KR100746585B1 - 자극추구형 성격과 알코올 선호도가 증가된α1ＧＴ-타입채널 유전자 적중생쥐 및 알파1Ｇ 유전자를조절하여 기분장애를 치료하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 α1G T-타입 칼슘 채널 돌연변이 생쥐의 신경 질환 모델로서의 새로운 용도에 관한 것으로서, 구체적으로 새로운 자극 추구성향(novelty-seeking) 및 알코올 선호도(alcohol preference)를 나타내는 α1G T-타입 칼슘 채널이 결손된 생쥐를 사람에게서 나타나는 자극추구형 성격 질환, 알코올 중독(alcoholism) 및 스트레스와 같은 감정 및 욕구조절 이상과 관련된 신경 질환의 모델로서 이용하는 용도에 관한 것이다. 본 발명의 α1G T-타입 칼슘 채널 돌연변이 생쥐의 새로운 자극 추구 및 알코올 선호 성향은 이와 관련된 사람의 신경 질환에 대한 약물 및 치료 방법 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

자극추구형 성격과 알코올 선호도가 증가된 α1ＧＴ-타입채널 유전자 적중생쥐 및 알파1Ｇ 유전자를 조절하여 기분장애를 치료하는 방법{Mice lacking alpha1G showing enhanced novelty-seeking and alcohol preference and therapeutic methods for mood disorders by modulating alpha1G T-type calcium channels}

도 1의 A는 본 발명의 α1G T-타입 칼슘 채널 돌연변이 생쥐의 개방장에서의 새로운 환경에 대한 반응성을 나타낸 그래프이고,

도 1의 B는 새로운 사육상자에서의 새로운 환경에 대한 반응성을 나타낸 그래프이고,

도 2는 개방장의 운동성 검사에서 시간에 따른 각 구간의 이동경로를 추적한 결과이고,

도 3의 A는 대조군으로서 사용한 정상생쥐의 새로운 물체에 대한 반응성으로 시간의 경과에 따라 이동시킨 물체의 이동 사진이고,

도 3의 B는 본 발명의 변이 생쥐의 새로운 물체에 대한 반응성으로 시간의 경과에 따라 이동시킨 물체의 이동 사진이고,

도 3의 C는 정상생쥐(α1G+/+) 및 본 발명의 변이 생쥐(α1G-/-)의 새로운 물체접근 지체시간과 접촉시간을 나타낸 그래프이고,

도 3의 D는 새로운 물체탐사 행동분류에 따른 차이를 나타낸 그래프이고,

도 3의 E는 시간에 따른 물체접촉의 차이를 나타낸 그래프이고,

도 3의 F는 물체이동 거리 측정치를 나타낸 그래프이고,

도 4의 A는 정상생쥐(α1G+/+) 및 본 발명의 변이 생쥐(α1G-/-)의 사물구분 능력 검사에서 상대적으로 구분하기 어려운 두 물체를 구별하는 양상을 나타낸 그래프이고,

도 4의 B는 상대적으로 구분하기 용이한 두 물체를 구별하는 검사결과 그래프이고,

도 5는 로타로드 기구를 이용한 운동학습 능력 검사 그래프이고,

도 6의 A는 공포조건반사 학습 24 시간 후 US(tone) 자극에 대한 운동성 감소 반응치를 나타낸 그래프이고,

도 6의 B는 공포 조건반사 학습 24 시간 후 공간조건에 의한 운동성 감소치를 나타낸 그래프이고,

도 7의 A는 모리스 수중미로 검사결과로서 숨겨진 플랫폼 찾기 공간학습 검사 결과를 나타내 그래프이고,

도 7의 B는 숨겨진 플랫폼 찾기 공간학습 검사를 4 일 동안 12 회 반복한 후 5 일째 플랫폼 없는 수중미로에서 플랫폼이 있었던 사반구(P)에 머무르는 시간(time spend), 지나간 횟수(crossing) 및 근접성 측정치(proximity)를 나타낸 그래프이고,

도 8의 A는 암페타민 처리 직후 개방장 노출에 따른 운동성 변화를 나타낸 그래프이고,

도 8의 B는 암페타민 처리 한 시간 이후 개방장 노출에 따른 운동성 변화를 나타낸 그래프이고,

도 9의 A는 식염수 처리 한 시간 이후 개방장에서의 운동성 변화를 나타낸 그래프이고,

도 9의 B는 리튬 처리 한 시간 이후 개방장에서의 운동성 변화를 나타낸 그래프이고,

도 9의 C는 식염수 및 리튬 처리 한 시간 이후 새로운 물체에 대한 접촉 빈도를 나타낸 그래프이고,

도 9의 D는 식염수 및 리튬 처리 한 시간 이후 새로운 물체의 이동거리를 나타낸 그래프이고,

도 10의 A는 절망행동 측정검사를 위한 꼬리매달기 실험 결과 그래프이고,

도 10의 B는 절망행동 측정검사를 위한 강제수영검사 결과 그래프이고,

도 11은 이중 급이통 선택검사를 통하여 알코올과 물, 설탕과 물 및 퀴닌과 물에 대한 선호도 측정치를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 α1G T-타입 칼슘 채널 돌연변이 생쥐의 신경 질환 모델로서의 새 로운 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 새로운 자극 추구성향(novelty-seeking) 및 알코올 선호도(alcohol preference)를 나타내는 α1G T-타입 칼슘 채널이 결손된 생쥐를 사람에게서 나타나는 자극추구형 성격 질환, 알코올 중독(alcoholism) 및 스트레스와 같은 감정 및 욕구조절 이상과 관련된 신경 질환의 모델로서 이용하는 용도에 관한 것이다.

자극추구형(novelty-seeking) 성격을 소유한 사람은 경험하지 못한 새로운 대상이나 약물에 관한 선호도가 일반적인 사람에 비하여 증가되어 있어, 모험이나 범죄와 같은 위험한 행동 양상이 유발되기 쉽고 알코올 중독 및 쇼핑 중독에 쉽게 노출되지만, 현재까지 이들의 생리학적 또는 유전학적인 조절 메커니즘에 관하여 밝혀진 바가 없다.

