CN109563153A - 抗-ryk抗体及使用其的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于抑制神经元变性的方法、治疗神经/神经变性疾病的方法、调节神经元定向生长的方法，以及干扰Wnt和Ryk相互作用的方法。还提供了特异性结合Wnt结合域的分离的抗Ryk抗体和抗体片段。

Description

抗-RYK抗体及使用其的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求根据35U.S.C.§119(e)于2016年3月28日提交的美国系列号62/314,025的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
资助信息
本发明是在国立卫生研究院授予的资助号NS047484和NS081738的政府支持下完成的。美国政府对本发明享有一定的权利。
序列表
本申请包含已经以ASCII形式进行电子提交的序列表并且其全部内容通过引用并入本文。所述ASCII副本，创建于2017年3月15日，命名为20378-201389_SL.txt，并且其大小为14,104字节。
技术领域
本发明一般涉及抗体，并更具体地涉及特异性结合至Wnt结合域以抑制Wnt-Ryk信号传导的抗Ryk抗体或抗体片段的用途。
背景技术
中枢神经***(CNS)通过上行感觉通路和下行运动或调节通路连接。在CNS中，体感通路上升到大脑中枢，且控制身体运动的运动通路从大脑下降到脊髓。与周围神经***不同，中枢神经***轴突(诸如脊髓轴突)的损伤无法修复，导致神经功能的永久性损伤(诸如瘫痪)。脊髓在中枢神经***中起重要作用。一个这样的功能是允许身体和大脑的交流。脊髓内的神经纤维携带从大脑至身体其他部位的往来信息。通常，来自身体的感觉信息沿着脊髓向上行进到大脑，以及来自大脑的指令(诸如运动命令)沿着脊髓从大脑向下行进。
术语“脊髓损伤”是指椎管内神经元的任何损伤。脊髓损伤可由脊柱或脊髓本身的创伤或疾病而发生。大多数脊髓损伤是由于脊柱创伤导致骨折，或伴随骨柱移位的韧带撕裂产生脊髓收缩所致。大多数颈部骨折和背部骨折，或椎骨骨折，不会导致任何脊髓受损；然而，在发生椎骨创伤的10-14％的病例中，受损严重到导致脊髓受损。据估计，脊髓损伤(SCI)的年发病率(不包括在事故现场死亡的人)在美国每百万人口约有40例，或每年约11,000例新病例。目前，美国存活着且有SCI的人数估计为每百万人口721至906人。这相当于183,000至230,000人。脊髓损伤患者的治疗选择有限。通常，SCI患者会留下严重的、永久性残疾。
近年来，越来越多的证据表明，在早期发育中更为人所知的成形素Wnt在脊椎动物和无脊椎动物的神经***布线期间是保守的轴突导向分子(Zou,Y.2004.Trends Neurosci27:528-32；Fradkin,et al.2005.J Neurosci 25:10376-8；Zou&Lyuksyutova.2007.CurrOpin Neurobiol 17:22-8；Salina0s,et al.2008.Annu Rev Neurosci 31:339-358)。Wnt是分泌的糖蛋白，其结合三类受体，卷曲蛋白、Ryk和ROR2(Gordon&Nusse.2006.J BiolChem 281:22429-33；Logan&Nusse.2004.Annu Rev Cell Dev Biol 20:781-810)。研究还表明，Wnt家族蛋白是沿脊髓A-P轴和发育中连接视网膜和中脑顶盖神经纤维的突起的地形图形成的基本导向诱因，并且可能在脊髓损伤后调节成人CNS轴突再生中发挥重要作用(Lyuksyutova et al.2003.Science 302:1984-8；Liu,et al.2005.Nat Neurosci 8:1151-9；Schmitt et al.2006.Nature 439:31-7；Wolf et al.2008.J Neurosci 28:3456-67；Liu et al.2008.The Journal of Neuroscience 28:8376-8382)。
源自背脊髓的连合轴突，首先沿着背-腹轴线朝向腹侧中线(底板)生长方向突出。连合轴突的腹侧定向生长由排斥性诱因，由源自背侧中线(顶板)的BMP和吸引性诱因，由底板分泌的神经生长因子-1和音猬因子(Zou et al.2007.Curr Opin Neurobiol 17:22-8)导向。一旦这些连合轴突穿过中线，其就会失去对中线引诱剂的响应，并获得对来自底板和邻近腹侧灰质的化学排斥物(裂隙(slits)和信号素)的敏感性，迫使其90°转向变为其纵向轨迹(Zou et al.2000.Cell 102:363-75)。啮齿动物连合轴突的背部群体全部转向前方并向大脑突出。前转向需要Wnt-卷曲蛋白信号。包括Wnt4、Wnt7b、Wnt7a和Wnt5a的几个Wnt以沿腹中线的脊髓的前-后递减梯度表达，并吸引穿过中线的穿过后连合轴突向前转向。当通过添加Wnt抑制剂(分泌卷曲蛋白相关蛋白(sFRP)或在“开放式”外植体培养物中放置分泌Wnt4的细胞聚合物)破坏Wnt梯度时，连合轴突表现出中线穿越后特异性A-P随机化生长。在卷曲蛋白3突变体胚胎中，脊髓连合轴突在体内失去A-P定向性(Lyuksyutova etal.2003.Science 302:1984-8)。
在果蝇中线轴突寻路中的研究独立地显示DWnt5是化学排斥物并且通过称为Derailed的受体排斥连合轴突的子集(Yoshikawa et al.2003.Nature 422:583-8)。Derailed的脊椎动物同源物，Ryk也是一种排斥性Wnt受体，并且由Wnt1和Wnt5a的差异表达产生的前高-后低的Wnt梯度是脊髓中皮质脊髓束轴突后部生长所必需的(Liu etal.2005。Nat Neurosci 8：1151-9)。因此，Wnts通过吸引和排斥的导向机制控制脊髓中上行和下行轴突的A-P导向。还发现Wnt-Ryk信号传导通过排斥机制调节哺乳动物前脑中胼胝体的寻路(Keeble et al.2006.J Neurosci 26:5840-8)。在秀丽隐杆线虫中的研究表明，Wnt信号传导控制许多轴突的寻路和成神经细胞迁移的前后定向性(Pan et al.2006.DevCell 10:367-77；Hilliard et al.2006.Dev Cell 10:379-90；Prasad&Clark.2006.Development 133:1757-66)。因此，A-P导向机制似乎在动物界中高度保守(Zou.2006.Neuron 49:787-9.)。
除了Wnt在轴突寻路中的作用之外，Wnt3还是连接视网膜和中脑顶盖神经纤维的***中地形映射的位置诱因，充当视网膜神经节细胞轴突的侧向定向映射力，与视顶盖中的肝配蛋白B1梯度产生的中间定向力相反(Schmitt et al.2006.Nature 439:31-7)。Wnt3在视顶盖中以中-高到侧-低的梯度表达。Ryk在视网膜神经节细胞中以背腹(D-V)增加梯度表达。因此，更多腹侧RGC轴突分支被Wnt3更强烈地排斥，并且Wnt3-Ryk信号传导驱使间质分支朝向侧面顶盖生长。同时，肝配蛋白B1以相同的梯度方式表达，并且EphB在腹侧RGC中以更高水平表达。EphBs介导对肝配蛋白B1的吸引力。因此，更多的腹侧RGC轴突分支更容易被ephinB1吸引到中间顶盖。中间(ephrinB1)和侧面(Wnt3)映射力之间的平衡作用确保RGC轴突在正确的地形位置终止。值得注意的是，在果蝇视觉***中适当的背腹侧视网膜皮质映射也需要Wnt-卷曲蛋白信号传导(Sato et al.2006.Nat Neurosci 9:67-75；Zou&Lyuksyutova.2007.Curr Opin Neurobiol 17:22-8)。因此，Wnt是沿着D-V轴的保守地形映射的诱因。
通过分别由中线底板和顶板细胞分泌的化学引诱物(神经生长因子-1和音猬因子(Shh))和化学排斥物(骨形态发生蛋白(BMP))的协作将发育中的脊髓的连合轴突导向至腹侧中线。一旦这些轴突到达底板，其就会关闭其对来自底板的化学引诱物的响应，并对由底板细胞和周围腹侧灰质表达的化学排斥诱因(包括3型信号素(Sema3B和Sema3F)的成员和Slit家族蛋白质)做出响应(Serafini,T.,et al.Cell 78,409-424,1994；Kennedy,T.E.,et al.Cell 78,425-435,1994；Serafini,T.,et al.Cell 87,1001-1014,1996；Zou,Y.,etal.Cell 102,363-375,2000；Charron,F.,et al.Cell 113,11-23,2003；Long,H.,etal.Neuron 42,213-223,2004)。神经纤毛蛋白-2突变体胚胎表现出严重的导向缺陷，包括中线停滞、向脊髓对侧过调和沿前后轴随机突出(Zou,Y.,et al.Cell 102,363-375,2000)。
SCI后神经元生长和再生调节剂的鉴定可应用于具有这种使人衰弱的病症的患者的新形式治疗。神经元生长和再生调节剂的鉴定也可用于治疗患有神经元功能紊乱的其他障碍(诸如神经/神经变性疾病或障碍)的患者。可以应用能够在脊髓损伤后沿着A-P轴促进轴突生长的试剂，以帮助预防通常与SCI相关的永久性瘫痪。因此，需要更好地治疗SCI，并且对神经元生长和再生调节剂的更好理解可能引起这种神经/神经变性疾病或障碍的治疗方法的改善。
发明内容
本发明基于以下发现：特异性结合Wnt结合域的抗Ryk抗体或抗体片段抑制Wnt-Ryk信号传导。因此，当脊髓受损时，抗Ryk抗体或抗体片段可用于调节哺乳动物神经元的定向生长，以及抑制神经元变性和治疗神经变性疾病。
因此，在一个方面，本发明提供了分离的抗Ryk抗体或抗体片段，其特异性结合至Wnt的结合域或特异性结合至Wnt上与参考抗体或抗体片段特异性结合相同的表位，或与参考抗体或抗体片段特异***叉竞争结合至Wnt的相同表位。在各种实施方案中，抗体或抗体片段和/或参考抗体或抗体片段包括重链可变区，其包含SEQ ID NO:5-7或SEQ ID NO:5、11和12中所示的CDR序列；和/或轻链可变区，其包含SEQ ID NO:1-3或SEQ ID NO:9、2和3中所示的CDR序列。在各种实施方案中，抗体或抗体片段特异性结合至Wnt的氨基酸残基90-183内的表位。在各种实施方案中，抗体或抗体片段的重链可变区包括与SEQ ID NO:8或13具有至少85％的序列一致性、至少90％的序列一致性、至少95％的序列一致性、或至少99％的序列一致性的氨基酸序列。在各种实施方案中，抗体或抗体片段的轻链可变区包括与SEQ IDNO:4或10具有至少85％序列一致性、至少90％序列一致性、至少95％序列一致性、至少99％的序列一致性的氨基酸序列。在各种实施方案中，将抗体或抗体片段配制在药学上可接受的载体或赋形剂中。
另一方面，本发明提供了编码本文所述的分离的抗体或抗体片段的核酸序列。还提供了包含核酸序列的载体(诸如表达载体)。还提供了宿主细胞，诸如包含载体的哺乳动物宿主细胞。
另一方面，本发明提供了与治疗剂(诸如细胞毒素或放射性同位素)连接的分离的抗Ryk抗体或抗体片段的免疫偶联物。另一方面，本发明提供双特异性分子(例如双特异性抗体)，其包括与第二功能部分连接的分离的抗Ryk抗体或抗体片段，所述第二功能部分具有与分离的抗Ryk抗体或抗体片段不同的结合特异性。
在另一方面，本发明提供了干扰Wnt和Ryk相互作用的方法。该方法包括使包含Wnt和Ryk的样品与本文所述的分离的抗体或抗体片段接触，从而干扰Wnt和Ryk的相互作用。
另一方面，本发明提供抑制神经元变性的方法。该方法包括使神经元与本文所述的分离的抗体或抗体片段接触，从而抑制神经元的变性。在各种实施方案中，抑制神经元轴突的变性或抑制神经元细胞体的变性。在各种实施方案中，轴突是脊髓连合轴突、上运动神经元轴突或中枢神经***轴突。在各种实施方案中，神经元是受损的脊髓神经元、感觉神经元、运动神经元、小脑颗粒神经元、背根神经节神经元、皮质神经元、交感神经元或海马神经元。在各种实施方案中，神经元形成神经移植物(nerve graft)或神经移植体(nervetransplant)的一部分。在各种实施方案中，神经元是离体或体外的。在各种实施方案中，神经移植物或神经移植体形成诸如哺乳动物或人的生物体的一部分。
在另一个方面，本发明提供治疗神经疾病或障碍(例如患有或有发展为神经疾病或障碍(例如神经变性疾病或病症))风险的方法。该方法包括向受试者施用本文所述的分离的抗体或抗体片段，从而治疗受试者中的神经疾病或障碍，(例如神经变性疾病或障碍)。在各种实施方案中，神经变性疾病是肌萎缩性侧索硬化、阿尔茨海默氏病或帕金森病。
另一方面，本发明提供了一种调节哺乳动物神经元定向生长的方法。该方法包括使神经元与本文所述的分离的抗体或抗体片段接触，从而调节神经元、脊髓连合轴突、上运动神经元轴突或中枢神经***轴突的定向生长。在各种实施方案中，神经元是受损的脊髓神经元、感觉神经元、运动神经元、小脑颗粒神经元、背根神经节神经元、皮质神经元、交感神经元或海马神经元。在各种实施方案中，神经元形成神经移植物或神经移植体的一部分。在各种实施方案中，神经元是离体的或体外的。在各种实施方案中，神经元的定向生长促进神经元的再生。
另一方面，本发明提供了诸如小鼠的转基因非人哺乳动物，其基因组包含Ryk基因的杂合的或纯合的缺失、失活或敲除。在各种实施方案中，小鼠具有卷曲蛋白3-/-Ryk+/-表型。在各种实施方案中，小鼠含有Ryk基因的条件性破坏(例如Ryk基因的皮质脊髓束(CST)特异性破坏)。在各种实施方案中，破坏的Ryk基因包括重组Ryk等位基因、选择标记、位于选择标记侧翼的frt位点，以及位于等位基因的一部分侧翼的loxP位点。标记可以是PGK Neo，并且loxP位点可以位于等位基因的外显子3-6的侧翼。因此，本发明还提供了源自转基因非人哺乳动物的分离细胞。还提供了用于制备转基因非人哺乳动物的载体，其基因组包含Ryk基因的杂合的或纯合的缺失、失活或敲除。示例性载体可包括Ryk基因的一部分，其中，Ryk基因的外显子3-6侧翼为3'和5'loxP位点、外显子6和5'loxP位点之间的选择标记，以及选择标记侧翼的frt位点。
另一方面，本发明提供了产生敲除小鼠的方法，该敲除小鼠具有Ryk基因的条件性破坏(例如Ryk基因中CST靶向的破坏)。该方法包括将上述载体转染到鼠胚胎干(ES)细胞群中，选择表达所述选择标记的经转染的ES细胞，将所述经转染的ES细胞导入所述小鼠祖先的胚胎中，使所述胚胎发育到在其种系中足以产生具有条件性敲除构建体的嵌合小鼠，繁殖所述嵌合小鼠以产生具有条件性可破坏的Ryk基因的杂合小鼠，并用所述杂合小鼠与含有仅在皮质脊髓轴突中阻止tdTomato表达的loxP侧翼终止盒的小鼠繁殖，以产生具有Ryk基因条件性破坏的小鼠(例如Ryk基因中的CST特异性破坏)。
另一方面，本发明提供筛选调节非典型蛋白激酶C(aPKC)或MARK2的量、水平和/或活性的试剂的方法。例如，本文提供了筛选用于治疗神经疾病或障碍的治疗剂的筛选方法。该方法包括向本文所述的转基因非人哺乳动物施用试验试剂并评估试验试剂对以下至少一项的影响：在转基因非人哺乳动物的至少一种疾病相关组织中的非典型蛋白激酶C(aPKC)或MARK2蛋白的量、aPKC或MARK2的水平活性或者aPKC或MARK2的水平，其中，以下至少一项：相对于未接受试验试剂的相似转基因非人类哺乳动物，至少一种疾病相关组织中aPKC蛋白的量减少、MARK2蛋白的量增加、aPKC活性水平的降低、MARK2活性水平的升高、aPKC水平的降低或MARK2水平的升高表明试验试剂对神经疾病或障碍具有治疗作用。
附图说明
图1A-图1F是显示抑制aPKC诱导神经突变性和神经元凋亡的图解图表。图1A显示内源性aPKC定位于皮质神经元细胞体(E16.5)(箭头(arrows))和SMI-312+轴突(箭头(arrowheads))中。图1B-图1F显示大脑皮质神经元中PKCζ-WT、PKCζ-KD或PKCζ-T410A的过表达(pCIG2-EGFP用作对照)。图1B显示重组PKCζ-WT蛋白定位于神经元细胞体(箭头(arrows))和突起(箭头(arrowheads))中，而神经突中不存在PKCζ-KD和PKCζ-T410A蛋白。图1C显示了更高放大倍数的图像，其显示PKCζ-WT转染的神经元中的完整神经突(实线箭头)和标记了EGFP的PKCζ-KD转染细胞(虚线箭头)中的片段化神经突。图1D显示了用所示质粒转染的神经元中的Casp3免疫染色。图1E显示了在EGFP+神经元总数上计数的具有变性神经突的转染神经元的数目(B中的虚线箭头)，并表示为对照的％。图1F显示了在EGFP+神经元总数上计数的凋亡转染神经元(aCasp3+EGFP+)的数目。数据代表平均值±SEM(图1E中的n＝5次实验，图1F中的n＝3次实验。*p<0.05，**p<0.01，Bonferroni后测试的ANOVA。比例尺：200μm(图1B)、100μm(图1D)、50μm(图1A和1C)。
图2A-图2H是显示aPKC抑制诱导在神经元细胞体死亡之前的快速轴突变性的图解图表。图2A和2B显示用10μM肉豆蔻酰化aPKC PS处理2小时的E16.5大脑皮质神经元中的轴突变性。在神经元的总数上计算具有变性的轴突的神经元的比例(SMI-312+细胞)。实线箭头表示具有完整轴突的神经元，虚线箭头为带有珠状轴突的神经元和箭头(arrowheads)为没有轴突的神经元。图2C和2D显示了剂量-(图2C)和时间-(图2D)依赖性方式的PKC PS诱导的轴突片段化。图2E显示了aPKC PS处理降低了PKCζ-T410的磷酸化。固定细胞培养物并用抗磷酸化PKCζ-T410抗体免疫标记。在用水(对照)或10μM aPKC PS孵育2小时的神经元细胞培养物中的神经元细胞体(箭头)中测量P-PKCζ-T410免疫反应性。图2F-2I显示由PKC抑制在细胞体死亡之前诱导的轴突变性。将皮质神经元与水(对照)或10μM aPKC PS一起孵育2小时、4小时或24小时，固定并对SMI-312和TUNEL(图2F)或活化的胱天蛋白酶-3双标记。实线箭头表示在对照神经元和用aPKC PS处理的神经元中对TUNEL标记的死神经细胞体。虚线箭头表示具有未标记TUNEL的珠状轴突的神经元。图代表在SMI-312+神经元中aPKC PS处理2小时、4小时或24小时后计数的变性轴突的神经元(图2G)和死亡神经元(TUNEL+(图2H)或aCasp3+(图2I))的比例。数据代表平均值±SEM(n＝3次实验)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。图2B-2D：Bonferroni后检验的ANOVA；图2E和2G-2I：未配对的学生t检验。比例尺：50μm(图2A和2F)、25μm(图2E)。
图3A-3I是显示通过调节MARK2活性和Tau磷酸化，抑制aPKC使微管不稳定的图解图表。图3A和3B显示通过用紫杉醇稳定微管部分地防止了由PKC诱导的轴突变性。在7μMaPKC PS处理2小时之前和期间，将皮质神经元与10μM紫杉醇一起孵育2小时。固定细胞并用SMI-312抗体免疫标记。在SMI-312+神经元中计数具有完整轴突的神经元的比例(图3B)。实线箭头表示具有完整轴突的神经元。虚线箭头表示具有珠状轴突的神经元。箭头(Arrowheads)表示没有轴突的神经元。图3C-3F显示了用来自用水(对照)或10μM aPKC PS孵育2小时的E16.5大脑皮质细胞培养物的蛋白质裂解物进行的蛋白质印迹的结果。通过密度计分析评估磷蛋白水平并用相应的总蛋白和肌动蛋白或GAPDH标准化(图3C-3E)。用GAPDH标准化Glu-微管蛋白的水平(图3F)。泳道1-3和泳道4-6分别代表对照和aPKC PS的三次重复。图3G-3I显示Tau-S262A过表达保护神经元免受PKCζ-KD过表达诱导的神经突变性。将用指定质粒转染培养3天的E16.5皮质细胞在转染后2天固定，并对EGFP和aCasp3进行免疫标记，并用DAPI复染。图3H显示了在EGFP+神经元总数上计数的具有变性神经突的转染神经元的数目。图3I显示了在EGFP+神经元总数上计数的凋亡转染神经元(aCasp3+EGFP+)的数目。数据代表平均值±SEM。图3B-3F：n＝3次实验；图3H和3I：n＝4次实验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，图3B-3F：未配对学生t检验；H、I：Bonferroni后检验的ANOVA。比例尺：50μm(图3A)、100μm(图3G)。
图4A-4E是显示aPKC抑制激活JNK-cJun信号通路的图解图表。图4A-4C显示在aPKC抑制时JNK磷酸化增加。用来自用水(对照)或10μMAPKCPS孵育1小时或2小时，培养3天的E16.5皮质神经元的蛋白质裂解物进行蛋白质印迹。图4B和4C显示通过密度计分析评估的磷蛋白水平。用相应的总蛋白和GAPDH标准化磷蛋白的水平。图4D和4E显示用水(对照)或10μM aPKC PS孵育1小时的皮质神经元培养物对P-JNK T183/T185(D)或P-c-Jun S63(图4E)免疫标记。箭头表明与对照神经元相比，用aPKC PS处理的神经元中的免疫反应性增加。数据代表平均值±SEM。n＝3次实验/组，*p<0.05，**p<0.01，未配对的学生t检验。比例尺：100μm。
图5A-5F是显示Ryk促进由PKC抑制诱导的轴突变性的图解图表。图5A和5B显示在Ryk KO小鼠皮质神经元细胞培养物中aPKC活性增加。用来自在体外培养3天的E16.5Ryk野生型、杂合子和KO胚胎的皮质神经元的蛋白质裂解物进行蛋白质印迹。通过密度计分析评估P-PKCζ-T410的水平，并用总PKCζ和GAPDH标准化。图5C和5D显示单克隆Ryk抗体阻断变性。将E16.5皮质神经元与单克隆小鼠抗Ryk抗体(50μg/ml或100μg/ml)或正常小鼠IgG(100μg/ml)一起孵育2小时，然后7μM aPKC PS处理2小时。固定细胞并对SMI-312进行免疫标记。图5D显示具有变性轴突的SMI-312+神经元的比例。图5E和5F显示Ryk敲除小鼠具有减少的变性。将从E16.5WT(Ryk+/+)和Ryk KO胚胎(Ryk-/-)单独分离的皮质神经元与7μM aPKC PS一起孵育2小时。固定细胞并对SMI-312进行免疫标记。图5F显示了用aPKC PS或水(对照)处理的Ryk+/+和Ryk-/-神经元中具有变性轴突的SMI-312+神经元的比例。实线箭头表示具有完整轴突的神经元，虚线箭头为具有珠状轴突的神经元和箭头(arrowheads)为没有轴突的神经元。数据代表平均值±SEM(图5A：Ryk+/+：n＝3个胚胎，Ryk+/-n＝3个胚胎，Ryk-/-：n＝4个胚胎；D：n＝5次实验；图5F：Ryk+/+：n＝4个胚胎，Ryk-/-：n＝6个胚胎)。*p<0.05，**p<0.001，***p<0.001；图5B和5F：未配对的学生t检验，D：Bonferroni后检验的ANOVA。比例尺：100μm。
