JP7366388B2 - 抗Ryk抗体およびその使用方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2016年3月28日に出願された米国特許仮出願第62/314,025号に対する35 U.S.C.§119(e)に基づく優先権の恩典を主張し、この仮出願の開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、米国立衛生研究所によって付与された助成金番号NS047484およびNS081738での政府による補助を伴ってなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
本出願は配列表を含み、配列表はASCII形式で電子形式により提出されており、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。前記のASCIIコピーは、2017年3月15日に作成され、名称は20378-201389_SL.txtであり、サイズは14,104バイトである。
本発明は、一般的には抗体に関し、より詳しくは、Wnt-Rykシグナル伝達を阻害するためのWntの結合ドメインに特異的に結合する抗Ryk抗体または抗体断片の使用に関する。
中枢神経系(CNS)は、上行性の感覚経路および下行性の運動経路または調節経路に接続されている。CNSでは、体性感覚経路が脳中枢へと上行し、身体の動きをコントロールする運動経路は脳から脊髄へと下行する。末梢神経系とは異なり、中枢神経系の軸索、例えば脊髄内の軸索に対するダメージは修復が不可能であり、神経機能の永久的な障害、例えば麻痺が引き起こされ得る。脊髄は中枢神経系において重要な機能を果たしている。かかる機能の1つは、体と脳の連絡を可能にすることである。脊髄内の神経線維が脳へ、および脳から他の身体部分へ情報を伝達する。一般に、身体からの感覚情報は脊髄を通って脳まで伝わり、脳からの指令、例えば運動指令が脳から脊髄を通って伝わる。
[本発明1001]
(a)Wntの結合ドメインに特異的に結合し、SEQ ID NO:5~7もしくはSEQ ID NO:5、11および12に示すCDR配列を含む重鎖可変領域;ならびに/またはSEQ ID NO:1~3もしくはSEQ ID NO:9、2および3に示すCDR配列を含む軽鎖可変領域を含むか;または
(b)Wnt上の、参照抗体もしくは参照抗体断片が結合するのと同じエピトープに特異的に結合するか、またはWntに対する特異的結合について参照抗体もしくは参照抗体断片と交差競合し、該参照抗体または参照抗体断片がSEQ ID NO:5~7もしくはSEQ ID NO:5、11および12に示すCDR配列を含む重鎖可変領域;ならびに/またはSEQ ID NO:1~3もしくはSEQ ID NO:9、2および3に示すCDR配列を含む軽鎖可変領域を含む、
単離された抗Ryk抗体または抗体断片。
[本発明1002]
Wntに対するRykの結合を阻害または低減する、本発明1001の単離された抗Ryk抗体または抗体断片。
[本発明1003]
Wntの90~183位のアミノ酸残基内のエピトープに特異的に結合する、本発明1001の単離された抗Ryk抗体または抗体断片。
[本発明1004]
前記重鎖可変領域が、SEQ ID NO:8に対する少なくとも85%の配列同一性、任意でSEQ ID NO:8に対する少なくとも90%の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む、本発明1001の単離された抗体または抗体断片。
[本発明1005]
前記重鎖可変領域が、SEQ ID NO:8に対する少なくとも95%の配列同一性、任意でSEQ ID NO:8に対する少なくとも99%の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む、本発明1001の単離された抗体または抗体断片。
[本発明1006]
前記重鎖可変領域が、SEQ ID NO:8に示すアミノ酸配列を含む、本発明1001の単離された抗体または抗体断片。
[本発明1007]
前記重鎖可変領域が、SEQ ID NO:13に対する少なくとも85%の配列同一性、任意でSEQ ID NO:13に対する少なくとも90%の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む、本発明1001の単離された抗体または抗体断片。
[本発明1008]
前記重鎖可変領域が、SEQ ID NO:13に対する少なくとも95%の配列同一性、任意でSEQ ID NO:13に対する少なくとも99%の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む、本発明1001の単離された抗体または抗体断片。
[本発明1009]
前記重鎖可変領域が、SEQ ID NO:13に示すアミノ酸配列を含む、本発明1001の単離された抗体または抗体断片。
[本発明1010]
前記軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:4に対する少なくとも85%の配列同一性、任意でSEQ ID NO:4に対する少なくとも90%の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む、本発明1001の単離された抗体または抗体断片。
[本発明1011]
前記軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:4に対する少なくとも95%の配列同一性、任意でSEQ ID NO:4に対する少なくとも99%の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む、本発明1001の単離された抗体または抗体断片。
[本発明1012]
前記軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列を含む、本発明1001の単離された抗体または抗体断片。