새로운 대상이나 환경은 호기심뿐 만 아니라 내재된 위험성에 대한 불안감 또는 두려움 등 복합적인 감정변화를 유발한다(Bronson, G. W., Psychol Bull 69, 350-358, 1968; Marks, I., J Child Psychol Psychiatry 28, 667-697, 1987). Cloninger 박사의 TPQ(Tri-dimensional Personality Questionnaires) 분류법에 따르면, 자극추구 형 성격은 특히, 새로운 대상에 대한 불안감이나 두려움이 상대적으로 감소된 경우이다(Cloninger, C. R., Psychiatr Dev 4, 167-226, 1986). 자극추구 성향이 높은 사람들은 일상적으로 새로운 모험을 시도하고, 틀에 박힌 사고를 싫어하며 관심사가 매우 다양하여 여러분야에 관심을 보인다(Cloninger, C. R., Psychiatr Dev 4, 167-226, 1986; Cloninger, C. R. et al., Psychol Rep 69, 1047-1057, 1991; Maggini, C. et al., Compr Psychiatry 41, 426-431, 2000). 1998년에 미국 LA의 캘리포니아대학의 어니스트 노블 박사는 소위 도파민 수용체 DRD2 및 DRD4의 특정 대립유전자가 비행기로부터의 공중낙하, 번지점프 같이 스릴을 느낄 수 있는 행위와 술, 담배, 마약 등을 유난히 좋아하는 성격을 갖는 사람들에게서 발견된다는 연구 결과를 발표했다(Noble, E. P. et al., Am J Med Genet 81, 257-267, 1998). 그러나 인간의 두뇌가 어떻게 위험스런 새로운 자극에 대한 선호도를 보이게 되는지 아직까지 구체적인 메커니즘은 밝혀지지 않고 있다. 그 이유 중 하나는 자극추구형 성격에 관한 적절한 실험동물 모델이 없고, 도파민 수용체 이외에 다른 분자표적이 발견되지 않고 있기 때문이다.

전압 의존성 칼슘 채널은 신경세포의 활성에 의해 세포 내 칼슘 농도를 증가시키는 역할을 하는데(Tsien, R. W., Annu Rev Physiol 45, 341-358, 1983), 전압 의존도에 따라 고전압 의존성(high-voltage dependent) 및 저전압 의존성(low-voltage dependent) 채널로 분류된다(Tsien, R. W. et al., Trends Neurosci 18, 52-54, 1995). T-타입 칼슘 채널은 대표적인 저전압 의존성 칼슘 채널로서 포유류에서는 α1 서브유니트(subunit)에 대한 유전자형에 따라 Cav3.1(α1G), 3.2(α1H), 3.3(α1I)의 세 종류가 존재한다(Perez-Reyes, E., Physiol Rev 83, 117-161, 2003). α1G 칼슘 채널은 시상핵에서 신경세포의 다발성 발화(burst firings)의 생성에 관여하며, 최근에 중요한 병리학적인 기능들이 밝혀졌다(Kim, D. et al., Science 302, 117-119, 2003; Kim, D. et al., Neuron 31, 35-45, 2001).

약리학적 연구와 α1G 칼슘 채널 변이생쥐의 분석에 의하면, α1G 칼슘 채널은 GABAB 수용체의 신호를 받아 압상스 간질의 SWDs(spike-and-wave discharge) 형성에 관여하며(Kim, D. et al., Neuron 31, 35-45, 2001), 시상핵의 주요기능인 감각신호 전달에서 통증신호가 지속되면 이를 억제하는 데도 관여하는 것으로 밝혀졌다(Kim, D. et al., Science 302, 117-119, 2003). 그러나 상기한 α1G T-타입 채널의 결손이 개체의 행동에 미치는 영향은 규명된 바가 없었다.

이에 본 발명자들은 α1G T-타입 채널이 결손된 생쥐를 다양한 행동학적 방법을 이용하여 관찰하였으며, 그 결과 α1G 변이 생쥐가 새로운 자극 추구성향(novelty-seeking) 및 알코올 선호도(alcohol preference)를 나타냄을 밝히고, 상기의 α1G T-타입 채널 결손 생쥐를 사람에게서 나타나는 자극추구형 성격, 알코올 중독(alcoholism) 및 스트레스와 같은 감정 및 욕구조절 이상과 관련된 신경 질환의 모델로 사용함으로써 궁극적으로 사람의 신경 질환에 대한 약물 및 치료 방법 개발에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 α1G T-타입 칼슘 채널 돌연변이 생쥐를 사람의 자극추구형 성격, 알코올 중독(alcoholism) 및 스트레스와 같은 감정 및 욕구조절 이상과 관련된 신경 질환의 모델로서 이용하는 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 α1G T-타입 칼슘 채널 돌연변이 생쥐를 자극추구형 성격, 알코올 중독 및 스트레스의 신경 질환의 동물모델로서 이용하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 α 1G T-타입 칼슘 채널의 억제제 또는 활성화제를 자극추구형 성격, 알코올 중독 및 스트레스의 치료제로 이용하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 α 1G T-타입 칼슘 채널 돌연변이 생쥐를 자극추구형 성격, 알코올 중독 및 스트레스의 치료약물 스크리닝에 이용하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 α1G T-타입 칼슘 채널 돌연변이 생쥐를 자극추구형 성격, 알코올 중독 및 스트레스의 신경 질환의 동물모델로서 이용하는 방법을 제공한다.

본 발명에서는 T-타입 칼슘 이온 통로의 α1G 칼슘 채널의 변이에 의한 행동학적 양태의 변화를 알아보기 위하여, α1G 단백질의 N-말단 부위가 상실된 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 α1G 유전자 변이 생쥐를 이용하였다. 상기 α1G 유전자 변이 생쥐는 본 발명자들에 의하여 2001년 5월 25일자로 출원된 "칼슘 이온 통로 알파 1D 유전자 변이생쥐 및 그의 제조 방법"(출원번호:10-2001-0028803)을 이용하여 제조하였다.

