CN109536541A - 玉米浆预处理方法和生产柠檬酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种对玉米浆进行预处理的方法以及采用经预处理的玉米浆生产柠檬酸的方法，其中，通过利用复合蛋白酶对玉米浆进行预处理，并将经预处理的玉米浆用于发酵生产柠檬酸，能够明显改善玉米浆的微生物利用，并显著降低发酵过程的泡沫量，从而提高了柠檬酸产率。

Description

玉米浆预处理方法和生产柠檬酸的方法

技术领域

本发明属于生物工程和微生物领域，涉及对柠檬酸的发酵生产工艺中的玉米浆进行预处理的方法以及采用经预处理的玉米浆发酵生产柠檬酸的方法。

背景技术

柠檬酸(CA)是三羧酸循环的一种重要中间代谢产物，广泛应用于食品、医药、精细化学品等领域。我国柠檬酸生产起步较晚，初期主要以糖蜜或砂糖进行浅盘发酵研究；1968年，首次实现以淀粉为原料深层发酵柠檬酸，同期天津工业微生物所开发了以薯干为原料深层发酵生产柠檬酸的工艺。另一方面，高产菌育种工作在柠檬酸行业中一直处于举足轻重的地位，我国在菌种选育方面的研究非常活跃，经过几代人的不懈努力，选育出了具有底物粗放(无需预处理)、底物广泛(淀粉质、糖质原料)、耐受性强(耐高糖、耐高柠檬酸并抗金属离子)、产酸高等优良特性的菌种，开发出了黑曲霉液态深层发酵的主流生产技术。

目前，国内的柠檬酸发酵生产工艺主要是以玉米为原料进行的全粉带渣发酵。非发酵性原料固体成分以及黑曲霉菌丝体缠绕等因素严重影响发酵过程的传质，造成淀粉利用率不足、无效能耗多、杂质含量高，从而影响产品分离提取精制。因此，急需开发出一种高效的柠檬酸发酵生产新工艺，大幅度降低柠檬酸生产成本并提升柠檬酸产品质量。随着玉米淀粉产量的不断增加，淀粉生产技术的不断进步，淀粉成本不断降低，玉米浆的产量也相应增加。将玉米浆用作生产发酵产品的培养基原料来生产各类高附加值产品，从而扩展玉米浆的用途有着非常重要的意义。

目前，以淀粉为原料的柠檬酸全清液发酵工艺成为关注重点，主要是将玉米淀粉经过液化、糖化制备成糖液，添加玉米淀粉加工副产物—玉米浆作为氮源，再添加少量N、P等营养物质进行发酵，该工艺的主要优点是：1)全清液发酵，因此传质溶氧水平高、发酵产酸高、转化率高、周期短、生产成本低；2)黑曲霉菌丝体不含玉米种皮和纤维，有利于其进一步高值化利用。

玉米浆是玉米淀粉制备过程中产生的副产物，是用亚硫酸浸泡玉米的水经过浓缩加工制成，为黄褐色的浓稠不透明的絮状悬浮物，其中固体含量在50wt％左右，由于玉米浆含有丰富的氨基酸、还原糖、磷、微量元素和生长素等营养物质，且制备成本低廉，多年来在发酵行业有着极为广泛的应用。

但是，目前以玉米浆作为氮源的工艺也存在明显的缺点：当使用大量的玉米浆作为氮源培养黑曲霉时，导致发酵过程中的泡沫增多，随着玉米浆用量加大，发酵罐利用效率随之降低。另外，玉米浆中不溶性颗粒及部分不易高温杀灭的微生物芽孢也随之增多，发酵染菌风险增大。而且，玉米浆中大量未被利用的杂质随发酵液进入提取环节，同样对提取过程造成不利影响，如除杂难度加大、主产品收率降低等等，这些杂质最后进入废液，往往成为废液处理困难的部分因素。

为解决这些问题，对含丰富有机氮源的原料进行预处理已成为近年来研究较多的一个领域，例如，目前豆粕水解液已有较多研究报道；与未水解原料相比，微生物对有机氮源利用效率较高，可明显提高发酵产量，但这些原料大多价格昂贵，不利于发酵成本的控制。

另外，例如专利CN104046674B公开了一种发酵生产β-胡萝卜素用的改良玉米浆及其制备方法和应用。该改良玉米浆是将玉米浆原料与Na₂S混合后充分反应后离心，调整上清液pH值而得。此方法制备的改良玉米浆应用于β-胡萝卜素的发酵中，作为主要的氮源和微量元素来源，β-胡萝卜素产量提高，大幅度降低发酵成本。然而，此方法制备玉米浆中的硫含量较高，应用到发酵过程中将会对菌体的生长代谢产生影响，另外，也会在一定程度上对下游产品的提纯和精制带来困难。

本发明以廉价易得的玉米浆为原料，采用酶水解的方式进行预处理，以期获得更易为微生物利用的经预处理的玉米浆，同时将所得的玉米浆作为原料之一应用于柠檬酸发酵，从而得到改善的柠檬酸发酵工艺。

