CN104212851A - 一种多级连续发酵生产l-苯丙氨酸的方法 - Google Patents
一种多级连续发酵生产l-苯丙氨酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104212851A CN104212851A CN201410459862.0A CN201410459862A CN104212851A CN 104212851 A CN104212851 A CN 104212851A CN 201410459862 A CN201410459862 A CN 201410459862A CN 104212851 A CN104212851 A CN 104212851A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tank
- fermentor
- feed supplement
- speed
- fermentation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 71
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 71
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 title claims abstract description 45
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 12
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 title abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 33
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000006052 feed supplement Substances 0.000 claims description 46
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 37
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 35
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 25
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 23
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 21
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 19
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 16
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 14
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 13
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 13
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 claims description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 10
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 8
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 6
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 6
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 4
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims description 4
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 claims description 4
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 claims description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 abstract description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N kalafungina Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC=C2C(=O)C2=C1[C@@H](C)O[C@H]1[C@@H]2OC(=O)C1 XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 2
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 2
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- QNRATNLHPGXHMA-XZHTYLCXSA-N (r)-(6-ethoxyquinolin-4-yl)-[(2s,4s,5r)-5-ethyl-1-azabicyclo[2.2.2]octan-2-yl]methanol;hydrochloride Chemical compound Cl.C([C@H]([C@H](C1)CC)C2)CN1[C@@H]2[C@H](O)C1=CC=NC2=CC=C(OCC)C=C21 QNRATNLHPGXHMA-XZHTYLCXSA-N 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000080590 Niso Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
一种多级连续发酵生产L-苯丙氨酸的方法，通过种子培养、发酵培养和多级连续发酵来完成，具体是以大肠杆菌WR1001为出发菌株，进行三级以上的发酵，通过控制不同级发酵罐内的发酵条件，满足菌株在不同时期的代谢需求，提高原料转化率和L-苯丙氨酸产量。本发明简化了发酵过程，提高了L-苯丙氨酸产量，有效降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及L-苯丙氨酸发酵领域，具体涉及一种多级连续发酵生产L-苯丙氨酸的方法。
背景技术
L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine 简称L-Phe)又名L-苯基-α-氨基丙酸为白色斜方晶系结晶粉末。具有苦杏仁味，熔点：283 ℃（分解）。L-苯丙氨酸是人体所需八种必需的氨基酸之一，在人体代谢过程中具有重要作用。常用大肠杆菌WR1001为出发菌株进行发酵，在医药、食品、化工等领域也有广泛的应用。L-苯丙氨酸的发酵过方法包括分批发酵、酪氨酸流加分批发酵、三阶段流加葡萄糖发酵、多级连续高密度发酵。分批发酵由于营养物质的缺乏，菌体生长受限，因此产量不高；酪氨酸流加分批发酵中L-酪氨酸流加加速了菌体的生长，提高了生产强度，缩短了发酵周期。在流加浓度为75 mg/h时，最大菌体干重达到了40.13 g/L，生产周期缩短到30 h，生产速率达到1. 409 g/h/L。但是L-酪氨酸的流加减少发酵时间并提高生产强度，但对L-苯丙氨酸的最终产量没有明显的影响；三阶段流加葡萄糖发酵分别优化了L-苯丙氨酸发酵的初始葡萄糖浓度和葡萄糖的指数流加策略，显著地降低了乙酸的积累，促进了L-苯丙氨酸的合成，最终获得L-苯丙氨酸的产量达48.45 g/L；多级连续高密度发酵是最近一种新的发酵方法，该方法已经应用在一些微生物发酵上，该方法降低了底物抑制作用、产物抑制作用 ，提高了底物利用率，产品生产率和收率。
发明内容
解决的技术问题：针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多级连续发酵生产L-苯丙氨酸的方法，简化工艺的同时提高了L-苯丙氨酸的产量。
一种多级连续发酵生产L-苯丙氨酸的方法，包括以下步骤：
第一步，种子培养；
第二步，发酵培养；
第三步，多级连续发酵，以大肠杆菌WR1001为出发菌株，进行三级以上的发酵，通过控制不同级发酵罐内的发酵条件，满足菌株在不同时期的代谢需求，提高原料转化率和L-苯丙氨酸产量，所述三级以上的发酵是指将3个以上的发酵罐串联后进行发酵。
