CN109529033A - 一种稳定的载氧微泡及其制备方法和应用 - Google Patents

一种稳定的载氧微泡及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种简单易行，高效载氧，稳定性好且粒径均匀的载氧微泡及其制备方法，以及其在放疗中的内照射和外照射增敏剂的应用，该载氧微泡包括外壳和填充气体，外壳包含磷脂以及稳定剂，填充气体包含氧气以及含氟气体。

Description

一种稳定的载氧微泡及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医学医药技术领域，具体涉及一种稳定的载氧微泡及其制备方法和应用。
背景技术
近年，我国的癌症患病率和患者死亡率正在逐年上升，严重威胁着人民身体健康。常规肿瘤治疗方法以手术、放疗和化疗为主。其中放疗(放射治疗，radiotherapy)是利用放射线***的一种局部治疗方法。约近70％的恶性肿瘤患者在治疗过程中需要用放射治疗，40％的恶性肿瘤可以用放疗根治。放疗的基本原理是利用放射性同位素产生的α、β、γ射线和各类X射线治疗机或加速器产生的x射线、电子线、质子束及其他粒子束等对水分子的电离作用，产生自由基。自由基再与生物大分子(RH)相互作用，再作用于DNA链并造成DNA链断裂。这一过程需依赖于氧气的存在。但是实体瘤内部的乏氧(也可称为缺氧)情况使肿瘤细胞易产生放射性抵抗，增加复发及转移的风险。大剂量放射线亦可对肿瘤周围血供正常的组织造成很大损伤，引起相关脏器功能异常甚至衰竭，严重降低患者生活质量，减少生存期。所以，临床实践上尝试引入辐射敏化剂。一般以一些高亲电子试剂(如肖基咪唑或硝基苯衍生物)作为敏化剂，提高肿瘤细胞对射线的敏感性。但是这些化学敏化剂同时无差别的增加了正常细胞的杀伤和其在肿瘤细胞的浓度不便于测量，且毒副作用大。国内外的学者尝试直接提高肿瘤部分的氧气浓度来提高肿瘤对放射的敏感性，比如在放射治疗时使患者吸纯氧或在高压氧仓中进行放疗。由于高浓度氧对正常组织的损伤问题尚未有精细研究，这些方法尚未推广。其他学者利用能载带大量的氧的氟碳乳剂(FC)来向肿瘤组织的乏氧区输送氧气。但是氟碳乳剂由于安全问题和其他副作用而未通过之前的临床试验。为了解决上述问题，本发明利用载氧微泡结合超声控制来向肿瘤组织的乏氧区输送氧气为肿瘤放疗增敏提高一个安全有效的方案。
微泡作为超声造影剂在临床上已经大量应用，批准上市的商品名包括 SonoVue,Optison和Definity。目前国内有大量用于超声造影剂的微泡制备的专利。比如CN200810217176公开了一种由合成磷脂、其聚二乙醇衍生物和糖脂成分为主要成分作为复合脂膜，膜内填充全氟碳气体的微泡。 CN200310122421.2公开了另外一种以磷脂成分为成膜材料的可以用作超声造影剂的微泡，该微泡由磷脂成分(1％-10％)、起泡剂(5％-15％)、聚合物 (70-90％)、稳定剂(0.5％-10％)和氟碳气体组成。另外，CN200480002975.2 公开了一种冻干基质的脂质微泡造影剂，在注射前微泡由冻干基质重建而成。另外，微泡在一定能量的超声激发下产生空化效应发生破裂。结合这一现象，微泡被大量用来作为载体来进行药物，基因，抗体等的体内运输定点释放。
利用载氧微泡来传送氧气到人体缺氧组织还处于起步阶段，一般是利用载氧微泡在因呼吸道堵塞或者肺部受伤引起的缺氧和低氧血症时向血液里供给氧气。如CN103212094A公开了一种氟氧微泡用来将氧气释放在缺氧脑组织，以实现直接、定点且高效供氧、满足神经细胞的需氧要求。而用于放疗增敏的载氧微泡在应用场景面临着新的需求。第一，载氧微泡的填充气体为氧气，和用于超声造影剂的微泡的填充气(SF6或C3F8)相比，其在水中扩散系数更高造成载氧微泡的稳定性差，难以储存，所以最好注射前能够实现简易的现场制备。其次，超声微泡等属于血池性对比剂造影剂，始终分布在血管内，直径较大，一般在1-8μm。用于血液供氧的载氧微泡粒径类似。但是用于放疗增敏的载氧微泡需要穿过血管壁到达肿瘤内部，所以要求粒径较小，其直径一般要在1μm以下。目前尚无符合以上两点要求的可用于放疗增敏的载氧微泡。
本发明公开的用于放疗增敏的载氧微泡的研究国内外尚无相关报道，这种结合超声控制和微泡供氧气的技术具有良好的应用开发前景，为临床上提供一项安全可靠和高效的放射增敏感方案。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单易行，高效载氧，稳定性好且粒径均匀的载氧微泡及其制备方法，尤其适合应用于放疗中的内照射和外照射增敏剂，克服现有的增敏剂比如肖基咪唑带来的严重副作用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种稳定的载氧微泡，包括外壳和填充气体，所述外壳包含磷脂，以及以下稳定剂中的一种或多种：二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC),二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC),二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC),二月桂酰基卵磷脂(DLPC), 1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC),1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂(POPC),二花生酰基磷脂酰胆碱(DAPC),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE),二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE),二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE),二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE),二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE),二硬脂酰磷脂酰甘油 (DSPG),二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG),二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG),二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG),二硬脂酰基磷脂酸(DSPA),二棕榈酰基磷脂酸 (DPPA),二肉豆蔻酰基磷脂酸(DMPA),二月桂酰基磷脂酸(DLPA),1,2-二棕榈酰-SN-甘油-3-磷酸钠盐(DOPA),二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸(DPPS),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-mPEG2000),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-mPEG5000),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二-叶酸(DSPE-PEG-FA),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环肽 (DSPE-PEG-cRGD)，聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物；所述填充气体包含氧气，以及以下含氟气体中的一种或多种：六氟化硫，全氟丙烷，全氟丁烷，全氟戊烷蒸汽，全氟己烷蒸汽。
进一步地，所述的载氧微泡，还包括冷冻保护剂。
优选地，所述冷冻保护剂包括下列碳水化合物中的一种或多种：葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐、可溶性淀粉、聚乙二醇、甘露醇。
优选地，所述磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。
优选地，所述填充气体为氧气和六氟化硫的混合气体，氧气与六氟化硫比例为4：1至8：1。或者，所述填充气体为氧气和全氟戊烷蒸汽的混合气体，氧气与全氟戊烷蒸汽比例为4：1至8：1。又或者，所述填充气体为氧气和全氟己烷蒸汽的混合气体，氧气与全氟己烷蒸汽比例为4：1至8：1。
优选地，所述载氧微泡为微米级微泡，平均粒径为1.0μm-4.0μm。
或者，所述载氧微泡为纳米级微泡，平均粒径为0.2μm-0.8μm。
同时提供所述的载氧微泡的一种制备方法，包括以下步骤：
a.将磷脂以及稳定剂在甘油和丙二醇水溶液里水浴加热溶解，获得磷脂溶液；其中，所述稳定剂包括二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC),二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC),二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC),二月桂酰基卵磷脂 (DLPC),1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC),1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂 (POPC),二花生酰基磷脂酰胆碱(DAPC),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE), 二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE),二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE),二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE),二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE),二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG),二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG),二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG), 二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG),二硬脂酰基磷脂酸(DSPA),二棕榈酰基磷脂酸 (DPPA),二肉豆蔻酰基磷脂酸(DMPA),二月桂酰基磷脂酸(DLPA),1,2-二棕榈酰-SN-甘油-3-磷酸钠盐(DOPA),二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸(DPPS),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-mPEG2000),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-mPEG5000),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二-叶酸 (DSPE-PEG-FA),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环肽 (DSPE-PEG-cRGD)，聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物中的一种或多种；