구체적으로, 적중 벡터를 염색체 상의 특정 유전자에 도입함으로써 게놈 중 의 특정 유전자를 파괴하여 변이 동물을 제조하는 유전자 적중법을 이용하여 α1G 유전자 변이 생쥐를 제조하였다. 사용된 적중벡터는 칼슘 이온 통로 α1G N-말단 일부가 상실된 단백질을 코딩하는 유전자에 대한 상동절편, PGK-neo 카셋트 및 3' 말단에 위치하는 티미딘 키나제(thymidine kinase) 유전자 카셋트를 포함한다. 상기의 적중벡터는 상동 절편에서 동형재조합(homologous recombination)이 발생하고, α1G 단백질의 N-말단 부분이 상실되기 때문에 정상적인 칼슘 이온 통로 α1G 유전자가 발현되지 않는다. 먼저 상기한 적중벡터를 쥐의 배아간세포에 도입하고, 유전자 적중이 확인된 배아간세포 클론을 배양한 후 포배아의 포배강에 주입하여, 정관수술한 수컷과 교배시킨 후 2.5 p.c.된 가임신 대리모 생쥐의 자궁에 이식함으로써 키메라 생쥐의 발생을 유도하였다. 상기 키메라 생쥐를 정상 생쥐와 교배시켜 α1G +/- 유전자형을 갖는 이형접합체(heterozygote) 생쥐를 얻고, 다시 상기 이형접합체 생쥐의 암컷과 수컷을 교배시킴으로써 α1G-/- 유전자형을 갖는 유전자변이 생쥐를 제조하였다.

상기 유전자 변이 생쥐는 정상적으로 출생하여 정상 생쥐와 같은 수명을 갖고 있고, 암수 둘 다 정상 생쥐와 교배했을 때 정상적인 생식능력을 갖고 있다.

본 발명자들은 상기의 T-타입 칼슘 이온 통로의 소공형성 구성단위(subunit)를 암호화하는 α1G 유전자의 일부가 결실되어 α1G T-타입 칼슘 채널의 기능이 억제된 상기의 유전자 변이 생쥐를 이용하여 다양한 행동학적 특징을 관찰하고 이와 관련된 신경질환 기작을 연구하였다.

먼저, 본 발명자들은 α1G-/- 변이 생쥐의 환경 변화에 따른 행동양상 변화를 관찰한 결과, 새로운 환경을 탐색 하는 동안 α1G-/- 생쥐의 운동성이 정상 생쥐에 비하여 증가함을 확인하였다(도 1 및 2 참조). 이를 확실하게 검증하기 위해 적응된 사육상자에 새로운 물체를 넣고 반응성을 측정한 결과, 새로운 물체에 접근하는 시간은 정상생쥐에 비해 짧은 반면 접촉하는 시간은 길었으며, 새로운 물체에 대한 행동 방식에 있어서도 새로운 물체 주변을 파헤치거나 물체를 물고 밀고 끌고 다니는 등 정상생쥐에서 거의 관찰되지 않는 놀이행동들이 관찰되었다(도 3 참조).

상기한 α1G-/- 생쥐와 정상생쥐의 행동 양상의 차이는 새로운 물체를 감지하는 시각적인 능력의 차이가 아니라 새로운 물체에 대한 두뇌의 반응성에서 차이에서 비롯된다(도 4 참조).

본 발명의 α1G-/- 생쥐의 행동 양상과 유사하게 기존의 보고된 운동성이 증가된 질병모델을 예를 들면 주위결손행동장애(attention-deficit hyperactive disorder)(Jaber, M. et al., C R Seances Soc Biol Fil 192, 1127-1137, 1998), 정신분열증(schizophrenia)(Mailman, R. B. et al., Appl Res Ment Retard 2, 1-12, 1981) 및 반복행동장애(stereotypy)(Aman, M. G., J Autism Dev Disord 12, 385-398, 1982)가 있는데, 상기한 질병의 공통적인 특성은 공간학습을 포함한 고등 인지기능에 이상이 있다는 것이다.

따라서 본 발명자들은 α1G-/- 변이 생쥐의 증가된 운동성이 상기한 질병들의 소인과 관계가 있는지를 확인하기 위해 다양한 학습능력 검사를 수행하였지만 정상 생쥐와 큰 차이를 발견할 수 없었다(도 5, 6 및 7 참조). 이외에도 기존의 보고된 결과들을 분석해 보면 학습능력 이상을 수반하는 운동 증가의 경우는 α1G-/- 생쥐에게서 보이는 것처럼 새로운 환경에 의해 증가된 운동성이 적응함에 따라 감소하지 않고 장시간 지속 되게 되는데 이는 학습 능력 결손으로 새로운 환경에 적응하는데 문제가 있음을 시사한다. 결국 α1G-/- 생쥐에게서 보이는 새로운 환경이나 새로운 물체에 친화적인 운동성 증가는 기존에 보고되지 않았던 새로운 형태임을 알 수 있다.

약리학적인 검사 결과도 상기한 결과를 지지한다. 주위결손 행동장애(attention-deficit hyperactive disorder)의 치료제로 쓰이는 암페타민(amphetamine)은 운동성을 증가시키는 기능을 하지만 주위결손행동장애가 있는 경우에는 오히려 운동성증가를 완화하는 효과가 있다고 알려져 있는데(Cirulli, F. and Laviola, G., Neurosci Biobehav Rev 24, 73-84, 2000), α1G-/- 생쥐의 경우는 초기 운동성 증가가 암페타민에 의해 감소되지 않고 오히려 새로운 환경에 비의존적인 운동성 증가가 과도하게 나타났으며(도 8 참조), 조울증 치료제로 사용되는 흥분억제제인 리튬(Nolen, W. A.. Ned Tijdschr Geneeskd 143, 1299-1305, 1999)의 경우도 운동성 자체에는 큰 효과를 나타내지 못하였다(도 9 참조). 따라서 α1G-/- 생쥐의 운동성 증가는 원인을 모르는 새로운 형태임을 약리학적으로도 확인 할 수 있다. 다만 리튬을 전 처리한 α1G-/- 생쥐의 경우 새로운 물체에 대한 반응성에 있어 탐색행동에는 차이가 없으나, 이후 증가되는 놀이행동을 억제하였는데, 이는 변이 생쥐의 과도한 놀이행동의 경우 두뇌의 감정적 변화와 관련이 있음을 의미한다.

상기한 바와 같이, 변이 생쥐의 새로운 것에 대한 선호도 및 반응성이 증가하는 것은 사람의 자극 및 신기 추구형(sensation/novelty-seeking) 성격에서 기술 된 바와 상당히 흡사하다. 자극 추구형 사람들은 새로운 환경이나 자극을 선호함 에 따라 위험스런 놀이행동을 즐기며 약물남용 및 중독에 민감한 반면, 새로운 환경이나 자극이 보통사람들에게 일으킬 수 있는 스트레스나 공포에 대해 덜 민감한 것이 특징이라 할 수 있다(Cloninger, C. R., Psychiatr Dev 4, 167-226, 1986; Cloninger, C. R. et al., Res Publ Assoc Res Nerv Ment Dis 60, 145-166, 1983; Maggini, C. et al., Compr Psychiatry 41, 426-431, 2000). 본 발명의 α1G-/- 변이생쥐는 자극추구형 사람들과 유사하게 환경적 스트레스나 우울함을 유도하는 환경에 덜 민감하다(도 10 및 11 참조).