发明内容

随着利用玉米淀粉作为原料发酵生产柠檬酸的工艺的不断发展，迫切需要解决玉米浆大量使用带来的发酵过程泡沫控制难、发酵罐利用率低等难题，通过对新鲜玉米浆进行特定预处理，提高微生物对营养物质的利用率，促进玉米浆的资源化利用，从而可进一步促进柠檬酸的积累。

本发明公开了一种对玉米浆进行预处理的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

(1)取玉米浆加入发酵罐中，按照1:(0.5-1.5)的体积比向所述玉米浆中加入水，得到混合液；

(2)调节所述混合液的pH至6-8，随后升温至60℃-70℃，向所述混合液中加入复合蛋白酶并进行酶解反应7-9h；

(3)在所述酶解反应后，将反应体系升温至85℃-95℃进行灭酶，然后冷却至20℃-35℃，得到经预处理的玉米浆。

另一方面，本发明涉及一种生产柠檬酸的方法，其中，所述方法包括如下步骤：

(i)用水配制粉浆浓度为13％-18％(w/v)的玉米淀粉溶液，将所述玉米淀粉溶液在40℃-70℃的温度下静置浸泡，随后调节其pH至5.0-6.0，向其中添加α-淀粉酶，在酶活温度下保温并不断搅拌，得到玉米淀粉液化液；

(ii)向所述玉米淀粉液化液中添加根据上述方法得到的经预处理的玉米浆、氨水和水，得到种子培养基；

(iii)将用无菌生理盐水或无菌水制备的黑曲霉孢子悬液接种入所述种子培养基中，在30℃-40℃下培养，得到种子培养液；

(iv)将步骤(i)得到的玉米淀粉液化液的pH调至3.8-5.0，向其中加入糖化酶在酶活温度下进行糖化，在糖化期间测定其中的总糖和还原糖，当DE值达到80％以上结束所述糖化，得到玉米淀粉糖化液；

(v)向所述玉米淀粉糖化液中添加根据上述方法得到的经预处理的玉米浆和水，得到发酵培养基，向所述发酵培养基中接种所述种子培养液，在30℃-40℃下进行发酵培养，得到柠檬酸。

本发明对玉米浆使用酶水解进行预处理，将其中的蛋白质分子降解为多肽及游离氨基酸，除了使微生物更容易利用且提高了柠檬酸产率以外，而且由于降低了发酵过程中的泡沫量，还可以节省发酵过程中的消泡剂的用量(相对于采用未预处理的玉米浆的情况而言，消泡剂的量减少了15wt％以上)，从而能够降低成本；并且还增加了溶氧，由此促进细胞生长，提高产酸率；缩短发酵周期；增加发酵罐装液量，提高单产。

具体实施方式

为了充分说明本发明，在此列举了一些示例性的实施方式，但是本发明不受这些实施方式的限制。在不影响本发明主旨的情况下，本发明可以进行各种各样的修饰和变形。

在本文中，除非另有说明，术语“室温”是指20℃-35℃的温度。

在本文中，除非另有说明，术语“DE值”是指葡萄糖当量(Dextrose Equivalent)的值。

玉米浆的预处理

本发明中涉及的玉米浆可以是可商购的玉米浆；或者可以根据本领域已知的常规知识制备得到，例如，记载于如下文献中的方法：陈璥编，《玉米淀粉工业手册》，中国轻工业出版社，2009-09-01；白坤编，《玉米淀粉工程技术》，中国轻工业出版社，中国轻工业出版社，以引用的方式将其并入本文作为参考。

在一个实施方式中，本发明涉及一种对玉米浆进行预处理的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

(1)取玉米浆加入发酵罐中，按照1:(0.5-1.5)的体积比向所述玉米浆中加入水，得到混合液；

(2)调节所述混合液的pH至6-8，随后升温至60℃-70℃，向所述混合液中加入复合蛋白酶并进行酶解反应7-9h；

(3)在所述酶解反应后，将反应体系升温至85℃-95℃进行灭酶，然后冷却至20℃-35℃，得到经预处理的玉米浆。

在优选的实施方式中，在上述步骤(1)中，按照1:1的体积比向所述玉米浆中加入水。

在优选的实施方式中，在上述步骤(2)中，向所述混合液中通入氨气来调节所述混合液的pH，优选地，调节所述混合液的pH至7.00±0.05。

在优选的实施方式中，在上述步骤(2)中，升温至65℃。

在优选的实施方式中，在上述步骤(2)中，向所述混合液中加入占所述混合液的体积的1％的所述复合蛋白酶。

在优选的实施方式中，在上述步骤(2)中，所述复合蛋白酶包含酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶中的一种或者多种。

在优选的实施方式中，在上述步骤(2)中，在进行所述酶解反应的同时，以190-220r/min的速度对所述混合液进行搅拌。

在优选的实施方式中，在上述步骤(2)中，所述酶解反应进行8h。

在优选的实施方式中，在上述步骤(3)中，将所述反应体系升温至90℃进行灭酶；优选地，所述灭酶进行10-20min、例如15min。

在优选的实施方式中，在上述步骤(3)中，所述经预处理的玉米浆中的各种氨基酸的含量以g/100g计为：Asp 0.939；Thr 0.523；Ser 0.579；Glu2.162；Gly 0.799；Ala1.768；Val 0.883；Ile 0.511；Leu 1.330；Tyr 0.246；Phe 0.525；His 0.490；Lys 0.431；Arg 0.439。