[本発明1013]
軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:10に対する少なくとも85%の配列同一性、任意でSEQ ID NO:10に対する少なくとも90%の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む、本発明1001の単離された抗体または抗体断片。
[本発明1014]
前記軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:10に対する少なくとも95%の配列同一性、任意でSEQ ID NO:10に対する少なくとも99%の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む、本発明1001の単離された抗体または抗体断片。
[本発明1015]
前記軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:10に示すアミノ酸配列を含む、本発明1001の単離された抗体または抗体断片。
[本発明1016]
Wntの結合ドメインに特異的に結合する単離された抗体または抗体断片であって、以下を含む、該単離された抗体または抗体断片:
a)SEQ ID NO:8に示すアミノ酸配列に対する少なくとも85%の配列同一性を含む重鎖可変領域であって、SEQ ID NO:5~7に示す3つのCDR配列を含む重鎖可変領域;および/または
b)SEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列に対する少なくとも85%の配列同一性を含む軽鎖領域可変領域であって、SEQ ID NO:1~3に示す3つのCDR配列を含む軽鎖可変領域。
[本発明1017]
前記重鎖可変領域が、SEQ ID NO:8のアミノ酸配列に対する少なくとも90%の配列同一性を含み、前記軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列に対する少なくとも90%の配列同一性を含む、本発明1016の単離された抗体または抗体断片。
[本発明1018]
前記重鎖可変領域が、SEQ ID NO:8のアミノ酸配列に対する少なくとも95%の配列同一性を含み、前記軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列に対する少なくとも95%の配列同一性を含む、本発明1016の単離された抗体または抗体断片。
[本発明1019]
前記重鎖可変領域が、SEQ ID NO:8のアミノ酸配に対する少なくとも99%の配列同一性を含み、前記軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列に対する少なくとも99%の配列同一性を含む、本発明1016の単離された抗体または抗体断片。
[本発明1020]
前記重鎖可変領域が、SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む、本発明1016の単離された抗体または抗体断片。
[本発明1021]
Wntの結合ドメインに特異的に結合する単離された抗体または抗体断片であって、以下を含む、該単離された抗体または抗体断片:
a)SEQ ID NO:13に示すアミノ酸配列に対する少なくとも85%の配列同一性を含む重鎖可変領域であって、SEQ ID NO:5、11および12に示す3つのCDR配列を含む重鎖可変領域;ならびに/または
b)SEQ ID NO:10に示すアミノ酸配列に対する少なくとも85%の配列同一性を含む軽鎖領域可変領域であって、SEQ ID NO:9、2および3に示す3つのCDR配列を含む軽鎖可変領域。
[本発明1022]
前記重鎖可変領域が、SEQ ID NO:13のアミノ酸配列に対する少なくとも90%の配列同一性を含み、前記軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:10のアミノ酸配列に対する少なくとも90%の配列同一性を含む、本発明1021の単離された抗体または抗体断片。
[本発明1023]
前記重鎖可変領域が、SEQ ID NO:13のアミノ酸配列に対する少なくとも95%の配列同一性を含み、前記軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:10のアミノ酸配列に対する少なくとも95%の配列同一性を含む、本発明1021の単離された抗体または抗体断片。
[本発明1024]
前記重鎖可変領域が、SEQ ID NO:13のアミノ酸配列に対する少なくとも99%の配列同一性を含み、前記軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:10のアミノ酸配列に対する少なくとも99%の配列同一性を含む、本発明1021の単離された抗体または抗体断片。
[本発明1025]
前記重鎖可変領域が、SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含む、本発明1021の単離された抗体または抗体断片。
[本発明1026]
有効量の本発明1001~1025のいずれかの抗体または抗体断片および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、薬学的組成物。
[本発明1027]
本発明1001~1025のいずれかの単離された抗体または抗体断片をコードしている核酸配列。
[本発明1028]
本発明1027の核酸配列を含むベクター。
[本発明1029]
発現ベクターである、本発明1028のベクター。
[本発明1030]
本発明1028のベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1031]
哺乳動物宿主細胞である、本発明1030の宿主細胞。
[本発明1032]
本発明1030の宿主細胞を含むトランスジェニックマウスであって、核酸にコードされたポリペプチドを発現する、該トランスジェニックマウス。
