为谷氨酸，E)，其对应于SEQ ID NO:5，

·来自人IgG1的野生型铰链区，其对应于SEQ ID NO:6，

·人IgG1的野生型CH2域，其对应于SEQ ID NO:7，

·人IgG1同种异型G1m(3)的野生型CH3域，其对应于SEQ ID NO:8，

b)野生型曲妥珠单抗轻链的氨基酸序列，其对应于SEQ ID NO:12，

c)突变的西妥昔单抗轻链的氨基酸序列，其对应于SEQ ID NO:15。

在进一步的方面，双特异性抗体可以具有以下结构：

a)连续重链，其由以下各项组成：

·西妥昔单抗重链可变区(VH)，其对应于SEQ ID NO:4，

·来自人IgG1的突变的CH1恒定域(Kabat位置192处的残基已从苏氨酸突变为谷氨酸，E)，其对应于SEQ ID NO:5，

·连接两个Fab重链的多肽接头，其对应于SEQ ID NO:3，

·曲妥珠单抗重链可变区(VH)，其对应于SEQ ID NO:1，

·来自人IgG1的野生型CH1恒定域(Kabat位置192处的残基为苏氨酸，T)，其对应于SEQ ID NO:2，

·来自人IgG1的野生型铰链区，其对应于SEQ ID NO:6，

·人IgG1的野生型CH2域，其对应于SEQ ID NO:7，

·人IgG1同种异型G1m(3)的野生型CH3域，其对应于SEQ ID NO:8，

b)野生型曲妥珠单抗轻链的氨基酸序列，其对应于SEQ ID NO:12，

c)突变的西妥昔单抗轻链的氨基酸序列，其对应于SEQ ID NO:15。

在更进一步的方面，双特异性抗体可以具有以下结构：

a)连续重链，其由以下各项组成：

·西妥昔单抗重链可变区(VH)，其对应于SEQ ID NO:4，

·来自人IgG1的突变的CH1恒定域(Kabat位置192处的残基已从苏氨酸突变为谷氨酸，E)，其对应于SEQ ID NO:5，

·连接两个Fab重链的多肽接头，其对应于SEQ ID NO:16，

·曲妥珠单抗重链可变区(VH)，其对应于SEQ ID NO:1，

·来自人IgG1的野生型CH1恒定域(Kabat位置192处的残基为苏氨酸，T)，其对应于SEQ ID NO:2，

·来自人IgG1的野生型铰链区，其对应于SEQ ID NO:6，

·人IgG1的野生型CH2域，其对应于SEQ ID NO:7，

·人IgG1同种异型G1m(3)的野生型CH3域，其对应于SEQ ID NO:8，

b)野生型曲妥珠单抗轻链的氨基酸序列，其对应于SEQ ID NO:12，

c)突变的西妥昔单抗轻链的氨基酸序列，其对应于SEQ ID NO:15。

双特异性抗体可以含有以下突变的至少一个：

-来自人IgG1的突变的CH1恒定域，其对应于SEQ ID NO:20，

-来自人IgG1的突变的CH1恒定域，其对应于SEQ ID NO:21，

-来自人IgG1的突变的CH1恒定域，其对应于SEQ ID NO:22，

-突变的人Kappa恒定域，其对应于SEQ ID NO:23，

-突变的人Kappa恒定域，其对应于SEQ ID NO:24，

-突变的人Kappa恒定域，其对应于SEQ ID NO:25。

在进一步的方面，根据表1和表2中列出的组合，双特异性抗体具有VH区、CH1域、VL区和C-Kappa域，其显示了本发明抗体的各种可能形式。

双特异性抗体优选对EGFR和/或HER2显示出更高的结合亲和力。例如，关于EGFR和/或HER2，双特异性抗体可以显示小于1x 10^-7M、10^-8M，优选小于1x 10^-9或1x 10^-10M的Kd。

表1

表2

接头的设计

多肽接头，也称为“铰链衍生的多肽接头序列”或“伪铰链接头”，其包含选自IgA、IgG和IgD的(优选人源的)一种或多种免疫球蛋白的铰链区的全部或部分序列。所述多肽接头可以包含仅一种免疫球蛋白的铰链区的全部或部分序列。在这种情况下，所述免疫球蛋白可以属于与衍生相邻CH1域的免疫球蛋白相同的同种型和亚类，或属于不同的同种型或亚类。或者，所述多肽接头可以包含至少两种不同的同种型或亚类的免疫球蛋白的铰链区的全部或部分序列。在这种情况下，直接在CH1域之后的多肽接头的N-末端部分优选由免疫球蛋白的全部或部分铰链区组成，所述免疫球蛋白属于与衍生所述CH1域的免疫球蛋白相同的同种型和亚类。

任选地，所述多肽接头可以进一步包含免疫球蛋白的CH2域的2至15个，优选5至10个N-末端氨基酸的序列。

多肽接头序列通常由少于80个氨基酸，优选地少于60个氨基酸以及更优选地少于40个氨基酸组成。

在一些情况下，可以使用来自天然铰链区的序列；在其他情况下，可以对这些序列进行点突变，特别是用丙氨酸或丝氨酸取代天然IgG1、IgG2或IgG3铰链序列中的一个或多个半胱氨酸残基，以避免不需要的链内或链间二硫键。

在具体的实施方案中，多肽接头序列包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：EPKX₁CDKX₂HX₃X₄PPX₅PAPELLGGPX₆X7PPX₈PX₉PX₁₀GG(SEQ ID NO:36)，其中相同的或不同的X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀为任意氨基酸。特别地，多肽接头序列可以包含选自由以下各项组成的组的序列，或者由选自由以下各项组成的组的序列组成：

EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPGGPPGPGPGGG(SEQ ID NO:37)；

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQ ID NO:3)；

EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQ ID NO:16)；

EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGG(SEQ ID NO:34)；

EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPGPAPGGG(SEQ ID NO:38)。

可以用于本发明的多特异性抗原结合片段中的铰链衍生的多肽接头的非限制性实例是具有SEQ ID NO:3的多肽。所述多肽由人IgG1铰链的全长序列，其后是人IgG1CH2的9个N-末端氨基酸(APELLGGPS，SEQ ID NO:28)、其后是人IgA1铰链的部分序列(TPPTPSPS，SEQ ID NO:29)以及其后是二肽GG组成，添加二肽GG以便为接头提供补充的柔性。在另一个优选的实施方案中，铰链衍生的多肽接头序列是SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:16。

在具体的实施方案中，相同的或不同的X₁、X₂和X₃是苏氨酸(T)或丝氨酸(S)。

在另一个具体的实施方案中，相同的或不同的X₁、X₂和X₃选自由以下各项组成的组：Ala(A)、Gly(G)、Val(V)、Asn(N)、Asp(D)和Ile(I)，更优选地相同的或不同的X₁、X₂和X₃可以是Ala(A)或Gly(G)。

或者，相同的或不同的X₁、X₂和X₃可以是Leu(L)、Glu(E)、Gln(Q)、Met(M)、Lys(K)、Arg(R)、Phe(F)、Tyr(T)、His(H)、Trp(W)，优选地Leu(L)、Glu(E)或Gln(Q)。

在具体的实施方案中，相同的或不同的X₄和X₅是选自由以下各项组成的组的任意氨基酸：丝氨酸(S)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)和甘氨酸(G)。

在优选的实施方案中，X₄是丝氨酸(S)或半胱氨酸(C)。

在优选的方面，X₅是丙氨酸(A)或半胱氨酸(C)。

在具体的实施方案中，相同的或不同的X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀是除苏氨酸(T)或丝氨酸(S)之外的任意氨基酸。优选地相同的或不同的X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀选自由以下各项组成的组：Ala(A)、Gly(G)、Val(V)、Asn(N)、Asp(D)和Ile(I)。

或者，相同的或不同的X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀可以是Leu(L)、Glu(E)、Gln(Q)、Met(M)、Lys(K)、Arg(R)、Phe(F)、Tyr(T)、His(H)、Trp(W)，优选地Leu(L)、Glu(E)或Gln(Q)。

在优选的实施方案中，相同的或不同的X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀选自由以下各项组成的组：Ala(A)和Gly(G)。

在更优选的实施方案中，X₆和X₇是相同的并且优选地选自由以下各项组成的组：Ala(A)和Gly(G)。

在优选的实施方案中，多肽接头序列包含序列SEQ ID NO:36或者由序列SEQ IDNO:36组成，其中

相同的或不同的X₁、X₂和X₃是苏氨酸(T)、丝氨酸(S)；

X₄是丝氨酸(S)或半胱氨酸(C)；

X₅是丙氨酸(A)或半胱氨酸(C)；

相同的或不同的X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀选自由以下各项组成的组：Ala(A)和Gly(G)。

在另一个优选的实施方案中，多肽接头序列包含序列SEQ ID NO:36或者由序列SEQ ID NO:36组成，其中

相同的或不同的X₁、X₂和X₃是Ala(A)或Gly(G)；

X₄是丝氨酸(S)或半胱氨酸(C)；

X₅是丙氨酸(A)或半胱氨酸(C)；

相同的或不同的X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀选自由以下各项组成的组：Ala(A)和Gly(G)。

优选的双特异性抗体

若干种双特异性抗体(命名为BiXAb-3486、BiXAb-3489、BiXAb-3732SS和BiXAb-E06528)的制备描述于实施例中。

本发明的一种优选的双特异性抗体(BiXAb-3486)具有以下结构：

i)连续重链，其包含

·曲妥珠单抗重链可变区(VH)，其对应于SEQ ID NO:1

·来自人IgG1的野生型CH1恒定域(Kabat位置192处的残基为苏氨酸，T)，其对应于SEQ ID NO:2

·连接两个Fab重链的多肽接头，其对应于SEQ ID NO:3

·西妥昔单抗重链可变区(VH)，其对应于SEQ ID NO:4

·来自人IgG1的突变的CH1恒定域(Kabat位置192处的残基已从苏氨酸突变为谷氨酸，E)，其对应于SEQ ID NO:5

·来自人IgG1的野生型铰链区，其对应于SEQ ID NO:6

·人IgG1的野生型CH2域，其对应于SEQ ID NO:7

·人IgG1同种异型G1m(3)的野生型CH3域，其对应于SEQ ID NO:8

所以，本发明的双特异性抗体具有SEQ ID NO:9的连续重链(701个残基)