柠檬酸的发酵生产

在本发明中采用的玉米淀粉可以是可商购的玉米淀粉；或者可以根据本领域已知的常规知识制备得到，例如，记载于如下文献中的方法：陈璥编，《玉米淀粉工业手册》，中国轻工业出版社，2009-09-01；白坤编，《玉米淀粉工程技术》，中国轻工业出版社，中国轻工业出版社，以引用的方式将其并入本文作为参考。

黑曲霉(Aspergillus niger)为半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。黑曲霉是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。仅出于示例的目的，本发明的发酵方法中采用了商业化的黑曲霉Co827(Aspergillus niger Co827)菌株(柴敏，一种黑曲霉斜面培养基的优化方法，《科技资讯》，2014，12(24):231-232)。真菌孢子悬液的制备采用本领域的常规手段进行，可采用无菌水或无菌生理盐水制备孢子悬液。

在一个实施方式中，本发明涉及一种生产柠檬酸的方法，其中，所述方法包括如下步骤：

(i)用水配制粉浆浓度为13％-18％(w/v)的玉米淀粉溶液，将所述玉米淀粉溶液在40℃-70℃的温度下静置浸泡，随后调节其pH至5.0-6.0，向其中添加α-淀粉酶，在酶活温度下保温并不断搅拌，得到玉米淀粉液化液；

(ii)向所述玉米淀粉液化液中添加根据上述方法得到的经预处理的玉米浆、氨水和水，得到种子培养基；

(iii)将用无菌生理盐水或无菌水制备的黑曲霉孢子悬液接种入所述种子培养基中，在30℃-40℃下培养，得到种子培养液；

(iv)将步骤(i)得到的玉米淀粉液化液的pH调至3.8-5.0，向所述玉米淀粉液化液中加入糖化酶在酶活温度下进行糖化，在糖化期间测定其中的总糖和还原糖，当DE值达到80％以上结束所述糖化，得到玉米淀粉糖化液；

(v)向所述玉米淀粉糖化液中添加根据上述方法得到的经预处理的玉米浆和水，得到发酵培养基，向所述发酵培养基中接种所述种子培养液，在30℃-40℃下进行发酵培养，得到柠檬酸。

在优选的实施方式中，在上述步骤(i)中，将所述玉米淀粉溶液放置在循环水浴槽中进行浸泡。

在优选的实施方式中，在上述步骤(i)中，将所述玉米淀粉溶液浸泡20-60min、优选25-55min。

可采用本领域已知的对α-淀粉酶具有相容性的任意的酸或碱调节玉米淀粉溶液的pH。在优选的实施方式中，在上述步骤(i)中，用氢氧化钙调节所述pH。

在优选的实施方式中，在上述步骤(i)中，按照20U·g^-1玉米淀粉的量添加所述α-淀粉酶。

在优选的实施方式中，在上述步骤(i)中，在90℃的温度下保温。

在优选的实施方式中，在上述步骤(i)中，以100-400rpm的速度进行所述搅拌。

在优选的实施方式中，在上述步骤(ii)中，所述种子培养基的总糖含量为10％-14％(g/mL)，总氮含量为0.25％(g/mL)。

在优选的实施方式中，在上述步骤(iii)中，所述黑曲霉孢子悬液的浓度为10⁶个/mL。

在优选的实施方式中，在上述步骤(iii)中，将所述黑曲霉孢子悬液以0.2-0.8％(v/v)的比例接种入所述种子培养基中。

在优选的实施方式中，在上述步骤(iii)中，所述培养在三角瓶或机械搅拌不锈钢发酵罐中进行。在进一步优选的实施方式中，在上述步骤(iii)中，所述培养在机械搅拌不锈钢发酵罐中进行，并且，所述发酵罐的通气量为0.6-1.0vvm，并控制其中的溶解氧(DO)在30％-60％。

在优选的实施方式中，在上述步骤(iv)中，用稀硫酸将所述玉米淀粉液化液的pH调至3.8-5.0。

在优选的实施方式中，在上述步骤(iv)中，向所述玉米淀粉液化液中加入0.1％-0.5％(v/v)的糖化酶。

在优选的实施方式中，在上述步骤(iv)中，在60℃下进行所述糖化。

在优选的实施方式中，在上述步骤(iv)中，在进行所述糖化的同时，以100-300rpm的速度进行搅拌。

按照相关的国家标准中公开的方法，测定总糖和还原糖的含量。按照如下公式计算DE值：DE值＝还原糖/总糖×100％。

在优选的实施方式中，在上述步骤(v)中，所述发酵培养基的总糖含量为12％-18％(g/mL)，总氮含量为0.09％(g/mL)。

在优选的实施方式中，在上述步骤(v)中，向所述发酵培养基中按照5％(v/v)-10％(v/v)的比例接种所述种子培养液。

在优选的实施方式中，在上述步骤(v)中，所述培养在三角瓶或机械搅拌不锈钢发酵罐中进行。在进一步优选的实施方式中，在上述步骤(v)中，所述培养在机械搅拌不锈钢发酵罐中进行，并且，所述发酵罐的通气量为0.6-0.8vvm，并控制其中的溶解氧(DO)在40％-70％。在进一步优选的实施方式中，在所述发酵培养期间，相对于发酵体系的总体积而言，加入0.02％-0.034％(v/v)的消泡剂。