[本発明1033]
WntとRykを含む試料を本発明1001~1025のいずれかの単離された抗体または抗体断片と接触させ、それによりWntとRykの相互作用に干渉することを含む、WntとRykの相互作用に干渉する方法。
[本発明1034]
ニューロンを本発明1001~1025のいずれかの単離された抗体または抗体断片と接触させ、それにより該ニューロンの変性を抑止することを含む、ニューロンの変性を抑止するための方法。
[本発明1035]
ニューロンの軸索の変性が抑止されるか、またはニューロンの細胞体の変性が抑止される、本発明1034の方法。
[本発明1036]
軸索が脊髄交連神経軸索である、本発明1035の方法。
[本発明1037]
軸索が上位運動ニューロンの軸索である、本発明1035の方法。
[本発明1038]
軸索が中枢神経系の軸索である、本発明1035の方法。
[本発明1039]
ニューロンが、損傷した脊髄のニューロンである、本発明1034の方法。
[本発明1040]
ニューロンが感覚ニューロンである、本発明1034の方法。
[本発明1041]
ニューロンが運動ニューロンである、本発明1034の方法。
[本発明1042]
ニューロンが小脳顆粒ニューロン、後根神経節ニューロン、皮質ニューロン、交換神経ニューロン、または海馬ニューロンである、本発明1034の方法。
[本発明1043]
ニューロンが神経移植片または神経移植組織の一部を形成する、本発明1034の方法。
[本発明1044]
ニューロンがエクスビボまたはインビトロである、本発明1034の方法。
[本発明1045]
神経移植片または神経移植組織が生物体の一部を形成する、本発明1043の方法。
[本発明1046]
生物体が哺乳動物である、本発明1045の方法。
[本発明1047]
哺乳動物がヒトである、本発明1046の方法。
[本発明1048]
本発明1001~1025のいずれかの単離された抗体もしくは抗体断片、本発明1026の薬学的組成物、本発明1027の核酸配列、本発明1028もしくは1029のベクター、または本発明1030もしくは1031の宿主細胞の有効量を対象に投与し、それにより該対象の神経性の疾患または障害を処置すること
を含む、神経性の疾患を有するか、または神経性の疾患を発症するリスクがある対象において、神経性の疾患または障害を処置する方法。
[本発明1049]
神経性の疾患または障害が神経変性性の疾患または障害である、本発明1048の方法。
[本発明1050]
神経変性性の疾患または障害が筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病またはパーキンソン病である、本発明1049の方法。
[本発明1051]
ニューロンを本発明1001~1025のいずれかの単離された抗体または抗体断片と接触させ、それにより該ニューロンの指向的成長をモジュレートすることを含む、ニューロンの指向的成長をモジュレートするための方法。
[本発明1052]
ニューロンが脊髄交連神経軸索である、本発明1051の方法。
[本発明1053]
ニューロンが上位運動ニューロンの軸索である、本発明1051の方法。
[本発明1054]
ニューロンが中枢神経系の軸索である、本発明1051の方法。
[本発明1055]
ニューロンが、損傷した脊髄のニューロンである、本発明1051の方法。
[本発明1056]
ニューロンが感覚ニューロンである、本発明1051の方法。
[本発明1057]
ニューロンが運動ニューロンである、本発明1051の方法。
[本発明1058]
前記指向的成長がニューロンの再生を助長する、本発明1051の方法。
[本発明1059]
Wntの結合ドメインに特異的に結合してWnt-Ryk相互作用を阻害する単離されたモノクローナル抗Ryk抗体または抗体断片の有効量を対象に投与し、それにより該対象の神経性の疾患または障害を処置すること
を含む、神経性の疾患もしくは障害を有するか、または神経性の疾患もしくは障害を発症するリスクがある対象において、神経性の疾患または障害を処置する方法。
[本発明1060]
神経性の疾患または障害が神経変性性の疾患または障害である、本発明1059の方法。
[本発明1061]
前記抗体または抗体断片がWntの90~183位のアミノ酸残基内のエピトープに特異的に結合する、本発明1059の方法。
[本発明1062]
治療剤と連結された、本発明1001~1025のいずれかの単離された抗Ryk抗体または抗体断片を含むイムノコンジュゲート。
[本発明1063]
治療剤が細胞毒素または放射性同位体である、本発明1062のイムノコンジュゲート。
[本発明1064]
本発明1001~1025のいずれかの単離された抗Ryk抗体または抗体断片とは異なる結合特異性を有する第2の機能性部分と連結された、本発明1001~1025のいずれかの単離された抗Ryk抗体または抗体断片を含む二重特異性分子。
[本発明1065]
そのゲノムがRyk遺伝子のヘテロ接合性またはホモ接合性の欠失、不活性化またはノックアウトを含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
[本発明1066]
マウスである、本発明1065のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
[本発明1067]
前記マウスが表現型Frizzled3 -/- Ryk +/- を有する、本発明1066のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
[本発明1068]
前記マウスがRyk遺伝子の皮質脊髄路(CST)特異的破壊を含む、本発明1066のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
[本発明1069]
破壊されたRyk遺伝子が、組換えRykアレル、選択可能マーカー、該選択可能マーカーに隣接しているfrt部位、および該アレルの一部分に隣接しているloxP部位を含む、本発明1068のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