또한, 자극 추구형 사람들에게서 자주 나타나는 알코올 선호도에 있어서도 α1G-/- 생쥐의 알코올 선호도가 정상생쥐에 비해 유의하게 증가되어 있다(도 12 참조).

결론적으로 본 발명의 α1G-/- 생쥐는 새로운 환경이나 물체 혹은 이나 알코올과 같은 약물이 유발할 수 있는 쾌감에 민감하며, 상대적으로 스트레스도 덜 받는 성향을 보인다. 따라서, α1G-/- 생쥐는 자극추구형 성격과 상당히 유사하며 이들 성격에서 나타나는 긍정적 혹은 부정적 효과를 검사해 볼 수 있는 동물 모델로 충분히 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 α1G T-타입 칼슘 채널의 억제제 또는 활성화제를 자극추구형 성격, 알코올 중독 및 스트레스의 치료제로 이용하는 방법을 제공한다.

상기한 결과는 α1G T-타입 칼슘 채널의 α1G 유전자가 자극추구형 성격 형성에 중요한 역할을 한다는 것을 의미하며, 이는 곧 α1G T-타입 칼슘 채널의 억제제 또는 활성화제가 자극추구형 성격, 알코올 중독 및 스트레스와 관련된 신경질환의 치료제로 이용될 수 있음을 의미한다.

구체적으로, 환경에 대한 지나친 공포심이나 모험심 부족 또는 스트레스 과도에 따르는 신경 질환은 α1G 채널을 억제함으로써 완화 할 수 있으며, 또한, α1G 채널을 활성화하면 여러 가지 중독증상에서 문제가 되는 쾌감에 대한 과도한 추구성향을 억제할 수 있다.

또한, 본 발명은 α 1G T-타입 칼슘 채널 돌연변이 생쥐를 자극추구형 성격, 알코올 중독 및 스트레스의 치료약물 스크리닝에 이용하는 방법을 제공한다.

상기한 바에 의하면 α1G 유전자는 자극추구형 성격 형성에 중요한 역할을 하며, 이러한 사실은 α1G 유전자가 자극추구형 성격, 알코올 중독 및 스트레스와 관련된 신경질환의 치료 방법이나 약물검색에 유용한 목표물질이 될 수 있음을 의미한다. 따라서 α1G 유전자가 결실된 α1G T-타입 칼슘 채널 돌연변이 생쥐를 상기 질환의 치료약물 스크리닝에 손쉽게 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> α1G T-타입 칼슘 채널 돌연변이 생쥐(α1G -/-)의 제조

<1-1> 적중벡터의 제작

본 발명자들은 T-타입 칼슘 이온 통로의 α1G 유전자의 일부가 결실된 유전자 변이 생쥐를 제조하기 위하여, 본 발명자들에 의하여 2001년 5월 25일자로 출원된 "칼슘 이온 통로 알파 1D 유전자 변이생쥐 및 그의 제조 방법"(출원번호:10-2001-0028803)을 이용하였다.

우선, 생쥐 게놈으로부터 칼슘 이온 통로 α1G 유전자를 분리하기 위하여, 랫트의 칼슘 이온 통로 α1G 유전자의 cDNA의 688-1008 부분에 해당하는 부위를 RT-PCR로 분리해 내고 이를 탐침(probe)으로 사용하여 129/svJae 생쥐 게놈 DNA 라이브러리(LamdaFixII, Stratagene)에 혼성화 반응을 수행하였다. 이로부터, 칼슘 이온 통로 α1G 유전자를 가진 게놈 클론 파지를 선별한 후 제한 효소 지도, 서던 블럿 분석 및 염기서열 결정 등에 의하여 상기 파지 클론이 칼슘 이온 통로 α1G 유전자인 것을 확인하였다.

칼슘 이온 통로 α1G 유전자가 결실된 적중벡터를 제조하기 위하여, 상기 α1G 유전자 클론에서 α1G 단백질의 N-말단 부위 중 82-118 부분을 암호하는 부분을 제거하여 PSK-플라스미드 벡터(Stratagene Inc.)에 클로닝하였다. 상기 α1G 유전자의 일부가 결실된 것을 포함하는 적중벡터의 3' 상동절편 말단에는 유전자의 적중 효율을 높이기 위하여 티미딘 키나제(thymidine kinase) 유전자 카셋트 및 음성선별 마커(negative selection marker)를 삽입하였다.

<1-2> 배아간세포의 배양

상기 실시예 <1-1>로부터 제작된 적중벡터를 형질도입시키기 위한 세포주로 J1 배아간세포(embroinic liver cells)를 사용하였다. J1 배아간세포(미국, MIT 의 R. Jeanisch 로부터 분양받음)를 DMEM 배지(Gibco Co.)에 15% 소 태아 혈청(fetal bovine serum, Hyclone Co.), 1x 페니실린-스트렙토마이신 (phenicillin-streptomycin, Gibco Co.), 1x 비-필수 아미노산(Gibco Co.), 0.1 mM 2-머캅토에탄올이 첨가된 ES 배지에 접종한 후 37℃에서 2 내지 3 일 동안 배양하였다. 상기 배양으로부터 얻은 배세포군에 0.25% 트립신이 포함된 1 mM EDTA 용액을 처리하여 단일세포들로 분리하였다.

<1-3> 적중벡터의 도입

상기 실시예 <1-2>에서 단일세포로 분리된 배아간세포에 실시예 <1-1>에서 제작한 적중벡터를 트랜스펙션(transfection)하기 위하여 일렉트로포레이션 (electroporation)을 수행하였다. 구체적으로, 2x10⁷ cells/㎖의 세포농도로 희석된 배아간세포에 실시예 <1-1>의 적중벡터 DNA 25 ㎍를 첨가하여 혼합한 후 270 V/500 μF 조건으로 전기충격을 가하였다. 상기 배아간세포를 0.3 mg/ml G418 및 2 μM의 간사이클로버가 포함된 ES 배지에서 5 내지 7일 동안 배양하여 동형재조합(homologous recombination) 방법에 의해 배아간세포 내 칼슘 이온 통로 α1G 유전자가 적중벡터에 의해 정확하게 적중된 배아간세포 클론을 서던 블럿으로 선별·유지하였다.