本发明的一些目的或优势可通过如下段落中列出的示例性的技术方案加以实现：

1.一种对玉米浆进行预处理的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

(1)取玉米浆加入发酵罐中，按照1:(0.5-1.5)的体积比向所述玉米浆中加入水，得到混合液；

(2)调节所述混合液的pH至6-8，随后升温至60℃-70℃，向所述混合液中加入复合蛋白酶并进行酶解反应7-9h；

(3)在所述酶解反应后，将反应体系升温至85℃-95℃进行灭酶，然后冷却至20℃-35℃，得到经预处理的玉米浆。

2.如段落1所述的方法，在所述步骤(1)中，按照1:1的体积比向所述玉米浆中加入水。

3.如段落1或2所述的方法，在所述步骤(2)中，向所述混合液中通入氨气来调节所述混合液的pH，优选地，调节所述混合液的pH至7.00±0.05。

4.如段落1-3中任一段所述的方法，在所述步骤(2)中，升温至65℃。

5.如段落1-4中任一段所述的方法，在所述步骤(2)中，向所述混合液中加入占所述混合液的体积的1％的所述复合蛋白酶。

6.如段落1-5中任一段所述的方法，在所述步骤(2)中，所述复合蛋白酶包含酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶中的一种或者多种。

7.如段落1-6中任一段所述的方法，在所述步骤(2)中，在进行所述酶解反应的同时，以190-220r/min的速度对所述混合液进行搅拌。

8.如段落1-7中任一段所述的方法，在所述步骤(2)中，所述酶解反应进行8h。

9.如段落1-8中任一段所述的方法，在所述步骤(3)中，将所述反应体系升温至90℃进行灭酶；优选地，所述灭酶进行10-20min、例如15min。

10.如段落1-9中任一段所述的方法，在所述步骤(3)中，所述经预处理的玉米浆中的各种氨基酸的含量以g/100g计为：Asp 0.939；Thr0.523；Ser 0.579；Glu2.162；Gly0.799；Ala 1.768；Val 0.883；Ile 0.511；Leu 1.330；Tyr 0.246；Phe 0.525；His 0.490；Lys 0.431；Arg 0.439。

11.一种生产柠檬酸的方法，其中，所述方法包括如下步骤：

(i)用水配制粉浆浓度为13％-18％(w/v)的玉米淀粉溶液，将所述玉米淀粉溶液在40℃-70℃的温度下静置浸泡，随后调节其pH至5.0-6.0，向其中添加α-淀粉酶，在酶活温度下保温并不断搅拌，得到玉米淀粉液化液；

(ii)向所述玉米淀粉液化液中添加根据权利要求1-10中任一项所述的方法得到的经预处理的玉米浆、氨水和水，得到种子培养基；

(iii)将用无菌生理盐水或无菌水制备的黑曲霉孢子悬液接种入所述种子培养基中，在30℃-40℃下培养，得到种子培养液；

(iv)将步骤(i)得到的玉米淀粉液化液的pH调至3.8-5.0，向所述玉米淀粉液化液中加入糖化酶在酶活温度下进行糖化，在糖化期间测定其中的总糖和还原糖，当DE值达到80％以上结束所述糖化，得到玉米淀粉糖化液；

(v)向所述玉米淀粉糖化液中添加根据上述方法得到的经预处理的玉米浆和水，得到发酵培养基，向所述发酵培养基中接种所述种子培养液，在30℃-40℃下进行发酵培养，得到柠檬酸。

12.如段落11所述的方法，在所述步骤(i)中，将所述玉米淀粉溶液放置在循环水浴槽中进行浸泡。

13.如段落11或12所述的方法，在所述步骤(i)中，将所述玉米淀粉溶液放置在循环水浴槽中进行浸泡。

14.如段落11-13中任一段所述的方法，在所述步骤(i)中，将所述玉米淀粉溶液浸泡20-60min、优选25-55min。

15.如段落11-14中任一段所述的方法，在所述步骤(i)中，用氢氧化钙调节所述pH。

16.如段落11-15中任一段所述的方法，在所述步骤(i)中，按照20U·g^-1玉米淀粉的量添加所述α-淀粉酶。

17.如段落11-16中任一段所述的方法，在所述步骤(i)中，在90℃的温度下保温。

18.如段落11-17中任一段所述的方法，在所述步骤(i)中，以100-400rpm的速度进行所述搅拌。

19.如段落11-18中任一段所述的方法，在所述步骤(ii)中，所述种子培养基的总糖含量为10％-14％(g/mL)，总氮含量为0.25％(g/mL)。

20.如段落11-19中任一段所述的方法，在所述步骤(iii)中，所述黑曲霉孢子悬液的浓度为10⁶个/mL。

21.如段落11-20中任一段所述的方法，在所述步骤(iii)中，将所述黑曲霉孢子悬液以0.2-0.8％(v/v)的比例接种入所述种子培养基中。

22.如段落11-21中任一段所述的方法，在所述步骤(iii)中，所述培养在三角瓶或机械搅拌不锈钢发酵罐中进行。

23.如段落22所述的方法，在所述步骤(iii)中，所述培养在机械搅拌不锈钢发酵罐中进行，并且，所述发酵罐的通气量为0.6-1.0vvm，并控制其中的溶解氧(DO)在30％-60％。