ii)野生型曲妥珠单抗轻链，其包含

·野生型可变区(VL)，其对应于SEQ ID NO:10

·野生型人Kappa恒定域(Kabat位置114和137处的残基分别为丝氨酸(S)和天冬酰胺(N))，其对应于SEQ ID NO:11

所以，曲妥珠单抗轻链对应于SEQ ID NO:12

iii)西妥昔单抗轻链，其包含

·野生型可变区(VL)，其对应于SEQ ID NO:13

·突变的人Kappa恒定域(Kabat位置114和137处的残基分别为丙氨酸(A)和赖氨酸(K))，其对应于SEQ ID NO:14

所以，西妥昔单抗轻链对应于SEQ ID NO:15。

本发明的另一个优选的双特异性抗体(BiXAb-3489)是具有以下结构的抗体：

i)连续重链，其包含

·曲妥珠单抗重链可变区(VH)，其对应于SEQ ID NO:1

·野生型CH1恒定域(Kabat位置192处的残基为苏氨酸，T)来自人IgG1，其对应于SEQ ID NO:2

·连接两个Fab重链的多肽接头，其对应于SEQ ID NO:16

·西妥昔单抗重链可变区(VH)，其对应于SEQ ID NO:4

·来自人IgG1的突变的CH1恒定域(Kabat位置192处的残基已从苏氨酸突变为谷氨酸，E)，其对应于SEQ ID NO:5

·来自人IgG1的野生型铰链区，其对应于SEQ ID NO:6

·人IgG1的野生型CH2域，其对应于SEQ ID NO:7

·人IgG1同种异型G1m(3)的野生型CH3域，其对应于SEQ ID NO:8

所以，本发明的双特异性抗体具有SEQ ID NO:17的连续重链(701个残基)

ii)野生型曲妥珠单抗轻链，其由SEQ ID NO:12组成

iii)西妥昔单抗轻链，其由SEQ ID NO:15组成

本发明的另一个优选的双特异性抗体(BiXAb-E06528)是具有以下结构的抗体：

i)连续重链，其包含

·曲妥珠单抗重链可变区(VH)，其对应于SEQ ID NO:1

·来自人IgG1的野生型CH1恒定域(Kabat位置192处的残基为苏氨酸，T)，其对应于SEQ ID NO:2

·连接两个Fab重链的多肽接头，其对应于SEQ ID NO:34

·西妥昔单抗重链可变区(VH)，其对应于SEQ ID NO:4

·来自人IgG1的突变的CH1恒定域(Kabat位置192处的残基已从苏氨酸突变为谷氨酸，E)，其对应于SEQ ID NO:5

·来自人IgG1的野生型铰链区，其对应于SEQ ID NO:6

·人IgG1的野生型CH2域，其对应于SEQ ID NO:7

·人IgG1同种异型G1m(3)的野生型CH3域，其对应于SEQ ID NO:8

所以，本发明的双特异性抗体具有SEQ ID NO:35的连续重链(701个残基)

ii)野生型曲妥珠单抗轻链，其由SEQ ID NO:12组成

iii)西妥昔单抗轻链，其由SEQ ID NO:15组成

本发明的另一个优选的双特异性抗体具有以下结构：

i)连续重链，其包含

·西妥昔单抗重链可变区(VH)，其对应于SEQ ID NO:4

·来自人IgG1的突变的CH1恒定域(Kabat位置192处的残基已从苏氨酸突变为谷氨酸，E)，其对应于SEQ ID NO:5

·连接两个Fab重链的多肽接头，其对应于SEQ ID NO:3

·曲妥珠单抗重链可变区(VH)，其对应于SEQ ID NO:1

·来自人IgG1的野生型CH1恒定域(Kabat位置192处的残基为苏氨酸，T)，其对应于SEQ ID NO:2

·来自人IgG1的野生型铰链区，其对应于SEQ ID NO:6

·人IgG1的野生型CH2域，其对应于SEQ ID NO:7

·人IgG1同种异型G1m(3)的野生型CH3域，其对应于SEQ ID NO:8

所以，本发明的双特异性抗体具有SEQ ID NO:18的连续重链(701个残基)

ii)野生型曲妥珠单抗轻链，其由SEQ ID NO:12组成

iii)西妥昔单抗轻链，其由SEQ ID NO:15组成

本发明的另一个更优选的双特异性抗体(BiXab 3732SS)具有以下结构：

i)连续重链，其包含

·西妥昔单抗重链可变区(VH)，其对应于SEQ ID NO:4

·来自人IgG1的突变的CH1恒定域(Kabat位置192处的残基已从苏氨酸突变为谷氨酸，E)，其对应于SEQ ID NO:5

·连接两个Fab重链的多肽接头，其对应于SEQ ID NO:16

·曲妥珠单抗重链可变区(VH)，其对应于SEQ ID NO:1

·来自人IgG1的野生型CH1恒定域(Kabat位置192处的残基为苏氨酸，T)，其对应于SEQ ID NO:2

·来自人IgG1的野生型铰链区，其对应于SEQ ID NO:6

·人IgG1的野生型CH2域，其对应于SEQ ID NO:7

·人IgG1同种异型G1m(3)的野生型CH3域，其对应于SEQ ID NO:8

所以，本发明的双特异性抗体具有SEQ ID NO:19的连续重链(701个残基)

ii)野生型曲妥珠单抗轻链，其由SEQ ID NO:12组成

iii)西妥昔单抗轻链，其由SEQ ID NO:15组成

突变的衍生物

本发明利用(西妥昔单抗和曲妥珠单抗的)野生型序列或其突变的衍生物。

术语“突变的衍生物”、“突变体”或“功能性变体”指通过缺失、取代或***一个或若干个氨基酸而与其所指的亲本序列不同的序列。优选地，突变体优选地显示与天然序列至少80％、优选地至少85％、更优选地至少90％的同源序列。在具体的实施方案中，突变基本上不影响抗体的功能。

突变的衍生物或功能性变体可以包含VH链，所述VH链包含与本文所述的任意参照序列至少85％(例如，90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列，VL链，所述VL链具有与本文所述的任意参照序列至少85％(例如，90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列，或者这两者。这些变体能够与EGFR和HER2结合。在一些实例中，变体相对于上文所述的参照抗体具有相似的抗原结合亲和力(例如，具有小于1x 10^-8，优选地小于1x 10^-9或1x 10^-10M的Kd)。

使用术语ka(结合速率常数)、kd(解离速率常数)或KD(平衡解离)定义结合的亲和力。通常，当关于抗体使用特异性结合时，是指抗体以小于10^-8M(例如，小于10^-9M或10^-10M)的亲和力(KD)值与其靶物特异性结合(“识别”)。较低的KD值表示具有较高的结合亲和力(即，更强的结合)，从而10^-9的KD值表示比10^-8的KD值具有更高的结合亲和力。

使用经Karlin和Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993中修改的Karlin和Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990的算法确定两条氨基酸序列的“同一性百分比”。此类算法已并入Altschul,et al.J.Mol.Biol.215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)。可以使用XBLAST程序(评分＝50，字长＝3)实施BLAST蛋白质检索，以获得与感兴趣的蛋白质分子同源的氨基酸序列。当在两条序列之间存在空位时，可以利用如Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402,1997中所述的空位BLAST。当利用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数。

在其他实施方式中，本文所述的功能性变体可以含有一个或多个突变(例如，保守性取代)，其优选地不出现在预计与一个或多个CDR相互作用的残基处。

本文描述了基本上与参照抗体相同的突变的衍生物或功能性变体。

术语“基本上相同的”或“无实质性的(insubstantial)”指变体的相关氨基酸序列(例如，在框架区(FR)、CDR、VH或VL域中)与参照抗体相比无实质性地不同(例如，包括保守性氨基酸取代)，使得变体相对于参照抗体具有基本上相似的结合活性(例如，亲和力、特异性或者这两者)和生物活性。此类变体可以包含微小的氨基酸改变，例如在特定区域的5个氨基酸序列中有1或2个取代。在通常情况下，与CDR区相比，在FR区中可以有更多取代，只要其对抗体的结合功能不具有负面影响(如与原始的抗体相比结合亲和力降低50％以上)即可。在一些实施方式中，在原始的抗体与经修饰的抗体之间的序列同一性可以是约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。在一些实施方式中，经修饰的抗体具有相同的结合特异性，并且具有原始抗体的至少50％的亲和力。

保守性取代将产生具有与进行此类修饰的分子类似的功能和化学特征的分子。例如，“保守性氨基酸取代”可以牵涉使用另一残基对天然氨基酸残基的取代，所述取代使得对该位置氨基酸残基的极性或电荷几乎没有影响或没有影响。本领域技术人员可以确定所需的氨基酸取代(无论是保守性的还是非保守性的)。例如，氨基酸取代可以用于鉴定分子序列的重要残基，或者用于提高或降低本文所述的分子的亲和力。可以根据本领域普通技术人员已知的改变多肽序列的方法制备包含一个或多个保守性氨基酸取代的变体，例如在汇编此类方法的参考文献中找到的，例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook,et al.编,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,New York,1989或Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel,et al.编,John Wiley&Sons,Inc.,New York。氨基酸的保守性取代包括在下组中的氨基酸之间的取代：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；和(g)E、D。

本公开内容还提供了具有改善的抗体的生物学特性的抗体变体，例如更高或更低的结合亲和力，或者具有经改变的ADCC特性，或者具有EGFR和/或HER2表达细胞的生存力抑制的经改变的作用。

可以通过将适当的核苷酸改变引入到抗体核酸者中或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如从抗体的氨基酸序列中缺失残基和/或***残基和/或取代残基。可以进行缺失、***和取代的任意组合以获得最终的构建体，前提是最终的构建体具有所需的特征。可以通过本领域已知的各种方法制备编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于对此前制备的抗体的变体或非变体(天然)版本的寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变。在一个实施方案中，本发明的抗体的平衡解离常数(KD)值小于10^-8M，特别地小于10^-9M或10^-10M。可以使用本领域已知的技术确定结合亲和力，例如ELISA或双特异性相互作用分析，或者本领域已知的其他技术。

可以遵循常规方法检测本文所述的任意抗体以确定其特性，例如抗原结合活性、抗原结合特异性和生物功能。

可以修饰本文所述的任意抗体以使其含有本领域已知且易于获得的另外的非蛋白质部分，例如通过PEG化、高糖基化、毒素的结合、放射性标记等。感兴趣的是可以增强血清半衰期的修饰。