<1-4> 키메라(chimera) 생쥐의 제조

칼슘 이온 통로 α1G +/-의 유전자형을 갖는 키메라 생쥐를 제조하기 위하여, 수정된 포배아 세포에 상기 실시예 <1-3>에서 선별된 배아간세포 클론을 미세주입하였다.

구체적으로, C57BL/6J 생쥐(Jackson Laboratory, USA) 암컷과 수컷을 교배시키고 교미 후 3.5일(3.5 p.c.)된 암컷을 경부탈구법으로 희생시켰다. 희생된 암컷으로부터 자궁을 적출하여 자궁 말단부를 가위로 절제한 후 1 ㎖ 주사기를 이용하여 20 mM HEPES, 10% 소 태아 혈청, 0.1 mM 2-머캅토에탄올 및 DMEM을 포함하는 주사 용액 1 ㎖을 관류시켰다. 해부 현미경하에서 미세 유리관을 사용하여 상기 자궁조직으로부터 포배아를 분리하였으며, 분리한 포배아를 35 mm 페트리디쉬 위에 미리 떨어뜨려 놓은 주사 용액 방울에 옮긴 후 후속하는 도입과정에 사용하였다.

이와 같이 분리한 포배아에 상기 실시예 <1-3>에서 선별된 배아간세포 클론을 도입하기 위하여, 미세주입기(Zeiss 사)를 이용하여 홀딩(holding) 피펫으로 포배아의 내부세포괴(inner cell mass) 방향을 음압으로 잡은 상태에서 10 내지 15 개의 배아간세포 클론을 흡입한 주사 피펫을 포배아의 포배강내로 삽입한 후 양압을 주어 배아간세포 클론을 포배아의 포배강내로 주입하였다. 상기 클론이 주입된 포배아를 정관수술한 수컷과 교배시킨 후 2.5 p.c.된 가임신 대리모 생쥐의 자궁에 이식하여 배아간세포 클론(J1) 및 C57BL/6J 생쥐의 포배아로부터 형성된 이형세포 교잡종의 일종인 키메라 생쥐의 발생을 유도하였다. 이때, 자궁이식은 애버틴(avertine, 1 ㎎/㎏ 몸무게)으로 마취된 대리모의 복부를 1 ㎝ 정도 절제하고; 자궁 상부를 핀셋으로 집어 2 cm 정도 체외로 잡아당기고; 주사 바늘로 자궁에 구멍을 내어 이 구멍을 통하여 상기의 포배아를 미세유리관으로 주입하고; 내부 복강막을 봉합사로 두 바늘 꿰멘 다음 겉가죽을 내과용 클립으로 봉입하는 방법을 사용하였다. 이렇게 배아간세포가 주입된 포배아를 대리모 생쥐의 자궁으로 이식하여 약 19 일 동안 배양함으로써 배아간세포 유래의 세포와 포배아 유래의 세포가 융합되어 게놈 내 칼슘 이온 통로 α1G +/-의 유전자형을 가지는 키메라 생쥐를 확보하였다.

<1-5> α1G +/- 유전자형의 이형접합체 생쥐 제조

상기 <실시예 1-4>로부터 얻은 키메라 생쥐를 각각 C57BL/6J과 129sv 생쥐와 6 차례 이상 교배하면서 유지하고, 이로부터 생성된 C57BL/6J-α1G+/- 과 129sv-α1G+/- 생쥐를 교배하여 F1 단계에서 α1G+/+ 와 α1G-/- 생쥐를 제조하였으며, 이들을 하기의 행동실험에 사용하였다. 생쥐들은 SPF(specific pathogen free) 시설에서 12 시간 광주기로 사육 관리 되었으며, 유전자 형 검사는 중합효소 연쇄반응(PCR) 방법을 사용하였다.

<실시예 2> α1G T-타입 칼슘 채널 돌연변이 생쥐의 행동학적 양태 분석

<2-1> 새로운 환경에 대한 반응성 검사

α1G 칼슘 채널 변이 생쥐가 새로운 환경 및 물체에 노출되었을 때 반응하는 양상을 분석하기 위하여, 본 발명의 생쥐를 새로운 사육상자 및 개방장으로 옮겨 행동양태를 관찰하였다.

먼저, 새로운 사육상자에서의 행동양상 분석은 변이 생쥐를 한마리씩 24 시간 동안 독립사육하고, 사육되던 상자로부터 새로운 사육상자로 옮긴 후의 행동을 1 시간 동안 CCD 카메라로 녹화한 뒤, 녹화된 화면을 통해 유전자형을 모르는 실험자가 관찰함으로써 수행하였다.

또한, 개방장(Openfield)에서의 반응성 검사는 실험이 시작되기 1 시간 전, 동물을 검사실로 옮기고, 독립된 사육상자에 한 마리씩 두어 실험 상황에 미리 적응시킨 후, 깔짚이 약 0.5 ㎝ 두께로 깔려 있는 개방장 장치(백색 아크릴, 50×50×50㎝)의 중심부에 동물을 올려놓고 1 시간 동안의 보행활동(locomotor)을 관찰하였다.

그 결과, 새로운 환경을 탐색 하는 동안 정상 생쥐 α1G+/+ 및 변이 생쥐 α1G-/- 생쥐 모두 운동성이 초기 구간에서 유의하게 증가되었으며, 특히, 변이 생쥐인 α1G-/- 생쥐의 새로운 것에 대한 반응성이 더욱 크게 증가하는 것을 확인하였다(도 1 및 2). 구체적으로, 개방장의 경우는 초기 30 분 까지, 새로운 사육상 자의 경우는 20 분까지 탐색운동성이 증가되었다. 그러나, α1G+/+ 및 α1G-/- 그룹 모두 환경적응(habituation)을 통해 탐색 운동성이 감소하는 양상을 보이고 결국에는 서로 차이를 보이지 않게 된다.