b.将步骤a制备的磷脂溶液密封于容器中，填充氧气及含氟气体的混合气；其中，所述含氟气体包括戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、环辛烷、环壬烷、环癸烷、全氟戊烷，全氟己烷、全氟庚烷、全氟辛烷、全氟壬烷、全氟辛烷、全氟溴辛烷、全氟-15-冠-5-醚中的一种或多种；
c.使用前，通过机械振荡获得用于放疗增敏的稳定载氧微泡。
又提供所述的载氧微泡的另一种制备方法，包括以下步骤：
a.将磷脂以及稳定剂在甘油和丙二醇水溶液里水浴加热溶解，获得磷脂溶液；其中，所述稳定剂包括二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC),二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC),二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC),二月桂酰基卵磷脂(DLPC), 1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC),1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂(POPC),二花生酰基磷脂酰胆碱(DAPC),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE),二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE),二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE),二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE),二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE),二硬脂酰磷脂酰甘油 (DSPG),二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG),二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG),二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG),二硬脂酰基磷脂酸(DSPA),二棕榈酰基磷脂酸(DPPA),二肉豆蔻酰基磷脂酸(DMPA),二月桂酰基磷脂酸(DLPA),1,2-二棕榈酰-SN-甘油-3-磷酸钠盐(DOPA),二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸(DPPS),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-mPEG2000),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-mPEG5000),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二-叶酸 (DSPE-PEG-FA),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环肽 (DSPE-PEG-cRGD)，聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物中的一种或多种；
b.将步骤a制备的磷脂溶液中加入沸点为60-160℃的不溶于水的有机溶剂，通过超声或机械破碎获得纳米或微米级的乳液；
c.将步骤b制备的乳液加入冷冻保护剂，经过冻干获得冻干基质，密封于容器中，填充氧气及含氟气体的混合气，获得用于放疗增敏的稳定载氧微泡；其中，所述含氟气体包括戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、环辛烷、环壬烷、环癸烷、全氟戊烷，全氟己烷、全氟庚烷、全氟辛烷、全氟壬烷、全氟辛烷、全氟溴辛烷、全氟-15-冠-5-醚中的一种或多种。
优选地，所述b步骤中的有机溶剂包括下列溶剂中的一种或多种：戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、环辛烷、环壬烷、环癸烷、全氟戊烷，全氟己烷、全氟庚烷、全氟辛烷、全氟壬烷、全氟辛烷、全氟溴辛烷、全氟-15- 冠-5-醚。
两种微泡制备方案可选择应用于不同场景。第一，利用冻干法制备冻干基质可重建的携氧微泡。例如，用合成磷脂和其聚乙二醇衍生物如二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC),二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)等配置磷脂溶液，加入全氟庚烷等不容于水的有机溶剂做油相。然后通过机械搅拌或超声破碎分散成乳化液。油滴的粒径同调节机械搅拌或超声破碎的参数来控制在0.3-4.0μm。乳化液分散到玻璃小瓶中并加入冷冻干燥的保护剂如聚乙二醇后冻干其中的水分和油相，随后密封加入氧气和氧气和其他气体的混合气。微泡在使用前加入生理盐水，用水轻轻振荡即可得。这种微泡为干燥粉末，存储方便，易于运输，临床使用方便，但是微泡浓度较低。该微泡可用于内照射放疗，需要少量多次注射携氧微泡进行放疗增敏。第二，载氧微泡通过磷脂溶液和机械振荡器现场制备。例如，用合成磷脂和其聚乙二醇衍生物如二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-mPEG5000)等配置磷脂溶液，然后分配到玻璃小瓶中用橡胶塞密封，然后将瓶子中的空气置换成氧气或氧气和提取含氟气体的混合气。将含有磷脂溶液的玻璃瓶子保存在 4℃冰箱保存。使用前，利用银汞胶囊调和器机械振荡60秒(4000rpm)即可获得乳白色的微泡悬浊液。该种微泡为现场制备，微泡浓度高，该微泡用于外照射放疗，可大量注射携氧微泡进行放疗增敏。