图6A-6E是显示Ryk和卷曲蛋白3在神经元细胞死亡中的遗传相互作用的图解图表。图6A显示了WT脑切片(Ryk+/+)的较低放大倍数，其显示了后部(RSP)皮质的定位。图6B和6C显示与Ryk+/+小鼠相比，在Ryk-/-胚胎中aCasp3+细胞数减少。图6D和6E显示与卷曲蛋白3+/+和卷曲蛋白3+/-小鼠相比，卷曲蛋白3-/-胚胎的RSP中aCasp3+细胞数增加。Ryk敲低减弱了卷曲蛋白3KO小鼠的RSP中的细胞死亡。数据代表平均值±SEM(Ryk+/+：n＝6个胚胎，Ryk+/-：n＝4个胚胎，Ryk-/-：n＝5个胚胎，卷曲蛋白3+/+：n＝4个胚胎，卷曲蛋白3+/-：n＝6个胚胎，卷曲蛋白3-/-：n＝8个胚胎，卷曲蛋白3-/-Ryk+/-：n＝5个胚胎)。*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。图6C：学生t检验，E：Bonferroni后检验的ANOVA。HIPP：海马，LV：侧脑室，RSP：后部皮质。比例尺：500μm(图6A)、200μm(图6B和6D)。
图7A和7B是显示aPKC对轴突完整性和神经元细胞存活的作用的模型的示意图。图7A显示在正常条件下，当aPKC表达并具有活性时，aPKC通过T585上的磷酸化抑制MARK2活性。Tau的磷酸化状态低并且Tau结合并稳定微管，维持轴突完整性和神经元细胞存活。图7B显示当aPKC激酶活性降低或抑制时，MARK2活性增加并使S262上的微管结合域中的Tau磷酸化。过度磷酸化的Tau从微管分离，使微管不稳定。微管的破坏激活应激激酶JNK/SAPK途径，导致轴突变性和神经元细胞死亡。
图8A-8F是显示Ryk条件性缺失增强脊髓损伤的运动功能恢复的图解图表。图8A显示了概述双侧颈水平S(CS)脊柱损伤的实验细节的时间线。图8B-8C显示了Ryk条件等位基因的产生。图8B显示位于外显子3-6侧翼的loxP位点。图8C显示了在出生后第0天用AAV2/1突触蛋白Cre感染的小鼠出生后第7天的运动皮质提取物的蛋白质印迹的结果。全长印迹示于图23A和23B。图8D和8E示出了显示相对于不同前肢肌群的涉及运动神经元池的CS损伤水平的示意图(改编自McKenna，Prusky和Whishaw，2000)。图8F显示前肢到达熟练的食物-颗粒取回任务的行为表现显示Ryk条件性缺失后在双侧运动皮质的增强的恢复(来自21窝n＝2S小鼠(对照)、17只小鼠(Ryk cKO)，重复测量ANOVA P＝0.0003，F(1,40)＝16.0102)。数据表示为平均值±s.e.m。
图9A-9H是显示Ryk条件性缺失增强脊髓损伤后皮质脊髓轴突出芽的图解图表。图9A和9B显示来自8个间隔140μm的连续矢状冷冻切片的tdTomato标记的CST轴突的代表性图像，其叠加在损伤中心的GFAP星形胶质细胞染色上(1次实验，n＝12只小鼠/组，来自11窝；指南针显示背侧(D)、腹侧(V)、头侧(R)和尾侧(C))。与对照小鼠相比，Ryk条件性缺失的小鼠在损伤的头侧和尾侧具有更高水平的侧支化(单尾t检验*P<O.OS)。图9C和9D分别示出了来自图9A和9B中所示的加框区域(到损伤部位的尾侧1.5mm)的单个共焦平面的更高放大率。图9E显示背柱和灰质中相对于对照，至损伤的头侧超过3mm的tdTomato标记的轴突(标准化为锥体标记)总和(n＝12只小鼠/组，单尾t检验P＝0.12，t(21)＝1.198)。与对照小鼠相比，Ryk条件性缺失的小鼠在损伤的头侧和尾侧具有更高水平的侧支化(n＝12只小鼠/组，单尾t检验*P<O.OS：头侧P＝0.0499t(19)＝1.730，尾侧P＝0.0397t(19)＝1.855)。图9F-9H显示了背柱(图9F)或脊髓灰质(图9G和9H)内的皮质脊髓轴突的分布(轴突指数是在8个总矢状脊髓冷冻切片中的每0.411μm的阈值像素除以横向锥体中的阈值像素)。图9H是来自图9G的头侧侧枝的放大视图。CS损伤部位为0μm，头侧为负数，尾侧为正数。图9E中的数据表示为具有四分位数范围的中值，图9F-9H中的数据表示为平均值±s.e.m。
图10A-10D是显示CS背柱损伤后皮质脊髓连通性变化的图解图表。图10A和10B显示皮质脊髓轴突的中间-侧向分布，其显示在Ryk条件性缺失后，最接近主要，背侧皮质脊髓束(区域I和II)的侧枝增加最多(n＝12只小鼠/组，单尾t检验*P<O.OS：II头侧P＝0.0225t(19)＝2.146，II尾侧P＝0.0295t(21)＝1.996，I尾侧P＝0.0059t(17)＝2.819)。图10C显示对照和Ryk条件性缺失小鼠在CS损伤部位头侧的600μm处显示突触前密度(vGlut1与tdTomato标记的皮质脊髓轴突共定位)(1次实验，n＝9只小鼠/组)。图10D显示了在CS损伤部位头侧600μm处的皮质脊髓神经支配的中间-侧向分布。所有数据均以中位数和四分位数间距表示。
图11A-11F是显示在颈水平3的第二次损伤消除增强的恢复的图解图表。图11A是概述从双侧CS背柱损伤恢复后的第二次C3损伤实验的实验细节的时间线。图11B是第二次C3损伤的示意图，其高于(图10C-10E)中所示的增加的突触前密度水平。图11C显示了对前肢到达熟练的食物-颗粒取回任务的行为表现，其显示在第二次C3背柱损伤的Ryk条件性缺失后消除增强的恢复(1次实验，n＝8只(对照假手术组)，7只(对照C3)，6只(Ryk cKO假手术组&C3)小鼠，来自14窝的小鼠，ANOVA P＝0.0102F(3)＝4.7432，Bonferroni校正t检验*P<0.05：1、Ryk cKO假手术组v对照假手术组P＝0.0106，2、Ryk cKO假手术组v Ryk cKO C3P＝0.0092)。图11D-11F显示第二次C3背柱损伤消除了Ryk条件性缺失小鼠中增强的侧支化水平。图11D显示来自8个间隔140μm的连续矢状冷冻切片的tdTomato标记的CST轴突的代表性图像，其叠加在损伤中心的GFAP星形胶质细胞染色上(1次实验，7只对照，6只Ryk cKO小鼠)。图11E和11F显示背柱(图11E)或脊髓灰质(图11F)内的皮质脊髓轴突(如上所述的轴突指数)的分布。C3损伤部位为0μm，头侧为负数，尾侧为正数。图11C中的数据表示为中值和四分位数范围，图11E和11F中的数据表示为平均值±s.e.m。
图12A-12I是显示单克隆Ryk抗体输注促进脊髓损伤的功能恢复的图解图表。图12A是显示通过鞘内导管***术的抗体输注的示意图。图12B显示了对前肢到达熟练的食物-颗粒取回任务的行为表现，其显示在损伤开始时用Ryk单克隆抗体输注28天的大鼠的恢复增强(n＝6只大鼠(IgG对照)，5只大鼠(Ryk单克隆)，重复测量ANOVA P＝0.0354，F(1,9)＝6.113)。图12C显示熟练的运动网格穿越任务的行为表现不受Ryk单克隆抗体输注的影响。图12D显示通过Western和免疫细胞化学Ryk单克隆识别在转染的COS-7细胞中表达的全长Ryk蛋白。图12E-12H显示输注Ryk单克隆抗体的大鼠中BDA标记的皮质脊髓轴突具有比对照小鼠IgG输注大鼠更高水平的侧支化。图12E和12F是来自6个间隔280μm的连续矢状冷冻切片的BDA标记的CST轴突的图像，其叠加在GFAP星形胶质细胞和损伤中心的NG2染色上。图12G和5H显示了背柱(图12G)或脊髓灰质内(图12H)的皮质脊髓轴突的分布(轴突指数是在每个0.741μm，在6个总矢状脊髓冷冻切片中的阈值像素除以横向锥体中的阈值像素)。CS损伤部位为0μm，头侧为负数，尾侧为正数。图12I显示相对于对照超过5mm的标准化轴突侧枝的总和。相比对照小鼠IgG输注的大鼠，输注Ryk单克隆抗体的大鼠在损伤后的头侧和尾侧具有更高水平的侧支化(n＝6只大鼠(IgG对照)，5只大鼠(Ryk单克隆)，单尾t检验585*P<0.05：头侧P＝0.0446t(6)＝2.000，尾侧P＝0.0196t(6)＝2.594)。图12B、12C、12G和12H中的数据表示为平均值±s.e.m.，图12I中的数据表示为中值和四分位数间距。
图13A-13C是显示在脊髓损伤恢复期间皮质映射重组的图解图。图13A是概述在双侧CS背柱损伤后每周行为测试的光遗传学映射的实验细节的时间线。图13B是在CS背柱损伤之前和之后3天、4周和8周，相对于前囟(*)的肘屈肌和伸肌激活的地形图。数据表示为在每个位置响应诱发运动的小鼠总数，较浅的颜色表示较大数量的小鼠在给定位置响应。每个tic标记代表300μm。图13C显示随后的C3背柱损伤破坏重塑的回路，而随后的锥体束切断术消除了单侧诱发的运动输出。两者均在损伤后3天测量。
图14A-14F是显示前肢运动映射表现渗入静止的前后肢皮质区域的图解图表。图14A是来自小鼠脊髓损伤的皮质映射重组，其接受每周训练，证实了损伤后映射图心如何偏移。标记的大小与给定肌肉群的诱发运动动作的小鼠的百分比成比例。图14B和14C示出了肘伸肌运动映射将尾侧和内侧移向最初由后肢表现占据的皮质。图14D和14E显示具有Ryk条件缺失的小鼠在CS损伤后4周具有更大的比例致力于肘屈肌激活(图14D)，并且相反地，较小比例的运动皮质致力于伸肌激活(图14E)(n＝10(对照)11(Ryk cKO)只小鼠，单尾t检验*P<0.05：肘关节屈曲P＝0.0347t(19)＝1.925，肘关节伸展P＝0.0460t(16)＝-1.791，数据以平均值±sem呈现)。图14F是由轴突可塑性介导的异位皮质运动区域的招募的模型。在背柱损伤后，前肢区域在损伤水平之上的立即扩张可能是由运动皮质内的横向连通性介导的。Ryk条件性缺失后轴突可塑性和连通性增加可能驱动前肢运动皮质的新型、异位区域的形成。
图15A-15D是显示皮质映射重组和脊髓损伤的功能恢复取决于康复训练的图解。图15A是概述仅在损伤后8周进行末端行为测试的光遗传映射的实验细节的时间线。图15B是在没有每周行为测试的情况下，CS背柱损伤之前和之后3天、4周和8周，相对于前囟，肘屈肌和伸肌激活的地形图。图15C显示在CS背柱损伤后8周，具有每周行为测试的小鼠、RykcKO和对照都表现优于仅在8周测试的那些(n＝10(对照每周测试)，11(Ryk cKO每周测试)，5(对照和Ryk cKO仅8周测试)只小鼠，ANOVA P＝0.0037F(3)＝5.7157，Bonferroni校正t检验*P<0.05：1、Ryk cKO每周v.8周仅测试P＝0.0277。2、每周对照v仅8周测试P＝0.0346，数据表示为中位数和四分位数间距)。图15D显示，在每周行为测试(黑色Xs)的动物中，无论伤害或基因型如何，手腕运动与熟练的前肢到达表现都有很强的相关性(n＝84次测量(4个时间点，21只小鼠)，双变量皮尔逊相关性P，P<0.0001p＝0.665)。浅蓝色是密度椭圆(a＝0.95)。没有每周行为测试的小鼠以红色显示。
图16是表示来自前肢读取视频的一系列样本帧的图示。在C5背柱损伤后13周(C3假手术后1周)的该实例证明了熟练的前肢抓握的恢复。成功的达到需要使用抓握动作，因为扫掠运动将导致颗粒落入食物颗粒平台(黑色)和主外壳之间的间隙中，或者通过外壳的线框底板。
图17A和17B是显示大鼠中Ryk单克隆抗体输注的示意图。图17A显示了Ryk单克隆抗体的特异性。全长印迹示于图23A和23B。图17B是概述在大鼠双侧C5背柱损伤后输注Ryk单克隆抗体的实验细节的时间线。
图18是显示在损伤尾侧的Ryk单克隆抗体输注后轴突侧枝化增加的图解。用Ryk单克隆抗体输注28天的大鼠比对照IgG输注的大鼠具有更高水平的损伤尾侧的侧枝化(n＝6只(IgG对照)5(Ryk单克隆)只大鼠，单尾t检验*P＝0.0196P＝0.0196t(6)＝2.594，数据表示为平均值±s.e.m)。损伤部位为0μm，尾侧用正数表示。轴突指数是矢状脊髓中的阈值像素除以横向锥体中的阈值像素。
图19是显示光遗传学映射实例的图示。用470nm LED通过纤维光缆刺激具有单侧颅窗的镇静小鼠以引起肌肉运动。显示了来自一只动物，C5背柱损伤前和后3天的运动映射的两个实例。
图20是显示响应于每周训练和Ryk条件性缺失的特征性运动输出随时间变化所占的运动皮质的比例的图表。
图21是显示用于皮质映射实验的小鼠的熟练前肢到达的恢复的图解。熟练前肢到达任务的行为表现显示在对侧运动皮质Ryk条件性缺失后增强的恢复(C5损伤后第1-8周，n＝10(对照)11(Ryk cKO)只小鼠，重复测量ANOVA P＝0.0304F(1,19)＝5.472)。第二次C3消除了Ryk条件性缺失后增强的恢复(n＝9(对照)8(Ryk cKO))，而单侧锥体束切断术(n＝8(对照)7(Ryk cKO))完全消除了小鼠执行任务的能力。数据表示为平均值±s.e.m。
图22是显示在受伤后没有训练的情况下特征性运动输出所占的运动皮质的比例相对稳定的图表。
图23A和23B是显示来自图8C和图17A的完整蛋白质印迹的结果的图示。图23A显示了来自图17A的Ryk单克隆抗体的特异性。图23B显示来自用于图8C的AAV2/1突触蛋白Cre在出生后第0天感染的小鼠的出生后第7天运动皮质提取物的蛋白质印迹。来自两个独立的Ryk KO胚胎小鼠皮质的E18.5皮质在右侧两个泳道作为对照。GAPDH在相同的印迹中上样对照。
具体实施方式
本发明基于以下发现：特异性结合Wnt结合域的抗Ryk抗体或抗体片段抑制Wnt-Ryk信号传导。因此，本发明提供了使用抗Ryk抗体或抗体片段调节神经元变性和神经元引导的方法。因此，抗Ryk抗体或抗体片段可用于治疗患有或有发生神经疾病或障碍风险的受试者(例如神经变性疾病或障碍)的神经疾病或障碍(例如神经变性疾病或障碍)，和/或治疗受试者的脊髓损伤(SCI)。
在描述本发明的组合物和方法之前，应理解本发明不限于所述的特定组合物、方法和实验条件，因为这样的组合物、方法和条件可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限定，因为本发明的范围仅由所附权利要求限定。
如在本说明书和所附权利要求中使用的，除非上下文另有明确说明，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代。因此，例如，提及“该方法/所述方法”时包括在阅读本公开等后对于本领域技术人员而言变得显而易见的一种或更多种方法，和/或本文所述类型的步骤。
术语“包括(comprising)”其可与“包含(including)”、“含有(containing)”或“特征在于(characterized by)”互换使用，是包含性或开放式语言，并且不排除另外的，未列举的要素或方法步骤。短语“由...组成”排除了权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。短语“基本上由......组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤以及不会实质上影响所要求保护的发明的基础和新颖特征的那些。本发明考虑了对应于这些短语中的每一个的范围的本发明组合物和方法的实施方案。因此，包含所列举的要素或步骤的组合物或方法考虑了其中所述组合物或方法基本上由这些要素或步骤组成的特定实施方案。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，但现在对优选的方法和材料进行描述。
如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”或“缓解(palliating)”或“改善(ameliorating)”在本文中可互换使用。这些术语是指用于获得有益或期望结果的方法，包括但不限于治疗益处和/或预防益处。治疗益处是指根除或改善所治疗的潜在障碍。此外，通过根除或改善与潜在障碍相关的一种或多种生理症状来实现治疗益处，使得在患者中观察到改善，尽管患者仍然可能患有潜在障碍。至于预防益处，可以将组合物施用于有发展特定疾病风险的患者，或报告疾病的一种或多种生理症状的患者，即使可能尚未对该疾病进行诊断。治疗包括预防疾病，即，在诱导疾病之前通过施用保护性组合物而引起疾病的临床症状不发展；抑制疾病，即通过在诱导事件后但在临床出现或再次出现疾病之前施用保护性组合物而引起疾病的临床症状不发展；抑制疾病，即通过在初始出现后施用保护性组合物来阻止临床症状的发展；防止疾病再次发生和/或缓解疾病，即通过在初始出现后施用保护性组合物引起临床症状消退。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以诱导所需生物学结果的活性剂的量。该结果可以是疾病的体征、症状或原因的减轻，或生物***的任何其他期望的改变。术语“治疗有效量”在本文中用于表示当在一段时间内重复施用于受影响区域时引起疾病状况实质性改善的制剂的任何量。该量将随所治疗的病症、病症的进展阶段以及所用制剂的类型和浓度而变化。在任何给定的实例中，适当的量对于本领域技术人员来说是显而易见的，或者能够通过常规实验确定。
术语“药学上可接受的盐”是指衍生自本领域熟知的各种有机和无机抗衡离子的盐，并且仅举例来说，包括钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等；当分子含有碱性官能团时，有机或无机酸的盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。
“受试者”、“个体”或“患者”在本文中可互换使用，其是指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于鼠类、猴子、人类，农场动物，运动动物和宠物。还包括体外获得的或体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。
如本文所用，“促进(promote)”或“增加(increase)”或“促进(promoting)”或“增加(increasing)”在本文中可互换使用。这些术语是指与未处理的细胞(组织或受试者)相比，处理的细胞(组织或受试者)中测量参数(例如，活性，表达，信号转导，神经元变性)的增加。还可以在治疗之前和之后对相同的细胞或组织或受试者进行比较。足以检测到增加。在一些实施方案中，与未处理的细胞相比，经处理的细胞的增加为至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、2倍、3倍、4倍或更多倍。
如本文所用，“抑制(inhibit)”、“防止(prevent)”或“减少(reduce)”或“抑制(inhibiting)”、“防止(preventing)”或“减少(reducing)”在本文中可互换使用。这些术语是指与未处理的细胞(组织或受试者)相比，处理的细胞(组织或受试者)中测量参数(例如，活性、表达、信号转导、神经元变性)的降低。还可以在治疗之前和之后对相同的细胞或组织或受试者进行比较。足以检测到降低。在一些实施方案中，与未处理的细胞相比，处理的细胞的减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或完全被抑制。在一些实施方案中，与未处理的细胞相比，处理的细胞中测量的参数是不可检测的(即，完全抑制)。
与生物活性剂相关的术语“选择性抑制(selective inhibition)”或“选择性抑制(selective inhibit)”是指与脱靶信号传导活性相比，通过与靶标的直接或间接相互作用优先降低靶标信号传导活性的试剂能力。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸，γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构(即与氢，羧基，氨基和R基团结合的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。天然编码的氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)和吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。
“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置，密码子可以改变为所述的任何相应密码子而不改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，其是保守修饰变异的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将意识到，核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子；和除了TGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)可以被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异隐含在每个所述序列中。
关于氨基酸序列，技术人员将意识到，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的各个改变、缺失或添加(其改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小百分比氨基酸)是“保守地修饰的变体”，其中改变导致用化学上相似的氨基酸替换氨基酸。提供本领域熟知的功能相似的氨基酸的保守取代表。此类保守修饰的变体是对本发明的多态变体、种间同源物和等位基因的补充，并且不排除本发明的多态变体、种间同源物和等位基因。
以下八组各自含有彼此保守取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见，例如，Creighton，Proteins(1984))。