24.如段落11-23中任一段所述的方法，在所述步骤(iv)中，用稀硫酸将所述玉米淀粉液化液的pH调至3.8-5.0。

25.如段落11-24中任一段所述的方法，在所述步骤(iv)中，向所述玉米淀粉液化液中加入0.1％-0.5％(v/v)的糖化酶。

26.如段落11-25中任一段所述的方法，在所述步骤(iv)中，在60℃下进行所述糖化。

27.如段落11-26中任一段所述的方法，在所述步骤(iv)中，在进行所述糖化的同时，以100-300rpm的速度进行搅拌。

28.如段落11-27中任一段所述的方法，在所述步骤(v)中，所述发酵培养基的总糖含量为12％-18％(g/mL)，总氮含量为0.09％(g/mL)。

29.如段落11-28中任一段所述的方法，在所述步骤(v)中，向所述发酵培养基中按照5％(v/v)-10％(v/v)的比例接种所述种子培养液。

30.如段落11-29中任一段所述的方法，在所述步骤(v)中，所述培养在三角瓶或机械搅拌不锈钢发酵罐中进行。

31.如段落30所述的方法，在所述步骤(v)中，所述培养在机械搅拌不锈钢发酵罐中进行，并且，所述发酵罐的通气量为0.6-0.8vvm，并控制其中的溶解氧(DO)在40％-70％。

32.如段落31所述的方法，在所述步骤(v)中，在所述发酵培养期间，相对于发酵体系的总体积而言，加入0.02％-0.034％(v/v)的消泡剂。

实施例

借助下述实施例对本发明进行说明，但是本领域技术人员可以理解的是，本发明的保护范围不仅限于此。

除非另有说明，下述制备例、实施例和对比例中采用的黑曲霉菌株为黑曲霉Co827。而且，除非另有说明，下文中涉及的各培养基均为本领域已知的常规培养基，可商购得到或者可由本领域技术人员根据本领域的普通技术知识(例如，陈天寿主编，《微生物培养基的制造与应用》，中国农业出版社，1995年6月第1版；马乐好等主编，《微生物培养基实用手册》，吉林科学技术出版社，2006年3月第1版，但不限于此)加以配制。

除非另有说明，下述实施例和对比例中的柠檬酸的含量通过如下方法测定：斐林试剂法。转化率通过如下计算：柠檬酸浓度(g/L)/初始总糖浓度(g/L)。

制备例1：玉米淀粉液化液的制备

用水配制粉浆浓度为13％(w/v)的玉米淀粉溶液，将该溶液在循环水浴槽中浸泡(浸泡温度为40℃，浸泡时间为55min)；然后，用氢氧化钙调节pH至5.0，添加α-淀粉酶(20U·g^-1玉米淀粉，购自诺维信中国生物技术有限公司)，在90℃下保温并不断搅拌(100rpm)，水解60min，补偿液化过程中蒸发的水量，得到玉米淀粉液化液。

制备例2：玉米淀粉液化液的制备

用水配制粉浆浓度为18％(w/v)的玉米淀粉溶液，将该溶液在循环水浴槽中浸泡(浸泡温度为68℃，浸泡时间为25min)；然后，用氢氧化钙调节pH至6.0，添加α-淀粉酶(20U·g^-1玉米淀粉，购自诺维信中国生物技术有限公司)，在90℃下保温并不断搅拌(400rpm)，水解50min，补偿液化过程中蒸发的水量，得到玉米淀粉液化液。

制备例3：玉米淀粉糖化液的制备

将1L的上述的玉米淀粉液化液的pH用稀硫酸调至3.8向其中加入5ml糖化酶(购自诺维信中国生物技术有限公司)在60℃下进行糖化，100rpm搅拌，12小时后，取溶液测定其中的总糖和还原糖含量，当DE值达到80％以上可结束糖化，得到玉米淀粉糖化液。

制备例4：玉米淀粉糖化液的制备

将4L的上述的玉米淀粉液化液的pH用稀硫酸调至5.0，向其中加入5ml糖化酶(购自诺维信中国生物技术有限公司)在60℃下进行糖化，300rpm搅拌，6小时后，取溶液测定其中的总糖和还原糖含量，当DE值达到80％以上可结束糖化，得到玉米淀粉糖化液。

制备例5：黑曲霉孢子悬液的制备

用无菌接种环取4℃下保藏的黑曲霉Co827菌株并接种到PDA固体培养基上活化，置于35℃的恒温培养箱培养7d，培养基的表面上布满致密的孢子；然后用接种环取一环孢子接种至茄子瓶内的麸曲培养基上，往复划线至涂满培养基表面，将茄子瓶置于35℃恒温培养箱培养7d，茄子瓶表面布满致密的孢子。

用50mL无菌生理盐水将茄子瓶表面的孢子完全洗下，倒入含有玻璃珠的三角瓶中，充分振荡，使孢子分散，得到孢子悬液母液。取1mL孢子悬液母液采用无菌生理盐水进行10倍稀释，并采用血球计数板进行计数，从而制得浓度为约10⁶个/mL的黑曲霉孢子悬液。