[本発明1070]
前記マーカーがPGK Neoであり、loxP部位が前記アレルの3~6位のエキソンに隣接している、本発明1069のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
[本発明1071]
本発明1065~1070のいずれかのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に由来する単離された細胞。
[本発明1072]
Ryk遺伝子の一部分であって、該Ryk遺伝子の3~6位のエキソンが3’loxP部位および5’loxP部位に隣接されている、該Ryk遺伝子の一部分、6位のエキソンと該5’loxP部位との間にある選択可能マーカー、該選択可能マーカーに隣接しているfrt部位を含む、ベクター。
[本発明1073]
前記マーカーがPGK Neoである、本発明1072のベクター。
[本発明1074]
(a)本発明1072のベクターをマウス胚性幹(ES)細胞集団にトランスフェクトする工程;
(b)前記選択可能マーカーを発現しているトランスフェクトされたES細胞を選択する工程;
(c)該トランスフェクトされたES細胞を前記マウスの祖先胚内に導入する工程;
(d)該胚を満期まで発育させ、その生殖細胞系内にコンディショナルノックアウト構築物を有するキメラマウスを作製する工程;
(e)該キメラマウスを交配し、条件付きで破壊可能なRyk遺伝子を有するヘテロ接合体マウスを作製する工程;および
(f)該ヘテロ接合体マウスを、皮質脊髄軸索においてのみtdTomato発現を抑制するloxP隣接停止カセットを含むマウスと交配し、Ryk遺伝子内にCST特異的破壊を有するマウスを作製する工程
を含む、Ryk遺伝子内にCSTを標的とする破壊を有するノックアウトマウスの作製方法。
[本発明1075]
神経性の疾患または障害を処置するための治療剤のスクリーニング方法であって、
被験剤を本発明1065~1070のいずれかのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に投与すること、および
非定型プロテインキナーゼC(aPKC)もしくはMARK2タンパク質の量、aPKCもしくはMARK2の活性レベル、またはaPKCもしくはMARK2レベルのうちの少なくとも1つに対する該被験剤の効果を、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物の少なくとも1つの疾患関連組織において評価すること
を含み、
ここで、該被験剤を投与されていない同様のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と比べたときの少なくとも1つの疾患関連組織における、aPKCタンパク質の量の減少、MARK2タンパク質の量の増加、aPKC活性レベルの低下、MARK2活性レベルの上昇、aPKCレベルの低下、またはMARK2レベルの上昇のうちの少なくとも1つが、該被験剤が該神経性の疾患または障害の治療に役立つことを示す、前記方法。
本発明は、Wntの結合ドメインに特異的に結合する抗Ryk抗体または抗体断片がWnt-Rykシグナル伝達を阻害するという所見に基づいている。そのため、本発明は、該抗Ryk抗体または抗体断片を用いてニューロン変性およびニューロンガイダンスをモジュレートするための方法を提供する。したがって、該抗Ryk抗体または抗体断片は、神経性の疾患もしくは障害、例えば神経変性性の疾患もしくは障害を有するか、または該疾患もしくは障害を発症するリスクがある対象において、神経性の疾患または障害、例えば神経変性性の疾患または障害を処置するため、および/または対象の脊髄損傷(SCI)を処置するために使用され得る。
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リシン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7)セリン(S)、トレオニン(T);および
8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton, Proteins(1984)参照)。
本明細書で用いる場合、「トランスジェニック生物体」は、まだ胚の段階で外来性DNAが導入された動物をいう。ほとんどの場合、トランスジェニックアプローチは、例えば、全転写単位をゲノム内に導入すること、あるいは既に存在している細胞内の遺伝子を上方調節もしくは下方調節または変異させることによるゲノムの特定の修飾が目的である。このような手順のうちのいくつかの手順の標的とされる特徴は、トランスジェニック技術を、ランダム変異を生殖細胞系統に付与する実験方法、例えば化学変異原の投与またはイオン化溶液での処理と区別する。トランスジェニック生物体は、遺伝子ノックアウトを有する生物体を含み得、または遺伝子変異誘導の結果であってもよい。
本明細書で用いる場合、「ニューロン」という用語は、ニューロンおよびその一部分または複数部分(例えば、ニューロンの細胞体、軸索または樹状突起)を包含している。「ニューロン」という用語は、本明細書で用いる場合、中心の細胞体あるいは神経細胞体、ならびに2つの型の伸長部または突起部:樹状突起(これにより、一般に、ニューロンの信号の大部分が細胞体に伝達される)、および軸索(これにより、一般に、ニューロンの信号の大部分が細胞体から効果器細胞、例えば標的ニューロンまたは筋肉に伝達される)を含む神経系の細胞を表す。ニューロンは、組織および器官からの情報を中枢神経系に伝達すること(求心性または感覚ニューロン)および中枢神経系からの信号を効果器細胞に伝達すること(遠心性または運動ニューロン)ができる。介在ニューロンと呼称される他のニューロンは、中枢神経系(脳および脊柱)内のニューロン同士を連絡する。本発明による処置または方法に供され得るニューロンの型の一部の特定の具体的な例としては、小脳顆粒ニューロン、後根神経節ニューロンおよび皮質ニューロンが挙げられる。