保守取代可以包括诸如碱性对碱性、酸性对酸性、极性对极性等的取代。由于结构原因，由此衍生的氨基酸组可能是保守的。这些组可以以维恩图的形式描述(LivingstoneC.D.and Barton G.J.(1993)"Protein sequence alignments:a strategy for thehierarchical analysis of residue conservation"Comput.Appl Biosci.9:745-756；Taylor W.R.(1986)"The classification of amino acid conservation"J.Theor.Biol.119；205-218)。例如，可以根据下表描述保守取代，该表描述了通常接受的氨基酸的维恩图分组。
表1：氨基酸分组
“序列一致性百分比”通过在比较窗口比较两个最佳比对序列来确定，其中对于两个序列的最佳比对，比较窗口中多核苷酸序列的部分可以包含与参考序列(例如，本发明的多肽)相比的添加或缺失(即，空位gaps)，而参考序列不包含添加或缺失的参考序列。通过确定在两个序列中出现一致核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数并将结果乘以100以得到序列一致性的百分比来计算比例。
在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下，术语“一致”或百分比“一致性”是指两个或更多个序列或子序列是相同序列。当在比较窗口进行比较和比对以获得最大对应关系，或者在使用以下序列比对算法之一或通过手动比对和目视检查时，如果两个序列具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域上，或当未指定时在整条序列上具有60％，可选地65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％一致性)，则两个序列“基本一致”。本发明提供分别与本文示例的多肽基本相同的多肽以及其用途，包括但不限于用于治疗或预防神经疾病或障碍(例如神经变性疾病或障碍)，和/或治疗SCI。可选地，一致性存在于长度为至少约50个核苷酸的区域上，或更优选长度为100至500或1000或更多个核苷酸的区域上，或参考序列的整个长度上。
对于序列比较，通常一条序列充当参考序列，测试序列与参考序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，如果需要指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，也可以指定替代参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。
如本文所用，“比较窗口”包括涉及选自由20至600，通常约50至约200，更通常约100至约150组成的组的任一数量的连续位置的片段，其中序列与具有相同数量连续位置的参考序列进行最佳比对之后，序列可与参考序列比较。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444的寻找相似性方法，通过这些算法的计算机化(WisconsinGenetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis)实现，或通过手动比对和目视检查(参见，例如，Ausubel etal.,Current Protocols in Molecular Biology(1995supplement))进行。
适用于确定序列一致性百分比和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul et al.(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402，和Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短字(words)来识别高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中的相同长度的字比对时，该短字匹配或满足一些正值阈值得分T。T被称为相邻字得分阈值(Altschul et al.,同上)。这些最初的相邻字命中作为种子，用于启动搜索以找到包含它们的更长的HSP。只要可以增加累积比对得分，字命中就沿着每条序列在两个方向上延伸。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积分数。在以下情况下，停止每个方向上的字命中的扩展：累积比对得分从其最大实现值下降数量X；由于一个或更多个负评分残基比对的累积，累积评分为零或低于零；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长为3，期望值(E)为10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较作为默认值。
BLAST算法还对两条序列之间的相似性进行统计学分析(参见，例如，Karlin andAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。BLAST算法所提供的一种相似性测量是最小和概率(P(N))，其提供了对两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.2，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。
“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，以及其互补物。该术语涵盖含有已知的核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接，其是合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有与参考核酸相似的结合特性，并且以类似于参考核酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯，2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
如本文所用，术语蛋白质的“显性失活突变体”是指缺乏野生型活性的突变多肽或核酸，并且其一旦在细胞中表达，其中相同蛋白质的野生型也表达，支配野生型蛋白质并有效地与野生型蛋白质竞争底物、配体等，从而抑制野生型分子的活性。显性失活突变体可以是具有与野生型蛋白质基本相似(即，至少约75％，约80％，约85％，约90％，约95％相似)的氨基酸序列的多肽。显性失活突变体也可以是包含野生型蛋白片段的多肽(例如野生型蛋白的C-结构域)。显性失活突变体可以是野生型蛋白质的截短形式。
小鼠模型
如本文所用，“转基因生物”是指动物仍处于其胚胎期时在其中引入外源DNA的动物。在大多数情况下，转基因方法旨在基因组的特定修饰(例如通过将完整转录单元引入基因组中，或通过上调或下调或突变预先存在的细胞基因)。这些程序中一些的靶向特征将转基因技术与赋予种系随机突变的实验方法(例如施用化学诱变剂或用电离溶液处理)区别开来。转基因生物可包括具有基因敲除或可引起诱导基因突变的生物。
“遗传敲除”是指细胞中的内源DNA序列编码的蛋白质表达的部分或完全抑制。“敲除”可以通过靶向缺失编码蛋白质的基因的全部或部分来影响。或者，可以通过胚胎干细胞中功能性蛋白的靶向突变来获得转基因生物。结果，缺失或突变可以阻止或减少蛋白质在其正常表达的整个动物的任何细胞中的表达，或导致具有不同于正常/野生型蛋白质的生物学功能的突变蛋白的表达。
术语“敲除动物”和“转基因动物”是指转基因动物，其中，给定基因已经通过与靶向载体重组而被抑制或突变。需要强调的是，该术语旨在包括所有后代。因此，包括创始动物和所有其F1，F2，F3等子代。
如本文所用，短语“条件性敲除”或“cKO”，当用于描述诸如小鼠的非人转基因哺乳动物时，是指在某些组织中敲除特定基因的小鼠。基因工程cKO小鼠的产生涉及将特定DNA序列(诸如敲除构建体/载体)***小鼠DNA中。***的序列被两种DNA特异性酶识别，即frt重组酶(也称为翻转酶)和Cre重组酶，通常不存在于小鼠中。Cre重组酶识别位点称为loxP位点，而flippase识别位点称为frt位点。这些酶中的每一种都可以切割和去除侧翼为其识别位点的DNA序列。如果去除目的基因的功能性DNA序列，这可能导致基因功能的破坏。另外，将选择标记基因***小鼠中，该引入允许选择含有Cre重组或翻转酶识别位点的胚胎小鼠细胞(干细胞)。得到的小鼠是条件性敲除小鼠。
敲除构建体是核酸序列(诸如DNA构建体)，当其被引入细胞时，导致细胞中内源DNA编码的多肽或蛋白质的表达的抑制(部分或完全)。本文提供了示例性敲除构建体。该构建体含有至Ryx基因外显子3的loxP位点5'和至Ryx基因外显子6的loxP位点3'、选择标记盒和至选择标记盒的loxP位点3'。选择标记盒包含至选择标记的frt位点5'和3'，位于3'frt位点和选择标记基因之间。合适的选择标记包括但不限于新霉素、嘌呤霉素和潮霉素。
含有一种以上转基因构建体和/或一种以上转基因表达构建体的动物可以以几种方式中的任何一种制备。制备的示例性方式是产生一系列动物，每个动物含有一种所需的转基因表型。这些动物通过一系列杂交、回交和选择而一起繁殖，最终产生含有所有所需转基因性状和/或表达构建体的单一动物，其中动物与野生型同源(遗传相同)，除了存在构建体和/或转基因。
因为胚胎干细胞的能力而通常选择胚胎干(ES)细胞，整合到发育中的胚胎的种系中并成为其一部分，从而产生转基因的种系传递。因此，任何能够这样做的ES细胞系都适用于本文。使用本领域技术人员熟知的方法产生和维持ES细胞(诸如由Doetschman et al.(1985)J.Embryol.Exp.Mol.Biol.87:27-45描述的那些)。可以使用任何ES细胞系，然而，通常以使细胞整合并成为发育中胚胎的种系的一部分，从而产生转基因/敲除构建体的种系传递的能力而选择所选择的细胞系。因此，任何被认为具有这种能力的ES细胞系都适用于本文。通常用于产生ES细胞的一种小鼠品系是129J品系。另一种ES细胞系是鼠细胞系D3(美国典型培养物保藏中心，目录号CKL 1934)。另一种ES细胞系是WW6细胞系(Ioffe et al.(1995)PNAS 92:7357-7361)。使用本领域技术人员熟知的方法培养和制备细胞用于敲除构建体***，诸如Robertson在Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A PracticalApproach,E.J.Robertson,ed.IRL Press,Washington,D.C.(1987)中提出的；和Bradleyet al.(1986)Current Topics in Devel.Biol.20:357-371；以及Hogan et al.(Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1986))。
可以使用本领域熟知的多种方法将敲除构建体引入ES细胞中，包括例如电穿孔、显微注射和磷酸钙处理。为了引入DNA序列，在适当的条件下将敲除构建体DNA加入ES细胞中以进行所选择的***方法。如果要对细胞进行电穿孔，则使用电穿孔机(电转化仪)并遵循制造商的使用指南将ES细胞和构建体DNA暴露于电脉冲。电穿孔后，使细胞在合适的孵育条件下恢复。然后以敲除构建体的存在筛选细胞。可以使用多种方法筛选含有转基因(同源重组体)的细胞。例如，如本文所述，可以根据需要处理细胞以使其中的DNA可用于通过聚合酶链反应(PCR)用特异性探针筛选。
一旦鉴定出合适的ES细胞，就使用标准方法将其引入胚胎中。例如，可以使用显微注射引入。获得处于ES细胞整合的适当发育阶段的胚胎(诸如通过灌注怀孕雌性的子宫)。例如，可以获得3-4天发育的小鼠胚胎，并使用微量移液管注射ES细胞。在将ES细胞导入胚胎后，将胚胎引入假孕雌性小鼠的子宫中。选择假妊娠的阶段以增加成功植入的机会。在小鼠中，2-3天的假孕雌性是合适的。
将ES细胞成功掺入植入的胚胎中引起的后代称为嵌合体。通过标准方法鉴定能够种系传递突变等位基因的嵌合体。繁殖嵌合体并筛选所得后代中是否存在所期望的改变(例如，修饰的重组Ryk等位基因)。这可以例如基于毛色或通过从后代(例如尾DNA)获得DNA以使用已知方法(例如，Southern分析，斑点印迹分析，PCR分析)来筛选。还可以通过已知方法(诸如Northern分析或PCR分析)评估转基因表达(例如，以确定是否表达了替代构建体)。可以进行后代DNA(例如尾部DNA)的Southern杂交或PCR分析以鉴定所期望的基因型。用于获得完全ES细胞衍生的转基因非人生物的合适技术描述于WO 98/06834中，其通过引用并入本文。
在各种实施方案中，本文公开的cKO小鼠包括至少三种元件：(1)位于靶基因的关键部分侧翼的至少两个酶特异性识别位点；(2)编码选择标记的基因，诸如但不限于新霉素；(3)在选择标记基因侧翼的至少两个酶特异性识别位点，用于在用特异性小鼠品系繁殖后容易除去。在一个非限制性实例中，靶基因的外显子3-6已被指定为关键部分。在一个实施方案中，靶基因关键部分侧翼的酶特异性识别位点是loxP位点。在另一个实施方案中，选择标记基因侧翼的酶特异性识别位点是frt位点。
如上所述，上述“敲除”和/或“敲入”构建体的同源重组有时是罕见的，并且这样的构建体可以非同源地***对已靶向缺失的基因没有影响的基因组的随机区域，并且其可能潜在地重组，从而破坏另一个本来不打算改变的基因。可以通过修饰上述靶向载体来选择这种非同源重组事件，使得其两端都是阴性选择标记(特别是通过使用白喉毒素基因、胸苷激酶基因)，其多肽产物可以选择在本领域熟知的适当组织培养基中表达细胞系-例如，含有诸如更昔洛韦的药物的细胞系。所得到的包含阴性选择标记的打靶载体与基因组之间的非同源重组通常引起这些阴性选择标记基因中的一个或两个的稳定整合，并且因此可以通过在适当的选择性培养基(例如含有诸如更昔洛韦的药物的培养基)中的生长来选择已经经历非同源重组的细胞。同时选择阳性选择标记和排除阴性选择标记，将引起克隆的富集，其中构建体已在待突变的基因的位点处同源重组。在所得干细胞系中靶基因位点上预计的染色体改变的存在可以通过本领域技术人员熟知的核酸印迹分析技术来确认。或者，可以使用PCR。
制备转基因动物的其他方法也是通常已知的。例如，参见Manipulating theMouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。还可以例如通过同源重组以***靶序列产生重组酶依赖性转基因生物，从而可以通过重组酶序列控制Ryk基因失活的组织特异性和/或时间控制。
因此，在一个方面，本发明提供了转基因非人哺乳动物(诸如小鼠)，其基因组包含Ryk基因的杂合或纯合缺失、失活或敲除以及其的制备方法。在各种实施方案中，小鼠具有表型卷曲蛋白3-/-Ryk+/-。在各种实施方案中，小鼠含有Ryk基因的皮质脊髓束(CST)特异性破坏。在各种实施方案中，破坏的Ryk基因包括重组Ryk等位基因、选择标记、位于选择标记侧翼的frt位点，以及位于等位基因的一部分侧翼的loxP位点。标记可以是PGK Neo，并且loxP位点可以位于等位基因的外显子3-6的侧翼。还提供了源自转基因非人哺乳动物的分离细胞。
神经元
如本文所用，术语“神经元”包括神经元及其一部分或多部分(例如，神经元细胞体、轴突或树突)。本文所用的术语“神经元”表示神经***细胞，其包括中央细胞体或体细胞，以及两种类型的延伸或突出：树突，通常，大部分神经元信号通过树突传递至细胞体，和轴突，通常，大部分神经元信号通过轴突从细胞体传递到效应细胞(诸如靶神经元或肌肉)。神经元可以将信息从组织和器官传递到中枢神经***(传入神经元或感觉神经元)，并将信号从中枢神经***传递到效应细胞(传出神经元或运动神经元)。其他神经元，称为中间神经元，连接中枢神经***(大脑和脊柱)内的神经元。可以进行根据本发明的治疗或方法的神经元类型的某些具体实例包括小脑颗粒神经元、背根神经节神经元和皮质神经元。
术语“神经元变性”广泛使用并且指神经元细胞中的任何病理变化，包括但不限于神经元细胞的死亡或丧失、细胞死亡之前的任何变化，以及神经细胞的功能或活动的任何减少或丧失。病理变化可以是自发的或可以由任何事件诱导，并且包括例如与细胞凋亡相关的病理变化。神经元可以是任何神经元，包括但不限于感觉神经元、交感神经神经元、副交感神经元或肠神经元(例如背根神经节神经元)、运动神经元和中枢神经元(例如来自脊髓的神经元)。神经元变性或细胞损失是多种神经疾病或障碍(例如神经变性疾病或障碍)的特征。在一些实施方案中，神经元是感觉神经元。在一些实施方案中，神经元是运动神经元。在一些实施方案中，神经元是受损的脊髓神经元。
在一些实施方案中，变性发生在神经元的一部分中(诸如神经元细胞体，轴突或树突)。因此，可以在神经元变性的一部分或多部分中抑制变性。在一些实施方案中，抑制神经元轴突的变性。在一些实施方案中，抑制神经元细胞体的变性。轴突可以是任何神经元的轴突。例如，在一些实施方案中，轴突是脊髓连合轴突，或上运动神经元轴突，或中枢神经***轴突。
如本文所述，所公开的方法可以在体内进行(诸如治疗神经变性疾病、神经障碍或神经***损伤)。该方法也可以在体外或离体进行(诸如在神经元功能的实验室研究和神经移植物或移植体的治疗中)。因此，在一些实施方案中，神经元形成神经移植物或神经移植体的一部分。在一些实施方案中，神经元是离体或体外的。在一些实施方案中，神经移植物或神经移植体形成生物体的一部分，人或非人(例如哺乳动物、灵长类动物、大鼠、小鼠、兔、牛、狗、猫、猪等)。
轴突变性
轴突变性是许多神经和神经变性疾病/障碍和创伤性损伤中的共同特征。研究表明其可以独立于神经细胞体的死亡和死亡之前发生。然而，轴突变性和保护的分子和细胞机制仍不清楚。阐明激活的变性途径或在轴突病理过程中失活的保护途径将有助于开发保持轴突完整性和增强再生的特定治疗剂。
在神经***发育期间，轴突对促进其生长以及抑制其生长的细胞外信号响应。一些细胞外诱因吸引轴突向更高浓度生长，而其他诱因排斥轴突以远离高浓度。调节这些相反的轴突响应的信号通路对轴突的延伸和去除具有深远的影响，尽管其在成熟轴突中的功能尚未被充分表征。研究表明，轴突导向分子可能在神经/神经变性疾病中起作用(诸如肌萎缩侧索硬化症(ALS))。
非典型蛋白激酶C(aPKC)，包括PKCζ和PKCι/λ，在包括细胞极化和存活的许多细胞过程中起关键作用。在神经元中，aPKC参与细胞极性(7-13)、神经突分化(11-13)和轴突导向(14)(15)。aPKC通过Wnt-卷曲蛋白3信号传导介导对Wnts的轴突吸引和连合轴突的前-后轴突导向(14)(15)。通过aPKC与Par6和Par3的相互作用，通过调节微管亲和力的活性，aPKC是海马神经元轴突规范所必需的，微管亲和力调节对微管相关蛋白Tau磷酸化的激酶MARK2和微管组装(9)。在神经元极化期间，aPKC由介导Wnt信号传导的散乱蛋白(Dvl)调节(11)。aPKC还参与了包括神经细胞在内的许多不同细胞类型的促存活信号传导(16-23)。然而，尚未阐明aPKC在神经元中的促存活功能的潜在机制。本公开证明使用显性失活构建体或豆蔻酰化非典型PKC假底物抑制aPKC促进轴突变性和神经元凋亡。这些生物化学研究表明，aPKC的抑制通过增加MARK2活性和Tau磷酸化导致微管去稳定化，导致轴突变性，并最终通过激活JNK-cJun途径导致神经元细胞体死亡。这与aPKC/Par6/Par3如何参与神经元极性和促进轴突延伸的信号机制相同(9)。总之，这些结果表明，一旦轴突形成，通过促进微管组装和稳定性，在初始轴突发育和维持期间的轴突伸长都需要aPKC。
Ryk是结合Wnt的非典型受体酪氨酸激酶。有趣的是，Ryk在发育过程中介导轴突排斥(24-27)并且在成年期创伤性损伤后抑制轴突可塑性(28-33)。阻断Ryk信号传导进入受损的背脊髓可防止轴突回缩，并可促进轴突再生(32)。最近，在疾病进展的早期阶段，发现Ryk在ALS小鼠模型中的运动神经元和腹侧脊髓轴突中的表达增加，表明Ryk可能参与触发ALS神经变性的早期事件(6)。在这项研究中，首先测试了Ryk是否调节aPKC。本文描述的发现显示在Ryk KO神经元中aPKC活性增加，表明Ryk可能通常抑制aPKC。这是Ryk和aPKC之间相互作用的新发现，这也可能与了解Ryk如何介导轴突排斥有关。
然后确定阻断Ryk信号传导是否可以防止由aPKC抑制诱导的轴突变性以及分析了Ryk敲除(KO)小鼠中的神经元死亡。这些研究表明，用特异性抗体或通过Ryk KO抑制Wnt/Ryk信号传导降低了aPKC诱导的轴突变性。因为Ryk和卷曲蛋白3KO小鼠在出生时死亡，所以探索了出生前正在经历神经元死亡的大脑区域。结果发现皮质区域显示神经元死亡的明显证据，其可通过E18.5定位于新皮质和海马之间的后皮质皮质(RSP)处的Casp3染色检测到。
与提出的Ryk在促进变性中的作用一致，在E18.5Ryk KO胚胎中凋亡减少。此外，发现在卷曲蛋白3KO胚胎的E18.5的RSP中的细胞凋亡大大增加，并且这种增加在Ryk+/-卷曲蛋白3-/-胚胎中显著减弱，揭示了卷曲蛋白3和Ryk之间的遗传相互作用。应该注意的是，小鼠基因组中有10个卷曲蛋白。只有RSP显示aCasp3免疫反应性明显增加的事实表明卷曲蛋白家族成员在此阶段皮质神经元保护中存在显著的功能冗余。不能排除大脑的其他区域在稍后的时间点(包括新生儿阶段)会显示细胞死亡增加。在卷曲蛋白3KO胚胎中，只有皮质的RSP区域显示出强烈的死亡增加(5倍)，进一步表明该区域在出生前是最脆弱的。有趣的是，当Ryk减少一半时，死亡的增加显著减少。
以相反方式调节aPKC的两种相反Wnt受体之间的这种遗传相互作用进一步证实了aPKC的重要作用和Wnt在调节神经元存活中的复合功能。这也与最近的一项研究一致，该研究显示卷曲蛋白3是脊髓运动轴突在初始轴突生长后存活所必需的(52)。最近的另一项研究还表明，平面细胞极性信号通路介导轴突导向，而aPKC参与扩增生长锥导向中的平面细胞极性信号传导(53)(15)。研究表明，Ryk抑制平面细胞极性信号传导(54)(55)。在这里，数据显示Ryk和aPKC在介导轴突和神经元存活中发挥相反的作用。因此，这些发现将有助于解开神经***用于精心组装神经回路的复杂分子信号传导途径，其破坏可能是神经/神经变性障碍的基础。