制备例6：经预处理的玉米浆的制备

取1L玉米浆加入5L机械搅拌发酵罐中，按水:玉米浆的体积比1∶1加入自来水，得到混合液，向其中通入氨气调节混合液的pH至7.00±0.05，升温至65℃，向所述混合液中加入占混合液的体积的1％的复合蛋白酶(购自诺维信)，搅拌速度为200r/min，反应8h后，升温至90℃，维持15min灭酶，然后冷却至室温，得到经预处理的玉米浆。

由中粮营养健康研究院有限公司质量安全检测中心通过采用高效液相色谱方法测定玉米浆中的氨基酸组成，上述的经预处理的玉米浆中的各种氨基酸的含量为(以g/100g计)：Asp 0.939；Thr 0.523；Ser 0.579；Glu2.162；Gly 0.799；Ala 1.768；Val 0.883；Ile 0.511；Leu 1.330；Tyr 0.246；Phe 0.525；His 0.490；Lys 0.431；Arg 0.439。

实施例1：摇瓶中利用经预处理的玉米浆生产柠檬酸

采用如下配制种子培养基(初始总糖浓度控制在120g/L，总氮含量为2.5g/L)：玉米淀粉液化液(200g/L的总糖浓度)、30g/L经预处理的玉米浆、10g/L氨水、余量的水配制种子培养基。

采用如下配制发酵培养基(初始总糖浓度控制在160g/L，总氮含量为0.9g/L)：玉米淀粉糖化液(200g/L的总糖浓度)、20g/L的经预处理的玉米浆和余量的水配制发酵培养基。

向250mL的三角瓶中加入50mL种子培养基，然后向其中加入0.2mL的上述的黑曲霉孢子悬液，培养温度为36℃，转速400rpm，培养24h得到种子培养液。

向250mL三角瓶中加入50mL上述发酵培养基，然后将达到对数生长期的种子培养液按10％(v/v)的接种量接种入上述发酵培养基中，在37℃的温度和300rpm的转速下发酵84h。

取发酵液进行测定，结果发现，柠檬酸产量为124g/L，玉米浆转化率为95.38％。

对比例1：摇瓶中利用未预处理的玉米浆生产柠檬酸

采用如下配制种子培养基(初始总糖浓度控制在120g/L，总氮含量为2.5g/L))：将玉米淀粉液化液(200g/L的总糖浓度)、30g/L未预处理的玉米浆、10g/L氨水、余量的水配制种子培养基。

采用如下配制发酵培养基(初始总糖浓度控制在160g/L，总氮含量为0.9g/L)：将玉米淀粉糖化液(200g/L的总糖浓度)、20g/L的未预处理的玉米浆和余量的水按照配制发酵培养基。

向250mL的三角瓶中加入50mL种子培养基，然后向其中加入0.2mL的上述的黑曲霉孢子悬液，培养温度为36℃，转速400rpm，培养24h得到种子培养液。

向250mL三角瓶中加入50mL上述发酵培养基，然后将达到对数生长期的种子培养液按10％(v/v)的接种量接种入上述发酵培养基中，在37℃的温度和300rpm的转速下发酵84h。

取发酵液进行测定，结果发现，柠檬酸产量为105g/L，玉米浆转化率为85.46％。

实施例2：50L机械搅拌发酵罐中利用经预处理的玉米浆生产柠檬酸

采用如下配制种子培养基(初始总糖浓度控制在120g/L，总氮含量为2.5g/L)：将玉米淀粉液化液(200g/L总糖浓度)、30g/L经预处理的玉米浆、10g/L氨水、余量的水配制种子培养基。

采用如下配制发酵培养基(初始总糖浓度控制在180g/L，总氮含量为0.9g/L)：将玉米淀粉糖化液(200g/L总糖浓度)、20g/L的经预处理的玉米浆和余量的水配制发酵培养基。

将上述的黑曲霉孢子悬液以0.8％(v/v)的比例接种到种子培养基中，在10L机械搅拌不锈钢发酵罐(保兴10JS)中进行培养，其中，种子培养基的装液量为7L，培养温度为36℃，转速为450rpm，通气量为1.0vvm，罐压为0.06Mpa，转速与溶解氧(DO)值偶联，将DO控制在40％。培养24h得到种子培养液。

将所述种子培养液按照10％(v/v)的接种量接种入50L机械搅拌不锈钢发酵罐(保兴50JS)中，该发酵罐中的发酵培养基的量为35L，消泡剂(900聚醚GPE)添加量为0.034％，转速为350rpm，通气量为0.6vvm，罐压为0.06Mpa，温度为37℃，培养时间为68h，转速与溶解氧(DO)值偶联，将DO控制在50％。

取发酵液进行测定，结果发现，柠檬酸产量170g/L，玉米浆转化率为94.4％，消泡剂用量为0.034％。

对比例2：50L机械搅拌发酵罐中利用未预处理的玉米浆生产柠檬酸

采用如下配制种子培养基(初始总糖浓度控制在120g/L，总氮含量为2.5g/L)：玉米淀粉液化液(200g/L总糖浓度)、30g/L未预处理的玉米浆、10g/L氨水。