軸索変性は、多くの神経系および神経変性の疾患/障害ならびに外傷性損傷に共通する特徴である。研究により、これは、ニューロンの細胞体の死滅とは独立してその死滅前に起こり得ることが示されている。しかしながら、軸索の変性および保護の基礎をなす分子機構および細胞機構は依然として不明である。軸索が病的な状態の際に活性化される変性経路または不活性化される保護経路を解明することは、軸索の完全性を保持し、再生を向上させる特異的治療剤の開発に役立つであろう。
したがって、本発明は、ニューロンを作用物質と接触させ、それによりニューロンの変性を抑止することにより神経細胞の成長をモジュレートするための方法および組成物を提供する。種々の態様において、作用物質は、Wntの結合ドメインに特異的に結合してWntシグナル伝達経路に影響を及ぼす抗Rykモノクローナル抗体または抗体断片であり得る。このような方法および組成物は、神経の成長および再生が有益であろう多種多様な治療状況において使用され得る。例えば、Wntシグナル伝達経路に影響を及ぼす抗Ryk抗体または抗体断片が、SCIを有する患者のA-P軸に沿って損傷したニューロンの軸索成長を刺激するために使用され得る。また、Wntはいくつかの脳内領域で発現されており、Wntシグナル伝達経路の成分が他の中枢神経系のニューロンの軸索にも存在することが観察されているため、本明細書に記載の抗Ryk抗体または抗体断片は、中枢神経系において軸索の成長および指向的ガイダンスをモジュレートするために使用され得ることが考えられ得る。
大部分の脊髄損傷患者は不完全な傷害を有し、この場合、脊髄組織の複数の部分は無傷のままである。成人の損傷脊髄、特にグリア性瘢痕における強い抑止的環境および成人の軸索の低い成長ポテンシャルのため、元の連絡は通常、回復しない。それにもかかわらず、リハビリ訓練により複雑な回路でリモデリングが行われ、いろいろなレベルの機能回復が得られ得る。
Wntは、広範な生物体の発生において役割を果たしている分泌型システインリッチグリコシル化タンパク質である。多くの多様な種が複数の保存されたWnt遺伝子を有しているため、Wntは、さまざまな発生過程および生理学的過程において機能していると考えられている(McMahon, 1992; Nusse and Varmus, 1992)。Wnt増殖因子ファミリーは、哺乳動物において同定された少なくとも19個の遺伝子、例えばWnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt 6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11およびWnt16を含む。他の脊椎動物種にも同様の数のWnt遺伝子が存在する(例えば、米国特許出願公開第2011/0065645号参照、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。もちろん、さらなるWntが将来、発見および/または特性評価されるかもしれず、当業者は、任意のかかるWntを本発明の状況において使用することができよう。さらに、当業者は、本明細書における教示を用いて、本発明の状況において任意の種のWntを取得および使用することができよう。
本発明の抗体は、任意の適切な手段、例えば非経口、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内および、局所処置が所望される場合は病変内投与によって投与され得る。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内および皮下投与が挙げられる。また、抗体を、パルス式輸注によって、特に抗体用量の漸減を伴って投与してもよい。投薬は、一部において投与が短期か長期かにもよるが、任意の適切な経路、例えば注射、例えば静脈内または皮下注射により行われ得る。
また、SEQ ID NO:1~13のいずれかを含む抗Rykポリペプチド配列をコードしている核酸配列も提供する。抗Ryk抗体をコードしている組換え核酸は、事実上、抗Ryk抗体の工場としての機能を果たす宿主細胞内での発現に特に有用である。種々の態様において、核酸は、当技術分野において周知の標準的な手法、例えば、アルカリ/SDS処理、CsClを用いたバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動などおよび他のものによって精製されて他の細胞構成要素または他の夾雑物(例えば、細胞内に存在している他の核酸もしくはタンパク質)から離されている場合、単離されている。例えば、F. Ausubel, et al ed.(1987)Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照のこと。種々の態様において、核酸は、例えばDNAまたはRNAであり、イントロン配列が含まれていても含まれていなくてもよい。好ましい一態様では、核酸がcDNA分子である。種々の態様において、組換え核酸は、宿主細胞ゲノムから自律的に存在するか、または宿主細胞ゲノムの一部として存在する抗Ryk抗体コード組換え遺伝子を供給する。
本明細書に記載の抗Ryk抗体または抗体断片は、ニューロン(例えば、軸索)変性を抑止するための方法において使用され得る。したがって、このような抗体または抗体断片は、例えば、(i)神経系の障害(例えば、神経性/神経変性性の疾患または障害)、(ii)神経系以外で一次作用を有する疾患、病的状態または治療に副次的な神経系の病的状態、(iii)物理的、機械的または化学的外傷によって引き起こされた神経系に対する損傷、(iv)疼痛、(v)眼関連神経変性、(vi)記憶力の低下、および(vii)精神障害の治療に有用である。このような疾患、病的状態および損傷の一例の非限定的な例を以下に示す。