突变的衍生物的实例描述如下。

根据本发明，描述了双特异性抗体，其包含

-来自人IgG1的突变的CH1恒定域(Kabat位置192处的残基已从苏氨酸突变为天冬氨酸，D)，其对应于SEQ ID NO:20

-来自人IgG1的突变的CH1恒定域(Kabat位置192处的残基已从苏氨酸突变为赖氨酸，K)，其对应于SEQ ID NO:21

-来自人IgG1的突变的CH1恒定域(Kabat位置192处的残基已从苏氨酸突变为精氨酸，R)，其对应于SEQ ID NO:22

-突变的人Kappa恒定域(Kabat位置114和137处的残基分别为丙氨酸(A)和精氨酸(R))，其对应于SEQ ID NO:23

-突变的人Kappa恒定域(Kabat位置114和137处的残基分别为丙氨酸(A)和谷氨酸(E))，其对应于SEQ ID NO:24

-或者突变的人Kappa恒定域(Kabat位置114和137处的残基分别为丙氨酸(A)和天冬氨酸(D))，其对应于SEQ ID NO:25。

在另一个实施方案中，在曲妥珠单抗的VH和VL序列中以下Kabat位置处的残基可以进行突变：

VH中Kabat位置31处，Asp至Glu或Ser

VH中Kabat位置32处，Thr至Ser、Asn或Tyr

VH中Kabat位置54处，Asn至Gln、His、Lys、Arg、Gly或Ser

VH中Kabat位置55处，Gly至Pro、Ala和Ser

VH中Kabat位置61处，Asp至Glu

VH中Kabat位置62处，Ser至Thr

VH中Kabat位置95处，Trp至Tyr或Phe

VH中Kabat位置98处，Asp至Glu

VH中Kabat位置99处，Gly至Pro或Ala

VL中Kabat位置28处，Asp至Glu或Gly

VL中Kabat位置29处，Val至Ile或Leu

VL中Kabat位置30处，Asn至Gln、His、Lys、Arg或Ser

VL中Kabat位置31处，Thr至Ser。

本发明的抗体可以是糖基化的或非糖基化的，或者可以显示出各种糖基化图谱。在优选的实施方案中，抗体在重链和轻链的可变区上是非糖基化的，但是在Fc区上是糖基化的。

例如为了除去西妥昔单抗的VH域中的N-糖基化位点，将Kabat位置H85处的Asn突变为天冬氨酸(D)(根据序列SEQ ID NO:26)，或者将Kabat位置H85处的Asn突变为谷氨酸(E)(根据序列SEQ ID NO:27)。

某些突变的衍生物可以使用参照西妥昔单抗抗体的人源化形式，其原始形式是具有小鼠来源的重链和轻链可变区的嵌合抗体。

在人源化方法中，将来自供体小鼠可变区的互补决定区(CDR)和某些其他氨基酸移植至人可变受体区中，然后将其与人恒定区连接。参见例如，Riechmann等，Nature 332:323-327(1988)；美国专利号5,225,539。

在一些实例中，描述了双特异性抗体，其包含

-如IMGT/Gene数据库中所定义的基于人免疫球蛋白基因kappa可变6-11等位基因02(IGKV6-11*02)的西妥昔单抗的轻链人源化版本，

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGTNIHWYQQKPDQSPKLLIKYASESISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQNNNWPTTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:30)

其中以下Kabat位置处的氨基酸残基为：

Kabat位置L31处Thr或Ser

Kabat位置L32处Asn或Ser

Kabat位置L33处Ile或Leu

Kabat位置L53处Glu或Gln

Kabat位置L89处Gln或His

Kabat位置L91处Asn、Ser、His、Lys或Arg

Kabat位置L92处Asn、Ser、His、Lys或Arg

Kabat位置L93处Asn、Ser、His、Lys或Arg

Kabat位置L94处Trp、Tyr或Phe

Kabat位置L96处Thr或Tyr。

-如IMGT/Gene数据库中所定义的基于人免疫球蛋白基因kappa可变3-11等位基因01(IGKV3-11*01)的西妥昔单抗的轻链人源化版本，

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSIGTNIHWYQQKPGQAPRLLIKYASESISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQNNNWPTTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:31)

其中以下Kabat位置处的氨基酸残基为：

Kabat位置L29处Ile或Val

Kabat位置L30处Gly或Ser

Kabat位置L31处Thr或Ser

Kabat位置L32处Asn或Tyr

Kabat位置L33处Ile或Leu

Kabat位置L34处His或Ala

Kabat位置L49处Lys或Tyr

Kabat位置L50处Tyr或Asp

Kabat位置L53处Glu或Asn

Kabat位置L54处Ser或Arg

Kabat位置L55处Ile或Ala

Kabat位置L56处Ser或Thr

Kabat位置L91处Asn、Arg、His或Lys

Kabat位置L92处Asn、Ser、His、Lys或Arg

Kabat位置L94处Trp、Tyr或Phe

Kabat位置L96处Thr或Tyr。

-如IMGT/Gene数据库中所定义的基于人免疫球蛋白基因重可变4-59等位基因01(IGHV4-59*01)的西妥昔单抗的重链人源化版本，

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTNYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPLTSRLTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:32)

其中以下Kabat位置处的氨基酸残基为：

Kabat位置H29处Leu或Ile

Kabat位置H30处Thr或Ser

Kabat位置H31处Asn或Ser

Kabat位置H33处Gly或Tyr

Kabat位置H35处His或Ser

Kabat位置H37处Val或Ile

Kabat位置H48处Leu或Ile

Kabat位置H50处Val或Tyr

Kabat位置H52处Trp、Tyr或Phe

Kabat位置H53处Ser或Tyr

Kabat位置H54处Gly或Ser

Kabat位置H56处Asn或Ser

Kabat位置H58处Asp或Asn

Kabat位置H61处Thr或Pro

Kabat位置H62处Pro或Ser

Kabat位置H64处Thr或Lys

Kabat位置H67处Leu或Val

Kabat位置H73处Asn或Thr

Kabat位置H78处Val或Phe。

-如IMGT/Gene数据库中所定义的基于人免疫球蛋白基因重可变3-33等位基因01(IGHV3-33*01)的西妥昔单抗的重链人源化版本，

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAVSGFSLTNYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPVTSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:33)

其中以下Kabat位置处的氨基酸残基为：

Kabat位置H28处Ser或Thr

Kabat位置H30处Thr或Ser

Kabat位置H48处Leu或Val

Kabat位置H49处Gly或Ala

Kabat位置H53处Ser或Asp

Kabat位置H55处Gly或Ser

Kabat位置H57处Lys或Thr

Kabat位置H58处Asp或Tyr

Kabat位置H60处Asn或Ala

Kabat位置H61处Thr或Asp

Kabat位置H62处Pro或Ser

Kabat位置H64处Thr或Lys

Kabat位置H65处Ser或Gly

Kabat位置H78处Val或Leu。

抗体的生产

将编码本发明的抗体的重链和轻链的核酸***表达载体中。可以在相同或不同的表达载体中克隆轻链和重链。编码免疫球蛋白链的DNA区段与表达载体中的控制序列可操作地连接，所述控制序列确保免疫球蛋白多肽的表达。此类控制序列包括信号序列、启动子、增强子和转录终止序列。表达载体通常作为附加体或作为宿主染色体DNA的整合部分在宿主生物体中是可复制的。通常，表达载体将含有选择标记，例如四环素或新霉素，以允许检测用所需的DNA序列转化的那些细胞。

在一个实例中，重链和轻链编码序列两者(例如，编码VH和VL的序列，VH-CH1和VL-CL，或全长重链和全长轻链)包括在一个表达载体中。在另一个实例中，将抗体的重链和轻链的每一个克隆到单个载体中。在后一种情况下，编码重链和轻链的表达载体可以共转染到一个宿主细胞中以表达两条链，其可以在体内或体外组装形成完整的抗体。或者，可以将编码重链的表达载体和编码轻链的表达载体引入不同的宿主细胞中以表达重链和轻链中的每一个，然后可以将其纯化和组装以在体外形成完整的抗体。

在具体的实施方案中，用三种独立的表达载体(例如质粒)共转染宿主细胞，导致所有三条链(即分别为重链HC和两条轻链LC1和LC2)的共同产生并且导致双特异性抗体的分泌。

更特别地，可以有利地以如下分子比例2:1:1(HC:LC1:LC2)使用三种载体。

用于表达本文所述抗体的重组载体通常含有编码与启动子(无论是组成型还是诱导型)可操作地连接的抗体氨基酸序列的核酸。载体可以适用于原核生物，真核生物或两者中的复制和整合。典型的载体含有转录和翻译终止子、起始序列和对调节编码抗体的核酸的表达有用的启动子。载体任选地含有通用表达盒，其含有至少一个独立的终止子序列、允许盒在真核生物和原核生物两者中复制的序列，即穿梭载体，以及用于原核和真核***两者的选择标记。

如本文所述的双特异性抗体可以在原核或真核表达***(例如细菌、酵母、丝状真菌、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本发明的重组抗体不必在真核细胞中糖基化或表达；然而，通常优选在哺乳动物细胞中表达。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例为人胚胎肾细胞系(293细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK细胞)、中国仓鼠卵巢细胞/-或+DHFR(CHO、CHO-S、CHO-DG44、Flp-in CHO细胞)、非洲绿猴肾细胞(VERO细胞)以及人肝细胞(Hep G2细胞)。

哺乳动物组织细胞培养优选表达和产生多肽，因为本领域已经开发了许多能够分泌完整免疫球蛋白的适合的宿主细胞系，并且其包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞，优选骨髓瘤细胞系，或转化的B细胞或杂交瘤。

在最优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体通过使用CHO细胞系，最有利地CHO-S或CHO-DG-44细胞系或其衍生物产生。

这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列，例如复制起点、启动子和增强子，以及必需的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点，多腺苷酸化位点和转录终止子序列。优选的表达控制序列是衍生自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛***瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。

含有感兴趣的多核苷酸序列(例如重链和轻链编码序列和表达控制序列)的载体可以通过众所周知的方法转移到宿主细胞中，这些方法根据细胞宿主的类型而变化。例如，磷酸钙处理或电穿孔可以用于其他细胞宿主。(通常参见Sambrook et al.,MolecularCloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press,2nd ed.,1989)。当将重链和轻链克隆到单独的表达载体上时，共转染载体以获得完整免疫球蛋白的表达和装配。

用载体转化或转染宿主细胞(例如，通过化学转染或电穿孔方法)并在常规营养培养基中培养(或适当修饰)以诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因。

抗体的表达可以是瞬时的或稳定的。

优选地，通过稳定表达的方法生产双特异性抗体，其中用编码双特异性抗体(例如BiXAb-3486,BiXAb-3489,BiXAb-3732SS和BiXAb-E06528)的所有多肽链的DNA稳定转染的细胞系能够持续表达，这使得能够制备治疗剂。例如，CHO细胞系中的稳定表达是特别有利的。

一旦得到表达，可以对本发明的全抗体、其二聚体、单个轻链和重链或其他免疫球蛋白形式进行进一步分离或纯化，以获得用于进一步测定和应用基本上均质的制剂。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。例如，适合的纯化规程可以包括在免疫亲和或离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、高效液相色谱(HPLC)、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、硫酸铵沉淀和凝胶过滤(通常参见Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,N.Y.,1982))。对于药物用途，优选至少约90至95％均质性，最优选98至99％或更高的均质性的基本上纯的免疫球蛋白。

体外生产允许放大以提供大量的本发明的所需的双特异性抗体。此类方法可以采用均质悬浮培养(例如，在气升式反应器中或在连续搅拌反应器中)，或固定化或包埋的细胞培养(例如，在中空纤维、微胶囊、琼脂糖微珠或陶瓷盒中)。

治疗用途：

已显示本发明的双特异性抗体诱导肿瘤生长抑制。

本发明的双特异性抗体用作药物，特别是用于治疗癌症。

如在本文中所使用的，术语“癌症”包括任何癌症，特别是胰腺癌和任何其他以EGFR或HER2表达或过表达为特征的癌症，特别是以EGFR和HER2两者的共表达为特征的那些癌症。