再提供所述的载氧微泡的一种应用，将其用作放射治疗中外照射增敏剂。
再提供所述的载氧微泡的另一种应用，将其用作放射治疗中碘125放射性粒子内照射增敏剂。
附图说明
图1.载氧微泡(实例5)在荷瘤小鼠体内的超声信号和微泡在高能超声作用后破碎释放氧气。(a)微泡注射前肿瘤部位的超声图像；(b)微泡注射大约2秒后肿瘤部位的超声图像，超声信号在肿瘤部位开始出现；(c)微泡注射大约15秒后肿瘤部位的超声图像，超声信号达到最强；(d)用于击破微泡高能超声(MI＝1.2)作用两分钟，肿瘤部位的超声图像。
图2.超声联合微泡作用下肿瘤部位的氧气饱和度变化。氧气饱和度指含氧血红蛋白光声信号强度和含氧/不含氧血红蛋白光声信号强度之和的比值。
图3.载氧微泡内照射增敏效果。小鼠分四组：组1：PBS对照；组2：微泡；组3：粒子和组4：粒子+微泡。(a)不同条件下各组的肿瘤生长曲线,P值:**P<0.01，(每组n＝5)。(b)十二天治疗后各组的平均肿瘤大小，P值:**P<0.01，(每组n＝5)。(c)十二天治疗后各组的苏木精 -伊红染色(H&E)和角蛋白(CK)染色的肿瘤组织切片的显微镜图像。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作下一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于这几种。
实施例1：微米级磷脂载氧微泡的冻干法制备
用分析天平量取20mg的二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC),20mg的二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG),2mg的棕榈酸和100mg的聚乙二醇4000(PEG4000)放入烧瓶中，向烧瓶中加入5mL的丙二醇，在55℃条件下水浴加热20min,然后加入35ml的10wt％甘油水溶液，在65℃条件下水浴加热20min。停止加热，上述磷脂溶液冷却至室温。然后将磷脂溶液置于冰水浴，加入3.2ml 全氟庚烷，利用高速匀浆机在13,000-17,000rpm条件下乳化上述混合液一分钟。所得的全氟庚烷乳液的平均粒径在1.0μm-4μm之间。将全氟庚烷乳液静置待恢复室温后通过离心重悬洗去过量的磷脂和其他小分子。最后分散到40ml的10wt％聚乙二醇4000水溶液，封装到玻璃小瓶中(每瓶1ml)。将玻璃小瓶置于液氮中迅速冷却，然后通过冻干机进行冻干。将含有冻干粉的小瓶用橡胶塞密封，然后将瓶中的空气抽出，重新注入氧气或配置好的混合气。使用之前需要放置一天使瓶中气体稳定。使用时，只需要通过注射器向瓶中注射4ml生理盐水，并用手轻轻振荡。
实施例2：纳米级磷脂载氧微泡冻干法制备
磷脂溶液制备方法同实施案例1，向磷脂溶液加入3.2ml全氟庚烷后，利用超声细胞破碎仪下乳化上述混合液一分钟，所得的全氟庚烷乳液的平均粒径在0.2μm-0.8μm之间。后续全氟庚烷乳液净化和冻干，以及微泡配制方法同实施案例1。
实施例3：冻干长久保存的靶向磷脂载氧微泡制备
用分析天平量取16mg的二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC),16mg的二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG),2mg的棕榈酸,4mg的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-mPEG2000),4mg的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸 (DSPE-PEG-FA)或者二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环肽 (DSPE-PEG-cRGD)和100mg的聚乙二醇4000(PEG4000)放入烧瓶，向烧瓶中加入5mL的丙二醇，在55℃条件下水浴加热20min,然后加入35ml的 10wt％甘油水溶液，在65℃条件下水浴加热20min。后续全氟庚烷乳化，所得乳液净化和冻干，以及微泡配制方法同实施案例1。
实施例4:大量制备磷脂载氧微泡制备
用分析天平量取3mg的二棕榈酰基磷脂酸(DPPA)，24mg的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，3mg的二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)，10mg的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-mPEG5000)放入烧瓶中，向烧瓶中加入5ml的丙二醇，和30ml的蒸馏水，在55℃条件下水浴加热20min,然后加入5ml的甘油和0.45g的氯化钠配置的溶液，升温至70℃加热20min。磷脂溶液冷却至室温，用1M HCl和1M NaOH调节溶液的pH至6.5。将磷脂溶液分装到玻璃小瓶(1.6ml每瓶)，然后用橡胶塞密封，然后将瓶中的空气抽出，重新注入氧气或配置好的混合气。放置到4℃冰箱保存。使用前，利用银汞胶囊调和器机械振荡60秒(4000rpm)即可获得乳白色的微泡悬浊液。