別の局面において、本発明は、神経性の疾患または障害の処置のための治療剤/被験剤/候補剤のスクリーニング方法を提供する。該方法は、被験剤を本明細書に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に投与すること、および非定型プロテインキナーゼC(aPKC)もしくはMARK2タンパク質の量、aPKCもしくはMARK2の活性レベルまたはaPKCもしくはMARK2レベルのうちの少なくとも1つに対する該被験剤の効果を、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物の少なくとも1つの疾患関連組織において評価することを含み、ここで、該被験剤を投与されていない同様のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と比べたときの少なくとも1つの疾患関連組織における、aPKCタンパク質の量の減少、MARK2タンパク質の量の増加、aPKC活性レベルの低下、MARK2活性レベルの上昇、aPKCレベルの低下またはMARK2レベルの上昇のうちの少なくとも1つは、該被験剤が該神経性の疾患または障害の治療に役立つことを示す。
方法
動物 - 時限的に交配した妊娠CD1マウスラットをCharles Riverから購入した。Ryk欠損マウスをSteven Stacker氏(Ludwig Institute for Cancer Research, Melbourne, VIC, Australia)から入手した(50)。Frizzled3欠損体はJeremy Nathans氏(John Hopkins University, Baltimore, MD)から入手した(51)。遺伝型は標準的なPCRによって調べた。膣栓の検出日をE0.5とみなした。動物を、温度制御された室内に収容し、標準的な実験用の飼料および水を随意に与えた。
aPKCの阻害により軸索変性およびニューロンのアポトーシスが促進される
aPKCの発現および大脳皮質ニューロンの生存における役割を調べるための培養系を確立した。E16.5の皮質の細胞をインビトロで3日間培養し(DIV3)、汎用軸索マーカーSMI-312および樹状突起マーカーMAP2について二重免疫標識した。この段階では、ほとんどのニューロンが、SMI-312について標識された軸索に相当する長い突起および樹状突起となる少数の短いMAP2+突起を示す。この段階の分極ニューロンの割合を評価するため、末端部分においてSMI-312について標識され、MAP2について標識されていない長い突起を有するニューロンの数を、SMI-312+ニューロンの総数において計数した。SMI-312+ニューロンのうち84.2±3.45%がこの培養条件で分極していることがわかった。次いで、aPKC発現を皮質ニューロンにおいて、PKCζ、PKCλ/ιおよびPKMζを含むaPKCファミリーのすべてのアイソフォームを認識する抗体を使用することによって調べた(34)。この観察結果は、aPKC免疫標識がニューロンの細胞体およびSMI-312+軸索に局在していたことを示す(図1A)。
aPKC阻害により、MARK2活性およびTauリン酸化が調節されることによって微小管が不安定化される
微小管の崩壊は、軸索変性過程の初期細胞事象であり、軸索の数珠状化およびニューロフィラメントの断片化の前に起こる(1、35~37)。aPKCの阻害によって微小管が不安定化することにより急速な軸索変性が促進され得るという仮説をたてた。この仮説を試験するため、皮質ニューロンの細胞培養物をまず、微小管安定剤であるタキソール(38)とともに、aPKC偽基質処理の2時間前および該処理中にプレインキュベートした。aPKC阻害によって誘導される軸索変性は、ニューロンの細胞培養物をタキソールで前処理した場合、低減された(図3Aおよび3B)。ニューロンの細胞骨格のいろいろな区画に対する特異的マーカー(微小管にはTau、ニューロフィラメントにはSMI-312、およびF-アクチンフィラメントにはローダミン-ファロイジン)を使用し、共焦点顕微鏡検査を用いると、微小管およびニューロフィラメントは、aPKC偽基質で処理したニューロンの軸索において破壊されているが、アクチンフィラメントは破壊されていないことがわかった。この観察結果は、aPKCが微小管の安定性に必要とされること、ならびにaPKC阻害は、微小管の破壊およびニューロフィラメントの破壊の両方を促進させ、最終的に軸索の変性に至ることを示唆する。
aPKC阻害はJNK-cJunシグナル伝達経路を活性化させる
JNK/SAPKは、中枢神経系および末梢神経系のさまざまな生理学的過程および病理学的過程に関与しているMAPKのサブファミリーである。特に、JNKは、ストレスおよび損傷に応答して、ならびになんらかの病理学的状態において神経細胞死を媒介する(42、43)。また、JNKは、軸索の変性を誘導し、後退させること、および脊髄損傷後の運動機能の回復を制限することが示された(44)。したがって、JNKがaPKC阻害によって誘導される軸索の変性に関与している可能性があるのかどうかを調べることが模索された。ウエスタン-ブロッティング実験により、aPKC PSによって誘導されるaPKC阻害は、T183/T185におけるJNKのリン酸化の増大をもたらすことが明らかになった。リン酸化の増大は、1時間目において、p54タンパク質アイソフォームおよびp46タンパク質アイソフォームの両方において起こった(図4Aおよび4B)。転写因子c-Junのリン酸化はS63において、1時間目および2時間目に増大し(図4Aおよび4C)、JNKの直接の基質であるc-Jun(45)は、aPKC活性が阻害されると速やかに活性化されることが示された。免疫細胞化学検査により、P-JNK-T183/T185およびP-cJun-S63の増大がニューロンの核内で確認された(図4Dおよび4E)。このような結果は、aPKC阻害により、細胞死JNK/c-Jun経路が活性化されることによって軸索の変性および神経細胞死が促進される可能性があることを示唆する。
RykはaPKC阻害によって誘導される軸索変性を促進させる