抑制神经元变性的方法
因此，本发明提供了通过使神经元与试剂接触来调节神经细胞生长的方法和组合物，从而抑制神经元的变性。在各种实施方案中，所述试剂可以是抗Ryk单克隆抗体或抗体片段，其特异性结合影响Wnt信号通路的Wnt的结合域。这些方法和组合物可用于多种神经生长和再生将是有益的的治疗环境中。例如，影响Wnt信号通路的抗Ryk抗体或抗体片段可用于沿着SCI患者的A-P轴刺激受损神经元的轴突生长。因为已经观察到Wnt在脑中的几个区域中表达并且Wnt信号通路的组分也存在于其他中枢神经***神经元的轴突中，所以本文所述的抗Ryk抗体或抗体片段可用于调节中枢神经***中轴突的生长和定向导向是有可能的。
在一些实施方案中，与神经元对照群体相比，如本文所述的方法引起在神经元群体的变性或神经元群体中的神经元轴突或细胞体或树突的变性至少10％的减少(例如，至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55、％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或甚至100％减少)。在一些实施方案中，与未给予本文所述的一种或多种试剂的受试者中变性的神经元(或其神经元体、轴突或树突)的数量相比，如本文所述的方法引起在受试者中变性的神经元(或其神经元体、轴突或树突)的数量至少10％的减少(例如，至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％减少)。在一些实施方案中，如本文所述的方法引起神经/神经变性疾病或障碍和/或病症中的一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8或9)症状至少10％的减少(例如，至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或甚至100％减少)。在一些实施方案中，如本文所述的方法引起发生神经/神经变性疾病或障碍和/或病症的可能性至少10％的减少(例如，至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％降低)。
抑制神经元变性的方法包括体外、体内和/或离体方法。在一些实施方案中，所述方法在体内实施，即，将抑制神经元变性的试剂施用于受试者。在一些实施方案中，所述方法是离体实施的，即待治疗的神经元形成受试者的神经移植物或神经移植体的一部分。在一些实施方案中，所述方法在体外实施。
抑制神经元变性的方法可用于抑制或预防新诊断为患有神经/神经变性疾病或障碍或有发展新神经/神经变性疾病或障碍风险的患者的神经元变性。另一方面，抑制神经元变性的方法也可用于抑制或预防已经患有或具有神经/神经变性疾病或障碍症状的患者的进一步神经元变性。预防神经元变性包括减少或抑制神经元变性，其可以通过完全或部分抑制神经元变性来表征。例如，这可以通过分析神经功能来评估。
脊髓损伤(SCI)
大部分脊髓损伤患者具有不完全损伤，其中脊髓组织的部分保持完整。由于受损的成年脊髓中的强抑制环境，特别是神经胶质瘢痕，以及成年轴突的生长潜力降低，原始连接通常不能恢复。尽管如此，通过康复训练，复杂的回路可以进行重塑以实现不同程度的功能恢复。
脊髓损伤后皮质脊髓运动***的功能恢复是最重要的，因为其对恢复自主运动控制至关重要。然而，在啮齿动物中，皮质脊髓束(CST)的作用更加有限，对运动和后肢使用几乎没有影响。尽管如此，CST对熟练的前肢运动控制至关重要。在主要CST的背柱损伤后，精细运动技能丢失，具有不同程度的自发恢复。
为了理解神经回路如何重组以在损伤后恢复功能，进行功能、结构和行为分析。本公开证明招募使得皮质区域不再用于后肢的运动皮质重新映射以控制前肢以实现在背柱损伤后的功能恢复，并且这种重组需要持久训练。本公开内容还显示去除作为轴突导向诱因Wnts的受体Ryk，与康复训练相结合，引起更大的CST轴突可塑性和皮质回路重塑，其引起最大功能恢复。在Ryk条件性敲除损伤小鼠中观察到的皮质控制映射中更加渐进和持久的变化可能是由于在没有Wnt-Ryk信号传导的脊髓和皮质回路内的连接性的增强变化。先前发现Wnt-Ryk信号传导控制在发育中的视觉***中地形映射形成。本公开揭示了Wnt-Ryk信号传导在控制成年期脊髓损伤后运动皮质重新映射中的新功能。
先前的工作已经证明，在发育中调节轴突导向的Wnt信号传导对成年脊髓损伤后的轴突可塑性具有深远的影响。在脊髓损伤后表征运动输出映射，并因此前肢运动映射扩散到受损伤影响的邻近区域。观察到屈肌控制区域朝向向最初负责后肢运动的皮质区域尾侧和内侧扩张(图7A，7B，13A和13B)。这些变化可能是一成不变的，因为手腕屈肌模型表现出如同其恢复时的内侧移位，类似于观察到灵长类动物中数字表示的移位(图7A，13A和13B)。
为了特异性地测试神经元中Wnt-Ryk信号传导的功能，产生编码排斥性Wnt受体的Ryk的条件等位基因，进行运动皮质特异性敲除，以及然后在颈水平5(CS)损伤背柱。在Ryk条件性敲除后，在背柱损伤后12周，小鼠在熟练的前肢到达任务恢复至损伤前水平峰值的81±7％，而野生型对照小鼠仅为60±5％。这种额外的恢复取决于损伤头侧的主要CST区段(C3-CS)，因为C3处的再次背柱损伤将功能恢复降低至对照水平。结构分析显示，在CS损伤之上和之下CST的侧枝出芽显著增加，并且在这些轴突芽中具有突触前的斑点。
使用光遗传学方法，监测运动皮质的输出映射。结果发现，在CS背柱损伤后，前肢肘关节屈曲可以立即被更大的皮质区域激活，而前肢伸展则丧失。随着时间的推移，激活前肢屈曲的区域缩小回原始大小，并且招募用于激活后肢的新区域以激活前肢伸展。在C3处的再次损伤之后，前肢屈曲的控制丢失，但是前肢伸展的新控制在很大程度上不受影响。在Ryk cKO中，这些变化更加渐进和持久。最后，未经历每周行为测试的小鼠仅显示有限的熟练前肢恢复，其性能类似于在损伤后一周测试的小鼠的性能。在没有每周测试的情况下，无论Ryk条件缺失如何，皮质运动映射的细化也受到损害，突出了目标可塑性的重要性。
多年来已经在脊髓损伤患者中注意到运动输出映射的改变，但是神经回路机制仍然是未知的。众所周知，早在脊髓损伤后一周，幼稚横断后肢突出的皮质脊髓神经元就会出芽到颈髓。然而，仅在3天后观察到的损伤水平之上的运动映射的早期扩展不太可能是由于出芽和新连通性模式的建立；相反，不受理论束缚，可能是由于皮质内侧向抑制的丧失。然而，在脊髓损伤后4周，皮质映射可能反映了颈脊髓中重塑皮质脊髓回路的输出。观察到在Ryk缺失后诱导的较多CST轴突侧支数目引起与损伤部位远端的运动单位的连接略微增加，但是与损伤头侧的那些强烈增加(图2H和3D)。因此，损伤水平以上的连通性变化可能是皮质映射变化的主要来源(图7F)。例如，损伤后4周肱二头肌的初始扩张，以及随后8周时的缩小，可能是由于CST侧枝的初始出芽，这些侧枝通常突出到颈髓前肢运动单位，随后通过赫布竞争(Hebbian competition)进行剪枝。用于肱三头肌控制的后肢皮质区域的募集可以源自从最初控制后肢的皮质脊髓神经元到颈脊髓的前肢运动单元的新生连接。这些芽可以直接接触运动单位或使用脊髓固有神经元形成分程传递。条件性缺失皮质脊髓神经元中的Ryk可增强侧枝芽，从而募集更多的脊髓回路，这一过程可能是自发熟练前肢控制的更大恢复的基础。脊髓中抗体输注实验的结果表明，颈脊髓中的回路重塑足以促进功能恢复。然而，主要运动皮质内的连通性变化也有助于整个回路的重塑似乎是合理的。
其他下行路径也涉及精细运动控制，并且可以部分地补偿熟练的前肢到达任务上的CST输入的损失。此外，通过补偿性前肢运动，锥体不完全损伤的动物已经显示了表现出与完整对照动物相比的熟练前肢到达的相似成功率，表明一小部分幸免的CST能够恢复完整的(如果改变的话)熟练的前肢到达任务功能。在59％的Ryk cKO小鼠和100％的Ryk单克隆抗体输注的动物中，观察到熟练前肢的恢复达到或高于损伤前水平峰值的水平。这种完全恢复显然需要新的CST连接到损伤头侧，正如再次C3损伤消除了增强的恢复。虽然CST不是介导控制熟练前肢伸展的唯一组件，但是其是恢复功能所必需的，因为在本文所述的小鼠模型中的锥体束切断术完全消除了伸缩和抓握行为。这些结果表明恢复至少一些CST功能是损伤后运动控制恢复的关键组成部分，因为其他区域的补偿可塑性驱使啮齿动物的有限恢复，其对运动控制的CST的依赖性低于灵长类动物。
本公开还证明Ryk单克隆抗体可以是治疗工具，因为在损伤后阻断Ryk功能引起功能恢复的改善。这里已经表明，通过结合针对前肢功能(持续达到和抓握训练)的靶标可塑性和分子操作，可以实现前肢的最大恢复。因此，预期将其他功能的靶标可塑性与分子操作相结合可以允许恢复其他运动或感觉功能。大部分患者脊髓损伤不完全，为恢复提供了基础。本公开说明促进回路可塑性是脊髓不完全损伤后恢复最大功能的有前景的方法。
Wnt多肽
Wnt是分泌的富含半胱氨酸的糖基化蛋白质，其在多种不同的生物的发育中起作用。由于许多不同的物种具有多个保守的Wnt基因，因此认为Wnt在多种发育和生理过程中起作用(McMahon,1992；Nusse and Varmus,1992)。Wnt生长因子家族包括在哺乳动物中鉴定的至少19种基因，包括Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和Wnt16。在其他脊椎动物物种中存在相似数量的Wnt基因(参见，例如，美国公开号2011/0065645，其通过引用整体并入本文)。当然，将来可以发现和/或表征进一步的Wnt，并且本领域技术人员将能够在本发明的上下文中使用任何这样的Wnt。此外，本领域技术人员将能够使用本文的教导来获得和使用本发明上下文中的任何物种的Wnt。
抗Ryk抗体
本发明的抗体可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、鼻内，以及(如果需要局部治疗)病灶内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内和皮下施用。另外，抗体可以通过脉冲输注施用，特别是在抗体剂量下降的情况下。给药可以通过任何合适的途径，例如通过注射(诸如静脉内或皮下注射)，部分取决于施用是短暂的还是慢性的。
如本文所用，术语“抗体”以其最广泛的含义使用，包括多克隆和单克隆抗体，以及此类抗体的抗原结合片段。抗体的部分特征在于其特异性结合抗原，特别是抗原的一个或多个表位。当用于提及抗体时，术语“特异性结合”或“特异性结合活性”等意指抗体与特定表位的相互作用具有至少约1×10-6M的解离常数，通常至少约1×10-7M，通常至少约1×10- 8M，以及特别至少约1×10-9M或1×10-10M或更低。因此，保留特异性结合活性的抗体的Fab、F(ab')2、Fd和Fv片段包括在抗体的定义内。
如本文所用的术语“抗体”包括天然存在的抗体以及非天然存在的抗体，包括例如单链抗体、嵌合、双功能和人源化抗体，以及其抗原结合片段。这种非天然存在的抗体可以使用固相肽合成来构建，可以重组产生或可以例如通过筛选由可变重链和可变轻链组成的组合文库来获得(参见Huse et al.,Science 246:1275 1281,1989,其通过引用并入本文)。制备例如嵌合、人源化、CDR移植、单链和双功能抗体的这些和其他方法是众所周知的(Winter and Harris,Immunol.Today 14:243-246,1993；Ward et al.,Nature 341:544-546,1989；Harlow and Lane,Antibodies:A laboratory manual(Cold Spring HarborLaboratory Press,1999)；Hilyard et al.,Protein Engineering:A practicalapproach(IRL Press 1992)；Borrabeck,Antibody Engineering,2d ed.(OxfordUniversity Press 1995)；其中每一篇都通过引用并入本文)。另外，修饰的或衍生的抗体或抗体的抗原结合片段(诸如聚乙二醇化(聚乙二醇修饰的)抗体)，可用于本方法。
可以使用本领域熟知的多种方法测试抗体的抗靶标多肽活性。可以使用各种技术进行筛选以鉴定具有期望特异性的抗体，包括各种免疫测定(诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)，包括直接和配体捕获ELISA、放射免疫测定(RIA)、免疫印迹)和荧光激活细胞分选(FACS)。使用具有确定特异性的多克隆或单克隆抗体进行竞争性结合或免疫放射测定的许多方案是本领域熟知的。此类免疫测定通常涉及测量靶标多肽和特异性抗体之间的复合物形成。使用对靶标多肽上的两个非干扰表位具有反应性的单克隆抗体的双位点，基于单克隆的免疫测定是优选的，但也可以使用其他测定(诸如竞争性结合测定)。参见，例如，Maddox et al,1983,J.Exp.Med.158:1211。
在制备和施用抗体时可以考虑本发明中使用的抗体的结合靶的位置。当结合靶是细胞内分子时，提供本发明的某些实施方案将抗体或其抗原结合片段引入结合靶所在的细胞中。在一个实施方案中，本发明的抗体可以在细胞内表达为胞内抗体。如本文所用，术语“胞内抗体”是指在细胞内表达并且能够选择性结合靶标分子的抗体或其抗原结合部分，如Marasco,Gene Therapy 4:11-15,1997；Kontermann,Methods 34:163-170,2004；U.S.公开号6,004,940和6,329,173；U.S.专利申请公开号No.2003/0104402，以及PCT公开号WO 03/077945中所述。通过将编码所期望抗体或其抗原结合部分的核酸(缺少野生型前导序列和通常与编码该抗体或抗原结合片段的基因相关的分泌信号)引入靶标细胞中来实现胞内抗体的细胞内表达。可以使用将核酸引入细胞的任何标准方法，包括但不限于显微注射、弹道注射、电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质体和用携带感兴趣的核酸的逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和牛痘载体转染。
在另一个实施方案中，提供了内化抗体。抗体可以具有某些特征，这些特征可以增强抗体向细胞的递送，或者可以被修饰以具有这些特征。实现此目的的技术在本领域中是已知的。例如，已知抗体的阳离子化促进其摄入细胞(参见，例如，美国专利号6,703,019)。脂质转染或脂质体也可用于将抗体递送到细胞中。在使用抗体片段的情况下，特异性结合靶蛋白结合域的最小抑制片段通常是有利的。例如，基于抗体的可变区序列，可以设计保留结合靶标蛋白序列的能力的肽分子。这些肽可以化学合成和/或通过重组DNA技术产生(参见，例如，Marasco et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:7889-7893,1993)。
可以通过本领域已知的方法增强调节多肽向靶标细胞的进入。例如，某些序列(诸如衍生自HIV Tat或触角足突变同源结构域蛋白的序列)能够引导异源蛋白跨细胞膜的有效摄取(参见，例如，Chen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:4325-4329,1999)。
当结合靶位于脑中时，本发明的某些实施方案提供抗体或其抗原结合片段穿过血脑屏障。某些神经/神经变性疾病与血脑屏障的渗透性增加有关，使得抗体或抗原结合片段可以容易地引入脑中。当血脑屏障保持完整时，存在几种本领域已知的方法用于运输分子穿过血脑屏障，包括但不限于物理方法、基于脂质的方法，以及基于受体和通道的方法。
将抗体或抗原结合片段运输穿过血脑屏障的物理方法包括但不限于完全绕过血脑屏障，或通过在血脑屏障中产生开口。绕过方法包括但不限于直接注射到大脑中(参见，例如，Papanastassiou et al.,Gene Therapy 9:398-406,2002)，间质输注/对流增强递送(参见例如Bobo et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:2076-2080,1994)，以及将递送装置植入脑中(参见，例如，Gill et al.,Nature Med.9:589-595,2003；和Gliadel WafersTM,Guildford Pharmaceutical)。在屏障中产生开口的方法包括但不限于超声(参见例如美国公开号2002/0038086)、渗透压(例如，通过施用高渗甘露醇(Neuwelt,E.A.,Implicationof the Blood-Brain Barrier and its Manipulation,Volumes 1and 2,Plenum Press,N.Y.,1989))、通过例如缓激肽或透化剂A-7透化(参见，例如，美国专利号5,112,596、5,268,164、5,506,206和5,686,416)，以及用含有编码抗体或抗原结合片段的基因的载体转染跨越血脑屏障的神经元(参见，例如，美国公开号2003/0083299)
将抗体或抗原结合片段运输穿过血脑屏障的基于脂质的方法包括但不限于将抗体或抗原结合片段包封在脂质体中，该脂质体与抗体结合片段偶联，该抗体结合片段结合血脑屏障的血管内皮上的受体(参见，例如，美国公开号2002/0025313)，以及将抗体或抗原结合片段包被在低密度脂蛋白颗粒(参见，例如，美国公开号2004/0204354)或载脂蛋白E中(参见，例如，美国公开号2004/0131692)。
将抗体或抗原结合片段运输穿过血脑屏障的基于受体和通道的方法包括但不限于使用糖皮质激素阻断剂来增加血脑屏障的渗透性(参见，例如，美国公开号2002/0065259、2003/0162695和2005/0124533)；激活钾通道(参见，例如，美国公开号2005/0089473)、抑制ABC药物转运蛋白(参见，例如，美国公开号2003/0073713)；用转铁蛋白包被抗体并调节一种或多种转铁蛋白受体的活性(参见例如美国公开号2003/0129186)，以及使抗体阳离子化(参见例如美国专利号5,004,697)。
用于本发明方法的抗体组合物以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在此背景下考虑的因素包括所治疗的特定疾病、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、疾病的原因、试剂的递送部位、施用方法、施用方案以及医生所知的其他因素。抗体不必是，但可选地用一种或更多种目前用于预防或治疗成问题的障碍的试剂配制。这些其他试剂的有效量取决于制剂中存在的本发明抗体的量、障碍或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用途径，或者以本文所述剂量的约1％至99％，或以通过经验/临床确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，抗体的适当剂量(当单独使用或与其他试剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和进程、施用的抗体是用于预防还是治疗目的、先前的治疗、患者的临床病史和对抗体的响应，以及主治医师的判断。抗体适合一次或在一系列治疗中施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是用于施用于患者的初始候选剂量，例如是否通过一次或多次单独的施用，或通过连续输注。取决于上述因素，一种典型的日剂量可以为约1μg/kg至100mg/kg或更高。对于数天或更长时间的重复给药，取决于病症，通常持续治疗直至发生疾病症状所期望的抑制。抗体的一个示例性剂量范围为约0.05mg/kg至约10mg/kg。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一种或多种剂量。这些剂量可以间歇给药(例如每周或每三周一次(例如，使患者接受约2至约20，或例如约6个剂量的抗体))。可施用初始较高速效剂量，然后施用一次或多次较低剂量。示例性给药方案包括施用约4mg/kg的初始速效剂量，然后施用约2mg/kg抗体的每周维持剂量。然而，其他剂量方案可能是有用的。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。
在一些实施方案中，通过参考IgG说明不同的抗体区域，其包含四个氨基酸链-两个较长的重链和两个较短的轻链，其通过二硫键相互连接。重链和轻链各自包含恒定区和可变区。重链由重链可变区和重链恒定区组成。轻链由轻链可变区和轻链恒定区组成。在各种实施方案中，在可变区内存在三个负责抗原特异性的高变区。在各种实施方案中，高变区被称为互补决定区(CDR)并且***在称为框架区(FW)的更保守的侧翼区之间。在各种实施方案中，重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。
因此，在一个方面，本发明提供抑制Wnt-Ryk信号传导的抗Ryk抗体及其功能片段。在各种实施方案中，抗体是分离的单克隆抗体，其特异性结合Wnt的结合域以抑制Wnt-Ryk信号传导。本发明抗体关键区域的序列数据如表2和3所示：
表2：Ab5.5的序列数据
表3：Ab11.4的序列数据
因此，本发明提供了特异性结合Wnt的结合域以抑制Wnt-Ryk信号传导的抗体。因此，在各种实施方案中，本发明的抗Ryk抗体包括具有结合域的任何多肽或蛋白质，所述结合域与本文所述的特异性结合Wnt结合域的抗体可变区内的CDR组一致或基本上一致，(例如，与本文中的那些至少约80％一致，至少约85％一致，至少约90％一致，至少约95％一致或至少99％一致)。特别地，该抗体具有轻链可变区，其具有SEQ ID NO:1-3或SEQ ID NO:9、2和3中所示的CDR序列；和重链可变区，其具有SEQ ID NO:5-7或SEQ ID NO:5、11和12中所示的CDR序列。