采用如下配制发酵培养基(初始总糖浓度控制在180g/L，总氮含量为0.9g/L)：玉米淀粉糖化液(200g/L总糖浓度)、20％g/L的未处理的玉米浆和余量的水配制发酵培养基。

将上述的黑曲霉孢子悬液以0.8％(v/v)的比例接种到种子培养基中，在10L机械搅拌不锈钢发酵罐(保兴10JS)中进行培养，其中，种子培养基的装液量为7L，培养温度为36℃，转速为450rpm，通气量为1.0vvm，罐压为0.06Mpa，转速与溶解氧(DO)值偶联，将DO控制在40％。培养24h得到种子培养液。

将所述种子培养液按照10％(v/v)的接种量接种入50L机械搅拌不锈钢发酵罐(保兴50JS)中，该发酵罐中的发酵培养基的装液量为35L，消泡剂(900聚醚GPE)添加量为0.04％，转速为350rpm，通气量为0.6vvm，温度为37℃，培养时间为68h，转速与溶解氧(DO)值偶联，将DO控制在50％。

取发酵液进行测定，结果发现，柠檬酸产量为158g/L，玉米浆转化率为87.77％，消泡剂用量为0.04％。

实施例3：50L机械搅拌发酵罐中利用经预处理的玉米浆生产柠檬酸

采用如下配制种子培养基(初始总糖浓度控制在120g/L，总氮含量为2.5g/L)：将玉米淀粉液化液(200g/L总糖浓度)、30g/L经预处理的玉米浆、10g/L氨水、余量的水配制种子培养基。

采用如下配制发酵培养基(初始总糖浓度控制在180g/L，总氮含量为0.9g/L)：将玉米淀粉糖化液(200g/L总糖浓度)、20g/L的经预处理的玉米浆和余量的水配制发酵培养基。

将上述的黑曲霉孢子悬以0.2％(v/v)的比例接种到种子培养基中，在10L机械搅拌不锈钢发酵罐(保兴10JS)中进行培养，其中，种子培养基的装液量为7L，培养温度为36℃，转速为450rpm，通气量为0.6vvm，罐压为0.08Mpa，转速与溶解氧值偶联，将DO控制在30％，培养24h得到种子培养液。

将所述种子培养液按照5％(v/v)的接种量接种入50L机械搅拌不锈钢发酵罐(保兴50JS)中，该发酵罐中的发酵培养基的装液量为40L，消泡剂(900聚醚GPE)添加量为0.03％(v/v)，转速为350rpm，通气量为0.8vvm，罐压为0.08Mpa，温度37℃，转速与溶解氧值偶联，将DO控制在40％，培养时间为68h。

取发酵液进行测定，结果发现，柠檬酸产量为173g/L，玉米浆转化率为96.11％，消泡剂用量为0.03％。

实施例4：500L机械搅拌发酵罐中利用经预处理的玉米浆生产柠檬酸

采用如下配制种子培养基(初始总糖浓度控制在120g/L，总氮含量为2.5g/L)：将玉米淀粉液化液(200g/L总糖浓度)、30g/L经预处理的玉米浆、10g/L氨水、余量的水配制种子培养基

采用如下配制发酵培养基(初始总糖浓度控制在180g/L，总氮含量为0.9g/L)：将玉米淀粉糖化液(200g/L总糖浓度)、20g/L的经预处理的玉米浆和余量的水配制发酵培养基。

将上述的黑曲霉孢子悬液以0.6％(v/v)的比例接种到种子培养基中，在50L机械搅拌不锈钢发酵罐(保兴50JS)中进行培养，其中，种子培养基的装液量为35L，培养温度为36℃，转速为350rpm，通气量为0.8vvm，罐压为0.08Mpa，转速与溶解氧值偶联，将DO控制在60％，培养24h得到种子培养液。

将所述种子培养液按照8％(v/v)的接种量接种入500L机械搅拌发酵罐中，该发酵罐中的发酵培养基的装液量为400L，消泡剂(900聚醚GPE)添加量为0.02％(v/v)，转速为200rpm，通气量为0.8vvm，温度37℃，罐压为0.08Mpa，转速与溶解氧值偶联，将DO控制在70％，培养68h。

取发酵液进行测定，结果发现，柠檬酸产量为176g/L，玉米浆转化率为97.77％，消泡剂用量为0.02％。

Claims (10)

1.一种对玉米浆进行预处理的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

(1)取玉米浆加入发酵罐中，按照1:(0.5-1.5)的体积比向所述玉米浆中加入水，得到混合液；

(2)调节所述混合液的pH至6-8，随后升温至60℃-70℃，向所述混合液中加入复合蛋白酶并进行酶解反应7-9h；

(3)在所述酶解反应后，将反应体系升温至85℃-95℃进行灭酶，然后冷却至20℃-35℃，得到经预处理的玉米浆。

2.如权利要求1所述的方法，在所述步骤(1)中，按照1:1的体积比向所述玉米浆中加入水。

3.如权利要求1或2所述的方法，在所述步骤(2)中，向所述混合液中通入氨气来调节所述混合液的pH，优选地，调节所述混合液的pH至7.00±0.05；

优选地，在所述步骤(2)中，升温至65℃；优选地，在所述步骤(2)中，向所述混合液中加入占所述混合液的体积的1％的所述复合蛋白酶；

优选地，在所述步骤(2)中，所述复合蛋白酶包含酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶中的一种或者多种；