先の研究により、aPKCは、Wnt-Frizzled3媒介性軸索成長および誘引に必要とされるキナーゼであり、また、Frizzled3エンドサイトーシスを増大させることにより平面内細胞極性シグナル伝達を増幅させるための正のフィードバック機能を奏することが示された(46)。Rykは反発性Wnt受容体であり、平面内細胞極性シグナル伝達を阻害するため、RykがaPKCを調節するかどうかを試験した。ウエスタン-ブロッティングによって測定されたP-aPKC-T410レベルは、3日間培養したRyk KO皮質ニューロンにおいて増大していることがわかり(図5Aおよび5B)、Rykは通常、aPKC活性を阻害することが示唆された。
神経細胞死は発生中のRyk KOマウスの脳梁膨大後部皮質において低減されている
インビトロ結果により、Rykは神経細胞死に関与しているかもしれないことが示唆されている。先の研究により、Rykは発生中の齧歯類の前脳、例えば同種皮質、海馬および線条体で発現されていることが示された(24、48、49)。アポトーシスを、E18.5 Ryk欠損胚の前脳のいくつかの領域において、aCasp3免疫染色を用いて調べた。Ryk KOマウスは頭蓋および顔面の異常、例えば口蓋破裂を示し、出生時に死亡し(50)、そのため、解析はすべて、出生前に妊娠後期のE18.5胚において行った。E18.5の時点では、Ryk-/-脳の全体構造はおおむね正常であり、Ryk-/-胚とRyk+/-胚は区別不可能なようである(27)。aCasp3+細胞の数は、WT胚には少ないが、E18.5 RykKOマウスの皮質の限定された領域RSP(これは帯状皮質の後部に相当する)において45%少なかった(図6A~6C)。しかしながら、アポトーシスは、Ryk KO胚の背外側皮質、海馬および線条体において変わらず、Rykは発生中の皮質の特定の領域で細胞死を調節している可能性があることが示唆された。
Rykヘテロ接合性は、Frizzled3 KO胚の脳梁膨大後部皮質における神経細胞死を減衰させる
先の研究により、Wnt受容体Frizzled3欠損マウス胚の線条体における広範な細胞死、およびFrizzled3が発生中の線条体および同種皮質で強く発現されていることが示された(51)。細胞死を、Frizzled3 KOマウスの線条体および前脳の他の領域、例えばRSPにおいて調べた。この観察結果により、アポトーシスが線条体において強く増大していることが確認された。興味深いことに、アポトーシスは、E18.5 Frizzled3-/-胚のRSPではFrizzled3+/+およびFrizzled3+/-マウスと比べて5倍多いことがわかった(図6Dおよび6E)。神経前駆体マーカーであるネスチンおよび初期ニューロンマーカーであるβIII-チューブリンでの二重免疫標識により、aCasp3+免疫標識がβIII-チューブリン+ニューロンに局在することが示された。より厳密には、aCasp3は、胚発生中、皮質の第V層のニューロンで発現されるCTIP2と共局在した。しかしながら、皮質および海馬の背外側部分におけるアポトーシスは、E18.5 Frizzled3-/-ではFrizzled3+/+胚と比べて有意に異ならなかった。
さらなる方法
動物を12時間の明/暗サイクルで収容し、明サイクル時中の一貫した午前の時間に行動分析を行った。窓の埋め込み後に単独で収容した頭蓋窓を有するマウス以外、マウスとラットの両方をグループで収容した。グループの標本の大きさは、先の研究および検定力分析(25%効果量、a=0.05、639~=0.2、検定力80%)に基づいて選択した。1匹のマウスは、標識された皮質脊髄軸索が損傷レベルまたはそれ以下で存在しているという不完全なCS傷害の形跡のため試験から除外し、1匹のマウスは、損傷後、行動課題の実行を試みないため除外した。処置および方法(外科的処置、行動アッセイ、組織の加工処理、免疫染色、画像解析、COS-7トランスフェクションおよび皮質マッピング)はすべて、遺伝型または処置群について知らされていない試験担当者が実施した。
Ryk cKOはSCI後の精緻な運動制御の回復を向上させる
マウスに対して手伸ばしと把持の課題の2週間の訓練を行った後、CS脊柱の脊髄傷害に供した:部分的脊髄損傷モデルは、背側の灰白質、外側の白質および腹側の脊髄全体は無傷ままである(図8Aおよび8D)。脊柱傷害の直後、前肢伸ばしと把持の機能は失われている(図8F)。訓練を継続すると、砂糖ペレット取り出しの成功率が、神経回路再編成のため回復する。CSTでは損傷後にロバストな側枝発芽が起こることが示されており、この新たな側芽の一部のものが新たな機能回路を担っていると考えられている。しかしながら、軸索の発芽は、軸索の可塑性を制限する分子性合図によって抑止される。
Ryk cKOはSCI後のCSTの側枝発芽を向上させる
Ryk cKOマウスにおける機能回復の改善の基礎をなす機構に対する取り組みを開始するため、CST側枝およびシナプス密度を頚部脊髄内の側枝の側芽に沿って解析した。条件付きRyk欠失は、損傷後12週目、損傷CSTの軸索のダイイングバックを有意に低減させない(片側t-検定P=0.12)が、CS損傷部位の吻側と尾側の両方において脊髄の灰白質内のCST側枝の数の有意な増加をもたらす(片側t-検定P<0.05、図9E)ことがわかった。軸索側枝の数が増えることに加えて、皮質の錐体ニューロンのRykを条件付き欠失させたマウスは、損傷部位の吻側600μmに確認された皮質脊髄軸索側枝上にシナプス前小胞グルタミン酸トランスポーター1(vGlut1)標識斑点を示し、Rykの条件付き欠失後の機能的結合性の向上が示唆された(図10Cおよび10D)。
モノクローナルRyk抗体は機能回復を促進させる