在一些实施方案中，癌症包含具有野生型KRAS基因的细胞。

癌症的实例是实体瘤，例如胰腺癌、头颈癌，包括鳞状细胞癌、结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌。

因此，描述了通过向需要此类治疗的所述患者施用根据本发明的抗体治疗罹患癌症的患者的方法。因此，本发明的另一个方面是根据本发明的双特异性抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

本发明一个方面是一种药物组合物，所述药物组合物包含根据本发明的抗体。本发明的另一个方面是根据本发明的抗体在制备药物组合物中的用途。本发明的进一步的方面是一种用于制备药物组合物的方法，所述药物组合物包含根据本发明的抗体。

在另一个方面中，本发明提供了组合物(例如，药物组合物)，所述组合物包含与药物载体一起制剂的如本文所定义的抗体。

如在本文中所使用的，“药物载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适于静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。

可以通过本领域已知的各种方法施用本发明的组合物。施用途径和/或方式将根据所需的结果而改变。

为了通过某些施用的途径使用本发明的双特异性抗体，可以需要使用材料对本发明的双特异性抗体进行包覆或与本发明的双特异性抗体共同施用以防止其失活。例如，可以在适当的载体(例如，脂质体或稀释剂)中向受试者施用本发明的双特异性抗体。药学上可接受的稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。药物载体包括用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌水溶液或分散液和无菌粉末。用于药物活性物质的此类介质和药剂的使用是本领域已知的。

这些组合物还可以含有佐剂如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过灭菌规程和通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，尼泊金、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)两者确保阻止微生物的存在。还可以需要在组合物中包含等渗剂(例如氯化钠)。此外，可以通过包含延迟吸收的药剂延长注射药物形式的吸收。

可以改变本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平以获得针对特定患者、组分和施用方式达到所需的治疗应答且对患者不具有毒性的有效的活性成分的量。

所选择的剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括所采用的本发明的特定组合物的活性，施用的途径，施用的时间，治疗的持续时间，与所采用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康情况和既往病史以及医疗领域熟知的类似因素。例如，可以每周3次至每月1次以0.2-20mg/kg的剂量施用本发明的双特异性抗体。

因此，通过参考下述实施例将更易于理解通常如上文所述的本发明，这些实施例是以举例说明方式提供的并且并非旨在限制本发明。这些实施例不旨在表示以下实验是实施的全部或唯一的实验。

实施例

实施例1：本发明的双特异性抗体BiXAb-3486、BiXAb-3489和BiXAb-3732SS的制备

基因合成

在进行用于哺乳动物表达的密码子优化后，使用GeneScript程序将抗HER2(曲妥珠单抗，克隆humAb4D5-8)(Carter P.,Presta L.,Gorman C.M.,Ridgway J.B.,HennerD.,Wong W.L.,Rowland A.M.,Kotts C.,Carver M.E.,Shepard H.M.(1992)Humanizationof an anti-p185HER2antibody for human cancer therapy.Proc Natl Acad Sci U SA.15,4285-4289)和抗EGFR(西妥昔单抗)(Humblet Y.(2004).Cetuximab:anIgG1monoclonal antibody for the treatment of epidermal growth factor receptorexpressing tumors.Expert Opin Pharmacother 5:1621–1633)的氨基酸序列用于设计DNA序列。对于重链，通过GeneScript合成编码信号肽、Fab1的可变区和恒定CH1域、随后的伪铰链接头以及Fab2的可变区和恒定CH1域的DNA，其具有用于限制酶消化的旁侧序列。对于轻链，通过GeneScript合成编码信号肽以及可变和恒定Kappa区的DNA。

使用PfuTurbo热启动实施PCT反应以扩增***物，然后对于重链和轻链分别用NotI+ApaI和NotI+HindIII酶切所述***物。将经双重酶切的重链片段与经NotI+ApaI处理的pcDNA3.1表达载体(Invitrogen)连接，该表达载体中已***人IgG1CH1+铰链+CH2+CH3域。将经双重酶切的轻链片段与经NotI+HindIII处理的pcDNA3.1表达载体(Invitrogen)连接。通过双链DNA测序对质粒DNA进行验证。

变体的表达和纯化

使用瞬时基因表达在适于悬浮液中的无血清培养基(CHO SFM-II培养基，来自Life Technologies^TM)中的CHO-S细胞中通过以2:1:1＝HC:LC1:LC2(1条连续重链(HC)和2条轻链(LC))的分子比例将在单独的载体上编码的3个基因共转染生产本发明的双特异性抗体(也称为“BiXAb”抗体)。通常地，对于50mL培养基规模表达测试，将共计50μg质粒DNA(25μg重链1，12.5μg的曲妥珠单抗(抗HER2)轻链和12.5μg的西妥昔单抗(抗EGFR)轻链)在1.5mL Eppendorf管中混合，加入1mL的含有25μL的3mg/mL PEI转染试剂(Polyplus)pH7.0的CHO SFM培养基，在室温下温育20min。将DNA-PEI混合物加载在125mL摇瓶中的49mL 1-2x10⁶个细胞/mL的Life Technologies’Invitrogen FreeStyle^TMCHO-S细胞中。将细胞再振荡6天。通过将细胞3,000rpm离心15min收集上清液。使用FortéBio的蛋白质A生物传感器(Systems)测定上清液中BiXAb的表达滴度。然后，使用MabSelect SuRe(GEHealthcare Life Sciences)在蛋白质A亲和介质上纯化双特异性单克隆抗体(BiXAb)。在使用1M TRIS中和的情况下使用0.1M甘氨酸pH 3.5从蛋白质A上洗脱抗体。对在Dulbecco的PBS(Lonza BE17-512Q)中的经纯化的抗体进行无菌过滤(0.2μM无菌滤器，来自TechnoPlastic Products AG)，并通过使用Eppendorf在280nm下的OD读数测定抗体的终浓度。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

通过使用来自BioRad的Experion^TM自动电泳***实施经纯化的BiXAb-3486、BiXAb-3489和BiXAb-3732SS抗体的SDS-PAGE分析。在缓冲液中存在十二烷基硫酸钠(SDS)的情况下，抗体在凝胶中迁移的速率主要取决于其尺寸，从而能够测定分子量。

SDS-PAGE图谱显示在图2A和2B中。图2A中的泳道1和2分别显示对于BiXAb-3732SS和BiXAb-3489在非还原(左)和还原(右)条件下获得的概况。图2B显示对于BiXAb-3486(还原和非还原)的SDS-PAGE概况。

在非还原条件下，抗体的四级结构得以保持，并且所观察到的分子量应表示不同重链和轻链的分子量之和。

本发明的双特异性抗体形式由6条链组成：2条重链和4条轻链。不考虑翻译后的修饰(PTM)，例如N-糖基化，BiXAb-3486、BiXAb-3489和BiXAb-3732SS的理论分子量分别为245.50、245.44和245.451kDa。使用已知分子量的标准品校准非还原凝胶(图2A和2B)。在泳道1和2(图2A)和泳道1(图2B)中获得的概况在260kDa标准分子量处和以上显示出主要的宽条带，其与没有PTM的245kDa的计算分子量一致。BiXAb-3489、BiXAb-3732SS和BiXAb-3486在其重链中具有四个N-糖基化位点，两个在Fc区(每条重链上有一个)中(如在所有常规单克隆抗体N297处所发现的)，以及两个在每个Fab中(在西妥昔单抗的可变区中的每条重链上N88处有一个)。

在还原条件下，还原剂二硫苏糖醇(DTT)通过还原二硫键进一步使BiXAb变性并破坏BiXAb分子的四级结构。

6条多肽链根据其相对分子量在凝胶中单独迁移；具有完全相同分子量的两条重链和来自抗EGFR和抗HER2Fab域的2对轻链。

在还原的凝胶中获得的概况显示存在2组主要条带，基于分子量标准品的迁移率，一条大约75kDa而第二条大约25kDa。如以上部分中所述，每条重链具有2个N-糖基化位点，其解释了条带的宽度、糖基化蛋白质的典型标记及其表观分子量，所述表观分子量高于计算的质量。

尽管计算的抗EGFR(23.425kDa)和抗HER2(23.443kDa)轻链的分子量相似，但它们允许在凝胶上分离，这可能是由于每条轻链的流体动力学特性的差异。

通过在CHO细胞中瞬时表达，所有分子BiXAb-3486、BiXAb-3489和BiXAb-3732SS都具有良好的表达水平(约200mg/L)。该表达的水平与常规单克隆抗体(如亲本抗体之一，抗EGFR)所见的表达水平相当。

总之，通过SDS-PAGE分析获得的BiXAb-3486、BiXAb-3489和BiXAb-3732SS的概况非常相似，并且与计算的理论分子量一致。分子量的差异可能是由于PTM的存在，并特别是在两条重链中的4个N-糖基化位点的存在。

尺寸排阻色谱分析

在经工程化改造的蛋白质分子中经常会观察到蛋白质聚集。我们实施了尺寸排阻色谱(SEC)以测定一步亲和纯化BiXAb-3489和BiXAb-3732SS制备的高分子量物质含量。我们采用SEC-s3000(300x 7.8mm)柱(BioSep)和Aktapurifier 10***(GE Healthcare)；使用PBS缓冲液pH 7.4，流速为1mL/min进行测定。

图3A和3B中显示的SEC色谱图表明，两个色谱图中的主峰对应于分别占总样品的96.4％和97.4％的单体BiXAb-3489和BiXAb-3732SS的预期大小。此外，对于BiXAb-3489和BiXAb-3732SS，观察到对应于较高分子量物质的小峰(可能是二聚体)；该峰分别占总样品的3.6％和2.6％。因此，我们得出结论，较高分子量物质的含量百分比较低，并与CHO表达***中生产的常规单克隆抗体相近。单体峰的窄且对称的形状表明BiXAb-3489和BiXAb-3732SS两者都正确组装并由单一物质代表。

实施例2：本发明的双特异性抗体BiXAb-E06528的制备

基因合成

在进行用于哺乳动物表达的密码子优化后，使用GeneScript程序将抗EGFR(西妥昔单抗)和抗HER2(曲妥珠单抗)的氨基酸序列用于设计DNA序列。这些抗体称为“亲本”抗EGFR和“亲本”抗HER2mAb。

重链的DNA构建体以如下方式设计：信号肽，其后是由可变区组成的序列，其后是Fab1的恒定CH1域(抗HER2)，其后是AP接头，其后是可变区，其后是Fab2的恒定CH1域(抗EGFR)，其中在Kabat位置192处引入Thr至Glu的突变；在重链DNA构建体的两端引入用于限制性酶消化的旁侧序列。轻链的DNA构建体以如下方式设计：信号肽，其后是可变区，其后是恒定Kappa区。对于抗EGFR轻链，在Kabat位置137处的突变(Asn至Lys)和114处的突变(Ser至Ala)引入恒定Kappa域中。所有DNA构建体均由Gene Art合成。