<2-2> 새로운 물체에 대한 반응성 검사

본 발명자들은 상기한 실시예 <1-1>의 결과를 더욱 확실하게 검증하기 위하여, 적응된 사육상자에 새로운 물체를 넣고 반응성을 측정하였다. 생쥐를 기존 사육상자에서 꺼내어 준비된 임시 사육상자에 두고, 기존 사육상자에 두 개의 동일한 물체(크기: 3×3×3㎝, 무게: 2.5g, 종이테이프로 감은 스티로폼)를 장치의 반대편 구석에서 10 ㎝ 정도의 여유를 두고 놓아둔 후, 다시 생쥐를 기존 적응된 사육상자로 옮겨 동물의 머리를 물체 반대쪽 벽면을 향한 채로 올려놓고 15 분 동안의 행동을 관찰하였다. 물체는 실험장치의 바닥에 고정시키지 않고 그냥 두어 동물이 물체를 움직일 수 있도록 하였다. 모든 실험과정에서 동물의 행동을 비디오 카메라로 녹화하여 사후 분석에 사용하였다.

상기에서 행동 분석은 1 시간 동안 동물이 움직인 거리; 물체에 처음으로 접촉하기까지의 잠재기; 15 분 동안 동물이 물체에 접촉하는 시간; 물체에 대한 접촉 빈도와 패턴; 및 물체가 이동한 거리를 측정함으로써 수행하였다. 물체에 대한 접촉은 동물의 코가 물체 주변 반경 2 ㎝ 이내에서 물체를 향하고 있거나 혹은 코가 물체에 직접적으로 닿았을 때로 정의하였다. 물체에 대한 접촉 패턴은 동물의 코가 물체를 향하거나 물체에 닿을 때의 접근하기(approaching); 동물이 물체를 향한 채로 물체 주변의 깔짚을 파는 경우의 깔짚 파기(digging); 및 동물이 코, 앞발, 혹은 입을 사용하여 물체를 움직이는 경우의 물체 움직이기(pushing, towing & biting)로 정의하였다.

새로운 물체에 대한 반응성에 있어서는 지금까지 보고된 바 없었던 독특한 행동이 α1G-/- 생쥐에서 관찰 되었다. 즉, 새로운 물체에 접근 하는 시간이 정상생쥐에 비해 짧고 접촉하는 시간이 길었다(도 3의 C). 또한, 새로운 물체에 대한 행동 방식 또한 차이가 있었는데 새로운 물체 주변을 파헤치거나 물체를 물고 밀고 끌고 다니는 등 정상생쥐에서 거의 관찰되지 않는 놀이행동들이 관찰 되었다(도 3의 D). 시간상으로 보면 초기에는 물체를 이동시키지 않고 탐색하는 과정 이후에 물체의 위치를 변동시키게 되는 놀이행동들이 관찰 되었다(도 3의 E 및 F).

<2-3> 사물 구분능력 분석

상기한 α1G-/- 생쥐의 정상 생쥐와는 다른 행동패턴이 새로운 물체를 구분하는 시각적인 능력에서 비롯된 것인지를 확인하기 위하여, 사물 구분 능력에 관한 실험을 수행하였다. 구체적으로, 생쥐를 3일 동안 열린 상자(40×40×40 ㎝)에서 훈련시키면서, 훈련기간 동안 상자 안에 두 개의 사물을 5분 동안 놓아두어 생쥐가 볼 수 있도록 하였다. 이때, 생쥐가 1 인치 이내의 거리에서 머리를 사물로 향하고 있을 때에 사물을 인지하는 것으로 판단한다. 이어 1 시간 또는 24 시간의 간격(retention)을 두고, 상자 속의 같은 위치에 두 개의 사물을 놓아두는데 한 개의 친숙한 사물은 새로운 사물로 바꾸어 5 분 동안 놓아두어 생쥐가 볼 수 있도록 하였다. 두 가지 사물 중 어느 한 사물을 인지하거나 새로운 한가지 사물을 인지하는데 걸리는 총 시간을 측정하여 인지 기억을 분석하는데 사용하였다.

그 결과, α1G-/- 생쥐를 정상 생쥐와 사물구분 능력검사를 통하여 비교할 때, 새로운 물체를 구분하는 시각적인 능력에서는 거의 차이를 보이지 않았다(도 4). 이는 α1G-/- 생쥐와 정상생쥐의 행동양상의 차이가 새로운 물체를 감지하는 능력의 차이가 아니라 새로운 물체에 대한 두뇌의 반응성에서 차이가 있을 수 있음을 시사하는 것이다.

<2-4> 학습능력 검사

α1G-/- 변이 생쥐의 증가된 운동성이 주위결손행동장애(attention-deficit hyperactive disorder), 정신분열증(schizophrenia) 및 반복행동장애(stereotypy)와 같이 유사하게 운동성이 증가되는 것으로 알려진 질병들과 관계가 있는지를 확인하기 위하여, 로타로드(rota-rod) 기구의 회전 막대를 이용한 운동학습 능력; 모리스 수중 미로(Morris water maze) 테스트; 및 공포 조건 반사 분석 (Fear conditioning)을 통한 다양한 학습능력 검사를 수행하였다.

1) 운동학습 검사 (회전 막대검사, rota-rod test)

먼저, 로타로드 기구의 회전 막대에 쥐가 매달리도록 한 뒤, 막대를 초기 3 rpm으로 회전시키고 이후 35 rpm까지 서서히 증가시킨다. 35 rpm까지 걸리는 시간은 5 분으로 설정하였다. 만일 쥐가 떨어지면 실험을 종료하고 떨어지는 시점까지 의 시간을 기록하였다. 한 시간 간격으로 매일 5 회 3 일간 학습시키고, 확인 실험으로 30 일 뒤 다시 5 회 실시하여 시간을 측정하였다.

2) 공포 조건 반사 분석 (Fear conditioning)

동물은 싫어하는 비조건 자극(US)과 짝을 이룬 상태와 같은, 온화한 전기 발 쇼크와 같은 새로운 환경 또는 조건 자극(CS)에 공포를 학습한다. 부동 및 움츠림으로 특징되는 조건 부동 반응은 조건 자극의 뒤이은 표출에서 관찰된다. 설치류에서 해마의 병변은 2 가지 공포 조건의 형태로 한정되는데, 그중 하나는 해마 병변에 민감한 비특이적인 신호(챔버의 상황)이고, 다른 하나는 해마 병변에 민감하지 않은 특정 신호(상태)이다. 상황 조건은 해마에 의존하나, 신호 조건은 소뇌편도를 필요로 한다.