实施例5：氧气填充的载氧微泡制备
制备方法同实施案例1，将装有冻干粉末的密封玻璃瓶，重新注入氧气。使用之前需要放置一天使瓶中气体稳定。使用时，只需要通过注射器向瓶中注射4ml生理盐水，并用手轻轻振荡。
实施例6：SF6微泡制备
制备方法同实施案例1，将装有冻干粉末的密封玻璃瓶，重新注入SF6。使用之前需要放置一天使瓶中气体稳定。使用时，只需要通过注射器向瓶中注射4ml生理盐水，并用手轻轻振荡。
实施例7：O2/SF6混合气填充的载氧微泡制备
制备方法同实施案例1，将装有冻干粉末的密封玻璃瓶，重新注入氧气和SF6混合气(体积比5/1)。使用之前需要放置一天使瓶中气体稳定。使用时，只需要通过注射器向瓶中注射4ml生理盐水，并用手轻轻振荡。
实施例8：O2/全氟戊烷蒸汽混合气填充的载氧微泡制备
制备方法同实施案例1，将装有冻干粉末的密封玻璃瓶，重新注入氧气和全氟戊烷蒸汽混合气(体积比5/1)。使用之前需要放置一天使瓶中气体稳定。使用时，只需要通过注射器向瓶中注射4ml生理盐水，并用手轻轻振荡。
实施例9：O2/全氟己烷蒸汽混合气填充的载氧微泡制备
制备方法同实施案例1，将装有冻干粉末的密封玻璃瓶，重新注入氧气和全氟己烷蒸汽混合气(体积比5/1)。使用之前需要放置一天使瓶中气体稳定。使用时，只需要通过注射器向瓶中注射4ml生理盐水，并用手轻轻振荡。
实施例10：载氧微泡粒径和粒径分布的测量
现场配置的实施案例5-8微泡，取100ul加入2ml PBS溶液中，通过仪器Zetaplus(Brookhaven,UK)利用直接光散射法测量微泡的粒径。微泡的浓度通过血球计(Neubauer，Spain)测量。结果如表1所示。由表1结果表明，氧气混入一定的含氟气体会使重组的微泡粒径更小，浓度更高。含氟气体的在水中溶解度更低，微泡重建过程中更加稳定。反而，纯氧作为填充气，微泡容易在重建过程发生微泡融合，消融，所以浓度较低，平均粒径较大。
表1.不同填充气的微泡的物理参数。
实施例11：磷脂载氧微泡在裸鼠肿瘤模型的超声空化
采用10％的水合氯醛腹腔注射，100μl的实施案例6制备的载氧微泡通过鼠尾静脉注射种有鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)肿瘤的裸鼠体内。通过超声影像持续观察，结果如图1所示。注射2s后,超声信号在肿瘤部位开始出现。大概15s后，肿瘤部位超声信号达到最强时，提高超声强度至MI＝1.2，持续照射微泡大约2分钟使其破裂，释放氧气，肿瘤部位超声信号消失，表明微泡完全击破。肿瘤部分的氧气含量通过Nexus 128光声成像仪(Endra,US)测量含氧血红蛋白信号和不含氧血红蛋白信号强度来确定，结果如图2所示，超声联合载氧微泡作用可以使肿瘤部位的氧气饱和度增加3倍左右。
实施例12：磷脂载氧微泡对内照射放射治疗的增敏效果分析
人类鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)细胞CEN2种植在小鼠皮下，形成肿瘤模型，待肿瘤生长至体积160mm3。将老鼠随机分成四组，每组六只。分别标记为组1：PBS对照组，该组小鼠只每天注射100μl PBS 溶液，不做其他处理；组2：微泡，该组小鼠每天注射100μl实施案例5 载氧微泡然后超声激发，不做其他处理；组3：粒子，该组小鼠肿瘤部位植入125I粒子，不做其他处理；组4：粒子+微泡，该组小鼠肿瘤部位植入125I 粒子，该组小鼠每天注射100μl实施案例5载氧微泡然后超声激发。每天测量各组小鼠肿瘤大小，各组小鼠治疗十二天。肿瘤生长曲线和治疗十二天后小鼠的肿瘤体积如图3所示。图3.a和图3.b显示与组1(PBS对照组) 和组2(微泡)相比，组3(粒子)和组4(粒子+微泡)展现显著的肿瘤生长抑制效果。和组3只施加放射治疗相比，组4通过超声联合微泡增加肿瘤部位的氧气浓使治疗效果增加～105％。图3.c所示的各组肿瘤切片的病理分析显示和其他组相比，组4(微泡+粒子)对肿瘤细胞造成最大的杀伤。组4 显著的治疗效果的提高归因于超声作用于载氧微泡是肿瘤区域的氧气含量显著提高，增加了肿瘤乏氧区细胞对射线的放射敏感性。
综上所述，本发明已如说明书及图示内容，制成实际样品且经多次使用测试，从使用测试的效果看，可证明本发明能达到其所预期之目的，实用性价值乃无庸置疑。以上所举实施例仅用来方便举例说明本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，任何所属技术领域中具有通常知识者，若在不脱离本发明所提技术特征的范围内，利用本发明所揭示技术内容所作出局部更动或修饰的等效实施例，并且未脱离本发明的技术特征内容，均仍属于本发明技术特征的范围内。

Claims (14)

1.一种稳定的载氧微泡，包括外壳和填充气体，其特征在于：
所述外壳包含磷脂，以及以下稳定剂中的一种或多种：二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC),二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC),二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC),二月桂酰基卵磷脂(DLPC),1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC),1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂(POPC),二花生酰基磷脂酰胆碱(DAPC),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE),二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE),二