在各种实施方案中，轻链可变区具有与SEQ ID NO:4或10具有至少85％序列一致性的氨基酸序列，可选与SEQ ID NO:4或10具有至少90％的序列一致性。在进一步的实施方案中，轻链可变区具有与SEQ ID NO:4或10具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，可选与SEQ ID NO:4或10具有至少99％的序列一致性。在进一步的实施方案中，抗Ryk抗体Ab5.5具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的轻链可变区。在进一步的实施方案中，抗Ryk抗体Ab11.4具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在各种实施方案中，重链可变区具有与SEQ ID NO:8或13具有至少85％序列一致性的氨基酸序列，可选与SEQ ID NO:8或13具有至少90％的序列一致性。在进一步的实施方案中，重链可变区具有与SEQ ID NO:8或13具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，可选与SEQ ID NO:8或13具有至少99％的序列一致性。在进一步的实施方案中，抗Ryk抗体Ab5.5具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的重链可变区。在进一步的实施方案中，抗Ryk抗体Ab11.4具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的重链可变区。
虽然重链可变区和轻链可变区可以分别与其他轻链可变区和其他重链可变区组合，只要可以维持与Wnt的结合域的特异性结合以抑制Wnt-Ryk信号结合，在一些实施方案中，抗Ryk抗体包括与SEQ ID NO:8所示氨基酸序列具有至少85％序列一致性的重链可变区，重链可变区进一步具有如SEQ ID NO:5-7所示的三个CDR序列；和与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列具有至少85％序列一致性的轻链区可变区，该轻链可变区还具有如SEQ ID NO:1-3所示的三个CDR序列。在一些实施方案中，抗Ryk抗体包括与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列具有至少85％序列一致性的重链可变区，重链可变区进一步具有如SEQ ID NO:5、11和12中所示的三个CDR序列；和与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少85％的序列一致性的轻链区可变区，该轻链可变区还具有如SEQ ID NO:9、2和3所示的三个CDR序列。
在进一步的实施方案中，重链可变区与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少90％的序列一致性，并且轻链可变区与SEQ ID NO:4氨基酸序列具有至少90％的序列一致性。在更进一步的实施方案中，重链可变区与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少95％的序列一致性，并且轻链可变区与SEQ ID NO:4氨基酸具有至少95％的序列一致性。在更进一步的实施方案中，重链可变区与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少99％的序列一致性，并且轻链可变区与SEQ ID NO:4的序列具有至少99％的序列一致性。在抗Ryk抗体AB5.5中，重链可变区具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在进一步的实施方案中，重链可变区与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少90％的序列一致性，并且轻链可变区与SEQ ID NO:10氨基酸序列具有至少90％的序列一致性。在更进一步的实施方案中，重链可变区与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少95％的序列一致性，并且轻链可变区与SEQ ID NO:10氨基酸具有至少95％的序列一致性。在更进一步的实施方案中，重链可变区与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少99％的序列一致性，并且轻链可变区与SEQ ID NO:10的序列具有至少99％的序列一致性。在抗Ryk抗体AB11.4中，重链可变区具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
如上所述，本发明包括在序列一致性百分比内抗体CDR周围的序列的变异。关于两个氨基酸或多核苷酸序列，术语“序列一致性百分比”是指当序列最佳比对时两个序列中一致的残基的百分比。因此，80％氨基酸序列一致性意味着两个最佳比对的多肽序列中80％的氨基酸是一致的。同样，85％氨基酸序列一致性意味着两个最佳比对多肽序列中85％的氨基酸是一致的；和90％，95％和99％的氨基酸序列一致性意味着两个最佳比对的多肽序列中的90％，95％和99％的氨基酸是一致的。
在CDR之外允许序列一致性的变化，因为并非重链和轻链可变区内的所有氨基酸残基都是在Wnt的结合域处结合Ryk所必需的。特别是在CDR之外的区域(诸如框架区)可以突变而不丧失Ryk结合能力。更进一步地，当应用CDR治疗不同物种时，框架区可以进一步突变并因此在序列上变化。可以通过使用以下命名法来描述突变或变异：位置(#)；取代的氨基酸残基。根据这种命名法，例如，甘氨酸残基取代位置上的丙氨酸残基可以表示为A#G，其中#代表位置。当给定位置的氨基酸残基被两个或更多个替代氨基酸残基取代时，这些残基被逗号或斜线分开。例如，用甘氨酸或谷氨酸取代丙氨酸可以表示为#G/E，或#G，#E。在相同位置的丙氨酸缺失可以显示为Ala#*或A#*或*#Ala或*#A，其中#是指氨基酸的位置。多个突变由加号或斜线分隔。例如，分别用甘氨酸和丝氨酸取代丙氨酸和谷氨酸的两个位置突变(每个用“#”表示)表示为A#G+E#S或A#G/E#S。当给定位置#的氨基酸残基被两个或多个备选氨基酸残基取代时，这些残基被逗号或斜线分开。例如，用甘氨酸或谷氨酸取代#位置的丙氨酸表示为A#G，E或A#G/E，或A#G，A#E。当在本文中鉴定出适合于修饰的位置#而没有提出任何特定修饰时，应理解任何氨基酸残基可以取代该位置中存在的氨基酸残基。因此，例如，当提及在#位置处丙氨酸的修饰但未指定时，应理解丙氨酸可被删除或取代任何其他氨基酸残基(即R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V中的任何一个)。
返回到SEQ ID NO:1-13，本发明可以定义为具有抗Ryk结合活性的一组CDR区；然而，在优选的实施方案中，CDR肽(各自对应于单个CDR)连接形成抗Ryk抗体，其具有用于特异性结合Wnt结合域的可变区。同样，抗体可变区可以存在于例如完整抗体、抗体片段(例如，F(ab)、F(ab')2、scFv、微抗体(minibody)、四抗体以及其它)或抗体或抗体片段的重组衍生物中。在一些方面，抗体可变区存在于重组衍生物中。重组衍生物的实例包括单链抗体、双抗体、三抗体，四抗体和微型抗体(miniantibody)。在一些实施方案中，抗Ryk抗体还含有识别相同或不同表位的一个或更多个可变区。
在各种实施方案中，本发明的抗Ryk抗体可以含有其他组分，包括但不限于除可变区或其他可变区之外的提供，或帮助提供有用和/或另外活性的组分。有用的活性包括，例如，抗体效应功能(诸如抗体依赖性细胞毒性)、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性和半衰期/清除率。在一些实施方案中，抗体效应功能由不同的宿主组分(诸如Fcγ受体，新生Fc受体(FcRn)和C1q)介导。在各种实施方案中，使用不同类型的抗体组分或改变用于增强效应功能。有用组分或改变的实例包括使用非岩藻糖基化的寡糖、改变为具有增加的稳定性的氨基酸、具有增强的与FcRn结合的氨基酸、改变为具有增强的与Fcγ受体结合的氨基酸，以及改变为具有降低到Fcγ受体结合亲和力的氨基酸。
在各种实施方案中，本发明的抗Ryk抗体可含有其他组分以改变蛋白质的生理化学性质，从而提供药理学优势。例如，在一些实施方案中，通过在用作治疗剂时降低毒性和提高分子的效率，聚乙二醇(“PEG”)与分子的附着改善安全性。生理化学改变包括但不限于构象、静电结合和疏水性的变化，其可以一起起作用以增加治疗剂的全身性保留。另外，通过附着PEG基团增加抗Ryk抗体或其功能片段的分子量，药理学优势可包括延长的循环寿命、增加的稳定性和增强的对宿主蛋白酶的保护。PEG附着还可以影响治疗基团对细胞受体的结合亲和力。PEG是由重复单元(-O-CH2-CH2-)组成，以使分子量聚合物的范围从400到大于15,000的非离子聚合物(例如，分子量高达400,000的PEG聚合物可商购)。掺入PEG或PEG的长链聚合物的方法是本领域熟知的(例如，描述于Veronese,F.M.,et al.,DrugDisc.Today 10:1451-8(2005)；Greenwald,R.B.,et al.,Adv.Drug Deliv.Rev.55:217-50(2003)；Roberts,M.J.,et al.,Adv.Drug Deliv.Rev.,54:459-76(2002)中)，其内容通过引用并入本文。本领域已知的其他聚合物偶联方法也可用于本发明。
因此，抗Ryk抗体或其功能片段可以与另一种功能分子衍生化、连接或共表达(例如另一种肽或蛋白质(例如Fab片段))。例如，抗体可以与一种或多种其他分子实体(诸如另一种抗体(例如，产生双特异性或多特异性抗体)、细胞毒素、细胞配体或抗原(例如，产生诸如免疫毒素的免疫缀合物))功能性连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他)。抗体还可以与其他治疗基团连接，例如放射性同位素、小分子抗癌药、抗炎剂或免疫抑制剂。因此，本发明包括多种抗体偶联物、双特异性和多特异性分子，以及融合蛋白，如本文所述，所有这些特异性结合Wnt的结合域或特异性结合Wnt上与参考抗体或抗体片段相结合的相同表位，或者与特异性结合Wnt的参考抗体或抗体片段交叉竞争。
核酸
还提供了编码抗Ryk多肽序列的核酸序列，其包括SEQ ID NO:1-13中的任一条。编码抗Ryk抗体的重组核酸特别适用于在宿主细胞中表达，所述宿主细胞实际上用作抗Ryk抗体的工厂。在各种实施方案中，通过从包括碱性/SDS处理、CsCl条带、柱层析、琼脂糖凝胶、电泳和本领域熟知的其他技术的标准技术从其他细胞组分或其他污染物(例如，细胞中存在的其他核酸或蛋白质)纯化和分离核酸。参见例如F.Ausubel,et al.,ed.(1987)CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,NewYork。在各种实施方案中，核酸是例如DNA或RNA，并且可以包含或不包含内含子序列。在优选的实施方案中，核酸是cDNA分子。在各种实施方案中，重组核酸提供编码抗Ryk抗体的重组基因，其独立地存在于宿主细胞基因组中或作为宿主细胞基因组的一部分。
在一些实施方案中，重组基因含有编码蛋白质的核酸以及用于蛋白质表达的调节元件。通常，存在于重组基因中的调节元件包括转录启动子、核糖体结合位点、终止子和可选存在的操纵子。启动子定义为指导RNA聚合酶与DNA结合并启动RNA合成的DNA序列。还可以存在抗体相关内含子。遗传密码的简并性是这样的，对于除了两个氨基酸以外的所有氨基酸，不止一个密码子编码特定的氨基酸。这允许构建编码蛋白质的合成DNA的核苷酸序列与本文公开的核苷酸序列显著不同，但仍然编码这种蛋白质。这些合成DNA旨在在本发明的范围内。
疾病
本文所述的抗Ryk抗体或抗体片段可用于抑制神经元(例如轴突)变性的方法中。因此，这些抗体或抗体片段可用于治疗例如(i)神经***障碍(例如，神经/神经变性疾病或障碍)，(ii)神经***之外具有主要作用的疾病、病症或治疗的继发神经***病症，(iii)由物理、机械或化学创伤引起的神经***损伤，(iv)疼痛，(v)眼相关神经变性变，(vi)记忆丧失，以及(vii)精神疾病。以下提供这些疾病、病症和损伤中的一些的非限制性实例。
可根据本发明预防或治疗的神经/神经变性疾病和病症的实例包括肌萎缩侧索硬化症(ALS)、三叉神经痛、舌咽神经痛、贝尔氏麻痹、重症肌无力、肌营养不良、进行性肌萎缩、原发性侧脑室硬化(PLS)、假性延髓麻痹、进行性延髓麻痹、脊髓性肌萎缩、进行性延髓麻痹、遗传性肌萎缩、无脊椎动物盘综合征(例如，突出、破裂和脱垂盘综合征)、颈椎病、丛神经障碍、胸廓出口破坏综合征、周围神经病、紫质症、轻度认知障碍、阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、帕金森附加病(如多***萎缩，进行性核上性麻痹和皮质基底核变性)、路易体痴呆、额颞叶痴呆、脱髓鞘疾病(例如，吉兰-巴雷综合征和多发性硬化症)、腓骨肌萎缩症(CMT；也称为遗传性运动和感觉神经病(HMSN)、遗传性感觉运动神经病(HSMN)和腓骨肌肉萎缩)、朊病毒病(例如，克雅二氏症、Gerstmann-Straussler-Scheinker综合征(GSS)、致命的家族性失眠症(FFI)和牛海绵状脑病(BSE，俗称疯牛病))、皮克病、癫痫和艾滋病综合症(也称为HIV痴呆、HIV脑病和HIV相关性痴呆)。
本发明的方法还可用于预防和治疗眼相关神经变性和相关疾病和病症，诸如青光眼、晶格营养不良、色素性视网膜炎、年龄相关性黄斑变性(AMD)、光感受器变性相关湿性或干性AMD、其他视网膜变性、视神经玻璃疣、视神经病变和视神经炎。可根据本发明预防或治疗的不同类型青光眼的非限制性实例包括原发性青光眼(也称为原发性开角型青光眼、慢性开角型青光眼、慢性单纯性青光眼和单纯性青光眼)，低张力青光眼、原发性闭角型青光眼(也称为原发性尖角型青光眼、窄角型青光眼、瞳孔阻滞性青光眼和急性充血性青光眼)、急性闭角型青光眼、慢性闭角型青光眼、间歇性闭角型青光眼、慢性开角型青光眼、色素性青光眼、剥脱性青光眼(也称为假性剥脱性青光眼或囊膜性青光眼)、发育性青光眼(如原发性先天性青光眼和婴儿型青光眼)、第二次青光眼(如炎性青光眼(如葡萄膜炎和虹膜睫状体炎))、致癌性青光眼(如闭角型青光眼伴成熟性白内障、继发于晶状体囊破裂的晶状体过敏性青光眼、由于晶状体毒性网状阻塞导致的晶状体溶解性青光眼，以及晶状体半脱位)、继发于眼内出血的青光眼(例如，前房积血和溶血性青光眼，也称为红细胞破碎性青光眼)、创伤性青光眼(例如，角度衰退性青光眼，前房角创伤性衰退、术后青光眼，无晶状体瞳孔阻滞和睫状阻滞性青光眼)、新生血管性青光眼、药物性青光眼(如皮质类固醇诱发的青光眼和α-胰凝乳蛋白酶青光眼)、中毒性青光眼和与眼内肿瘤相关的青光眼、视网膜脱离、严重化学物质烧伤眼睛，以及虹膜萎缩。
在神经***之外具有主要影响的某些疾病和病症可导致神经***的损伤，其可根据本发明的方法治疗。这些病症的实例包括由例如糖尿病、癌症、AIDS、肝炎、肾功能障碍、科罗拉多蜱热、白喉、HIV感染、麻风病、莱姆病、结节性多动脉炎、类风湿性关节炎、结节病、干燥综合征、梅毒、***性红斑狼疮和淀粉样变性引起的周围神经病和神经痛。
此外，本发明的方法可用于治疗神经损伤(诸如周围神经病)，其由暴露于有毒化合物(包括重金属(例如铅、砷和汞))和工业溶剂，以及包括化学治疗剂(如长春新碱和顺铂)、氨苯砜、HIV药物(如齐多夫定、去羟肌苷、司他夫定、扎鲁西汀、利托那韦和安普那韦)、降胆固醇药物(如洛伐他汀、吲达帕米和吉非罗齐)、心脏或血压药物(如胺碘酮、肼苯哒嗪、哌克昔林)和甲硝唑的药物引起。
本发明的方法还可用于治疗由物理、机械或化学创伤引起的对神经***的损伤。因此，该方法可用于治疗由身体损伤(与例如烧伤、枪伤、手术和事故相关)、缺血、长时间暴露于低温(例如，霜冻)引起的周围神经损伤，以及由于例如中风或颅内出血(诸如脑出血)引起的对中枢神经***的损害。
进一步地，本发明的方法可用于预防或治疗记忆丧失(诸如，例如与年龄相关的记忆丧失)。可以受丧失影响并因此根据本发明治疗的记忆类型包括情景记忆、语义记忆、短期记忆和长期记忆。可根据本发明治疗的与记忆丧失相关的疾病和病症的实例包括轻度认知障碍、阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、化学疗法、压力、中风和创伤性脑损伤(例如脑震荡)。
本发明的方法还可用于治疗精神疾病，包括例如精神***症、妄想症、***情感障碍、精神***症、共享精神病、精神病、偏执型人格障碍、***型人格障碍、边缘型人格障碍、***人格障碍、自恋型人格障碍、强迫症、谵妄、痴呆、情绪障碍、躁郁症、抑郁症、应激障碍、恐慌症、广场恐怖症、社交恐怖症、创伤后应激障碍、焦虑症和冲动控制障碍(例如，盗窃癖、病理性赌博、纵火癖和拔毛癖)。
除了上述体内方法之外，本发明的方法可用于治疗离体神经，这可能有助于神经移植物或神经移植体。因此，本文提供的化合物可用作培养基的组分，用于体外培养神经细胞。
本文所述的抗体或抗体片段能可选地与彼此或已知可用于治疗相关疾病或病症的其他试剂组合或一起施用。因此，在ALS的治疗中，例如，化合物可以与利鲁唑(Rilutek)、米诺环素、***1(IGF-I)和/或甲基钴胺素组合施用。在另一个实例中，在帕金森病的治疗中，抑制剂可以与左旋多巴、多巴胺激动剂(例如溴隐亭、培高利特、普拉克索、罗匹尼罗、卡麦角林、阿扑***和麦角乙脲)、多巴脱羧酶抑制剂(例如左旋多巴、苄丝肼和卡比多巴)和/或MAO-B抑制剂(例如，司来吉兰和雷沙吉兰)一起施用。在进一步的实例中，在阿尔茨海默病的治疗中，抑制剂可以与乙酰胆碱酯酶抑制剂(例如多奈哌齐、加兰他敏和利凡斯的明)和/或NMDA受体拮抗剂(例如美金刚)一起施用。如本领域技术人员所确定合适的，组合疗法可以包括通过相同或不同的途径同时或顺序给药。本发明还包括药物组合物和试剂盒，包括本文所述的组合。
在本发明的上下文中，术语“接触(contact)”或“接触(contacting)”定义为化合物进入可以介导、调节或抑制神经元生长的位置的任何方式。“接触”可包括将可扩散或不可扩散的物质注射到神经元或邻近神经元的区域中。“接触”可以包括将编码化合物的核酸以一种方式放入或靠近神经元或非神经元细胞，使得核酸表达以制备可以作用于神经元的方式的化合物。遵循本说明书的教导，本领域技术人员将能够以任何方式使神经元与物质接触。
在某些实施方案中，用于调节神经元生长的方法可以是用于刺激神经元生长的方法、用于再生受损神经元的方法，或用于导向神经元沿前-后轴生长的方法。在其他实施方案中，用于调节神经元生长的方法进一步定义为用于脊髓和脑之间神经元的轴突定向取向生长的方法。
在某些实施方案中，使神经元与抗Ryk单克隆抗体或抗体片段接触，所述抗Ryk单克隆抗体或抗体片段特异性结合影响Wnt信号通路的Wnt的结合域，并且可以进一步涉及将神经元暴露于抗Ryk单克隆抗体或抗体片段的梯度，所述抗Ryk单克隆抗体或抗体片段特异性结合影响Wnt信号通路的Wnt的结合域。梯度可以在脊髓中(诸如脊髓内减小的前后梯度)。在其他实施方案中，将神经元暴露于梯度涉及刺激神经元沿前-后轴的定向取向的轴突生长。本发明考虑了轴突生长的任何方向。在某些实施方案中，轴突生长从脊髓指向脑(诸如在上行体感通路中的神经元生长)。在其他实施方案中，轴突生长从大脑指向脊髓(诸如在下行运动通路或其他调节途径中的神经元生长)。在进一步的实施方案中，轴突生长沿着脊髓丘脑途径指向。
本发明还包括调节受试者中神经元生长的方法，包括：(a)提供包含特异性结合影响Wnt信号通路的Wnt结合域的抗Ryk抗体或抗体片段的组合物；和适于递送给受试者的药物制剂；和(b)将该组合物施用于受试者。如上所述，本发明的调节神经元生长的方法考虑通过任何已知方法测量神经元生长。例如，调节神经元生长的方法可以定义为促进受试者中神经元生长和再生的方法、促进受试者中轴突生长和再生的方法，或促进受试者中定向指向轴突生长的方法。定向取向的轴突生长可以沿着前后轴(诸如从脊髓到大脑，或从大脑到脊髓)。
在另一个方面，本发明提供了包含本发明的抗体或抗体片段的组合物，其可以通过将抗体或免疫原性肽片段与生理学上可接受的载体或赋形剂混合来制备而用于施用受试者。在使用的剂量和浓度下，这些载体对接受者无毒。通常，这种组合物的制备需要将特定抗体盐、缓冲液、抗氧化剂(诸如抗坏血酸)、低分子量(少于约10个残基)多肽、蛋白质、氨基酸、碳水化合物(包括葡萄糖或葡聚糖)或螯合剂(如EDTA)、谷胱甘肽和其他稳定剂和赋形剂组合。这些组合物可以是悬浮液、乳液或冻干形式，并在适当制备和批准用于所期望应用的条件下配制。
生理学上可接受的载体或赋形剂可以是任何材料，当与本发明的免疫原性肽或多核苷酸组合时，允许该成分保留生物活性并且不会不期望地破坏与受试者免疫***的反应。实例包括但不限于任何标准生理学上可接受的载体，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(诸如油/水乳液)，和各种类型的润湿剂。用于气溶胶或肠胃外给药的优选稀释剂是磷酸盐缓冲盐水或生理(0.9％)盐水。包含此类载体的组合物通过众所周知的常规方法配制(参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,Chapter 43,14th Ed.,MackPublishing Co.,Easton PA 18042,USA)。
用于施用于受试者，肽或编码多核苷酸通常配制成组合物。因此，本发明提供了一种组合物，除了本发明的肽或多核苷酸外，其通常还含有载体，肽或多核苷酸可方便地配制在其中用于施用。例如，载体可以是水溶液(诸如生理缓冲盐水)或其他溶剂或载体(诸如乙二醇、甘油、油(诸如橄榄油)或可注射的有机酯)。载体还可包括生理学上可接受的化合物，其用于例如稳定肽或编码多核苷酸或增加其吸收。生理学上可接受的化合物包括，例如，碳水化合物(诸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)、抗氧化剂(诸如抗坏血酸或谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白质或其它稳定剂或赋形剂。类似地，已经处理的用于实施本发明的方法的目的的细胞(例如，滑液的单核细胞、树突细胞等)，当细胞施用于受试者时，也可配制成组合物。