作为优选的是，第三步，多级连续发酵，以大肠杆菌WR1001为出发菌株，进行三级以上的发酵，通过控制不同级发酵罐内的发酵条件，满足菌株在不同时期的代谢需求，提高原料转化率和L-苯丙氨酸产量，所述三级以上的发酵是指将5-10个发酵罐串联后进行发酵。
上述多级连续发酵生产L-苯丙氨酸的方法中多级连续发酵具体包括以下方法：
步骤1，配种子培养基、初始发酵培养基、糖补料罐培养液、酪氨酸补料罐培养液和培养基补料罐培养液；
步骤2，对发酵罐、糖补料罐、培养基补料罐、酪氨酸补料罐、种子培养基、初始发酵培养基、糖补料罐培养液、酪氨酸补料罐培养液、培养基补料罐培养液以及三角烧瓶进行灭菌处理；
步骤3，取灭菌后的三角烧瓶，接入灭菌后的种子培养基，接入大肠杆菌WR1001摇床培养后作为发酵菌种；
步骤4，将灭菌后的发酵罐串联后，在各级发酵罐中接入初始发酵培养基，通入无菌空气或纯O2，再按照接种量体积比为10%向各级发酵罐中接入发酵菌种，培养6个小时，然后多级连续发酵***开始运行，通过控制通气量，使最后一级的发酵罐中的溶氧在20%，除最后一级发酵罐外的各级发酵罐中的溶氧在5-20%；控制一级发酵罐中的培养基补料罐培养液流加速率；控制各级发酵罐的补糖速率、补酪氨酸速率、发酵液流出速率、发酵液流入速率、发酵液循环速率，使得各级发酵罐中菌体的比生长速率为0.3-0.8 h-1，发酵全程pH为6.5-7.5，温度为32-37℃。
作为优选的是，步骤4，通气量为0.03-0.08L/（min·L），培养基补料罐培养液流加速率为10-40ml/h，补糖速率为10-50 ml/h，发酵液流出速率为50-150 ml/h，发酵液流入速率为50-150 ml/h，发酵液循环速率为20-50ml/h。
作为优选的是，多级连续发酵生产L-苯丙氨酸的方法中发酵过程所用糖为葡萄糖、淀粉糖化液、糖蜜或木质纤维素水解液中的一种，初始发酵培养基中糖浓度为25-50g/L。
作为优选的是，多级连续发酵生产L-苯丙氨酸的方法中的多级连续发酵中补酪氨酸速率为5-15 ml/h。
作为优选的是，多级连续发酵生产L-苯丙氨酸的方法中的多级连续发酵中pH通过体积比为50%的氨水来调节。
有益效果
本发明方法使发酵体系中维持较高的菌体浓度，缩短了细胞生长的延滞期，与分批发酵相比，底物的利用率高，目标产物量大，产率稳定，不需要反复的洗罐、灭菌、接种等操作，降低生产成本。
附图说明
图1 为L-苯丙氨酸标准品的高效液相色谱图；
图2为实施例1发酵产物的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
“多级”是依照串联发酵罐的个数确定，如四级发酵即将四个发酵罐串联后进行发酵，其中第一个发酵罐为一级发酵罐，第二个发酵罐为二级发酵罐，第三个发酵罐为三级发酵罐，第四个发酵罐为四级发酵罐。
实施例1
第一步，配种子培养基、初始发酵培养基、糖补料罐培养液、酪氨酸补料罐培养液和培养基补料罐培养液，配方如下：
种子培养基：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 0.8%，卡拉霉素硫酸盐0.004mg，pH7.0。
初始发酵培养基：6g/L trptone，3g/L Yeast extract， 3.0 g/L MgSO4· 7 H2O，0.015 g/L CaCl2 · H2O，3.0 g/L KH2PO4，1.0 g/L NaCl，5.0 g/L (NH4)2SO4，0.075g/L FeSO4 · 7 H2O，1 g/L柠檬酸钠，0.075 g/L 维生素B（过滤除菌），0.4 g/L酪氨酸，40mg/L卡拉霉素硫酸盐（过滤除菌）， 25 g/L葡萄糖（分消），1.5 ml/L TES溶液（分消）。
TES溶液： 2.0 g/L Al2(SO4)3 · 18 H2O， 0.75 g/L CoSO4· 7 H2O， 2.5 g/L CuSO4 × 5 H2O， 0.5 g/L H3BO3，24 g/L MnSO4 · H2O，3.0 g/L Na2MoO4· 2 H2O， 2.5 g/L NiSO4 × 6 H2O ，15.0 g/L ZnSO4 ·7 H2O，pH7.0。
糖补料罐培养液：600g/L葡萄糖溶液。
酪氨酸补料罐培养液：10g/L 酪氨酸溶液（灭菌后加入7.5%左右的氨水溶解）。
培养基补料罐培养液：6g/L trptone， 3g/L Yeast extract， 3.0 g/L MgSO4· 7 H2O，0.015 g/L CaCl2 · H2O，3.0 g/L KH2PO4，1.0 g/L NaCl，5.0 g/L (NH4)2SO4，0.075g/L FeSO4 · 7 H2O， 1 g/L 柠檬酸钠，0.075 g/L 维生素B（过滤除菌），1.5 ml/L TES溶液（分消）。