使用PfuTurbo热启动实施PCR反应以扩增***物，然后对于重链和轻链分别用NotI和ApaI以及NotI和HindIII酶切所述***物。将经双重酶切的重链片段与经NotI和ApaI处理的pcDNA3.1表达载体(Invitrogen)连接，该表达载体中已***人IgG1铰链以及其后的CH2-CH3域。将经双重酶切的轻链片段与经NotI和HindIII处理的pcDNA3.1表达载体(Invitrogen)连接。通过双链DNA测序对质粒DNA进行验证。

表达和纯化

采用瞬时基因表达在适于悬浮液中无血清培养基(CHO SFM-II培养基，LifeTechnologies^TM)中的CHO-S细胞中通过以2:1:1＝HC:LC1:LC2分子比例(1条连续重链(HC)和2条轻链(LC))将在单独的载体上编码的3个基因共转染生产双特异性抗体BiXAb-E06528。通常地，对于50mL规模的表达，将共计50μg的质粒DNA(25μg重链，12.5μg的抗HER2轻链和12.5μg的抗EGFR轻链)在1.5mL Eppendorf管中混合，然后加入1mL的含有25μL的3mg/mL PEI转染试剂(Polyplus)pH7.0的CHO SFM培养基，并在室温下温育反应20min。随后将DNA-PEI混合物加入125mL摇瓶中的49mL 1-2x 10⁶个细胞/mL的Life Technologies’Invitrogen FreeStyle^TMCHO-S细胞中。将细胞振荡6天。通过3,000rpm离心15min收集上清液。使用FortéBio的蛋白质A生物传感器(Systems)测定上清液中BiXAb-E06528的表达滴度。然后在蛋白质A亲和树脂(MabSelect SuRe,GE Healthcare Life Sciences)上纯化BiXAb-E06528。使用0.1M甘氨酸pH 3.5从蛋白质A上洗脱抗体，并通过1M TRIS中和洗脱物。对在Dulbecco的PBS(Lonza)中的经纯化的抗体进行无菌过滤(0.2μM无菌滤器，Techno Plastic Products AG)，并通过在280nm下读取的光密度(OD)(Eppendorf)测定终浓度。

BiXAab-E06528通常在瞬时CHO表达中显示出良好的表达滴度(>180mg/升)。该表达水平与在常规单克隆抗体中所见的表达水平相当。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

为评估经纯化的BiXAb-E06528的质量，我们实施了SDS-PAGE。在电泳缓冲液中存在十二烷基硫酸钠(SDS)的情况下，抗体在凝胶中迁移的速率主要取决于其尺寸，从而能够测定分子量。在非还原条件下和在还原条件下实施该测定；后者允许二硫键的破坏，并因此允许单个多肽链(轻链和重链)的可视化。

SDS-PAGE数据呈现于图2C。在非还原条件下，抗体的四级结构得以保持，并且所观察到的分子量应表示不同重链和轻链的分子量之和。本发明的双特异性抗体(BiXAb-E06528)由6条链组成：两条重链和四条轻链。BiXAb-E06528的理论分子量为245.139kDa，其没有考虑翻译后修饰(PTM)，例如在Fc的天冬酰胺297处的N-糖基化。使用已知分子量的标准品的混合物对凝胶进行校准。非还原数据显示出在250kDa分子量标准品附近的主要条带，其与计算得到的分子量以及在Fc域中值置297处的两个天冬酰胺的预期的糖基化一致。在还原条件下，二硫苏糖醇(DTT)通过还原二硫键和破坏四级结构进一步使BiXAb-E06528变性，并因此六条多肽链将根据其分子量在凝胶中单独迁移。BiXAb-E06528的两条相同的重链作为单一条带共迁移，两对轻链由于其几乎相同的分子量而作为第二个条带共迁移。因此，根据分子量标准品的迁移率，数据显示出在约75kDa和25kDa处的主要的两组条带。每条重链在天冬酰胺297处具有一个N-糖基化位点，其解释了较高分子量的宽度以及观察到的分子量略高于计算得到的分子量(75.701kDa)；这种变宽是糖基化蛋白质的典型特征。尽管抗HER2(23.443kDa)和抗EGFR(23.425kDa)的轻链的计算分子量相近，它们允许在凝胶上分离，这可能是由于每条轻链的流体动力学特性的差异。

总而言之，在非还原和还原条件下，BiXAb-E06528的SDS-PAGE均显示出预期的概况，并且当考虑在重链中N-糖基化位点的存在时，其与计算得到的理论分子量一致。

尺寸排阻色谱分析

在经工程化改造的蛋白质分子中经常会观察到蛋白质聚集。我们实施了分析性尺寸排阻色谱(SEC)以测定一步亲和纯化BiXAb-E06528制备(参见变体的表达和纯化)的高分子量物质含量。我们采用SEC-s3000(300x 7.8mm)柱(BioSep)和Aktapurifier 10***(GEHealthcare)；使用PBS缓冲液pH 7.4，流速为1mL/min进行测定。

图3C中所示的SEC色谱图显示了与单体BiXAb-E06528的预期尺寸对应的主峰；该峰占样品总量的99.9％。因此，BiXAb-E06528没有显示聚集体或更高分子量的物质，并且可以在单步亲和色谱后作为均质抗体生产。单体峰的窄且对称的形状表明BiXAb-E06528得以正确组装并由单一物质代表。

实施例3：通过差示扫描量热法进行表征

使用差示扫描量热法(DSC)对BiXAb-3489、亲本抗HER2mAb和亲本抗EGFR mAb的热稳定性进行比较。使用MicrocalTM VP-毛细管DSC***(Malvern Instruments)实施差示扫描量热法实验。

将所有样品离心(20,000x g,5min,4℃)，并且在进行DSC分析之前使用采用IgG分析程序的Nanodrop ND-1000分光光度计(Thermo Scientific)对其蛋白质含量进行定量。为了进行测定，所有样品稀释于PBS中使终浓度为1mg/mL。

预平衡时间为3min，并且将所得到的热分析图在20至110℃之间、扫描速率60℃/h、过滤期25秒和介质反馈下采集。在样品分析之前，测量5次缓冲液/缓冲液扫描以稳定仪器，在每次蛋白质/缓冲液扫描之间实施缓冲液/缓冲液扫描。将数据拟合到非-2-态解折叠模型，通过扣除基线对转变前和转变后进行调整。

图4中所示的DSC曲线(覆盖50至100℃范围)显示了单个Fv区可以导致不同Fab解折叠概况的方式；该实验还表明Fv区决定了Fab的表观稳定性。抗HER2mAb的DSC概况显示出两个转变：具有27Kcal/摩尔/℃的Cp max和70.4℃的Tm1的小峰，其对应于CH2域的解折叠，以及具有152Kcal/摩尔/℃的Cp max和80.4℃的Tm2的大峰，其对应于CH3和Fab域两者的解折叠。抗EGFR mAb的DSC概况显示出两个转变：具有95Kcal/摩尔/℃的Cp max和71.9℃的Tm1的大峰，其对应于CH2和Fab域两者的解折叠，以及具有22Kcal/摩尔/℃的Cp max和82.4℃的Tm2的小峰，其对应于CH3域的解折叠。

BiXAb-3489的DSC概况也显示出了具有两个大峰的两个转变。第一个峰具有70Kcal/摩尔/℃的Cp max和71.7℃的Tm1，并且对应于抗EGFR mAb的CH2和Fab域的解折叠；第二个峰具有161Kcal/摩尔/℃的Cp max和80.9℃的Tm2，并且对应于抗HER2mAb的CH3和Fab域的解折叠。因此，BiXAb-3489的DSC概况类似于两个亲本mAb的两个DSC概况的叠加，并且说明了BiXAb-3489的极好的装配和稳定性。BiXAb-3489的T_起始(60.0℃)与亲本mAb相似(抗HER2T_起始＝63.1℃和抗EGFR T_起始＝61.5℃)，表明BiXAb-3489与亲本抗体具有相似的稳定性特性。

定义：

Tm或变性/熔化温度是解折叠和折叠物质的浓度相等的点，并且是解折叠转变的中点。作为一个参数，其描述了蛋白质对热变性的敏感性，并因此其与蛋白质的稳定性相关。Tm越高，蛋白质越稳定。

T_起始是解折叠转变开始时的温度。该参数的值通常比Tm低5至10℃。其也是描述蛋白质稳定性，但与对热变性的抗性相关的参数。

实施例4：无细胞结合特性

双重抗原结合ELISA测定

使用100μL由1x PBS pH7.4稀释制备的2μg/mL的重组人Fc-标记(tagged)的HER2(Bio-techne)在4℃下包被Maxisorp平板过夜。用1x PBST清洗平板5次，然后用1x PBS中的1％BSA在室温下封闭2hr(200μL/孔)。用1x PBST清洗平板5次。在BiXAb-3486和BiXAb-3489(起始2μg/mL)的1x PBS中制备八点三倍稀释系列，并在每个测定孔加入100μL(每个稀释步骤)。将平板在室温下温育1hr，并随后用1x PBST清洗平板5次。加入1x PBS中100μL/孔的1μg/mL生物素化的人EGFR(AcroBiosystems)，并将平板在室温下温育1hr。用1x PBST清洗5次后，加入用1x PBS稀释制备的100μL/孔0.1μg/mL的链霉抗生物素蛋白缀合的HRP(Bio-techne)。将平板在室温下温育1hr。用1x PBST清洗5次后，加入1x PBS中的TMB底物(100μL/孔)用于比色读数，并将平板在室温下温育15min用于显色。采用Victor2酶标仪(microplate reader)(Perkin Elmer)在650nm下收集测定数据。

在双ELISA形式中BiXAb-3486和BiXAb-3489显示出重叠的剂量依赖性结合曲线，表明其具有正确组装的抗HER2和抗EGFR Fab域(图5)。这表明BiXAb-3486和BiXAb-3489两者均是能够分别以100ng/mL和106ng/mL的EC50同时结合HER2和EGFR的双特异性抗体。如所预期的，在该双ELISA形式中亲本抗HER2显示无结合。

实施例5：通过SPR确定结合参数

在T200GxP仪器(Biacore，GE Healthcare)上进行SPR分光术。使用HBS-EP+pH7.4(由GE Healthcare提供的10x HBS-EP+稀释)作为运行缓冲液。根据制造商的建议，在25℃下进行测量。所有实验均以30μL/min的流速进行。由于在曲妥珠单抗的情况下蛋白质A捕获可以导致配体结合亲和力受损，因此选择人Fab特异性捕获。因此通过使用胺偶联试剂盒的EDC-NHS化学根据制造商的说明书(Rimmob～10 000RU)使用人Fab捕获试剂盒(GEHealthcare)采用CM5-S-系列传感器芯片(GE Healthcare)用于抗体捕获。流动池1(Fc1)被激活并失活以用作空白扣除的参照。通过用推荐的再生缓冲液(人Fab捕获试剂盒中提供的10mM甘氨酸-HCl pH 2.1)脉冲45秒，在测量循环之间再生表面。缓冲液注射用于双重参照。