구체적으로 스테인레스 철 막대 바닥(직경 5 ㎜, 1 ㎝ 공간을 띄움)을 포함하는 공포 조절 쇼크 챔버(19x20x33 ㎝) 및 활성 모니터를 사용하였다(WinLinc Behavioral Experimental control sofeware, coulbourn Instruments). 상황(contextual) 및 신호(cued) 공포를 주기 위하여, 8 내지 12 주된 생쥐를 공포 조건 기구 챔버에 2 분 동안 놓고, 20 초 동안 청각 조건 자극(CS, white noise)을 주었다. 톤의 마지막 2 초 동안 조절되지 않은 자극(US)으로 0.5 mA 쇼크를 바닥 그리드에 적용하였으며, 상기 프로토콜은 한번 수행하였다. 자극 강도 및 훈련 짝의 횟수는 학습을 최적화하기 위하여 파일럿 실험의 기초에서 선택되었다. 전후관계 학습을 평가하기 위하여, 동물을 훈련 후 훈련 전후관계에 24 시간 간격을 두었 고, 5 분 동안 부동을 측정하였다. 암시된 학습을 평가하기 위하여, 동물을 훈련 후에 다른 전후관계(새로운 챔버, 냄새, 바닥 및 비쥬얼 암시)에 24 시간 두었다. 상기 테스트의 마지막 3 분 동안 생쥐는 톤에 노출시켰다. 공포 반응은 동물이 부동 반응을 보이는 시간의 길이를 스톱워치로 측정함으로써 분석하였다. 기저 행동은 새로운 전후관계에서 6 분동안 측정하였고, 다음으로 음향 CS를 1 분 동안 주었다. 양쪽 상황 조건 및 신호 조건은 쇼크 챔버에서 한번의 CS/US 연습 후 24 시간에서 활동에 의해 측정되었다.

3) 모리스 수중 미로(Morris water maze) 테스트

수중 미로 기구는 24 내지 26℃의 물을 포함하는 원형 풀(흰색 플라스틱, 직경 120 ㎝, 높이 93 ㎝)로 구성되어 있고, 비독성-수용성 페인트를 사용하여 불투명하게 하였다. 풀은 방(2.5x2.5 m)의 방의 가운데에 위치하였고, 여기서 4 개의 다른 먼 부위의 큐(ques)를 4 개의 벽에 걸고, 풀에서 충분히 보일 수 있도록 하였다. 8 내지 12 주된 생쥐를 사용하여, 그룹 1은 7 기간(4회 시도/기간/일) 동안 숨겨진 플랫폼(직경 10 ㎝의 원, 물 밑 1 ㎝에 정도 가라앉게 위치함)을 찾도록 훈련시키고, 그룹 2는 동일하게 4 기간 동안 훈련시켰다. 생쥐는 무작위로 벽을 보게 하였고, 60 초 동안 플랫폼을 찾도록 한 뒤, 플랫폼에서 30 초 동안 쉬게 하였다. 만일 생쥐가 60 초 내에 플랫폼을 찾지 못하면, 이를 중단하고 플랫폼에 30초 동안 두었다. 3 개의 전달 테스트를 수행하였는데, 1차는 3차 기간의 끝에서 그룹 1 및 그룹 2에 주었고, 2차는 마지막 기간의 끝에서 그룹 1에 주었고, 3차는 4 기 간에서 2 주 후에 그룹 2에 주었다. 전달 테스트 동안 플랫폼을 없애고, 생쥐를 60 초 동안 풀에서 수영할 수 있게 하였다. 생쥐는 트랙커 유니트에 연결된 적외선-민감 카메라(Advanced VP 2000)에 의해 자취를 조사하였으며, 자취 위치는 저장하고 소프트웨어(HVS Water for windows software, HVS IMAGE Ltd)에 의해 수집한 뒤, 4분면에서 소요된 시간과 플랫폼의 교차횟수를 분석하였다.

가시적인 플랫폼 과업에서는 다른 생쥐(그룹 3)를 사용하였고, 동일한 물 미로를 사용하여 숨김 플랫폼 과업을 수행하였는데, 이때 3 번의 시도/기간/일 플랫폼은 검은색이고, 매 시도마다 옮겼다.

상기한 3가지 학습 능력 검사를 수행한 결과, 도 5, 6 및 7에서 보듯이 정상 생쥐와 변이 생쥐간의 차이는 확인할 수 없었다. 보고된 결과들을 분석해 보면 학습능력 이상을 수반 하는 운동 증가의 경우는 α1G-/- 생쥐에게서 보이는 것처럼 새로운 환경에 의해 증가된 운동성이 적응함에 따라 감소하지 않고 장시간 지속 되게 되는데 이는 학습 능력 결손으로 새로운 환경에 적응하는데 문제가 있음을 시사한다. 결국 α1G-/- 생쥐에게서 보이는 새로운 환경이나 물체에 친화적인 운동성증가는 기존에 보고되지 않았던 새로운 형태임을 알 수 있다.

<2-5> 약리학적 검사

상기한 실시예 <2-4>와 마찬가지로, α1G-/- 변이 생쥐의 증가된 운동성이 주위결손 행동장애, 정신분열증 및 반복행동 장애와 같은 질병들과 관계가 있는 지 를 확인하기 위하여, 상기 질병의 치료제로 사용되는 리튬(Lithium) 및 암페타민 (amphetamine)의 약리학적인 효과 분석 실험을 수행하였다.

새로운 물체에 대한 반응성 검사에 있어 암페타인 또는 리튬의 효과를 알아보기 위하여, 생쥐를 실험장치에 노출시키기 1시간 전 암페타인 또는 리튬(0.5 mEq/kg, 주사량 10 ml/kg)을 복강으로 주사하였다. 모든 실험 절차는 개방장에 물체에 대한 반응성 실험과 동일하였으나, 이 실험에서는 백색 아크릴의 개방장 대신 일반 사육상자(24×18×13㎝)를 사용하였고, 물체는 크기 1.5×1.5×1.5㎝에 무게 0.5 g의 알루미늄 호일로 덮은 스티로폼을 사용하였다. 상기 실험 또한 모든 실험과정에서 동물의 행동을 비디오 카메라로 녹화하여 사후 분석에 사용하였고, 분석에 사용된 기준 및 행동지표는 역시 이전 실험과 동일하였다.

그 결과, 주위결손행동장애(attention-deficit hyperactive disorder)의 치료제로 쓰이는 암페타민(amphetamine)은 운동성을 증가시키는 기능을 하지만 주위결손행동장애가 있는 경우에는 오히려 운동성증가를 완화하는 효과가 있다고 알려져 있는데(Cirulli, F. and Laviola, G., Neurosci Biobehav Rev 24, 73-84, 2000), α1G-/- 생쥐의 경우는 초기 운동성 증가가 암페타민에 의해 감소되지 않고 오히려 새로운 환경에 비의존적인 운동성증가가 과도하게 나타났다(도 8).