脊髄損傷後の損傷脊髄におけるWnt-Rykシグナル伝達軸の阻害がCSTリモデリングを高めるため、および行動の回復を向上させるために充分であるかどうかを試験するため、Wnt結合ドメインの半分(90~183位のアミノ酸範囲)を抗原として用いて新しいモノクローナルRyk抗体を作製し、脊髄損傷直後の成体ラットに注入した(図12A、17Aおよび17B)。機能遮断ポリクローナル抗体を、同じ領域を用いて事前に作製した。CS脊柱のワイヤナイフによる傷害後、浸透圧ミニポンプによる4週間のRyk抗体注入により前肢伸ばし課題における前肢の習熟機能の回復が促進され、すべてのラットが損傷前のピークレベルに回復したのに対して、IgG対照を注入したラットでは半分だけであった(図12B)。ラットが処置群に関係なく同様のレベルの前肢踏み込み障害を示したため、Ryk抗体は、格子渡り歩行運動課題における回復を向上さなかった(図12C)。皮質脊髄軸索を、運動皮質内へのビオチン化デキストランアミン(BDA)注射で標識した。損傷前の条件付きRyk欠失と整合して、損傷時点でのRykモノクローナル抗体の注入により、損傷レベルの吻側と尾側の両方において皮質脊髄軸索側枝の増加がもたらされることがわかった(片側t-検定P<0.05、図12E~12Iおよび18)。ラットにおけるRyk抗体注入後の側枝の側芽の増加の程度は、Ryk発現のないマウスのCST軸索で観察されたものと同様であった(図9Eおよび12I)。また、このような結果は、Rykシグナル伝達が実現可能な治療標的であることも示唆し、それは、脊髄損傷後のその機能の遮断によって機能回復が促進され得るためである。
回復時の皮質マップの再組織化
リモデリングされた脊髄に対する制御を一次運動野が回復する回路機構に取り組むため、光遺伝学アプローチを使用し、皮質のアウトプットをモニタリングした。齧歯類および霊長類において皮質内電気刺激ならびにヒトにおいて経頭蓋磁気刺激を用いて、皮質運動マップが研究されている。最近の光遺伝学的ツールにおける進歩により、侵襲性が最小限の様式での特定の神経集団の刺激が可能になっている。具体的には、光駆動性の非選択的なカチオンチャネルであるチャネルロドプシン-2(ChR2)の、Thy1プロモーターの制御下での発現(Thy1-ChR2)により、運動皮質内での第V層投射ニューロンの選択的活性化が可能になる。損傷後の誘発運動アウトプットの反復光遺伝学的マッピングによる運動マップの変化を調べるため、Thy1-ChR2マウスに対して利き手の前肢に対して反対側に片側開頭を行った(図19)。反対側皮質は前肢の訓練に応答して運動可塑性を示すため、開頭後、AAV-Creを利き手の前肢に対して反対側の運動皮質内に片側のみに注射し;機能回復をサポートするCST側枝の可塑性が、Ryk欠失を有するCST軸索において特異的に誘導された。運動マップアウトプットを、鎮静させたマウスの誘発反対側運動アウトプットを観察することによって評価した。
皮質の再組織化にはリハビリ訓練が必要とされる
実験過程における前肢伸ばし習熟の反復試験は、脊髄損傷からの運動機能の回復および皮質の再組織化を促進させ得るリハビリ訓練の代表的な例を本質的に構成する。Ryk欠失単独によって媒介される誘導型軸索可塑性が機能回復の促進に必要とされるかどうかを調べるため、前肢伸ばし習熟の回復をCS損傷後8週目に、損傷後に毎週の行動試験を行わない別のコホートのマウスにおいて試験した(図15A)。毎週の行動試験を行わなかったマウスは、限定的にすぎない習熟前肢回復を示し、遂行能力は損傷後1週間目に試験したマウスのものと同様であった(図15Cおよび8F)。毎週の試験がない場合、Rykの条件付き欠失とは関係なく皮質運動マップの精緻化も損なわれた(図15Bおよび22)。
Claims (9)
- Ryk上のWnt結合ドメインに特異的に結合する、もしくはRykのエクトドメイン領域であるRykの90~183位のアミノ酸内のエピトープに特異的に結合し、
CDR1、CDR2、およびCDR3の順番でSEQ ID NO:5~7に示すCDR配列を含む重鎖可変領域;ならびにCDR1、CDR2、およびCDR3の順番でSEQ ID NO:1~3に示すCDR配列を含む軽鎖可変領域を含む、
単離された抗Ryk抗体または抗体断片。 - Ryk上のWnt結合ドメインに特異的に結合する、またはRykのエクトドメイン領域であるRykの90~183位のアミノ酸内のエピトープに特異的に結合する、単離された抗体または抗体断片であって、以下を含む、該単離された抗体または抗体断片:
a)SEQ ID NO:8に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
b)SEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列を含む軽鎖領域可変領域。 - 有効量の請求項1または2記載の抗体または抗体断片および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、薬学的組成物。
- 請求項1または2記載の単離された抗体または抗体断片をコードしている核酸分子。
- WntとRykを含む試料を請求項1または2記載の単離された抗体または抗体断片と接触させ、それによりWntとRykの相互作用に干渉することを含む、WntとRykの相互作用に干渉する方法。
- 請求項1または2記載の単離された抗体または抗体断片を含む、ニューロンの変性を抑止するための医薬であって、該抗体または抗体断片がニューロンに接触してニューロンの軸索の変性が抑止されることによって、該ニューロンの変性が抑止される、医薬。
- 請求項1または2記載の単離された抗体もしくは抗体断片、請求項3記載の薬学的組成物、または請求項4記載の核酸分子を含む、神経性の疾患を有するか、または神経性の疾患を発症するリスクがある対象において、神経性の疾患または障害を処置するための医薬。
- 請求項1または2記載の単離された抗体または抗体断片を含む、ニューロンの指向的成長をモジュレートするための医薬であって、該抗体または抗体断片がニューロンに接触することによって、該ニューロンの指向的成長がモジュレートされ、ここで、該ニューロンが脊髄交連神経軸索、上位運動ニューロンの軸索、または中枢神経系の軸索である、医薬。
- 請求項1または2記載の単離された抗Ryk抗体または抗体断片とは異なる結合特異性を有する第2の機能性部分と連結された、請求項1または2記載の単離された抗Ryk抗体または抗体断片を含む二重特異性分子。
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