用于确定BiXAb-3489和BiXAb-3732SS以及其亲本抗EGFR和抗HER2mAbs，与hEGFR(EGR-H5222,Acro Biosystems)和hHER2(HE2-H5225,Acro Biosystems)的结合参数，通过注射运行缓冲液中适当稀释的每个相应分子180秒，其后注射hEGFR(20nM)或hHER2(20nM)180秒，其后是300s解离期捕获约100RU分析物(mAb或BiXAb)。在使用Biocore T200评估软件实施双重参照之后，通过用BiacoreEval 3.0软件拟合所得的传感图来确定亲和常数。将1:1结合模型与实验确定的RMax一起用作固定参数，以确定结合速率常数(ka)，解离速率常数(kd)和平衡解离常数(KD)。

通过使用1:1相互作用模型拟合单一浓度曲线，确定抗EGFR和抗HER2亲本mAb以及BiXAb-3489和BiXAb-3732SS与关联配体EGFR和HER2的相互作用的亲和力常数。通常观察到在低纳摩尔范围内非常相似的KD值(表3)。在测量高亲和力时，预计会有两倍的偏差，因此不应将高达50％的差异视为相关。可以想象，BiXAb-3732SS中的抗HER2Fab对于“反向”系列表现出略快的kd；尽管如此，这与内部Fab域的位阻不一致，因为在那种情况下kon会减少。

总而言之，抗HER2和抗EGFR Fab域的特性在BiXAb-3489和BiXAb-3732SS两者中非常相似，与它们是否位于Fc域的近端或远端无关，并且与相应的亲本抗体(抗EGFR和抗HER2)相似。因此，BiXAb分子中的关联抗原，EGFR和HER2的Fab结合不受位阻。

表3通过SPR分析确定的结合参数

抗体	Ka 10<sup>5</sup>[M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>]	Kd 10<sup>-4</sup>[s<sup>-1</sup>]	KD[nM]
				抗EGFR(亲本)	5.40	16.61	3.08
BiXAb-3489	5.97	14.17	2.37
				BiXAb-3732SS	8.45	16.84	1.99
抗HER2(亲本)	2.02	3.53	1.75
				BiXAb-3489	1.88	2.95	1.57
BiXAb-3732SS	1.42	7.76	5.48

实施例6：用未分级的非预活化单个核细胞(MNC)的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)

在补充由100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％胎牛血清的RPMI1640-Glutamax-I培养基中培养BxPC3胰腺癌细胞、A431皮肤鳞状细胞癌和SKOV-3卵巢癌细胞。

采用以下规程制备MNC。用柠檬酸盐对新抽取的外周血进行抗凝处理。随后，用5ml的Ficoll-Paque PLUS溶液对6ml抗凝全血分层。将样品在室温下以2,500rpm离心20min，随后不进行离心破碎。从血浆/Ficoll界面处收集MNC。在PBS中1:10对MNC细胞悬液进行稀释，并在室温下1,800rpm离心5分钟。除去上清液，通过向细胞悬液中加入45ml冰冷的蒸馏水溶解红细胞30秒，随后加入5ml 10x PBS。将细胞在室温下1,800rpm离心5min，并用1x PBS清洗3次以除去血小板。最后，将细胞重悬于5ml细胞培养基中。在ADCC测定中，将细胞数目调整至达到40:1＝效应细胞：肿瘤细胞的比例，当基于MNC中NK细胞的分级计算时，其对应于8:1＝NK细胞：肿瘤细胞的比例。

对于ADCC⁵¹铬释放测定，在37℃和5％CO₂条件下，将1x10⁶个靶细胞(BxPC-3、A541、A431)在含100μCi⁵¹铬的200μl PBS中温育2小时。温育2小时后，用7ml的培养基清洗细胞3次，并最终以0.1x 10⁶个细胞/ml的浓度重悬。在存在抗体的情况下，将靶细胞(5,000个细胞/孔)和MNC在96孔微量平板(200μl测定体积)中在37℃和5％CO₂条件下温育4小时。为测定最大靶细胞溶解(＝最大cpm)，加入Triton X-100。为测定基础⁵¹铬释放(＝基础cpm)，不再对靶细胞进行进一步处理。在温育4hr后，将微量滴定板在2000rpm下离心5min，并将25μl上清液与125μl Optiphase Supermix(Perkin Elmer)混合并在振荡培养箱中温育1min。在MicroBeta TriLux(Perkin Elmer)beta计数器中测定样品。使用下述公式计算靶细胞的溶解：

％溶解＝(实验cpm-基础cpm)/(最大cpm-基础cpm)x 100。

一式三份进行所有测量。采用非预活化的MNC作为效应细胞实施ADCC测定。

在图6A中，呈现了在BxPC-3细胞上用BiXAb-3486、BiXAb-3489、BiXAb-3732SS和BiXAb-E06528进行的ADCC测定。对BiXAb-E06528(EC50＝1.8nM)和BiXAb-3489(EC50＝2.2nM)观察到有效的细胞毒性，其与两个亲本抗体，抗EGFR+抗HER2的组合(EC50＝1.5nM)相似；所有三个抗体组的最大溶解几乎相同～20％。BiXAb-3486表现出相似的杀伤的效力(EC50＝2.0nM)，虽然大大降低的总溶解率<10％。BiXAb-3732SS几乎没有表现出溶解，与亲本抗EGFR抗体相似。亲本抗EGFR抗体表现出高效力(EC50＝0.8nM)，然而相对于BiXAb-E06528、BiXAb-3489和两种亲本抗体，抗EGFR+抗HER2的组合，总溶解减少(15％)。类似地，BiXAb-E06528(EC50＝0.12nM)和BiXAb-3489(EC50＝0.12nM)显示出与亲本抗EGFR+抗HER2的组合(EC50＝0.09nM)和单独的抗EGFR(EC50＝0.05nM)相似的针对A431细胞的最大溶解以及非常高的效力(图6B)。BiXAb-3486和BiXAb-3732SS再次证实了降低的效力(EC50＝0.26nM和EC50＝0.24nM)以及减少的最大溶解。SKOV-3细胞上的ADCC证实BiXAb-E06528(EC50＝0.87nM)和BiXAb-3489(EC50＝0.87nM)以及亲本抗EGFR+抗HER2的组合(EC50＝0.83nM)和抗HER2(EC50＝1.2nM)有效地杀死癌细胞(图6C)，然而，相对于组合或单独的抗HER2，两种BiXAb分子的最大溶解略微降低。BiXAb-3486和BiXAb-3732SS表现出略微降低的细胞毒性效力(EC50＝1.2nM和EC50＝2.1nM)和最大溶解。总而言之，所有BiXAb均显示出针对几种不同类型的EGFR⁺/HER2⁺癌细胞的细胞毒性活性，并且BiXAb-E06528和BiXAb-3489表现出针对这些癌细胞系的最高的细胞毒性效力和最大溶解。

实施例7：对癌细胞系的生存力的影响的评估

将NCI-N87人胃癌和CAL27人舌鳞状细胞癌细胞系在37℃下在其培养基(分别为RPMI1640+10％FBS和DMEM+10％FBS)中在潮湿的环境(5％CO2，95％空气)中生长为单细胞层。对于实验用途，通过用胰蛋白酶-维尔烯(versene)处理5分钟将肿瘤细胞从培养瓶中分离，并通过加入完全培养基中和。根据供应商的说明在血细胞计数器(KOVA载玻片)中计数细胞，并通过0.25％台盼蓝排除法评估其生存力。

为了评估抗体对癌细胞系生存力的影响，在96孔平底微量滴定平板中使用最佳细胞系密度(111000个细胞/mL)。将其在37℃下温育24小时，然后在补充有10％FBS的无药物RPMI 1640培养基中处理。接种量为90μl。在一个独立实验中一式三份对化合物测试。

在处理开始时，将10μL体积的测试和对照物质稀释液加入孔中以达到以下终浓度：

-对于测试和对照物质，浓度等于190；100；50；25和10μg/mL。

-对于抗HER2+抗EGFR抗体的组合，抗EGFR和抗HER2两者的浓度均等于140；100；50；25和10μg/mL。

一式三份将细胞在含有测试物质的100μL终体积的培养基中在37℃，5％CO2下温育96小时。

在化合物温育96小时后，根据制造商的说明通过CellTiter-Glo发光测定试剂盒(Promega)揭示了化合物对癌细胞生存力的影响。简而言之，制备并在每个孔中加入100μL的CellTiter Glo试剂。然后摇动平板以诱导细胞溶解，之后记录发光。

生存的剂量反应抑制(IC)表示如下：

IC＝100x(OD_{药物暴露的孔}/OD_{载体暴露的孔})

OD值是3次实验测量的平均值。

BiXAb-E06528和BiXAb-3489有效抑制NCI-N87的生存力，IC50分别为102.6μg/mL和50.2μg/mL。抗EGFR+抗HER2抗体的组合未达到50％生存力抑制水平，而估计IC50>140μg/mL。亲本抗EGFR或抗HER2的单独制剂在测试的浓度范围内具有最小活性，并且也未达到50％生存力抑制水平；因此，估计两者的IC50均>190μg/mL。

BiXAb-E06528和BiXAb-3489也有效地抑制CAL27，所述BiXAb-E06528和BiXAb-3489在最低浓度下抑制其生存率～60％，因此估计两种分子的IC50<10μg/mL。两种亲本抗体(抗EGFR+抗HER2)的组合抑制生存力，IC50＝10.5μg/mL。亲本抗EGFR mAb的单独制剂表现出低得多的抑制的程度，IC50＝93.1μg/mL；亲本抗HER2mAb的单独制剂在测试的浓度范围内未显示出抑制作用。

总而言之，BiXAb-E06528和BiXAb-3489两者均显示出对胃和舌鳞状细胞癌的生存力的有效抑制，这比两种亲本抗体中的任一种或其组合更有效。

实施例8：本发明的抗体的生物学特性的评估

已经在携带胰腺肿瘤BxPC-3的小鼠中评估了本发明的原始双特异性四价抗体，其以原始方式同时靶向EGFR和HER2受体，并与抗EGFR和抗HER2亲本抗体的组合进行了比较。

本发明的双特异性四价抗体BiXAb-3486和BiXAb-3489用于测定。

治疗时间表

BxPC-3细胞系获得自ATCC(Rockville，MD)并在含有10％胎牛血清、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI 1640中培养。