本领域技术人员将认识到，载体或赋形剂(包括生理学上可接受的化合物)的选择取决于例如肽或编码多核苷酸的施用方式，以及组合物的施用途径。当组合物在免疫条件下，即作为疫苗施用时，其通常通过肌肉内、皮内或皮下施用，但也可以肠胃外施用(诸如静脉内施用)，以及可以通过注射、插管或其他本领域已知的方法施用。当所需的免疫***调节耐受时，组合物优选口服给药，或者可以如上给药。
筛选方法
在另一方面，本发明提供筛选用于治疗神经疾病或障碍的治疗/试验/候选试剂的方法。该方法包括向本文所述的转基因非人哺乳动物施用试验试剂并评估试验试剂对以下至少一种的影响：转基因非人哺乳动物的至少一种疾病相关组织中非典型蛋白激酶C(aPKC)或MARK2蛋白的量、aPKC或MARK2的水平或在aPKC或MARK2的活性水平，其中至少一种：相对于未接受试验试剂的相似转基因非人类哺乳动物至少一种疾病相关组织中aPKC蛋白量减少、MARK2蛋白量增加、aPKC活性水平下降、MARK2活性水平增加、aPKC水平的降低或MARK2水平的增加表明试验试剂对神经疾病或障碍具有治疗作用。
“试验试剂”或“候选试剂”是指在本文所述的一种或更多种试验中筛选的试剂。该试剂几乎可以是任何化合物。其可以作为单一分离的化合物存在或者可以是化学(例如，组合)文库的成员。在一个实施方案中，试验试剂是小有机分子。术语小有机分子是指与药物中通常使用的那些有机分子大小相当的分子。
通常，通过鉴定具有一些所需性质或活性的化合物(称为“先导化合物”)，产生先导化合物的变体，并评估那些变体化合物的性质和活性，产生具有有用性质的新化学实体。
被鉴定为治疗神经疾病或障碍的潜在治疗剂的任何试剂可以与药学上可接受的载体结合，所述载体构成一种或更多种辅助成分。当用于提及载体时，术语“药学上可接受的”是指载体、稀释剂或赋形剂必须与制剂的其他成分相容并且对其接受者无害。
用于配制施用于受试者的试剂的药学上可接受的载体是本领域熟知的，包括，例如，水溶液(诸如生理缓冲盐水)或其他溶剂或载体(诸如乙二醇、甘油、油(诸如橄榄油)或可注射的有机酯)。药学上可接受的载体可含有生理学上可接受的化合物，其用于例如稳定或增加偶联物的吸收。这些生理学上可接受的化合物包括，例如，碳水化合物(诸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)、抗氧化剂(诸如抗坏血酸或谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白质或其它稳定剂或赋形剂。本领域技术人员会知道，药学上可接受的载体(包括生理学上可接受的化合物)的选择取决于例如治疗剂的物理化学特性和组合物的给药途径，其可以是例如，口服、鼻内或本领域已知的任何其他此类方法。药物组合物还可含有第二种(或更多种)化合物(诸如诊断试剂、营养物质、毒素或治疗剂(例如癌症化学治疗剂)和/或维生素)。
在实施本发明方法中施用的化合物或组合物的总量可以作为单剂量施用于受试者，作为推注或通过在相对短的时间段内输注，或者可以是使用分次治疗方案施用，其中在延长的时间段内施用多剂量。本领域技术人员将知道用于治疗受试者失血的血浆扩张剂的量取决于许多因素，包括受试者的年龄和一般健康状况以及施用途径和施用的治疗次数。鉴于这些因素，技术人员将根据需要调整特定剂量。通常，最初使用I期和II期临床试验确定药物组合物的制剂和施用途径和施用频率。
以下实施例旨在说明而非限制本发明。
实施例1
方法
动物-预时配种的怀孕CD1小鼠购自Charles River。Ryk缺陷型小鼠获自StevenStacker(Ludwig Institute for Cancer Research，Melbourne，VIC，Australia)(50)。卷曲蛋白3缺陷来自Jeremy Nathans(John Hopkins University，Baltimore，MD)(51)。通过标准PCR确定基因型。***栓检测日被认为是E0.5。将动物饲养在温控室中，并提供可随意采食的标准实验室食物和水。
抗体、试剂和质粒构建体-豆蔻酰化aPKC和cPKC假底物购自Enzo Life Sciences-Biomol(分别为#BML-P-219和#BML-P205)。
针对Ryk的胞外域(氨基酸90-183)产生单克隆小鼠Ryk抗体，与麦芽糖结合蛋白融合。
本研究中使用的商业一抗包括P-PKCζT410(Santa Cruz sc-101778，兔1:1000)、总PKCζ(Santa Cruz C-20sc-216，兔，1:2000)、P-MARK2T595(Abcam，兔1:1000)、总MARK2(Abcam，山羊1:1000)、SMI-312(Covance，小鼠，1:1000)、MAP2(Abcam，兔1:1500)、βIII-微管蛋白(Covance，小鼠，1:1000)、罗丹明-鬼笔环肽(Invitrogen，1:100)、P-Tau S262(Invitrogen，兔，1:1000)、Tau(Tau5，Millipore，小鼠，用于细胞培养1:2000，用于蛋白质印迹1:4000)、P-JNK/SAPK T183/T185(Cell Signaling，rabbit，1:1000)、Total JNK/SAPK(Cell Signaling，1:1000)、Pc-Jun S63(Cell Signaling，rabbit 1:1000)、总c-Jun(CellSignaling，兔1:1000)、GAPDH(Millipore-Chemicon，小鼠，1:50,000)、肌动蛋白(小鼠，1:5000)、活化的Caspase-3(aCasp3，细胞信号，兔，细胞培养物1:1000，组织切片1:500)和CTIP2(Abcam，大鼠，1:500)。
将PKCζ-WT、PKCζ-KD(K281W)和PKCζ-T410A质粒构建体(56)的cDNA克隆到pCIG2-EGFP质粒(14)中。pCIG2-Tau-WT和pCIG2-Tau-S262A质粒由Georges Mairet-Coello(TheScripps Research Institute，La Jolla，CA)提供(57)。
大脑皮质细胞培养物-通过CO2窒息和颈脱位法处死E16.5小鼠怀孕的雌性。从子宫角中取出胚胎。从胚胎头上取下皮肤、头骨和脑膜。将皮质在L-15培养基(Sigma)中解剖，用0.025％胰蛋白酶/0.221mM EDTA(Mediatech)消化20分钟，然后在5％马血清的L-15培养基中孵育5分钟以抑制胰蛋白酶。将皮质机械解离，将细胞以500个细胞/mm2铺板于24孔板中的聚-D-赖氨酸(33.3μg/ml，Millipore)和层粘连蛋白(3.3μg/ml，Invitrogen)涂覆的12mm玻璃盖玻片上，或以1050个细胞/mm2铺板于在聚-D-赖氨酸(0.1mg/ml)涂覆的6孔板(35mm皿)上。将细胞在补充有含有谷氨酰胺(Gibco)、40mM葡萄糖、100U/ml青霉素和1mg/ml链霉素(Mediatech)的B27(Gibco)的神经基础培养基(Gibco)中孵育。将培养物保持在37℃的潮湿的5％CO2/空气培养箱中。
磁转染-对于磁转染，将来自E17.5胚胎的皮质在补充有DNAse I(100mg/ml，Sigma)的木瓜蛋白酶(Worthington)中于37℃解离20分钟，洗涤三次并在平板培养基中手动研磨。将细胞以565/mm2铺板在涂有聚-D-赖氨酸(1mg/ml，Sigma)的12mm玻璃底皿上。在补充有2.5％胎牛血清(Gemini)、B27(1X)、L-谷氨酰胺(2mM)和青霉素(2.5U/ml)-链霉素(2.5mg/ml)(Invitrogen)的神经基础培养基中培养细胞。根据制造商的说明并如前所述(57)，使用NeuroMag(OZ Bioscience)通过磁转染在DIV3转染神经元。简而言之，将2μgcDNA与NeuroMag在神经基础培养基中在室温下孵育15分钟，然后将混合物逐滴施用于培养细胞上。将培养物置于磁铁上20分钟进行转染。共转染以1:1的比例(w/w)进行。
免疫组织化学、免疫细胞化学和TUNEL测定-用4％PFA固定细胞培养物30分钟。将胚胎大脑在冷PBS中解剖，在4％PFA中固定2小时，并在30％蔗糖中孵育过夜用于冷冻保护。将脑包埋在商业包埋培养基(Tissue-Tek，Sakura Finetek)中，在干冰上快速冷冻，并使用低温恒温切片机(Leica)以20μm的厚度进行冠状切片。将切片固定在Superfrost Plus载玻片(Thermo Fisher Scientific)上并储存在-20℃。将细胞或切片在含有0.3％triton X-100(PBS-T)的PBS中透化10分钟，并与第一抗体在4℃孵育过夜。将单克隆抗体在PBS-T中稀释，并将多克隆抗体在含有10％乳蛋白、1％牛血清白蛋白的PBS-T溶液中稀释。使用AlexaFluor 588(1:500-1:1000)、594(1:500-1:1000)或649(1:200-1:500)偶联的第二抗体(Jackson ImmunoReasearch)显现染色。对于CTIP2免疫检测，将切片在pH＝6的10mM柠檬酸盐缓冲液中在90℃-95℃下进行抗原修复程序10分钟。切片用DAPI(Thermo FisherScientific)复染。根据制造商的说明书使用原位细胞死亡检测试剂盒TMR red(Roche)进行TUNEL。
Western印迹-在6孔板中培养的皮质细胞用PBS(pH 7.4)洗涤两次，使用橡胶淀帚刮取并在含有20μMTris-HCl pH7.6、150μMNaCl、0.1％SDS、1％triton X-100、蛋白酶抑制剂(完整迷你片剂，Roche Applied Science)、磷酸酶抑制剂(磷酸酶抑制剂混合片，RocheApplied Science)的裂解缓冲液中裂解。通过SDS PAGE分离20微克蛋白质，然后电转移到聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad)上。用在Tris缓冲盐水溶液和吐温20(10mM Tris-HCl pH 7.4、150mM NaCl、0.05％Tween 20)中含有2％BSA或5％脱脂奶粉的封闭缓冲液封闭膜，并与稀释在封闭缓冲液中的一抗在4℃孵育过夜。在室温下用HRP偶联的第二抗体(1:5000)孵育1小时，并使用化学发光(ECL)进行可视化。
图像采集和分析-所有图像均在具有LSM采集软件(Carl Zeiss Microscopy)的倒置Zeiss LSM510共聚焦显微镜上采集。为了定量细胞培养物中P-PKCζT410免疫反应性，将暴露时间调节至最高免疫荧光信号的饱和水平，并在不同样品之间保守。使用FiJi-ImageJ软件(NIH)测量神经元细胞体中的平均免疫荧光强度水平。所有定量均在来自至少三个独立实验的细胞培养物中的10个非重叠区域和来自至少三个用于体内实验动物的四个非连续区段上进行。
统计分析-使用具有Bonferroni后检测的ANOVA或使用GraphPad Instat 3.05(GraphPad软件)的学生t检验进行统计学分析。所有数据均表示为平均值或百分数±s.e.m。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。
实施例2
aPKC的抑制促进轴突变性和神经细胞凋亡
建立培养***以研究aPKC在大脑皮质神经元存活中的表达和作用。将E16.5皮质细胞在体外培养3天(DIV3)，并对泛轴突标记物SMI-312和树突标记物MAP2进行双重免疫标记。在这个阶段，大多数神经元表现出标记为对应于轴突的SMI-312的长过程和少数将产生树突的短MAP2+过程。为了评估该阶段的极化神经元的比例，在SMI-312+神经元的总数上计算SMI-312标记的长过程并且远端部分未标记MAP2的神经元的数量。发现在这些培养条件下，84.2±3.45％的SMI-312+神经元被极化。然后，通过使用识别aPKC家族的所有同种型的抗体在皮质神经元中研究aPKC表达，所述同种型包括PKCζ、PKCλ/ι和PKMζ(34)。这些观察结果表明aPKC免疫标记定位于神经元细胞体和SMI-312+轴突中(图1A)。
为了研究aPKC在神经元存活中的作用，通过在皮质神经元培养物中转染激酶缺陷型PKCζ(PKCζ-KD)或不可磷酸化突变体(PKCζ-T410A)来抑制aPKC活性。这些构建体的aPKC抑制在转染2天后诱导神经突变性(图1B，1C和1E)，如PKCζ-KD和PKCζ-T410A转染的神经元的大量片段化神经突所示(图1B和1C)。PKCζ-KD和PKCζ-T410A过表达也诱导神经元凋亡，如aCasp3+神经元的比例增加所示(图2D和2F)。PKCζ-WT蛋白的过表达不影响神经突完整性或神经元存活(图1B-1F)。大量轴突片段化表明轴突最初已经广泛生长并且同时发生变性，这表明轴突维持需要aPKC。有趣的是，虽然过度表达的PKCζ定位于神经元细胞体和神经突中，过表达的PKCζ-KD和PKCζ-T410A突变蛋白被排除在过程之外并被限制在细胞体内(图1B)，表明PKCζ活性可能调节其自身的定位和/或蛋白质的稳定性。
为了使用独立方法测试aPKC在轴突存活中的作用并且允许生化分析，使用对aPKC特异的细胞可渗透的豆蔻酰化假底物(14)。作为对照，使用对常规PKC(14)特异的肉豆蔻酰化假底物。aPKC和cPKC抑制剂的IC50分别为10μM和8μM，因此使用10μM的起始剂量。在该剂量下，在aPKC假底物处理后2h，aPKC抑制剂但不是cPKC抑制剂促进皮质神经元中的快速轴突变性，如SMI-312+轴突的珠状方面所示(图2A和2B)。此外，aPKC假底物以剂量(图2C)和时间依赖性方式(图2D)促进轴突变性，效果从5μM开始，并且早在10μM剂量下1小时开始。为了验证aPKC假底物的功效，在10μM aPKC PS处理2小时后测量神经元细胞体中的P-PKCζ-T410免疫反应性，并且发现其显著降低(图2E)，表明aPKC假底物减少aPKC的(自身)磷酸化活性。
由PKC假底物诱导的轴突变性早在1小时就发生(图2D)，并且时程分析显示几乎所有神经元4小时后都表现出变性的轴突或缺乏的轴突(图2F和2G)。与轴突变性平行，并在2小时、4小时和24小时使用TUNEL和激活Caspase-3染色测量神经元细胞体死亡。当轴突的准整体已经变性时(图2G)，发现SMI312+神经元中的细胞死亡在与PKC假底物孵育4小时时开始(图2H)，表明阻断aPKC信号传导触发了死亡机制。有趣的是，神经元在4小时后开始显示出aCasp3，但所有神经元在24小时后都没有表达激活的Caspase-3(图2I)，而所有神经元在24小时内都是TUNEL+(图2H)，这表明aPKC抑制可能同时触发caspase-3依赖性和非依赖性细胞死亡途径。
实施例3
通过调节MARK2活性和Tau磷酸化，aPKC抑制使微管不稳定
微管变性是轴突变性过程中的早期细胞事件，在轴突珠化和神经丝片段化之前(1，35-37)。猜想抑制aPKC可通过使微管不稳定而促进快速轴突变性。为了测试该猜想，在aPKC假底物处理之前和期间2小时，首先将皮质神经元细胞培养物与紫杉醇(微管稳定剂)(38)预孵育。当用紫杉醇预处理神经元细胞培养物时，由aPKC抑制诱导的轴突变性减少(图3A和3B)。使用特异性标记物用于神经元细胞骨架的不同区室(Tau用于微管，SMI-312用于神经细丝，罗丹明-鬼笔环肽用于F-肌动蛋白微丝)，用共聚焦显微镜发现在用aPKC假底物处理的神经元轴突中，微管和神经细丝但没有肌动蛋白微丝，被破坏。这些观察结果表明aPKC是微管稳定性是必需的，并且aPKC抑制促进微管和神经细丝破坏，最终导致轴突变性。
进一步研究了由aPKC抑制诱导的微管去稳定化中涉及的信号通路。首先，通过蛋白质印迹证实了aPKC假底物阻断aPKC(自身)磷酸化活性的功效。aPKC假底物在孵育2小时后降低P-PKCζT410水平(图3C)，与免疫细胞化学分析一致(图2E)。然后焦点集中在MARK2上，因为(1)其属于最初被发现触发微管解体的MARK/Par1家族激酶(39)和(2)当被aPKC在T595上磷酸化时，其被抑制(40)。发现aPKC假底物处理在2小时时降低了MARK2T595上的磷酸化(图3D)，表明当aPKC被抑制时MARK2活性增加。此外，S262处的微管结合域中的Tau磷酸化(图3E)在2h时增加，而由Glu-微管蛋白(图3F)显示的稳定微管减少。这些观察结果与之前的研究一致，表明MARK家族激酶通过磷酸化包括Tau在内的MAP而使微管不稳定(9，39，41)。
为了进一步测试Tau磷酸化在由aPKC抑制诱导的轴突变性中的作用，用PKCζ-KD和Tau-WT或Tau在S262(Tau-S262A)的非磷酸化突变体的质粒构建体共转染皮质神经元。Tau-WT，而不是Tau-S262A的过表达，以与PKCζ-KD相似的程度诱导轴突变性和神经元凋亡(图3G-3I)。PKCζ-KD与Tau-S262A共转染而不与Tau-WT共转染可阻止由PKCζ-KD过表达诱导的轴突变性和神经元细胞死亡(图3G-3I)，表明PKCζ-KD诱导的轴突变性是由S262处的Tau磷酸化。
实施例4
aPKC抑制激活JNK-cJun信号通路
JNK/SAPK是涉及中枢和周围神经***中的各种生理和病理过程的MAPK亚家族。特别地，JNKs在对应激和损伤以及某些病理条件的响应下介导神经细胞死亡(42,43)。JNK也被证明可以诱导脊髓逆行，逆行轴突变性并限制脊髓损伤后的运动恢复(44)。因此，试图确定JNK是否可能参与由PKC抑制诱导的轴突变性。Western印迹实验显示，aPKC PS诱导的aPKC抑制引起JNK T183/T185处磷酸化的增加。在1小时时p54和p46蛋白同种型均发生增加的磷酸化(图4A和4B)。1小时和2小时时转录因子c-Jun的磷酸化的增加在S63(图4A和4C)，表明当aPKC活性被抑制时，c-Jun(JNK的直接底物(45))被快速激活。通过免疫细胞化学在神经元的细胞核中证实了P-JNK-T183/T185和P-cJun-S63的增加(图4D和4E)。这些结果表明aPKC抑制可能通过激活细胞死亡JNK/c-Jun途径促进轴突变性和神经细胞死亡。
实施例5
Ryk促进通过aPKC抑制诱导的轴突变性
先前的研究显示aPKC是Wnt-卷曲蛋白3介导的轴突生长和吸引所需的激酶，并且还通过增加卷曲蛋白3内吞作用而发挥正反馈功能以扩增平面细胞极性信号传导(46)。因为Ryk是排斥性Wnt受体并且抑制平面细胞极性信号传导，所以测试了Ryk是否调节aPKC。发现通过蛋白质印迹测量的P-aPKC-T410水平在培养3天的Ryk KO皮质神经元中增加(图5A和5B)，表明Ryk通常抑制aPKC活性。
先前已经显示在脊髓损伤后重新诱导某些Wnt和Ryk受体的表达，并且阻断Wnt/Ryk信号传导减少了来自损伤部位的皮质脊髓轴突的收缩(32)。这些最近的研究表明，在疾病进展的早期阶段，在ALS小鼠模型的脊髓中运动神经元和轴突中Ryk表达增加，表明Ryk参与ALS神经变性的早期步骤(47)。因此猜想Ryk也可能参与轴突变性，并且测试阻断Wnt/Ryk信号传导是否可以保护皮质轴突免受aPKC抑制诱导的变性。
为了阻断Ryk信号传导，产生针对小鼠Ryk的胞外域的小鼠单克隆抗体(由JohnKolkinskin，Baltimore，MD的Alex Kolodkin的实验室)。为了测试该抗体的特异性，对来自用小鼠Ryk表达载体转染的HEK细胞的蛋白质提取物进行蛋白质印迹分析。检测到大约70KDa的信号，即Ryk蛋白的预期大小。在E14.5胚胎野生型小鼠组织中内源性地检测到相似大小的较弱条带，但在Ryk KO组织中没有检测到，表明该抗体对Ryk特异。在aPKC PS处理2小时之前和期间，用小鼠Ryk抗体而非正常小鼠IgG预孵育皮质神经元细胞培养物，部分阻断轴突变性(图5C和5D)。还在Ryk KO小鼠神经元细胞培养物中分析了由aPKC抑制诱导的轴突变性。与WT神经元相比，由aPKC PS触发的轴突变性在Ryk KO皮质神经元中减少(图5E和5F)。
实施例6
发育中的Ryk KO小鼠的压后皮质中神经元细胞死亡减少
体外结果表明Ryk可能参与神经元细胞死亡。以前的研究表明，Ryk在发育中的啮齿动物前脑(包括同种皮质、海马和纹状体(24，48，49))中表达。使用Cap3免疫染色在E18.5Ryk缺陷胚胎中检测前脑的几个区域中的细胞凋亡。Ryk KO小鼠出现颅面畸形(包括腭裂)和出生时死亡(50)，因此所有分析均在产前的E18.5胚胎妊娠晚期进行。在E18.5，Ryk-/-脑的整体结构似乎大致正常，Ryk-/-和Ryk+/-胚胎无法区分(27)。尽管WT胚胎中低，在E18.5Ryk KO小鼠的对应于扣带皮质的后部的皮质的限制区域(RSP)中，aCasp3+细胞的数量减少了45％(图6A-6C)。然而，在Ryk KO胚胎的背外侧皮质、海马和纹状体中细胞凋亡没有改变，这表明Ryk可能调节发育中皮质特定区域的细胞死亡。
实施例7
Ryk杂合性减弱卷曲蛋白3KO胚胎的压后皮质神经元细胞死亡
先前的研究显示在Wnt受体卷曲蛋白3缺乏的小鼠胚胎纹状体中广泛的细胞死亡，以及卷曲蛋白3在发育中的纹状体和同形皮质中强烈表达(51)。在卷曲蛋白3KO小鼠的纹状体和前脑的其他区域(包括RSP)中检查细胞死亡。这些观察结果证实纹状体细胞凋亡强烈增加。有趣的是，与卷曲蛋白3+/+和卷曲蛋白3+/-小鼠相比，发现在E18.5卷曲蛋白3-/-胚胎的RSP中细胞凋亡增加了5倍(图6D和6E)。具有神经前体标记物巢蛋白和早期神经元标记物βIII-微管蛋白的双重免疫标记显示aCasp3+免疫标记定位于βIII-微管蛋白+神经元中。更确切地说，aCasp3与在胚胎发育期间在皮质层V的神经元中表达的CTIP2共定位。然而，与卷曲蛋白3+/+胚胎相比，E18.5卷曲蛋白3-/-在皮质和海马的背外侧部分中的细胞凋亡没有显著差异。
由于在卷曲蛋白3KO和Ryk KO胚胎的RSP中以相反的方式调节细胞死亡，因此将卷曲蛋白3+/-小鼠与Ryk+/-小鼠杂交。将由这些杂交产生的双杂合小鼠与卷曲蛋白3+/-小鼠杂交6代，以使卷曲蛋白3/Ryk小鼠品系进入卷曲蛋白3品系(Black6)。然后，卷曲蛋白3+/-Ryk+/-雌性与卷曲蛋白3+/-Ryk+/-雄性杂交。来自7窝的超过52个胚胎没有在E18.5产生任何胚胎双重敲除卷曲蛋白3和Ryk，这表明卷曲蛋白3-/-Ryk-/-胚胎可能在这个发育阶段不可活。因此，在卷曲蛋白3-/-Ryk+/-胚胎中进行分析，结果发现，在E18.5时，敲除Ryk表达50％减弱了卷曲蛋白3KO胚胎的RSP细胞凋亡，正如与卷曲蛋白3-/-Ryk+/+动物相比，卷曲蛋白3-/-Ryk+/-胚胎的RSP中活化的Caspase 3+细胞的数量减少了30％(图6D和6E)。