조울증 치료제로 사용되는 흥분억제제인 리튬(Nolen, W. A., Ned Tijdschr Geneeskd 143, 1299-1305, 1999)의 경우도 운동성 자체에는 큰 효과를 나타내지 못했다. 다만, 리튬을 전 처리한 α1G-/- 생쥐의 경우 새로운 물체에 대한 반응성에는 영향을 주었는데 탐색행동에는 차이가 없었고, 이후 증가되는 놀이행동을 억제 하였다(도 9). 따라서 α1G-/- 생쥐의 운동성증가는 원인을 모르는 새로운 형태임을 약리학적으로도 확인 할 수 있었으며, 정상생쥐에게서 보이지 않는 새로운 물체에 대한 과도한 놀이행동의 경우 두뇌의 감정적 변화와 관련이 있음을 알 수 있었다.

<2-6> 스트레스 분석

자극 추구형 사람들이 새로운 환경이나 자극을 선호함 에 따라 위험스런 놀이행동을 즐기며 약물남용 및 중독에 민감한 반면, 새로운 환경이나 자극이 보통사람들에게 일으킬 수 있는 스트레스나 공포에 대해 덜 민감하다는 기존 결과에 비추어 본 발명의 변이 생쥐 역시 유사한 성향을 갖는지 확인하기 위하여 강제 수영 테스트와 꼬리 매달기 테스트를 수행하였다. 이들 테스트는 과도한 스트레스와 우울함을 유도하여 탈출행동을 포기 하는 정지(immobility) 시간을 증가시킨다. 만일 우울증치료제(anti-depressants) 들은 이러한 무운동 시간을 단축시키는 것으로 알려져 있다. 실험결과 양 테스트에서 모두 α1G-/- 생쥐는 무운동시간이 짧아져 있음을 알 수 있었다(도 10). 따라서, α1G-/- 는 자극추구 형 사람들과 유사하게 환경적 스트레스나 우울함을 유도하는 환경에 덜 민감한 것을 알 수 있다.

<2-7> 이중 급이병 선택검사(two-bottle choice test)에 의한 알코올 선호도 조사

물을 각각 두 개의 다른 급이병에 담아 일주일 동안 제공하여 익숙하게 한 뒤, 생쥐의 제 1 그룹은 첫째 날 하나의 급이병을 10% 알코올로 바꾼 뒤 먹는 양을 이후 일주일간 측정 하였다. 급이병의 상대적인 위치는 3 일에 한번씩 바꿔 주었다. 제 2 그룹과 제 3 그룹은 각각 0.015 M 퀴닌(quinine) 과 0.033% 사카린 (saccharine)을 제공하여 먹는 양을 물과 비교하였다.

그 결과, α1G-/- 생쥐의 알코올 선호도가 정상생쥐에 비해 유의하게 증가되어 있는 반면, 단맛을 내는 사카린이나 쓴맛을 내는 퀴닌에 대한 선호도는 크게 차이가 없었다(도 11). 상기한 결과는 알코올 선호도가 미각의 민감도에서 오는 것이 아님을 의미한다.

결론적으로, α1G-/- 생쥐는 새로운 환경이나 물체 또는 알코올과 같은 약물이 유발할 수 있는 쾌감에 민감하고 상대적으로 스트레스도 덜 받는 상태로서, 사람의 자극추구형 성격과 상당히 유사하며, 이에 따라 이들 성격에서 나타나는 긍정적 혹은 부정적 효과를 검사해 볼 수 있는 훌륭한 동물 모델이 될 수 있다. 또한, α1G 유전자는 자극추구형 성격 형성에 중요한 역할을 한다고 판단되며, 관련된 신경질환의 치료 방법이나 약물검색에 유용한 목표물질이 될 수 있으므로 이의 약물 및 치료 방법 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 새로운 자극 추구성향(novelty-seeking) 및 알코올 선호도(alcohol preference)를 나타내는 α1G T-타입칼슘 채널 돌연변이 생쥐를 사람에게서 나타나는 감정 및 욕구조절 이상과 관련된 신경질환의 모델로서 이용하는 용도에 관한 것으로서 본 발명의 동물 모델을 이용하면 자극추구형 성격, 알코올 중독(alcoholism) 및 스트레스와 관련된 사람의 신경질환에 대한 약물 및 치료 방법 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (6)

1. T-타입 칼슘채널의 α1G 유전자가 넉아웃(knock-out)된 생쥐를 사람의 자극추구형 성격질환, 알코올 중독(alcoholism) 및 스트레스 관련 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 신경질환 동물모델로서 이용하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, α1G 유전자가 넉아웃(knock-out)된 생쥐는

   (i) T-타입 칼슘 이온 통로의 α1G 유전자에 대한 적중벡터(targeting vector)를 생쥐 배아간세포에 도입하는 단계;

   (ii) 상기 배아간세포를 포배아의 포배강에 주입하여 키메라 생쥐(chimera mouse)를 얻는 단계;

   (iii) 상기 키메라 생쥐를 정상 생쥐와 교배시켜 α1G +/- 유전자형을 갖는 이형접합체(heterozygote) 생쥐를 얻는 단계; 및

   (iv) 상기 이형접합체 생쥐의 암컷과 수컷을 교배시켜 α1G-/- 유전자형을 갖는 α1G T-타입 칼슘 채널이 넉아웃(knock-out)된 생쥐를 얻는 단계로 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 삭제
4. 인간을 제외한 포유동물의 α1G T-타입 칼슘 채널의 소공형성 구성단위(subunit)를 암호화하는 α1G 유전자를 활성화시킴으로써 상기 포유동물의 자극추구형 성격질환 및 알코올 중독(alcoholism)을 억제하는 방법.
5. 인간을 제외한 포유동물의 α1G T-타입 칼슘 채널의 소공형성 구성단위(subunit)를 암호화하는 α1G 유전자를 억제함으로써 상기 포유동물의 스트레스를 완화시키는 방법.
6. T-타입 칼슘채널의 α1G 유전자가 넉아웃(knock-out)된 생쥐를 자극추구형 성격질환, 알코올 중독 및 스트레스 관련 질환의 치료약물 스크리닝에 이용하는 방법.

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