第二步，对发酵罐、糖补料罐、培养基补料罐、酪氨酸补料罐、种子培养基、初始发酵培养基、糖补料罐培养液、酪氨酸补料罐培养液、培养基补料罐培养液以及500ml三角烧瓶在121℃下灭菌15分钟，备用；
第三步，取灭菌后的三角烧瓶，接入50ml种子培养基，接入大肠杆菌WR1001（Escherichia coli WR1001），摇床37℃转速为200 rpm下培养10小时；
第四步，将灭菌后的发酵罐串联后，在各级发酵罐中接入初始发酵培养基，通入无菌空气，通气量为0.07 L/（min·L），再按照接种量体积比为10%向各级发酵罐中接入发酵菌种，培养6个小时，使菌体生长并消耗各级发酵罐中的初始发酵培养基，然后多级连续发酵***开始运行，培养基补料罐培养液连续流加到培养罐组的一级发酵罐，接着由一级发酵罐流入二级发酵罐，二级发酵罐流入三级罐，依次进行，控制发酵过程最后一级发酵罐中的溶氧在20%，其他各级发酵罐溶氧在5%，培养基补料罐培养液流加速率为10ml/h，发酵液流出速率50 ml/h，发酵液流入速率50 ml/h，发酵液循环速率为30 ml/h，补葡萄糖速率为10 ml/h，酪氨酸补料速率为5 ml/h，使得各级发酵罐中的菌体的比生长速率在0.3 h-1，发酵全程pH为7.0，温度为37℃，发酵120小时后取发酵产物进行高效液相色谱法检测，色谱图如图1所示，并测定含量。通过将图1与L-苯丙氨酸标准品的色谱图进行对比，验证发酵产物为L-苯丙氨酸。
实施例2
第一步至第三步同实施例1，其中，发酵过程中所用糖为淀粉糖化液。
第四步，将灭菌后的发酵罐串联后，在各级发酵罐中接入初始发酵培养基，通入无菌空气，通气量为0.07L/（min·L），再按照接种量体积比为10%向各级发酵罐中接入发酵菌种，培养6个小时使菌体生长并消耗各级发酵罐中的初始发酵培养基，然后多级连续发酵***开始运行，培养基补料罐培养液连续流加到培养罐组的一级发酵罐，接着由一级发酵罐流入二级发酵罐，二级发酵罐流入三级罐，依次进行，控制发酵过程最后一级发酵罐中的溶氧在20%，其他各级发酵罐溶氧在15%，培养基补料罐培养液流加速率为20 ml/h，发酵液流出速率150 ml/h，发酵液流入速率150 ml/h，发酵液循环速率为30 ml/h，补淀粉糖化液速率为30 ml/h，酪氨酸补料速率为10 ml/h，使得发酵罐中的菌体的比生长速率在0.8 h-1，，发酵全程pH为7.0，温度为37℃，发酵120小时后测定发酵产物的产量。
实施例3
第一步至第三步同实施例1，其中，发酵过程中所用糖为糖蜜。
第四步，将灭菌后的发酵罐串联后，在各级发酵罐中接入初始发酵培养基，通入纯O2，通气量为0.04L/（min·L），再按照接种量体积比为10%向各级发酵罐中接入发酵菌种，培养6个小时，使菌体生长并消耗各级发酵罐中的初始发酵培养基，然后多级连续发酵***开始运行，培养基补料罐培养液连续流加到培养罐组的一级发酵罐，接着由一级发酵罐流入二级发酵罐，二级发酵罐流入三级罐，依次进行，控制发酵过程最后一级发酵罐中的溶氧在20%，其他各级发酵罐中的溶氧在10%，培养基补料罐培养液流加速率为20 ml/h，发酵液流出速率100 ml/h，发酵液流入速率100 ml/h，发酵液循环速率为30 ml/h，补糖蜜速率为20 ml/h，酪氨酸补料速率为10 ml/h使得发酵罐中的菌体的比生长速率在0.6 h-1，发酵全程pH为7.0，温度为37℃，发酵120小时后测定发酵产物的产量。
实施例4
第一步至第三步同实施例1，其中，发酵过程中所用糖为淀粉糖化液。
第四步，将灭菌后的发酵罐串联后，在各级发酵罐中接入初始发酵培养基，通入无菌空气，通气量为0.08L/（min·L），再按照接种量体积比为10%向各级发酵罐中接入发酵菌种，培养6个小时，使菌体生长并消耗各级发酵罐中的初始发酵培养基，然后多级连续发酵***开始运行，培养基补料罐培养液连续流加到培养罐组的一级发酵罐，接着由一级发酵罐流入二级发酵罐，二级发酵罐流入三级罐，依次进行，控制发酵过程最后一级发酵罐中的溶氧在20%，其他各级发酵罐中的溶氧在8%，培养基补料罐培养液流加速率为10 ml/h，发酵液流出速率70 ml/h，发酵液流入速率70 ml/h，发酵液循环速率为30 ml/h，补淀粉糖化液速率为40 ml/h，使得发酵罐中的菌体的比生长速率在0.3 h-1，发酵全程pH为7.0，温度为37℃。发酵120 小时后测定发酵产物的产量。
实施例5
第一步至第三步同实施例1。