实施例8
附加方法
将动物圈养在12小时光照/黑暗循环中，并且始终在光周期期间的早晨进行行为分析。除了在窗口植入后单独饲养的具有颅窗的小鼠外，小鼠和大鼠都分组饲养。基于先前的研究和能力(power)分析(25％效应大小，a＝0.05,639～＝0.2，能力为80％)选择组样本大小。一只小鼠被排除在研究之外，因为存在标记的皮质脊髓轴突的CS损伤不完整且低于损伤水平的证据，以及一只小鼠被排除，因为其没有尝试在损伤后进行行为任务。所有程序和方法(外科手术、行为测定、组织处理、免疫染色、图像分析、COS-7转染和皮质映射)由对基因型或处理组不知情的研究者进行。
转基因小鼠的产生-将含有外显子3-6侧翼的loxP以及PKG-neo选择盒的靶载体转染到ES细胞中。通过用于打靶载体整合的核酸印迹和PCR以筛选细胞。然后产生嵌合小鼠。将Ryk cKO小鼠与含有阻止tdTomato表达的loxP侧翼停止盒的Ai14B6.Cg小鼠杂交(TheJackson Laboratory，Bar Harbor，ME，RRID:IMSR_JAX:007914)并与C57BL/6J回交6代。对于皮质映射实验，将Ryk cKO::tdTomato Ai14小鼠与表达Thy1启动子(B6.Cg-Tg(Thy1-COP4/EYFP)18Gfng/J)(The Jackson Laboratory)后光敏感通道蛋白(Chr2)的小鼠杂交。
外科手术-皮质AAV注射：成年雌性C57BL/6J小鼠(6.1±0.1周龄)用异氟烷深度麻醉，直至对捏脚趾和尾巴不反应，并且在切开之前将头骨上方的区域剃毛并用聚维酮碘清洁。颅骨在运动皮质上双侧变薄并且使用36ga NanoFil针(World Precision InstrumentsInc.，Sarasota，FL)将自补的AAV2/6Cre-HA(Salk Institute for Biological StudiesGene Transfer，Targeting and Therapeutics Core，La Jolla，CA)(1.49x1011基因组拷贝/ml)每个半球注射10个位点(250nl/位点)。
颅窗：用异氟烷对成年雌性C57BL/6J小鼠(7.4±0.2周龄)进行深度麻醉。去除颅骨上的皮肤，使占优势前肢对侧的运动皮质周围的颅骨变薄，移除运动皮质上的颅骨，并如上所述将自补的AAV2/6Cre-HA注射到10个部位。用VetBond(3M，St.Paul，MN)保护(secured)的5mm#1圆形玻璃盖玻片(Warner Instruments，Hamden，CT)覆盖的暴露皮质。暴露的头骨覆盖有牙科握把粘合剂(Dentsply，York，PA)。
CS和C3背柱损伤(小鼠)：用异氟醚对小鼠进行深度麻醉，通过椎板切除术暴露脊髓CS(或C3)，并使用Vannas弹簧剪将背柱在1mm的深度处损伤(Fine Science Tools,Foster City,CA)。用4-0丝线缝合背部肌肉组织，并用伤口夹闭合皮肤。随机选择小鼠进行C3损伤或C3假手术(仅限椎板切除术)组。
锥体束切断术：用***(120mg/kg)和甲苯噻嗪(12mg/kg)深度麻醉小鼠，切开并将腹侧肌肉组织推到一边以暴露锥体。如前所述，打开硬脑膜并且用15°微型手术刀(Electron Microscopy Sciences，Hatfield，PA)损伤开颅同侧的锥体。
CS背柱损伤(大鼠)：成年雌性Fischer 344大鼠(120-135g)用2ml/kg***混合物(25mg/ml***、1.3mg/ml甲苯噻嗪和0.25mg/ml乙酰丙嗪)深度麻醉。通过椎板切除术暴露脊柱水平CS，在背角上刺穿硬脑膜，并且用2道Scouten线刀(David KopfInstruments，Tujunga，CA)使背柱损伤。用4-0丝线缝合背部肌肉组织，并用伤口夹闭合皮肤。聚乙烯鞘内导管(Durect Corp.，Cupertino，CA)预装有在人工脑脊髓液中的小鼠IgG或Ryk单克隆IgG(针对Ryk的胞外域氨基酸90-183范围产生的克隆25.5.5，Johns HopkinsMonoclonal Antibody Core，Baltimore,MD)(1mg/ml)，穿过小脑延髓池(magna cisterna)到颈髓，用4-0丝线缝合固定，并连接到填充200μl小鼠IgG或Ryk IgG的典型2004渗透性微型泵(Durect Corp.)。随机选择大鼠进行小鼠IgG或Ryk单克隆IgG处理。28天后除去渗透性微型泵。在CS脊髓损伤后16周，在每个半球20个位点(250nl/位点)用有10％wt/vol 10,000MW生物素化葡聚糖胺(BDA)的无菌磷酸盐缓冲盐水双侧注射大鼠；2周后处死动物。
皮质映射：用***(100mg/kg)甲苯噻嗪(10mg/kg)混合物轻微麻醉小鼠，仍然对捏脚趾和尾巴有反应，并在在***/甲苯噻嗪混合物刺激的过程中维持。将小鼠固定在立体定位框架(David Kopf Instruments)中，并使用固定在立体定位臂上的光缆和套管(直径200μm)来刺激相对于前囟的运动皮质位置，前囟不受颅骨或牙科粘合剂的阻碍(最多165个位点)。刺激是来自单通道LED驱动器(Thorlabs，Newton，NJ)的3个470nm光脉冲，1Hz持续250ms。刺激强度从50mA增加到1000mA，直到在连续3次脉冲中检测到运动。在1000mA下没有诱发运动的位点被评为无反应。只有对侧前肢运动得分；如先前在大鼠中所述，观察到偶然的，较弱的同侧运动。
产后第0天幼仔的Ryk敲除：将注射0.5μl AAV2/1-synapsin-Cre(Penn VectorCore，Philadelphia，PA)(1.99x1013基因组拷贝/ml)的小鼠使用36ga NanoFil针头注射到单侧运动皮质中的2个位点(World Precision Instruments Inc.)。7天后处死小鼠，分离运动皮质并在裂解缓冲液(20mM Tris HCl，pH 7.5、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、10mMNaF、10mMβ-甘油磷酸盐、1mM Na3VO4、0.5％wt/vol十二烷基硫酸钠、1％vol/vol TritonX-100和完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche，Indianapolis，IN)中匀浆。通过蛋白质印迹(40μg/孔)分析蛋白质。抗体使用小鼠的抗Ryk(20μg/ml)(Johns Hopkins单克隆抗体核心)、GAPDH(1:1000)(EMO Millipore，Billerica，MA，目录号#MAB374，RRID：AB_2107445)用于蛋白质印记。
处死和组织处理：用***混合物对动物进行深度麻醉，心脏灌注冰冷的PBS，然后用4％wt/vol多聚甲醛的PBS灌注，并将脑和脊柱在4℃的4％wt/vol多聚甲醛下固定过夜。将组织在30％wt/vol蔗糖的PBS中冷冻保护。将小鼠脊髓和脑干以及大鼠脑干在低温恒温器(Leica，Buffalo Grove，IL)上以20μm(矢状脊髓，横向脑干)切片并直接放置在Superfrost Plus载玻片(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)上。将大鼠脊髓切成40μm厚的矢状切片并收集为自由浮动切片。将切片用PBS洗涤三次，在含有0.25％triton-X100(PBST)和5％驴血清的PBS中封闭1小时，然后在4℃下与加有5％驴血清的PBST中的一抗孵育过夜。第二天，将切片洗涤三次，与Alexa Fluor偶联的二抗(Life Technologies，GrandIsland，NY；Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)在室温下孵育2.5小时，用DAPI(1μg/ml)复染(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)并在PBS中最后洗涤三次。用于荧光免疫组织化学的抗体是：兔抗dsRed(1:1000)(Clontech Laboratories Inc.，Mountain View，CA，目录号632496，RRID:AB_10013483)、单克隆GA-5抗GFAP(1:200)(Sigma-Aldrich，目录号#G3893，RRID:AB_2314539)、豚鼠抗-vGlut1(1:1000)(EMO Millipore，目录号AB5905，RRID:AB_2301751)和兔抗-GFAP(1:750)(Dako，Carpinteria，CA，目录号Z0334，RRID:AB_10013382)。
COS-7细胞转染：使用FuGene6(Roche)用pcDNA4-Ryk转染COS-7细胞以表达全长Ryk。将细胞用冰冷的4％wt/vol多聚甲醛的PBS固定30分钟以进行免疫细胞化学，或用裂解缓冲液裂解用于western印迹。
图像采集和分析：在具有LSM采集软件(Carl Zeiss Microscopy，LLC，Thornwood，NY)的倒置Zeiss LSM510共聚焦显微镜上采集图像。使用ImageJ(NIH，Bethesda，MD)对阈值图像进行图像密度定量。对实验组不知情的研究者进行了所有分析。轴突指数是小鼠间隔140μm的8个连续矢状脊髓冷冻切片中每0.411μm的总阈值像素，或者大鼠间隔280μm的6个连续矢状脊髓冷冻切片中的0.741μm，除以在闩水平锥体束横切面中的阈值像素。使用在StereoInvestigator(MBF Bioscience，Williston，VT)中的Cavalieri估计工具在每第七个40μm矢状切面上计算损伤体积。对于tdTomato和vGlut1共定位，在用于tdTomato定量的8个总连续矢状冷冻切片中，在距离CS损伤600μm的距离处，在210μm宽的区域内量化灰质内的所有轴突。选择600μm的位置，因为观察到两组动物中该区域中轴突侧枝的密度最高(图8G)，并且其位于原始CS和第二次C3损伤之间。
行为测试：在双侧脊髓损伤之前的两周内对所有动物进行熟练的前肢到达训练。动物在训练期间，然后在受伤后每周训练前24小时受到食物限制。动物通过垂直槽到达丙烯酸室前并越过一个小间隙以获取奖励颗粒。对于20mg蔗糖奖励片剂(TestDiet，St.Louis，MO)，小鼠每次进行25次达到。对于45mg糖颗粒(Bio-Serv，Flemington，NJ)，大鼠每次进行50次达到。成功的取回率计算为取回并吃掉的颗粒数除以前爪接触的数量。由两名对基因型或实验处理不知情的独立研究人员每周训练两次前肢到达；两个独立分数取平均值。在恢复期间没有每周训练的组中的小鼠仅在受伤后8周测试两次。除了前肢到达之外，大鼠每周测试网格交叉任务一次，其中前肢足迹计算为3个通路中的总前肢步数越过1英寸等距线网格的60英寸跨度的百分比。
统计学：使用JMP 9软件(SAS Institute，Cary，NC)进行正文中指出的统计测试。先前已经证实，抑制排斥性Wnt信号传导引起脊髓损伤后下行皮质脊髓和上行背柱感觉轴突的出芽和可塑性。在处理Ryk cKO或Ryk单克隆抗体增强轴突出芽的猜想时，通过单尾t检验测试增加(图8E、10B、12I和18)。为了测试具有多个等距测量的纵向行为研究，使用重复测量ANOVA(图8F，12B和21)。在测试具有连续参数数据的多个组时，在适当的事后比较中利用事后Bonferroni校正的ANOVA(图11C和15C)。进行双变量相关分析以确定前肢功能和皮质映射之间的关系(图15D)。使用参数检验测试连续数据，并假设数据是正态分布的，但这未经过正式测试。
实施例9
Ryk cKO增强SCI后精细运动控制的恢复
小鼠经历了两周达到和抓握任务的训练，接着是CS背侧脊髓损伤：部分脊髓损伤模型使背侧灰质、侧面白质和整个腹侧脊髓保持完整(图8A和8D)。在背柱损伤之后，前肢到达和抓握功能立即丢失(图8F)。通过持续训练，糖颗粒取回的成功率由于神经回路的重新配置而恢复。已经表明，CST在受伤后经历了强大的侧枝出芽，并且一些新芽被认为是新功能回路的原因。然而，轴突出芽受到限制轴突可塑性的分子诱因的抑制。
Wnt糖蛋白家族的成员是***发育上保守的轴突导向分子，其导向在发育期间沿着上行感觉轴突和下行CST轴突的头-尾轴的生长。介导发育的CST神经元的Wnt排斥的排斥性Wnt受体Ryk在正常成人运动皮质和CST神经元中不表达或者通过原位杂交或免疫组化检测到以极低水平表达。脊髓损伤重新诱导受损CST中Ryk mRNA和蛋白的表达。通过注射Ryk功能阻断抗体和可扩散的Wnt抑制剂，发现抑制Wnt-Ryk信号传导增强了损伤后感觉轴突和运动轴突的可塑性。然而，Ryk抗体或Wnt抑制剂可通过影响环境(诸如病变周围的神经胶质细胞)而不是CST轴突本身来发挥作用。
为了特异性地测试Ryk在神经元中的作用，产生Ryk条件等位基因(cKO)并且将这些小鼠与含有阻止tdTomato表达的loxP侧翼终止盒的Ai14 86.Cg小鼠杂交，以特异性标记病毒转导后的重组皮质脊髓轴突(图8B和8C)。向Ryk cKO::tdTomato Ai14小鼠注射在巨细胞病毒(CMV)的控制下表达Cre重组酶的腺相关病毒(AAV)进入初级运动皮质并评估皮质脊髓回路重塑的增强(图8A)。在CS背柱损伤之前平均2.3周将AAV-Cre注射到成年运动皮质，以确保足够的Cre表达时间，以便损伤不会引起Ryk表达。发现CST中的Ryk缺失显著增强了熟练前肢功能的恢复，如通过12周的前肢到达所评估的(重复测量ANOVA P<0.005，图8F和16)。早期观察到Ryk缺失的影响，具有在早期测试阶段趋向于更好的性能。这一直是观察到的，并且可能是由于先前证实的在输注Ryk抗体的动物中在损伤后5周轴突和侧支的收缩减少。在Ryk条件性缺失后，小鼠恢复到峰值损伤前成功率的81±7％，而对照小鼠仅为60±5％。
实施例10
Ryk cKO增强SCI后CST侧枝出芽
为了开始处理Ryk cKO小鼠中改善的功能恢复的潜在机制，沿着颈髓中的侧枝芽分析CST侧枝和突触密度。结果发现，条件性Ryk缺失并未显著减少受损CST的轴突死亡(单尾t检验P＝0.12)，但确实引起在损伤后12周，CS损伤部位的头侧和尾侧的脊髓灰质内CST侧支的数量显著增加(单尾t检验P<0.05，图9E)。除了更多数量的轴突侧枝外，从皮质锥体神经元中条件性缺失Ryk的小鼠在损伤部位头侧600μm处的已鉴定的皮质脊髓轴突侧支上显示突触前囊泡谷氨酸转运蛋白1(vGlut1)标记的斑点，表明随着Ryk条件性缺失而增强的功能连通性(图10C和10D)。
大多数CST轴突位于背柱内并且受到CS背柱损伤的损害。CST轴突的稀疏，次要组分在侧柱(侧向CST)内沿着脊髓下行，其在CS损伤范例中保持完整并且可以有助于功能恢复(图8D)。为了测试这一点，轴突侧枝的分布首先在CS损伤的头侧和尾侧的脊髓中表征。观察到在Ryk条件性缺失小鼠中遍及整个灰质的轴突侧枝密度增加，密度最高的更平均，更靠近主背柱皮质脊髓束(图10A和10B)，表明可能会从Ryk缺失后的CST背柱增加分支。在所研究的任何小鼠中，在CS损伤的背柱CST尾侧内没有轴突存在。
为了进一步评估背柱CST对行为恢复的贡献，在CS损伤后12周，在C3水平，原始CS损伤的头侧1.15±0.07mm处，对这些动物进行第二次背柱损伤(图11A和11B)。外侧CST再次幸免于此损伤。经过一周的延迟让小鼠从脊髓休克的即时低反射阶段恢复后，开始进行行为测试。C3的第二次损伤消除了在Ryk条件性缺失小鼠中观察到的增强的功能恢复，仅留下对照小鼠实现的适度水平的部分恢复(图11C)。这表明来自背柱CST的轴突芽确实负责Ryk条件性敲除中的增强的功能恢复。这也表明，幸免的侧向CST轴突可能仅对背柱皮质脊髓束的基础功能恢复提供较小的贡献。C3损伤后2周的轴突分布的定量证实第二次C3损伤消除了两个损伤部位之间的大部分轴突侧枝，从而破坏了重塑的皮质脊髓回路(图11D-11F)。
实施例11
单克隆Ryk抗体促进功能恢复
为了测试脊髓损伤后受损脊髓中Wnt-Ryk信号传导轴的抑制是否足以增加CST重塑和增强行为恢复，使用一半Wnt结合域(氨基酸范围90-183)作为抗原产生新的单克隆Ryk抗体并且在脊髓损伤后立即输注到成年大鼠中(图12A，17A和17B)。产生先前使用相同区域的功能阻断多克隆抗体。在CS背柱线刀损伤后，通过渗透性微型泵输注Ryk抗体4周促进了前肢到达任务中熟练前肢功能的恢复，所有大鼠恢复到伤前最高水平，相比之下输注了IgG对照的大鼠只恢复了一半(图12B)。Ryk抗体不能增强网格交叉运动任务的恢复，因为不管治疗组如何，大鼠表现出相似水平的前肢步进损伤(图12C)。皮质脊髓轴突用注射到运动皮质中的生物素化葡聚糖胺(BDA)标记。与损伤前条件性Ryk缺失一致，发现损伤时输注的Ryk单克隆抗体引起损伤水平处的头侧和尾侧皮质脊髓轴突侧支增加(单尾t检验P<0.05，图12E-12I和18)。在大鼠中输注Ryk抗体后侧枝芽的增加程度与在小鼠中缺乏Ryk表达的CST轴突中观察到的相似(图9E和12I)。这些结果还表明Ryk信号传导是一种可行的治疗靶点，因为通过在脊髓损伤后阻断其功能可以促进功能恢复。
实施例12
恢复期间的皮质映射重组
为了处理初级运动皮质恢复对重塑脊髓的控制的回路机制，使用光遗传学方法来监测皮质输出。已经在啮齿动物和灵长类动物中使用皮质内电刺激以及人类的经颅磁刺激研究了皮质运动映射。光遗传学工具的最新进展允许以微创方式刺激特定神经群体。具体地，在Thy1启动子(Thy1-ChR2)的控制下，光活化的非选择性阳离子通道光敏感通道蛋白-2(ChR2)的表达允许选择性激活运动皮质内的V层映射神经元。Thy1-ChR2小鼠上进行优势前肢对侧的单侧开颅手术，以通过对损伤后诱发运动输出的重复光遗传学映射来研究运动图谱变化(图19)。开颅手术后，AAV-Cre单侧注射到优势前肢对侧的运动皮质，因为对侧皮质在前肢训练时表现出运动可塑性；在具有Ryk缺失的CST轴突中特异性诱导支持功能恢复的CST侧枝可塑性。通过观察镇静小鼠中诱发的对侧运动输出来评估运动图谱映射。
在小鼠脊髓损伤后立即观察到皮质运动输出的大量重新映射。在CS损伤后急性(3天)，在损伤水平或低于损伤水平的肢体肌肉的运动表现的总面积减少或消除(图12C)。相反，运动映射用于扩展在损伤部位上方的具有运动神经元的肌肉群，最显著的是由肱二头肌和肱肌介导的肘屈曲(图13B，14E和20C)。在脊髓损伤后的接下来的两个月内，皮质映射随着持续的前肢到达和抓握训练经历了逐渐的变化(图20)。损伤后的行为恢复在损伤后4至8周达到稳定水平(图8F和21)，中位时间达到对照小鼠损伤后的6周表现或Ryk条件性缺失小鼠损伤后5周内的表现峰值的90％。因此，在损伤后4周和8周分别在峰值恢复之前和之后检查皮质运动映射。在损伤后4周，观察到分配到前肢伸肌(二头肌)或前肢屈肌(三头肌)激活的运动皮质的比例存在显著差异，其中Ryk缺失的小鼠表现出较大的屈肌运动映射，其代价是缩短的伸肌映射(P<0.05单尾t检验，图14E和14F)。4周时肘伸肌区域扩展到屈肌最初占据的区域与行为恢复呈负相关(n＝21只小鼠：10只(对照)、11只(Ryk cKO)，Spearman's p＝-0.5766，P＝0.0062)。在损伤后8周，Ryk缺失的小鼠表现出类似于对照的伸肌和屈肌运动映射的模式，然而所有肘部运动(屈肌和伸肌)占据的总面积在Ryk缺失的小鼠中显著更大(单尾t-试验，P＝0.0480t(14)＝1.79)。另外，在损伤后8周，与对照小鼠的10％相比，64％的Ryk缺失小鼠的腕部屈肌表现恢复(或超过)最大损伤前尺寸(Wilcoxon秩和P＝0.0136×2＝6.086，图20C)。腕部屈肌控制的恢复与损伤后8周的前肢到达性能的改善相关(Spearman's p＝0.4555，P＝0.0380)。在实验过程中，无论受伤或基因型如何，手腕运动和熟练的前肢到达性能都有很强的相关性(Pearson's p＝0.665，P<0.0001，图15D)。
为了进一步表征重新映射的皮质输出，在CS损伤后8周，小鼠在C3处，伸肌运动单位水平的头侧，经历第二次背柱损伤(图11B)。结果发现C3损伤显著降低了所有小鼠的屈肌运动映射，但令人惊讶的是，对恢复的伸肌运动映射几乎没有影响，表明屈肌控制的路线是从头侧或从外侧皮质脊髓束连接至C3(图13D)。重要的是，随后的单侧锥体束切断术消除了对皮质刺激的单侧前肢响应以及小鼠执行前肢到达任务的能力(图13D和21)。虽然其他脊柱上通路(诸如红核脊髓束或网状脊髓束)的可塑性也可能有助于功能恢复，但单侧锥体束切断术的效果表明，初级运动皮质与颈髓的直接联系对于自主熟练前肢运动的恢复至关重要。
实施例13
皮质重组需要康复训练
在实验过程中对熟练的前肢到达的重复测试基本上构成了可以促进脊髓损伤和皮质重组的运动恢复的康复训练范例。为了确定由Ryk单独缺失介导的诱导轴突可塑性是否为促进功能恢复所需要，在另一组损伤后未经过每周行为测试的小鼠中，测试在CS损伤后8周熟练前肢伸缩的恢复(图15A)。未经历每周行为测试的小鼠仅显示有限的熟练前肢恢复，其表现类似于在损伤后一周测试的小鼠的表现(图15C和8F)。在没有每周测试的情况下，无论Ryk条件性缺失如何，皮质运动映射的精细化也受到损害(图15B和22)。
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尽管已经参考上述实施例描述了本发明，但应理解，修改和变化包含在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅受以上权利要求的限制。
序列表
<110> 加利福尼亚大学董事会
<120> 抗-RYK抗体及使用其的方法
<130> 20378-201389
<140>
<141>
<150> 62/314,025
<151> 2016-03-28
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
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Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu
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Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