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE),二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE),二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE),二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG),二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG),二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG),二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG),二硬脂酰基磷脂酸(DSPA),二棕榈酰基磷脂酸(DPPA),二肉豆蔻酰基磷脂酸(DMPA),二月桂酰基磷脂酸(DLPA),1,2-二棕榈酰-SN-甘油-3-磷酸钠盐(DOPA),二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸(DPPS),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-mPEG2000),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-mPEG5000),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二-叶酸(DSPE-PEG-FA),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环肽(DSPE-PEG-cRGD)，聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物；
所述填充气体包含氧气，以及以下含氟气体中的一种或多种：六氟化硫，全氟丙烷，全氟丁烷，全氟戊烷蒸汽，全氟己烷蒸汽。
2.如权利要求1所述的载氧微泡，其特征在于，还包括冷冻保护剂。
3.如权利要求2所述的载氧微泡，其特征在于，所述冷冻保护剂包括下列碳水化合物中的一种或多种：葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐、可溶性淀粉、聚乙二醇、甘露醇。
4.如权利要求1所述的载氧微泡，其特征在于，所述磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。
5.如权利要求1所述的载氧微泡，其特征在于，所述填充气体为氧气和六氟化硫的混合气体，氧气与六氟化硫比例为4：1至8：1。
6.如权利要求1所述的载氧微泡，其特征在于，所述填充气体为氧气和全氟戊烷蒸汽的混合气体，氧气与全氟戊烷蒸汽比例为4：1至8：1。
7.如权利要求1所述的载氧微泡，其特征在于，所述填充气体为氧气和全氟己烷蒸汽的混合气体，氧气与全氟己烷蒸汽比例为4：1至8：1。
8.如权利要求1或2所述的载氧微泡，其特征在于，所述载氧微泡为微米级微泡，平均粒径为1.0μm-4.0μm。
9.如权利要求1或2所述的载氧微泡，其特征在于，所述载氧微泡为纳米级微泡，平均粒径为0.2μm-0.8μm。
10.如权利要求1所述的载氧微泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.将磷脂以及稳定剂在甘油和丙二醇水溶液里水浴加热溶解，获得磷脂溶液；其中，所述稳定剂包括二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC),二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC),二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC),二月桂酰基卵磷脂(DLPC),1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC),1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂(POPC),二花生酰基磷脂酰胆碱(DAPC),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE),二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE),二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE),二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE),二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE),二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG),二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG),二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG),二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG),二硬脂酰基磷脂酸(DSPA),二棕榈酰基磷脂酸(DPPA),二肉豆蔻酰基磷脂酸(DMPA),二月桂酰基磷脂酸(DLPA),1,2-二棕榈酰-SN-甘油-3-磷酸钠盐(DOPA),二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸(DPPS),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-mPEG2000),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-mPEG5000),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二-叶酸(DSPE-PEG-FA),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环肽(DSPE-PEG-cRGD)，聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物中的一种或多种；