第四步，将灭菌后的发酵罐串联后，在各级发酵罐中接入初始发酵培养基，通入无菌空气，通气量为0.06L/（min·L），再按照接种量体积比为10%向各级发酵罐中接入发酵菌种，培养6个小时，使菌体生长并消耗各级发酵罐中的初始发酵培养基，然后多级连续发酵***开始运行，培养基补料罐培养液连续流加到培养罐组的一级发酵罐，接着由一级发酵罐流入二级发酵罐，二级发酵罐流入三级罐，依次进行，控制发酵过程最后一级发酵罐中的溶氧在20%，其他各级发酵罐中的溶氧在15%，培养基补料罐培养液流加速率为20 ml/h，发酵液流出速率150 ml/h，发酵液流入速率150 ml/h，发酵液循环速率为30 ml/h，补葡萄糖速率为40 ml/h，使得发酵罐中的菌体的比生长速率在0.4 h-1，发酵全程pH为7.0，温度为37℃。发酵120小时后测定发酵产物的产量。
实施例6
第一步至第三步同实施例1，其中，发酵过程中所用糖为木质纤维素水解液。
第四步，将灭菌后的发酵罐串联后，在各级发酵罐中接入初始发酵培养基，通入纯O2，通气量为0.03L/（min·L），再按照接种量体积比为10%向各级发酵罐中接入发酵菌种，培养6个小时使菌体生长并消耗各级发酵罐中的初始发酵培养基，然后多级连续发酵发酵***开始运行，培养基补料罐培养液连续流加到培养罐组的一级发酵罐， 接着由一级发酵罐流入二级发酵罐，二级发酵罐流入三级罐，依次进行，控制发酵过程最后一级发酵罐中的溶氧在20%，其他各级发酵罐中的溶氧在20%，培养基补料罐培养液流加速率为10 ml/h，发酵液流出速率150 ml/h，发酵液流入速率150 ml/h，发酵液循环速率为30 ml/h，补木质纤维素水解液速率为40 ml/h，使得发酵罐中的菌体的比生长速率在0.4 h-1，发酵全程pH为7.0，温度为37℃。发酵120 小时后测定发酵产物的产量。
对比例1
以重组大肠杆菌WSH-Z06(pAP-B03)为出发菌株，采用三阶段葡萄糖添加的方式，控制发酵初始葡萄糖糖浓度为20g/L，预设稀释率为0.4，L-苯丙氨酸的最高浓度只有48.45g/L。
对比例2
以组大肠杆菌WSH-BRl65(pAP03)为出发菌株，采用酪氨酸流加的方式，初始葡萄糖浓度为20g/L，在酪氨酸流加浓度为75mg/h时，生产周期30h，生产强度达到1.409g/h/L，最终产物最高浓度只有42.27g/L。
与现有发酵技术相比，本方法多级连续发酵生产L-苯丙氨酸，工艺简单，易操作，所得L-苯丙氨酸的产量高，产量如表1所示。
表1 不同实施例发酵产物的产量
Claims (7)
1.一种多级连续发酵生产L-苯丙氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，种子培养；
第二步，发酵培养；
第三步，多级连续发酵，以大肠杆菌WR1001为出发菌株，进行三级以上的发酵，通过控制不同级发酵罐内的发酵条件，满足菌株在不同时期的代谢需求，提高原料转化率和L-苯丙氨酸产量，所述三级以上的发酵是指将3个以上的发酵罐串联后进行发酵。
2.根据权利要求1所述多级连续发酵生产L-苯丙氨酸的方法，其特征在于：第三步，多级连续发酵，以大肠杆菌WR1001为出发菌株，进行三级以上的发酵，通过控制不同级发酵罐内的发酵条件，满足菌株在不同时期的代谢需求，提高原料转化率和L-苯丙氨酸产量，所述三级以上的发酵是指将5-10个发酵罐串联后进行发酵。
3.根据权利要求1所述多级连续发酵生产L-苯丙氨酸的方法，其特征在于，多级连续发酵具体包括以下方法：
步骤1，配种子培养基、初始发酵培养基、糖补料罐培养液、酪氨酸补料罐培养液和培养基补料罐培养液；
步骤2，对发酵罐、糖补料罐、培养基补料罐、酪氨酸补料罐、种子培养基、初始发酵培养基、糖补料罐培养液、酪氨酸补料罐培养液、培养基补料罐培养液以及三角烧瓶进行灭菌处理；
步骤3，取灭菌后的三角烧瓶，接入灭菌后的种子培养基，接入大肠杆菌WR1001摇床培养后作为发酵菌种；
步骤4，将灭菌后的发酵罐串联后，在各级发酵罐中接入初始发酵培养基，通入无菌空气或纯O2，再按照接种量体积比为10%向各级发酵罐中接入发酵菌种，培养6个小时，然后多级连续发酵***开始运行，通过控制通气量，使最后一级发酵罐中的溶氧在20%，除最后一级发酵罐外的各级发酵罐中的溶氧在5-20%；控制一级发酵罐中的培养基补料罐培养液流加速率；控制各级发酵罐的补糖速率、补酪氨酸速率、发酵液流出速率、发酵液流入速率，使得各级发酵罐中菌体的比生长速率为0.3-0.8 h-1，发酵全程pH为6.5-7.5，温度为32-37℃。
4.根据权利要求3所述多级连续发酵生产L-苯丙氨酸的方法，其特征在于：步骤4，通气量为0.03-0.08L/（min·L），培养基补料罐培养液流加速率为10-40ml/h，补糖速率为10-50 ml/h，发酵液流出速率为50-150 ml/h，发酵液流入速率为50-150 ml/h，发酵液循环速率为20-50ml/h。