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Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Arg Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Glu Thr Leu Ile
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Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
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Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
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Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
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Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
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Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
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Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
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Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
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Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
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Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
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Ala Tyr Ile Ser Thr Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Ala Arg His Gly Glu Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
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Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro
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Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu
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Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys
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Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
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Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
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Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp
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Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe
275 280 285
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp
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Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys
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Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys
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Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr
405 410 415
Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser
420 425 430
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435

Claims (75)

1.一种分离的抗Ryk抗体或抗体片段：
(a)特异性结合至Wnt的结合域，所述抗体或抗体片段包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:5-7或SEQ ID NO:5、11和12中所示的CDR序列；和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:1-3或SEQ ID NO:9、2和3中所示的CDR序列；或者
(b)特异性结合至Wnt上与参考抗体或抗体片段特异性结合的相同表位，或与参考抗体或抗体片段交叉竞争特异性结合至Wnt的相同表位，所述参考抗体或抗体片段包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:5-7或SEQ ID NO:5、11和12中所示的CDR序列；和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:1-3或SEQ ID NO:9、2和3中所示的CDR序列。
2.权利要求1所述的分离的抗Ryk抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段抑制或降低结合至Wnt的Ryk。
3.权利要求1所述的分离的抗Ryk抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段特异性结合至Wnt的氨基酸残基90-183内的表位。
4.权利要求1所述的分离的抗体或抗体片段，其中，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:8具有至少85％序列一致性，可选地与SEQ ID NO:8具有至少90％的序列一致性的氨基酸序列。
5.权利要求1所述的分离的抗体或抗体片段，其中，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:8具有至少95％序列一致性，可选地与SEQ ID NO:8具有至少99％的序列一致性的氨基酸序列。
6.权利要求1所述的分离的抗体或抗体片段，其中，所述重链可变区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
7.权利要求1所述的分离的抗体或抗体片段，其中，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:13具有至少85％序列一致性，可选地与SEQ ID NO:13具有至少90％的序列一致性的氨基酸序列。
8.权利要求1所述的分离的抗体或抗体片段，其中，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:13具有至少95％序列一致性，可选地与SEQ ID NO:13具有至少99％的序列一致性的氨基酸序列。
9.权利要求1所述的分离的抗体或抗体片段，其中，所述重链可变区包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
10.权利要求1所述的分离的抗体或抗体片段，其中，所述轻链可变区包含与SEQ IDNO:4具有至少85％序列一致性，可选地与SEQ ID NO:4具有至少90％的序列一致性的氨基酸序列。
11.权利要求1所述的分离的抗体或抗体片段，其中，所述轻链可变区包含与SEQ IDNO:4具有至少95％序列一致性，可选地与SEQ ID NO:4具有至少99％的序列一致性的氨基酸序列。
12.权利要求1所述的分离的抗体或抗体片段，其中，所述轻链可变区包含与SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列。
13.权利要求1所述的分离的抗体或抗体片段，其中，所述轻链可变区包含与SEQ IDNO:10具有至少85％序列一致性，可选地与SEQ ID NO:10具有至少90％的序列一致性的氨基酸序列。
14.权利要求1所述的分离的抗体或抗体片段，其中，所述轻链可变区包含与SEQ IDNO:10具有至少95％序列一致性，可选地与SEQ ID NO:10具有至少99％的序列一致性的氨基酸序列。
15.权利要求1所述的分离的抗体或抗体片段，其中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
16.特异性结合至Wnt结合域的分离的抗体或抗体片段，包括：
a)重链可变区，其与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少85％的序列一致性，所述重链可变区包含SEQ ID NO:5-7所示的三个CDR序列；和/或
b)轻链可变区，其与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少85％的序列一致性，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:1-3所示的三个CDR序列。
17.权利要求16所述的分离的抗体或抗体片段，其中，所述重链可变区与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少90％的序列一致性，并且所述轻链可变区与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90％的序列一致性。
18.权利要求16所述的分离的抗体或抗体片段，其中，所述重链可变区与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少95％的序列一致性，并且所述轻链可变区与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少95％的序列一致性。
19.权利要求16所述的分离的抗体或抗体片段，其中，所述重链可变区与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少99％的序列一致性，并且所述轻链可变区与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少99％的序列一致性。
20.权利要求16所述的分离的抗体或抗体片段，其中，所述重链可变区含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列，并且所述轻链可变区含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
21.特异性结合至Wnt结合域的分离的抗体或抗体片段，包括：
a)重链可变区，其与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少85％的序列一致性，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:5、11和12所示的三个CDR序列；和/或
b)轻链可变区，其与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少85％的序列一致性，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:9、2和3所示的三个CDR序列。
22.权利要求21所述的分离的抗体或抗体片段，其中，所述重链可变区与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少90％的序列一致性，并且所述轻链可变区与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少90％的序列一致性。
23.权利要求21所述的分离的抗体或抗体片段，其中，所述重链可变区与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少95％的序列一致性，并且所述轻链可变区与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少95％的序列一致性。
24.权利要求21所述的分离的抗体或抗体片段，其中，所述重链可变区与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少99％的序列一致性，并且所述轻链可变区与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少99％的序列一致性。
25.权利要求21所述的分离的抗体或抗体片段，其中，所述重链可变区含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列，并且所述轻链可变区含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
26.药物组合物，所述药物组合物包含有效量的根据权利要求1-25中任一项所述的抗体或抗体片段，和药学上可接受的载体或赋形剂。
27.核酸序列，所述核酸序列编码根据权利要求1-25中任一项所述的分离的抗体或抗体片段。
28.载体，所述载体含有权利要求27所述的核酸序列。
29.权利要求28所述的载体，其中，所述载体为表达载体。
30.宿主细胞，所述宿主细胞含有权利要求28所述的载体。
31.权利要求30所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。
32.转基因小鼠，其含有权利要求30所述的宿主细胞，其中，所述小鼠表达由所述核酸编码的多肽。
33.一种干扰Wnt和Ryk相互作用的方法，包括：使包含Wnt和Ryk的样品与根据权利要求1-25中任一项所述的分离的抗体或抗体片段接触，从而干扰所述Wnt和Ryk的相互作用。
34.一种用于抑制神经元的变性的方法，所述方法包括使所述神经元与根据权利要求1-25中任一项所述的分离的抗体或抗体片段接触，从而抑制所述神经元的变性。
35.权利要求34所述的方法，其中抑制了所述神经元的轴突的变性，或者其中抑制了所述神经元的细胞体的变性。
36.权利要求35所述的方法，其中，所述轴突是脊髓连合轴突。
37.权利要求35所述的方法，其中，所述轴突是上运动神经元轴突。
38.权利要求35所述的方法，其中，所述轴突是中枢神经***轴突。
39.权利要求34所述的方法，其中，所述神经元是受损的脊髓神经元。
40.权利要求34所述的方法，其中，所述神经元是感觉神经元。
41.权利要求34所述的方法，其中，所述神经元是运动神经元。
42.权利要求34所述的方法，其中，所述神经元是小脑颗粒神经元、背根神经节神经元、皮质神经元、交感神经元或海马神经元。
43.权利要求34所述的方法，其中，所述神经元形成神经移植物或神经移植体的一部分。
44.权利要求34所述的方法，其中，所述神经元是离体的或体外的。
45.权利要求43所述的方法，其中，所述神经移植物或神经移植体形成生物体的一部分。
46.权利要求45所述的方法，其中，所述生物体是哺乳动物。
47.权利要求46所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。
48.一种治疗受试者的神经疾病或障碍的方法，所述受试者患有神经疾病或障碍或者有患神经疾病或障碍的风险，包括给所述受试者施用有效量的权利要求1-25中任一项所述的分离的抗体或抗体片段、权利要求26所述的药物组合物、权利要求27所述的核酸序列，权利要求28或29所述的载体，或权利要求30或31所述的宿主细胞，从而治疗所述受试者的神经疾病或障碍。
49.权利要求48所述的方法，其中，所述神经疾病或障碍是神经变性疾病或障碍。
50.权利要求49所述的方法，其中，所述神经变性疾病或障碍是肌萎缩性脊髓侧索硬化症、阿尔茨海默病或帕金森病。
51.一种用于调节神经元定向生长的方法，包括使所述神经元与根据权利要求1-25中任一项所述的分离的抗体或抗体片段接触，从而调节所述神经元的定向生长。
52.权利要求51所述的方法，其中，所述神经元是脊髓连合轴突。
53.权利要求51所述的方法，其中，所述神经元是上运动神经元轴突。
54.权利要求51所述的方法，其中，所述神经元是中枢神经***轴突。
55.权利要求51所述的方法，其中，所述神经元是受损的脊髓神经元。
56.权利要求51所述的方法，其中，所述神经元是感觉神经元。
57.权利要求51所述的方法，其中，所述神经元是运动神经元。
58.权利要求51所述的方法，其中，所述定向生长促进所述神经元的再生。
59.治疗受试者的神经疾病或障碍的方法，所述受试者患有神经疾病或障碍或者有患神经疾病或障碍的风险，包括给所述受试者施用有效量的分离的单克隆抗Ryk抗体或抗体片段，所述分离的单克隆抗Ryk抗体或抗体片段特异性结合至Wnt的结合域并抑制Wnt-Ryk相互作用，从而治疗所述受试者的神经疾病或障碍。
60.权利要求59所述的方法，其中，所述神经疾病或障碍是神经变性疾病或障碍。
61.权利要求59所述的方法，其中，所述抗体或抗体片段特异性结合至Wnt的氨基酸残基90-183内的表位。
62.免疫偶联物，所述免疫偶联物包含与治疗剂连接的权利要求1-25中任一项所述的分离的抗Ryk抗体或抗体片段。
63.权利要求62所述的免疫偶联物，其中，所述治疗剂是细胞毒素或放射性同位素。
64.双特异性分子，所述双特异性分子包含连接至第二功能部分的权利要求1-25中任一项所述的分离的抗Ryk抗体或抗体片段，所述第二功能部分具有与权利要求1-25中任一项所述的分离的抗Ryk抗体或抗体片段不同的结合特异性。
65.一种转基因非人哺乳动物，所述转基因非人哺乳动物的基因组包含Ryk基因的杂合或纯合的缺失、失活或敲除。
66.权利要求65所述的转基因非人哺乳动物，所述转基因非人哺乳动物是小鼠。
67.权利要求66所述的转基因非人哺乳动物，其中，所述小鼠具有卷曲蛋白3-/-Ryk+/-的表型。
68.权利要求66所述的转基因非人哺乳动物，其中，所述小鼠含有所述Ryk基因的皮质脊髓束(CST)特异性破坏。
69.权利要求68所述的转基因非人哺乳动物，其中，经破坏的Ryk基因包含重组Ryk等位基因、选择标记、位于所述选择标记侧翼的frt位点，以及位于所述等位基因的一部分侧翼的loxP位点。
70.权利要求69所述的转基因非人哺乳动物，其中，所述标记是PGK Neo以及所述loxP位点位于所述等位基因外显子3-6的侧翼。
71.分离的细胞，所述分离的细胞源自权利要求65-70中任一项所述的转基因非人哺乳动物。
72.包含Ryk基因的一部分的载体，其中，所述Ryk基因的外显子3-6的侧翼为3'和5'loxP位点、选择标记位于外显子6和所述5'loxP位点之间、所述选择标记的侧翼为frt位点。
73.权利要求72所述的载体，其中，所述标记是PGK Neo。
74.一种产生在Ryk基因中具有CST靶向破坏的敲除小鼠的方法，包括以下步骤：
(a)将权利要求72所述的载体转染到鼠胚胎干(ES)细胞群中；
(b)选择表达所述选择标记的经转染的ES细胞；
(c)将所述经转染的ES细胞导入所述小鼠祖先的胚胎中；
(d)允许所述胚胎发育至在其种系中足以产生具有条件性敲除构建体的嵌合小鼠；
(e)繁殖所述嵌合小鼠以产生具有条件性可破坏的Ryk基因的杂合小鼠；和
(f)用含有仅在皮质脊髓轴突中阻止tdTomato表达的loxP侧翼终止盒的小鼠繁殖所述杂合小鼠以产生在Ryk基因中具有CST特异性破坏的小鼠。
75.一种筛选用于治疗神经疾病或障碍的治疗剂的方法，包括施用试验试剂至权利要求65-70中任一项所述的转基因非人哺乳动物，并评价所述试验试剂对以下至少一项的作用：所述转基因非人哺乳动物的至少一种疾病相关组织中非典型蛋白激酶C(aPKC)或MARK2蛋白的量、aPKC或MARK2活性的水平或者aPKC或MARK2的水平，其中，以下至少一项：相对于未接受所述试验试剂的相似转基因非人类哺乳动物，至少一种疾病相关组织中aPKC蛋白的量减少、MARK2蛋白的量增加、aPKC活性水平的降低、MARK2活性水平的升高、aPKC水平的降低或MARK2水平的升高表明所述试验试剂对所述神经疾病或障碍具有治疗作用。
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