优选地，在所述步骤(2)中，在进行所述酶解反应的同时，以190-220r/min的速度对所述混合液进行搅拌；

优选地，在所述步骤(2)中，所述酶解反应进行8h。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，在所述步骤(3)中，将所述反应体系升温至90℃进行灭酶；优选地，所述灭酶进行10-20min、例如15min；

优选地，在所述步骤(3)中，所述经预处理的玉米浆中的各种氨基酸的含量以g/100g计为：Asp 0.939；Thr 0.523；Ser 0.579；Glu2.162；Gly 0.799；Ala 1.768；Val 0.883；Ile0.511；Leu 1.330；Tyr 0.246；Phe 0.525；His 0.490；Lys 0.431；Arg 0.439。

5.一种生产柠檬酸的方法，其中，所述方法包括如下步骤：

(i)用水配制粉浆浓度为13％-18％(w/v)的玉米淀粉溶液，将所述玉米淀粉溶液在40℃-70℃的温度下静置浸泡，随后调节其pH至5.0-6.0，向其中添加α-淀粉酶，在酶活温度下保温并不断搅拌，得到玉米淀粉液化液；

(ii)向所述玉米淀粉液化液中添加根据权利要求1-4中任一项所述的方法得到的经预处理的玉米浆、氨水和水，得到种子培养基；

(iii)将用无菌生理盐水或无菌水制备的黑曲霉孢子悬液接种入所述种子培养基中，在30℃-40℃下培养，得到种子培养液；

(iv)将步骤(i)得到的玉米淀粉液化液的pH调至3.8-5.0，向所述玉米淀粉液化液中加入糖化酶在酶活温度下进行糖化，在糖化期间测定其中的总糖和还原糖，当DE值达到80％以上结束所述糖化，得到玉米淀粉糖化液；

(v)向所述玉米淀粉糖化液中添加根据上述方法得到的经预处理的玉米浆和水，得到发酵培养基，向所述发酵培养基中接种所述种子培养液，在30℃-40℃下进行发酵培养，得到柠檬酸。

6.如权利要求5所述的方法，在所述步骤(i)中，将所述玉米淀粉溶液放置在循环水浴槽中进行浸泡；

优选地，在所述步骤(i)中，将所述玉米淀粉溶液放置在循环水浴槽中进行浸泡；

优选地，在所述步骤(i)中，将所述玉米淀粉溶液浸泡20-60min、优选25-55min；

优选地，在所述步骤(i)中，用氢氧化钙调节所述pH；

优选地，在所述步骤(i)中，按照20U·g^-1玉米淀粉的量添加所述α-淀粉酶；

优选地，在所述步骤(i)中，在90℃的温度下保温；

优选地，在所述步骤(i)中，以100-400rpm的速度进行所述搅拌。

7.如权利要求5或6所述的方法，在所述步骤(ii)中，所述种子培养基的总糖含量为10％-14％(g/mL)，总氮含量为0.25％(g/mL)。

8.如权利要求5-7中任一项所述的方法，在所述步骤(iii)中，所述黑曲霉孢子悬液的浓度为10⁶个/mL；

优选地，在所述步骤(iii)中，将所述黑曲霉孢子悬液以0.2-0.8％(v/v)的比例接种入所述种子培养基中；

优选地，在所述步骤(iii)中，所述培养在三角瓶或机械搅拌不锈钢发酵罐中进行；

优选地，在所述步骤(iii)中，所述培养在机械搅拌不锈钢发酵罐中进行，并且，所述发酵罐的通气量为0.6-1.0vvm，并控制其中的溶解氧(DO)在30％-60％。

9.如权利要求5-8中任一项所述的方法，在所述步骤(iv)中，用稀硫酸将所述玉米淀粉液化液的pH调至3.8-5.0；

优选地，在所述步骤(iv)中，向所述玉米淀粉液化液中加入0.1％-0.5％(v/v)的糖化酶；

优选地，在所述步骤(iv)中，在60℃下进行所述糖化；

优选地，在所述步骤(iv)中，在进行所述糖化的同时，以100-300rpm的速度进行搅拌。

10.如权利要求5-9中任一项所述的方法，在所述步骤(v)中，所述发酵培养基的总糖含量为12％-18％(g/mL)，总氮含量为0.09％(g/mL)；

优选地，在所述步骤(v)中，向所述发酵培养基中按照5％(v/v)-10％(v/v)的比例接种所述种子培养液；

优选地，在所述步骤(v)中，所述培养在三角瓶或机械搅拌不锈钢发酵罐中进行；

优选地，在所述步骤(v)中，所述培养在机械搅拌不锈钢发酵罐中进行，并且，所述发酵罐的通气量为0.6-0.8vvm，并控制其中的溶解氧(DO)在40％-70％；

优选地，在所述步骤(v)中，在所述发酵培养期间，相对于发酵体系的总体积而言，加入0.02％-0.034％(v/v)的消泡剂。