5.根据权利要求3所述多级连续发酵生产L-苯丙氨酸的方法，其特征在于：发酵过程中所用糖为葡萄糖、淀粉糖化液、糖蜜或木质纤维素水解液的一种，初始发酵培养基中糖浓度为25- 50g/L。
6.根据权利要求3所述多级连续发酵生产L-苯丙氨酸的方法，其特征在于：补酪氨酸速率为5-15ml/h。
7.根据权利要求3所述多级连续发酵生产L-苯丙氨酸的方法，其特征在于：pH通过体积比为50%的氨水来调节。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410459862.0A CN104212851B (zh) | 2014-09-11 | 2014-09-11 | 一种多级连续发酵生产l-苯丙氨酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410459862.0A CN104212851B (zh) | 2014-09-11 | 2014-09-11 | 一种多级连续发酵生产l-苯丙氨酸的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104212851A true CN104212851A (zh) | 2014-12-17 |
| CN104212851B CN104212851B (zh) | 2018-05-29 |
Family
ID=52094757
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410459862.0A Active CN104212851B (zh) | 2014-09-11 | 2014-09-11 | 一种多级连续发酵生产l-苯丙氨酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104212851B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106148444A (zh) * | 2016-08-31 | 2016-11-23 | 南京工业大学 | 一种多级连续发酵产l‑赖氨酸的方法 |
| CN106967761A (zh) * | 2017-05-27 | 2017-07-21 | 新疆苏源生物工程有限公司 | L‑苯丙氨酸及其制备方法 |
| CN111187794A (zh) * | 2020-04-03 | 2020-05-22 | 杭州巴洛特生物科技有限公司 | 一种利用大肠杆菌发酵制备l-苯丙氨酸的方法 |
| CN112251476A (zh) * | 2020-09-25 | 2021-01-22 | 天津科技大学 | 一种l-苯丙氨酸的生产方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4900669A (en) * | 1984-04-30 | 1990-02-13 | Biotechnica International, Inc. | Dual-stage fermentation |
| CN101302546A (zh) * | 2008-06-06 | 2008-11-12 | 江南大学 | 连续发酵或半连续发酵生产丁二酸的方法 |
| CN103911333A (zh) * | 2014-04-16 | 2014-07-09 | 南京工业大学 | 一株产高产苯丙氨酸的菌株及其生产苯丙氨酸的方法 |
-
2014
- 2014-09-11 CN CN201410459862.0A patent/CN104212851B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4900669A (en) * | 1984-04-30 | 1990-02-13 | Biotechnica International, Inc. | Dual-stage fermentation |
| CN101302546A (zh) * | 2008-06-06 | 2008-11-12 | 江南大学 | 连续发酵或半连续发酵生产丁二酸的方法 |
| CN103911333A (zh) * | 2014-04-16 | 2014-07-09 | 南京工业大学 | 一株产高产苯丙氨酸的菌株及其生产苯丙氨酸的方法 |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106148444A (zh) * | 2016-08-31 | 2016-11-23 | 南京工业大学 | 一种多级连续发酵产l‑赖氨酸的方法 |