b.将步骤a制备的磷脂溶液密封于容器中，填充氧气及含氟气体的混合气；其中，所述含氟气体包括戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、环辛烷、环壬烷、环癸烷、全氟戊烷，全氟己烷、全氟庚烷、全氟辛烷、全氟壬烷、全氟辛烷、全氟溴辛烷、全氟-15-冠-5-醚中的一种或多种；
c.使用前，通过机械振荡获得用于放疗增敏的稳定载氧微泡。
11.如权利要求2所述的载氧微泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.将磷脂以及稳定剂在甘油和丙二醇水溶液里水浴加热溶解，获得磷脂溶液；其中，所述稳定剂包括二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC),二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC),二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC),二月桂酰基卵磷脂(DLPC),1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC),1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂(POPC),二花生酰基磷脂酰胆碱(DAPC),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE),二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE),二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE),二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE),二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE),二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG),二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG),二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG),二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG),二硬脂酰基磷脂酸(DSPA),二棕榈酰基磷脂酸(DPPA),二肉豆蔻酰基磷脂酸(DMPA),二月桂酰基磷脂酸(DLPA),1,2-二棕榈酰-SN-甘油-3-磷酸钠盐(DOPA),二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸(DPPS),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-mPEG2000),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-mPEG5000),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二-叶酸(DSPE-PEG-FA),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环肽(DSPE-PEG-cRGD)，聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物中的一种或多种；
b.将步骤a制备的磷脂溶液中加入沸点为60-160℃的不溶于水的有机溶剂，通过超声或机械破碎获得纳米或微米级的乳液；
c.将步骤b制备的乳液加入冷冻保护剂，经过冻干获得冻干基质，密封于容器中，填充氧气及含氟气体的混合气，获得用于放疗增敏的稳定载氧微泡；其中，所述含氟气体包括戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、环辛烷、环壬烷、环癸烷、全氟戊烷，全氟己烷、全氟庚烷、全氟辛烷、全氟壬烷、全氟辛烷、全氟溴辛烷、全氟-15-冠-5-醚中的一种或多种。
12.如权利要求11所述的载氧微泡的制备方法，其特征在于，所述b步骤中的有机溶剂包括下列溶剂中的一种或多种：戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、环辛烷、环壬烷、环癸烷、全氟戊烷，全氟己烷、全氟庚烷、全氟辛烷、全氟壬烷、全氟辛烷、全氟溴辛烷、全氟-15-冠-5-醚。
13.如权利要求1或2所述的载氧微泡，用作放射治疗中外照射增敏剂。
14.如权利要求1或2所述的载氧微泡，用作放射治疗中碘125放射性粒子内照射增敏剂。
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