所有体内实验实施均符合法国法规和认可机构(accredited establishment)中实验动物研究的伦理指南。

将BxPC-3(3.5×10⁶个)细胞皮下注射到购自Harlan(Le Malcourlet，France)的六周龄裸雌性无胸腺小鼠的右侧腹部。

然后将携带可检测的生长肿瘤的肿瘤携带者分布在各组中。在肿瘤达到100mm³的预先定义的体积后，根据以下时间表通过腹膜内(ip)注射治疗动物。

·对照小鼠从动物随机分配并编入6个分组当天(第0天)起接受无关抗体，一周两次，直至第28天。

·C+T小鼠接受抗EGFR+抗HER2抗体，从第0天开始每种2mg/kg，一周两次，直至第28天。

·BiXAb小鼠根据以下方案接受双特异性抗体：

-BiXAb-3486，从第0天开始每种2mg/kg，一周两次，直至第28天

-BiXAb-3486，从第0天开始每种10mg/kg，一周两次，直至第28天

-BiXAb-3489，从第0天开始每种2mg/kg，一周两次，直至第28天

-BiXAb-3489，从第0天开始每种10mg/kg，一周两次，直至第28天

用于评估抗肿瘤活性的标准

作为功效的生物标记的安全性(体重、生存、临床症状和行为)和肿瘤生长作为随访的主要端点，并且在整个实验过程中一周两次对所有小鼠记录。图表和分析由NewlabOncology Software实施。

肿瘤体积

用卡尺测量肿瘤尺寸，并通过公式D1×D2×D3/2计算体积，并估计各种端点以评估治疗的效果。

肿瘤生长抑制

定义为治疗组与对照组的中值肿瘤体积之比的肿瘤生长抑制(T/C％)计算为T/C％＝[(第X天的治疗组的中值肿瘤体积)/(第X天的对照组的中值肿瘤体积)]x 100。最佳值是反映实现的最大肿瘤生长抑制的最小T/C％比率。

根据国家癌症研究所标准，T/C％比率的有效标准(Bissery MC and Chabot GGHistory and new development of screening and evaluation methods of anticancerdrugs used in vivo and in vitro.1991.Bull Cancer 78:587–602)为<42％。T/C<10％认为是非常高的活性，值得进行临床研究(B.A.Teicher.Tumor models in cancerresearch.Science&Business media 2010)。

在该实验中，从第1天直至第49天，在整个实验中评估T/C。

ΔT/ΔC

使用从治疗组和对照组中肿瘤体积的基线的变化来计算治疗组(ΔT)和对照组(ΔC)的中值数。T/C(％)是任何选定日期的中值数的比率。

当ΔT/ΔC值为负时，其表示肿瘤的消退。

部分消退，完全消退和无肿瘤幸存者

无论评估当天如何，部分消退(PR)定义为肿瘤体积减少≥50％。无论评估当天如何，完全消退(CR)定义为肿瘤体积减少至触诊极限(T＝30mm³)以下。在研究结束时(第105天)，确定无肿瘤幸存者(TFS)的数量，所述无肿瘤幸存者对应于没有任何可触知肿瘤的小鼠(Vrignaud P,Sémiond D,Lejeune P,Bouchard H,Calvet L,Combeau C,Riou JF,A,Lavelle F,Bissery MC.Preclinical antitumor activity ofcabazitaxel,a semisynthetic taxane active in taxane-resistant tumors.ClinCancer Res.2013；19(11):2973-83)。

对数细胞杀灭(LCK)

使用公式(T-C)/(3.32xTd)计算总对数细胞杀灭。在该公式中，肿瘤生长延迟(T-C)定义为在达到预定体积(750-1,000mm³)的中值时间(天)中T和C组中的肿瘤之间的差异。

在对照组中估计肿瘤倍增时间(Td)，其中肿瘤体积的对数作为天数的函数(在指数生长期，即100至1000mm³范围内)遵循具有斜率“a”的线性模型，如Td＝log2/a。

使用这些标准，抗肿瘤活性定义为对数细胞杀灭值>0.7。

南方研究所(Southern Research Institute)(Birmingham,AL,USA)评分用于根据对数细胞杀灭值对抗肿瘤活性进行分类，如下所示：<0.7＝-(无活性)；0.7-1.2＝+；1.3-1.9＝++；2.0-2.8＝+++；>2.8＝++++(高活性)(Schabel FM,Griswold DP,Laster WR,Corbett TH,Lloyd HH.Quantitative evaluation of anticancer agent activity inexperimental animals.Pharmacol.Ther 1977；1:411–35)。

还根据以下公式评估净LCK：n-LCK＝[(T-C)-治疗期的持续时间]/(3.32xTd)。如果n-LCK-净值为阳性，则治疗结束时存在的细胞数少于开始时的细胞数。另一方面，如果该值为阴性，则肿瘤在治疗下得以生长。

中值生存和治疗获益

结果也通过经适应性修改的Kaplan-Meier生存曲线，使用肿瘤达到2000mm³的确定体积所花费的时间表示。中值延迟定义为50％的小鼠肿瘤达到确定的体积的时间。

Mann-Whitney U检验

Mann-Whitney检验是一种非参数检验，其允许两组或条件或治疗进行比较，而不假设数值是正态分布的。在医学中，它用于确定两种药物的效果以及它们是否相同。已使用Newlab Oncology(NewLab,11rue d'Amsterdam54500FRANCE)对Mann-Whitney U检验进行评估。

药物毒性

还确定了与药物相关的死亡和最大百分比相对平均净体重减轻。体重减轻最低点(组的平均值)>20％或10％的药物死亡被认为表明过度有毒剂量。

已经观察到胰腺肿瘤BxPC-3表达高水平的EGFR受体，并且在该肿瘤中，观察到抗EGFR单克隆抗体西妥昔单抗具显著活性。相反地，该肿瘤表达非常低水平的Her2(Larbouret C,et al.In pancreatic carcinoma,dual EGFR/HER2targeting withcetuximab/trastuzumab is more effective than treatment with trastuzumab/erlotinib or lapatinib alone:implication of receptors'down-regulation anddimers'disruption.Neoplasia.2012Feb；14(2):121–130)，因此抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗没有显著活性。

有趣的是，两种抗体的组合产生的活性显著高于西妥昔单抗检测到的活性。

在该实验中，在携带BxPC-3肿瘤的小鼠中将本发明的双特异性四价抗体BiXAb-3486和BiXAb-3489的活性与亲本抗EGFR和抗HER2抗体的组合进行比较，并且在整个研究中没有检测到毒性作用。

携带BxPC-3细胞的小鼠一周两次用抗EGFR和抗HER2抗体IP治疗，从随机化的第0天至第28天，每种抗体以2mg/kg/注射。在先前的实验的基础上选择2mg/kg剂量。

本发明的两种双特异性抗体也在相同的治疗时间表下以2或10mg/kg/注射给予(图7a)。

肿瘤在载体处理的小鼠中以9天的倍增时间生长，并且在治疗的最后一天第28天达到1859+/-459mm³的平均值。在那一天，对于以2mg/kg剂量用抗EGFR和抗HER2抗体的组合治疗的小鼠组，肿瘤平均体积为634mm³。对于以2或10mg/kg的BiXAb-3486治疗的组，肿瘤平均体积仅为214mm³和111mm³，而对于以2或10mg/kg的BiXAb-3489治疗的组，则为223mm³和200mm³。

T/C和ΔT/ΔC评估(图7b)表明：

-根据NCI标准，所有治疗均为具有活性的，T/C<42％。

-仅用BiXAb-3486或BiXAb-3489治疗的小鼠组显示出非常高的活性(T/C<10％)，而用抗EGFR和抗HER2抗体治疗的小鼠经历了中等活性。

-治疗结束后(第28天后)非常高的活性得以维持。

在整个实验过程中部分或完全消退(定义为肿瘤体积减少≥50％或肿瘤体积减少至触诊极限以下)和治愈受到监测(表4)。在用10mg/kg的BiXAb-3486治疗的小鼠组中，总共6/10和3/10只动物分别经历完全消退和治愈，表明有效的活性。

表4：消退和治愈

指数增长及其相关的倍增时间的概念在临床上具有相关性(Frei E III.Modelsand the clinical dilemma.In:Fidler IJ,White RJ,editors.Design of models fortesting therapeutic agents.New York:Van Nostrand Reinhold；1982.p.248–59)。不同的组织学类型的癌症在可观察到的肿瘤大小的范围内显示出多种倍增时间(Shackney SE,McCormack GW,Guchural GJ Jr.Growth rate patterns of solid tumors and theirrelation to responsiveness to therapy.An analytical review.Ann InternMed.1978；89:107)。

最为治疗响应性的人类癌症，如睾丸癌和绒毛膜癌，倾向于具有<1个月长的倍增时间。不太响应性的癌症，例如头颈部鳞状细胞癌，在约2个月内似乎倍增。相对无反应的癌症，如结肠腺癌，倾向于每3个月倍增。显然，这种临床观察可以与增殖细胞的较高化学敏感性有关(见下文)，也就是说，如果肿瘤具有高比例的***细胞，它将倾向于更快地生长并且对于杀死***细胞的药物也将更为响应。或者，具有较高细胞损失率的肿瘤倾向于具有相对较慢的生长速率并且还具有较高的向抗药性的突变率。

对数细胞杀灭模型提出抗癌药物以一级动力学起作用，因此，假设对药物具有均一的敏感性，它们将消除恒定比例而不是恒定数量的肿瘤细胞，而不管肿瘤的初始大小。换句话说，如果药物治疗将10⁶个细胞减少到10⁵个，那么相同的治疗将使10⁴个细胞减少到10³个。

在实验中，我们观察到对照组中肿瘤的倍增时间为7天(图7a)。

根据总对数细胞杀灭计算[(T-C)/(3.32xTd)]和净对数细胞杀灭计算[(T-C)—治疗期的持续时间]/(3.32x Td)(表5)，似乎抗EGFR和抗HER2抗体的组合全局不具活性并且肿瘤在治疗下得以生长。

相反地，用BiXAb-3486或BiXAb-3489治疗的小鼠经历显著活性(++或+++)，并且BiXAb化合物消除了高达2个对数(99％)的初始肿瘤质量。净对数细胞杀灭计算是阳性的，表明用BiXAb化合物治疗是有效的，并且与治疗前(第0天)相比，在治疗结束时(第28天)肿瘤细胞更少。

表5：总和净对数细胞杀灭评估

中值生存、移植后当50％的小鼠具有体积为2000mm³的肿瘤时的天数和治疗获益(治疗组的中值-对照组的中值)(图7C和7D)表明相对于两种单克隆抗体疗法的组合，BiXAb疗法具有明显的治疗优势。

最后，实施Mann-Whitney U检验，以对用BiXAb化合物治疗的四组动物与用抗EGFR和抗HER2抗体组合治疗的组进行比较。

表6：Mann-Whitney U检验(BiXAb组对抗EGFR+抗HER2组)

再次，显然用BiXAb化合物治疗的组比用抗EGFR和抗HER2抗体的组合治疗的组经历更高的活性。在治疗结束后21天也可观察到这种差异。

事实上，使用了几种经常用于细胞毒性化合物的抗肿瘤评估的端点。似乎本发明的两种双特异性抗体比抗EGFR和抗HER2抗体的组合更有效。

1)T/C<10％仅通过本发明的两种双特异性抗体获得，该参数是NCI分类为高活性化合物所需的参数，值得临床研究；

2)对数细胞杀灭参数(总和净)及其向活性等级的转化也证实本发明的两种双特异性抗体比抗EGFR和抗HER2抗体的组合更具活性；

3)仅在用本发明的两种双特异性抗体治疗的组中观察到消退，其是有效活性的标志。

结论：在实施例6和7中，我们评估了通常与抗体的治疗活性相关的个体作用机制(MOA)。在实施例6中，我们在三种不同的细胞系上测试了抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。两种BiXAb分子(BiXAb-E06528和BiXAb-3489)证明了细胞介导的细胞毒性，类似于两种亲本抗体(抗EGFR+抗HER2)的组合的细胞介导的细胞毒性。在测定中观察到的一些可变性可以是由于EGFR/HER2在靶癌细胞上的不同比例。在实施例7中，我们测试了抗体的“直接”作用，即它们通过EGFR、HER2和与这些受体相关的异源二聚体阻断促增殖信号传导的能力，其对降低癌细胞系生存力具有影响。这些实验证明，BiXAb-E06528和BiXAb-3489显示出比个别地每种亲本抗体(抗EGFR、抗HER2)或其组合(抗EGFR+抗HER2)相关的抗增殖活性实质上更高的抗增殖活性。这意味着两种BiXAb都显示出比亲本抗体相关的能力强得多的抑制增殖和生长的能力。在实施例8中，我们在胰腺癌的异种移植模型中体内测试了BiXAb-3489和BiXAb-3486。与2种亲本抗体的组合相比，该模型证明了在与BiXAb相关的肿瘤生长抑制中的惊人增加。

在体内模型中，我们能够评估与药物的活性相关的所有MOA的总和；在这种情况下，这意味着免疫细胞介导的细胞毒性和抑制增殖的直接作用两者都有助于异种移植模型的结果。本发明的双特异性抗体显示出效力，其在胰腺肿瘤中很少观察到。

由于体内模型反映了BiXAb相对于两种亲本抗体组合具有实质上改善的活性，我们得出结论，直接抑制肿瘤中的促增殖信号传导对BiXAb在抑制肿瘤的生长和延长动物生存中的活性提供了重要贡献(实施例8)。

序列表

<110> 拜奥穆尼克斯制药等

<120> 靶向EGFR和HER2的双特异性抗体

<130> B2232PC

<160> 38

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 120

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 98

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val

<210> 3

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列

<400> 3

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser

20 25 30

Gly Gly

<210> 4

<211> 119

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 5

<211> 98

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Glu Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 7

<211> 110

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100 105 110

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

1 5 10 15

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 9

<211> 701

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BiXAb 3486重链

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu

245 250 255

Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile

260 265 270

Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp

275 280 285

Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp

290 295 300

Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser

305 310 315 320

Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser

325 330 335

Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr

340 345 350

Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

355 360 365

Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

370 375 380

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

385 390 395 400

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

405 410 415

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

420 425 430

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Glu Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

435 440 445

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

450 455 460

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

465 470 475 480

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

485 490 495

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

500 505 510

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

515 520 525

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

530 535 540

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

545 550 555 560

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

565 570 575

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

580 585 590

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

595 600 605

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

610 615 620

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

625 630 635 640

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

645 650 655

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

660 665 670

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

675 680 685

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

690 695 700

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 11

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 12

<211> 214

<212> PRT

<213> 智人

<400> 12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

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Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 13

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 13

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 14

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 14

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ala Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Lys Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 15

<211> 214

<212> PRT

<213> 智人

<400> 15

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala

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Pro Ala Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

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130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

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195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 16

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列

<400> 16

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser

20 25 30

Gly Gly

<210> 17

<211> 701

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BiXAb 3489重链

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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65 70 75 80

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Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

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115 120 125

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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

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165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu

245 250 255

Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile

260 265 270

Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp

275 280 285

Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp

290 295 300

Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser

305 310 315 320

Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser

325 330 335

Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr

340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

385 390 395 400

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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465 470 475 480

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

530 535 540

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

545 550 555 560

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

565 570 575

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

580 585 590

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

595 600 605

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

610 615 620

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<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(25)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(28)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(32)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 36

Glu Pro Lys Xaa Cys Asp Lys Xaa His Xaa Xaa Pro Pro Xaa Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Xaa Xaa Pro Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa

20 25 30

Gly Gly

<210> 37

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列

<400> 37

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ala Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Gly Gly Pro Pro Gly Pro Gly Pro Gly

20 25 30

Gly Gly

<210> 38

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列

<400> 38

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ala Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ala Ala Pro Pro Gly Pro Ala Pro Gly

20 25 30

Gly Gly

Claims (15)

1.包含两条重链和四条轻链的双特异性抗体，

其中每条重链包含

a.包含铰链-CH2-CH3域的免疫球蛋白的Fc区，

b.所述Fc区通过所述铰链域连接至抗体1(Ab1)的Fab重链CH1-VH，

c.其继而通过多肽接头序列连接至抗体2(Ab2)的Fab重链CH1-VH，其中所述多肽接头序列将所述Ab1的Fab重链VH域的N-末端与所述Ab2的CH1域的C-末端连接，

并且所述四条轻链包含与它们的关联重链域结合的Ab1的Fab轻链和Ab2的Fab轻链；

其中不同的Ab1和Ab2独立地选自由在一方面上西妥昔单抗(cetuximab)或其突变衍生物以及在另一方面上曲妥珠单抗(trastuzumab)或其突变衍生物组成的组。

2.权利要求1的双特异性抗体，其中Ab1或Ab2为西妥昔单抗或其突变衍生物，包含

οVH域，其包含SEQ ID NO:4，优选由SEQ ID NO:4组成，

οCH1域，其包含选自由以下各项组成的组的序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22，

οVL域，其包含SEQ ID NO:13，优选由SEQ ID NO:13组成，

οCL域，其包含选自由以下各项组成的组的序列：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25，

其中所述CH1和CL域如下结合

-SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:11，

-SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:23，

-SEQ ID NO:20与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:23，

-SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25，

-SEQ ID NO:22与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25。

3.权利要求1的双特异性抗体，其中Ab1或Ab2为曲妥珠单抗或其突变衍生物，包含

οVH域，其包含序列SEQ ID NO:1，优选由序列SEQ ID NO:1组成，

οCH1域，其包含选自由以下各项组成的组的序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22，

οVL域，其包含由序列SEQ ID NO:10组成的序列，

οCL域，其包含选自由以下各项组成的组的序列：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25，

其中所述CH1和CL域如下结合

-SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:11，

-SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:23，

-SEQ ID NO:20与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:23，

-SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25，

-SEQ ID NO:22与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25。

4.权利要求4或5中任一项的双特异性抗体，其中所述Ab1的CH1和CL域具有与所述Ab2的CH1和CL域不同的序列的组合。

5.权利要求1至4中任一项的双特异性抗体，其中所述多肽接头序列包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:34，优选由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:34组成。

6.权利要求1至5中任一项的双特异性抗体，其包含以下各项，优选由以下各项组成，

a)两条重链，每条包含连续序列，优选由连续序列组成，所述连续序列以N至C端次序包含：

·曲妥珠单抗重链VH，其包含SEQ ID NO:1，优选由SEQ ID NO:1组成，

·CH1域，其包含SEQ ID NO:2，优选由SEQ ID NO:2组成，

·多肽接头，其包含以下各项，优选由以下各项组成：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:34，

·西妥昔单抗重链VH，其包含SEQ ID NO:4，优选由SEQ ID NO:4组成，

·CH1域，其包含SEQ ID NO:5，优选由SEQ ID NO:5组成，

·铰链域，其包含SEQ ID NO:6，优选由SEQ ID NO:6组成，

·CH2域，其包含SEQ ID NO:7，优选由SEQ ID NO:7组成，

·CH3域，其包含SEQ ID NO:8，优选由SEQ ID NO:8组成，

b)两条曲妥珠单抗轻链，每条包含：

·VL域，其包含SEQ ID NO:10，优选由SEQ ID NO:10组成，

·CL域，其包含SEQ ID NO:11，优选由SEQ ID NO:11组成，

c)两条西妥昔单抗轻链，每条包含：

·VL域，其包含SEQ ID NO:13，优选由SEQ ID NO:13组成，

·CL域，其包含SEQ ID NO:14，优选由SEQ ID NO:14组成。

7.权利要求1至5中任一项的双特异性抗体，其包含以下各项，优选由以下各项组成，

a)两条重链，每条包含连续序列，优选由连续序列组成，所述连续序列以N至C端次序包含：

·西妥昔单抗重链VH，其包含SEQ ID NO:4，优选由SEQ ID NO:4组成，

·CH1域，其包含SEQ ID NO:5，优选由SEQ ID NO:5组成，

·多肽接头，其包含以下各项，优选由以下各项组成：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:34，

·曲妥珠单抗重链VH，其包含SEQ ID NO:1，优选由SEQ ID NO:1组成，

·CH1域，其包含SEQ ID NO:2，优选由SEQ ID NO:2组成，

·铰链域，其包含SEQ ID NO:6，优选由SEQ ID NO:6组成，

·CH2域，其包含SEQ ID NO:7，优选由SEQ ID NO:7组成，

·CH3域，其包含SEQ ID NO:8，优选由SEQ ID NO:8组成，

b)两条曲妥珠单抗轻链，每条包含SEQ ID NO:12，

c)两条西妥昔单抗轻链，每条包含SEQ ID NO:15。

8.权利要求1的双特异性抗体，其含有至少一个以下突变：

-来自人IgG1的突变的CH1恒定域，其包含SEQ ID NO:20，优选由SEQ ID NO:20组成，

-来自人IgG1的突变的CH1恒定域，其包含SEQ ID NO:21，优选由SEQ ID NO:21组成，

-来自人IgG1的突变的CH1恒定域，其包含SEQ ID NO:22，优选由SEQ ID NO:22组成，

-突变的人Kappa恒定域，其包含SEQ ID NO:23，优选由SEQ ID NO:23组成，

-突变的人Kappa恒定域，其包含SEQ ID NO:24，优选由SEQ ID NO:24组成，

-突变的人Kappa恒定域，其包含SEQ ID NO:25，优选由SEQ ID NO:25组成。

9.权利要求1的双特异性抗体，其中西妥昔单抗重链VH域由SEQ ID NO4、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27组成。

10.多肽，其包含如权利要求1至9中任一项中所定义的双特异性抗体的重链，优选由如权利要求1至9中任一项中所定义的双特异性抗体的重链组成。

11.包含编码权利要求10的多肽的序列的多核苷酸。

12.用包含权利要求11的多核苷酸的表达载体转染的宿主细胞。

13.用于生产权利要求1至9中任一项的双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：a)在适合的培养基和培养条件中培养宿主细胞，所述宿主细胞表达如权利要求1至9中任一项中所定义的抗体重链，和如权利要求1至9中任一项中所定义的抗体轻链；以及b)从所述培养基或从所述培养的细胞回收所述生产的抗体。

14.权利要求1至9中任一项的双特异性抗体，其用作药物。

15.权利要求1至9中任一项的双特异性抗体，其用于治疗癌症。