| CN106967761A (zh) * | 2017-05-27 | 2017-07-21 | 新疆苏源生物工程有限公司 | L‑苯丙氨酸及其制备方法 |
| CN111187794A (zh) * | 2020-04-03 | 2020-05-22 | 杭州巴洛特生物科技有限公司 | 一种利用大肠杆菌发酵制备l-苯丙氨酸的方法 |
| CN111187794B (zh) * | 2020-04-03 | 2023-06-16 | 杭州巴洛特生物科技有限公司 | 一种利用大肠杆菌发酵制备l-苯丙氨酸的方法 |
| CN112251476A (zh) * | 2020-09-25 | 2021-01-22 | 天津科技大学 | 一种l-苯丙氨酸的生产方法 |
| CN112251476B (zh) * | 2020-09-25 | 2022-11-15 | 天津科技大学 | 一种l-苯丙氨酸的生产方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104212851B (zh) | 2018-05-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11434467B2 (en) | Aspergillus niger seed continuous culture and method for producing citric acid therefrom | |
| CN102296102B (zh) | 微生物法生产葡萄糖酸盐的控制方法 | |
| CN104212851A (zh) | 一种多级连续发酵生产l-苯丙氨酸的方法 | |
| CN113321580B (zh) | 一种生产苹果酸的方法 | |
| CN102127515B (zh) | 一株高产l-脯氨酸短波单胞杆菌(jnpp-1)的筛选及应用 | |
| CN1912102A (zh) | 利用玉米浸泡水生产饲料酵母的方法 | |
| CN115181764A (zh) | 一种制备l-苏氨酸的半连续发酵方法及其糖蜜营养液 | |
| CN105189766A (zh) | 用于生产丙酸的基于水解玉米和/或甘蔗醪的发酵 | |
| CN101575579A (zh) | 一种富铁酵母及其生产方法 | |
| CN103992964A (zh) | 一种耐高ph值菌种及新型发酵法生产赖氨酸方法 | |
| CN106148444A (zh) | 一种多级连续发酵产l‑赖氨酸的方法 | |
| CN101974500A (zh) | 高纯中温α-淀粉酶的生产方法 | |
| CN112852896A (zh) | 一种l-精氨酸的发酵生产方法 | |
| CN101845475A (zh) | 一种发酵制备2-kga的营养强化培养基及其制备2-kga的方法 | |
| CN102399845A (zh) | 基于尾气中co2浓度的维生素b12发酵生产控制工艺 | |
| CN104651157A (zh) | 一种牦牛乳清低醇饮料的生产方法 | |
| CN109943604A (zh) | 一种提高谷氨酸发酵转化率和提取率的方法 | |
| CN102321700A (zh) | 一种曲酸发酵工艺及发酵设备 | |
| CN116144516B (zh) | 一株产丁二酸的酿酒酵母及其应用 | |
| CN115125177B (zh) | 一种发酵方法及发酵生产辅酶q10的方法 | |
| CN107699504A (zh) | 一种布拉酵母培养基及其制备方法 | |
| CN102732575A (zh) | 一种利用米根霉发酵生产l-乳酸的方法 | |
| CN112662609B (zh) | 一种用于提高β-丙氨酸产量的发酵培养基及应用方法 | |
| SU1117319A1 (ru) | Термотолерантный штамм дрожжей @ @ @ @ ,используемый дл сбраживани крахмалсодержащего сырь при производстве этилового спирта и способ сбраживани крахмалсодержащего сырь при производстве этилового спирта | |
| CN102443610A (zh) | 基于柠檬酸代谢网络的体积溶氧传递系数分阶段控制方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |