CN114760989A

CN114760989A - 胰腺癌的治疗

Info

Publication number: CN114760989A
Application number: CN202080074894.2A
Authority: CN
Inventors: 佩尔·克里斯蒂安·松蒂姆; 安德鲁·约翰·希利; 斯韦恩·克沃勒
Original assignee: Precision Medical Co ltd
Current assignee: Precision Medical Co ltd
Priority date: 2019-10-25
Filing date: 2020-10-23
Publication date: 2022-07-15
Also published as: EP4048231A1; US20220378692A1; WO2021080438A1; JP2023504232A; AU2020371044A1; CA3157149A1

Abstract

本发明涉及超声介导的将治疗剂递送至胰腺，特别是用于治疗胰腺癌，例如胰腺导管腺癌(PDAC)。更具体地，本发明提供了用于递送治疗剂和用于治疗包括PDAC在内的胰腺癌的簇组合物和药物组合物。

Description

胰腺癌的治疗

技术领域

本发明涉及治疗剂超声介导递送至胰腺，特别是用于治疗胰腺癌，例如胰腺导管腺癌(PDAC)。因此，本发明提供簇组合物和药物组合物，用于递送治疗剂和治疗胰腺癌，例如PDAC。

背景技术

胰腺导管腺癌(PDAC)的五年生存率低于9％，是最致命的恶性肿瘤之一。当前的临床治疗方案包括化学疗法和/或手术(使用或不使用放射疗法)。虽然手术仍然是治愈的唯一可能，但由于PDAC的诊断往往较晚且具有侵入性，因此它很少成为一个选择。如果肿瘤在治疗后降级，从而使手术成为可能，则总体存活会显著提高，这表明肿瘤体积的重要性。众所周知，PDAC对常规和靶向治疗剂具有抗药性。尽管造成如此广泛的化学抗性的原因可能是多方面的，但一种主要机制被认为是药物渗透到肿瘤床的低速率。这种极端抗药性的主要原因之一是促***增生和血管化不良的基质，其在PDAC细胞周围形成保护屏障。因此，使用治疗剂(例如化疗)有效治疗此类实体瘤的一个主要限制是，无论是由于肿瘤间质流体压力、缺乏血管形成或灌注，还是由于存在致密的基质矩阵，都无法充分递送至目标位置。基质微环境是一个复杂的结构，由细胞外基质(ECM)、活化的成纤维细胞和肌成纤维细胞、炎症细胞以及血液和***组成，它们会扭曲胰腺组织的正常结构。肿瘤细胞和基质之间复杂的相互作用促进癌细胞运动、低氧耐性和基质新血管形成。这些物理屏障导致大多数化学治疗剂无法进入肿瘤。因此，所有化疗治疗在体内都遭受相同的命运，而增加剂量用于补偿只会加剧全身副作用。因此，用于允许增强的治疗剂递送的肿瘤的机械破坏或肿瘤血管形成可能提供更大的临床前景。因此，改进的药物输送可能会对PDAC患者的化疗治疗结果产生重大影响。

目前正在研究专门针对实体瘤治疗中靶向药物递送的治疗选项，包括纳米颗粒、分子靶向以及超声和微泡介导疗法，即声孔疗法。声孔疗法是一种研究方法，其中气体微泡被注入脉管***，并通过超声(US)刺激以引发生物力学效应，从而增加血管屏障的渗透性和药物在特定位置的外渗。微泡是稳定气泡(直径2-3μm)，其血管内注射，通常在体内稳定长达1-2分钟，没有已知的副作用。在应用超声波后，这些微泡振荡，并被认为通过各种生物力学效应与附近的内皮/血管壁细胞相互作用形成穿孔。这种相互作用可以增加药物从血管隔室的外渗、细胞内的药物吸收，并且还允许治疗剂更深入地(相比单独的血管屏障)渗透到组织中。虽然这项技术显示出前景，但由于使用了为超声成像而非治疗增强而设计和优化的市售微泡，声孔疗法的真正潜力是有限的。因此，大量研究集中在开发针对超声介导、靶向和增强治疗进行优化的“下一代”微泡。主要限制是微泡的大小。由于小，它们可以在血管隔室内发挥的生物力学效应的水平是有限的。此外，与内皮壁的物理接触是有限的，并且由于诱导的生物力学效应通常随着与血管壁的距离呈指数下降，诱导穿孔的有效性受到限制。

最近，在WO2015/047103中，提出了一种用于超声介导的靶向递送的概念，其中微泡/微滴簇组合物与治疗剂一起给药，其中靶向病理受到超声波的声波作用，这可能导致与单独的治疗剂相比治疗效果提升。这一概念被称为声簇疗法(ACT声孔疗法或ACT)，后来在一系列临床前原理证明和概念证明研究中进行了调查。例如，“S.Kotopoulis等，AcousticCluster Therapy

induces transient tumour volume reduction in asubcutaneous xenograft model of pancreatic ductal adenocarcinoma.J ControlRelease,245(2016)70-80”描述了一项临床前研究，其中ACT与紫杉醇联合用于治疗小鼠的PDAC。不幸的是，由于本研究中的一些限制，与单独药物相比，治疗效果的增加是微不足道的，肿瘤生长率仅略有下降，生存时间没有改善，也没有完全反应者。

如上所述，对于用于治疗患有胰腺癌(例如PDAC)的受试者的新的和替代的组合物和方法仍然存在显著未满足的需求。

发明内容

本发明的一个目的是提供用于治疗患有胰腺癌的受试者，特别是用于治疗胰腺导管腺癌(PDAC)的组合物和方法。基于已进行的研究和新计划的研究，申请人发现声簇治疗技术可用于治疗PDAC，与单独使用治疗剂治疗受试者相比，它特别提供了共同施用治疗剂的改善治疗效果。

现在已经确定了一种包括一种簇组合物的药物组合物，其增强了治疗剂向胰腺的递送和胰腺癌的治疗。这使用ACT技术从施用的包含微泡/微滴簇的药物组合物在体内产生大的相移气泡，并促进单独的预给药和/或共同给药和/或后给药的治疗剂的递送。与单独使用治疗剂相比，该方法显著提高了治疗效果。

在一个方面，本发明提供了一种在治疗胰腺癌的方法中使用的药物组合物，其中该药物组合物包含：

(a)簇组合物，其包含簇在水性生物相容性介质中的悬浮液，其中所述簇的平均直径在1至10μm范围内，圆度<0.9，并且包含：

(i)第一组分，其包括气体微泡和用于稳定所述微泡的第一稳定剂；和

(ii)第二组分，其包括包含油相的微滴和用于稳定所述微滴的第二稳定剂，其中所述油包含能够扩散到所述气体微泡中以至少暂时增加其尺寸的可扩散组分；

其中所述第一组分和第二组分的微泡和微滴具有相反的表面电荷并通过有吸引力的静电相互作用形成所述簇；和

(b)治疗剂，选自化疗剂和免疫治疗剂或其组合的组，作为独立于(a)的组合物提供。

本发明还提供了一种治疗患有胰腺癌的受试者的方法，包括向受试者施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包含：

附图说明

图1提供了簇大小与体内产品功效的可视化，其中Y轴示出来自超声成像的灰度增强的计算的相关系数(即活化后沉积的气泡量)，X轴以微米为单位示出簇直径。

图2提供了在实施例2和实施例3的研究中使用的设备的A)设置照片和B)设置草图，用于包括超声活化和增强的ACT声孔过程的应用。图2C提供了用于实施例2的研究的治疗计划的概述，其中评估了源自患者的异种移植小鼠模型的PDAC治疗的治疗效果。

图3提供了实施例2的研究结果，其中Y轴示出了用脂质体伊立替康(实心方块)、盐水对照(空心方块)和脂质体伊立替康与ACT组合(实心圆圈)治疗小鼠胰腺导管腺癌时作为时间的函数的肿瘤体积。X轴以天为单位示出从治疗开始的时间。在第0、7和14天进行治疗。

图4提供来自实施例2研究的结果，其中Y轴示出用白蛋白结合型紫杉醇/吉西他滨(实心方块)、盐水对照(空心方块)、在施用白蛋白结合型紫杉醇/吉西他滨之前使用ACT(空心圆圈)以及ACT之后使用白蛋白结合型紫杉醇(实心圆圈)治疗小鼠胰腺导管腺癌时作为时间的函数的肿瘤体积。X轴以天为单位示出从治疗开始的时间。在第0、7和14天进行治疗。

图5提供了在化疗方案FOLFOX(亚叶酸和奥沙利铂输注2小时，随后在2小时的时候氟二氧嘧啶(5-FU)推注，然后氟二氧嘧啶输注48小时)执行期间进行的ACT治疗的实施例的图表。面板A：每个ACT治疗包括a：注入簇组合物，然后是b：使用常规医学成像US声波作用活化簇，c：使用低频US声波作用增强。面板B：Y轴示出相对于峰值的血浆浓度。X轴示出以分钟为单位的时间。在大约50分钟、80分钟和110分钟执行三个ACT程序以涵盖所有三种药物。

图6提供了利用化疗联合方案吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇的治疗计划的实施例的图表：白蛋白结合型紫杉醇30分钟输注，然后吉西他滨30分钟输注。ACT程序在化疗执行期间应用了3次，如灰色

声孔条所示。面板A：每个ACT程序的组成为a：簇组合物的注入，b：用60秒的常规医学成像超声波声波作用活化簇；和c：使用5分钟的400至600kHz超声波声波作用的增强步骤。面板B：Y轴以峰值百分比示出施用的化学治疗剂的血浆浓度，X轴以分钟为单位示出时间。

图7提供了实施例3的研究结果，其中Y轴示出了用溶瘤呼肠孤病毒(实心三角形)、盐水对照(实心正方形)和溶瘤呼肠孤病毒联合ACT(实心圆圈)治疗小鼠肝细胞癌(HCC)时作为时间的函数的肿瘤体积。X轴示出从治疗开始的时间。X轴下方的灰色三角形表示治疗天数。

具体实施方式

定义：

如本文所用，下文进一步定义的活化簇疗法(ACT)包括联合至少一种治疗剂(化学治疗剂或免疫治疗剂)施用簇组合物(参见下文定义)，以及随后向靶向病理区域(例如肿瘤)应用超声。

如本文所用，“受试者”是指针对治疗或疗法而选择的任何人类或非人类动物个体，包括并且可以限于患者，特别是诊断为患有胰腺癌(例如PDAC)的人类患者。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指以适用于任何治疗的合理益处/风险比有效地在受试者中产生所需治疗效果的治疗剂的量。

本文中使用术语“微泡”或“常规、造影微泡”来描述直径在0.2到10微米范围内的微泡，通常平均直径在2到3微米之间。“常规、造影微泡”包括市售试剂，例如Sonazoid(GEHealthcare)、Optison(GE Healthcare)、Sonovue(Bracco Spa.)、Definity(LantheusMedical Imagin)、Micromarker(VisualSonics Inc.)和Polyson L(Miltenyi BiotecGmbH)。

在本文中使用术语HEPS/PFB微泡来描述通过用2mL水重构第一组分(如实施例1中提供的)形成的微泡。

本文中的术语“相移气泡”、“大的相移气泡”、“大的、活化的气泡”和“活化的气泡”用于描述在簇组合物的超声(US)诱导活化后形成的大(>10μm)气泡。

本文中使用术语“微滴”来描述直径在0.2至10微米范围内的乳液微滴。

“声波作用(Insonation)”或“超声波声波作用”是用于描述暴露于超声波或用超声波治疗的术语。

术语“常规医学成像超声”用于描述来自用于医学成像的现成超声扫描仪和探头的超声。即，频率在1至10MHz之间，MI<1.9，优选<0.7，更优选<0.4。

本文中使用的术语“沉积示踪剂”与活化的相移气泡有关，因为微循环中大气泡的临时机械捕获意味着组织中相移气泡的区域沉积将反映在活化气泡沉积时流过组织微循环的血液量。因此，捕获的“沉积”相移气泡的数量将线性取决于沉积时的组织灌注。

本文中使用术语“相移(过程)”来描述物质从液态到气态的相变。具体而言，在超声波声波作用下，簇组合物的微滴的油组分的状态从液体变为气体的转变(过程)。

术语“双相”是指由两个状态相组成的***，特别是液态和气态，例如簇组合物的微泡(气体)和微滴(液体)成分。

在本文中，术语“治疗递送/治疗剂”和“药物递送/药物”均被理解为包括药物分子、纳米颗粒和纳米颗粒递送***以及脂质体递送***的递送，包括至少一种治疗活性剂。

本文使用术语“第一组分”(或C1)来描述分散气体(微泡)组分。在本文中使用术语“第二组分”(或C2)来描述包含可扩散组分的分散油相(微滴)组分。

在本文中使用术语“簇组合物”来描述由第一(微泡)组分和第二(微滴)组分的组合(例如混合)产生的组合物。因此，具有如本文进一步描述的特征的簇组合物是指配制的组合物，准备好施用于受试者，并用于活化簇疗法。

本文中使用术语“可扩散组分”来描述第二组分的油相中能够在体内扩散到第一组分中的微泡中、瞬时增加其尺寸的化学组分。

本文中使用的术语“药物组合物”具有其常规含义，特别是适合哺乳动物给药的形式。该组合物优选包含两种单独的组合物；簇组合物(a)和治疗剂(b)，它们均适用于哺乳动物给药，例如通过肠胃外注射、腹膜内注射或肌肉注射，通过相同或不同的给药途径。术语“以适合哺乳动物给药的形式”是指无菌、无热原、不含产生过度毒性或副作用的化合物并且在生物相容性pH(大约pH4.0至10.5)下配制的组合物。这样的组合物进行配制，使得在与生物流体(例如血液)接触时不会出现沉淀，仅包含生物相容的赋形剂，并且优选是等渗的。

本文中的术语“声波测量(***)”是指使用声学技术动态测量和计数活化相移气泡的体外测量***。

本文中使用术语“反应性”来描述第一组分中的微泡和第二组分中的微滴在混合时形成微泡/微滴簇的能力。库尔特计数适用于量化C1和C2中的微泡和微滴浓度和尺寸分布，以及表征簇组合物(药物产品，DP)中的颗粒。簇组合物的反应性(R)定义为；

R＝(C_C1+C_C2-C_DP)·100/(C_C1+C_C2)

其中C_C1、C_C2和C_DP分别是在C1、C2和DP中观察到的数量浓度。因此，反应性是以簇形式包含在DP中的C1和C2中的单个微泡和微滴的多少的度量。反应性还与这些簇的大小相关(即多少个单独的微泡和微滴构成一个簇)。根据C1、C2和DP的库尔特分析，可以轻松计算反应性。

本文中的术语“微泡/微滴簇”或“簇”是指通过静电吸引力在单个颗粒、团聚实体中永久保持在一起的微泡和微滴的组。本文中的术语“成簇”是指第一组分中的微泡和第二组分中的微滴形成簇的过程。

在医学超声中，声功率通常用“力学指数”(MI)来描述。该参数定义为超声场中的峰值负压(PNP)(按照0.3dB/cm/MHz降低)除以单位为MHz的超声场中心频率(Fc)的平方根[American Institute of Ultrasound in Medicine.Acoustic Output MeasurementStandard for Diagnostic Ultrasound Equipment.第一版.第二版.Laurel,MD:AmericanInstitute of Ultrasound in Medicine；1998,2003]。

医学超声成像期间的监管要求是使用小于1.9的MI。在使用微泡造影剂进行超声成像期间，建议MI低于0.7，以避免有害的生物效应，例如微出血和不可逆的血管损伤，使用低于0.4的MI被认为是“最佳实践”。

在本文中，在ACT程序的上下文中，术语“活化”或“活化步骤”是指通过超声(US)声波作用诱导微泡/微滴簇的相移，即产生大的活化气泡。

术语频率定义为每秒的(超声)循环数(Hz)。当在此使用时，该术语表示所施加声场的中心频率。

在本文中，在ACT程序的上下文中，术语“增强”或“增强步骤”是指通过超声波声波作用诱导大的活化气泡的体积振荡和随后的生物力学效应。

发明详述：

本发明提供了在治疗胰腺癌、特别是治疗患有胰腺导管腺癌(PDAC)的受试者的方法中使用的簇组合物。本发明使用ACT技术在体内由包含微泡/微滴簇的施用药物组合物产生大的相移气泡，并促进单独的预给药和/或共同给药和/或后给药治疗剂的递送和吸收。由于微脉管***中的生物力学机制，治疗剂的治疗效果与单独给药相比显著增加，这将在下文进一步解释。活化的相移气泡的直径大约是典型的常规造影微气泡的10倍。

胰腺癌包括任何类型的胰腺癌症，包括PDAC、非腺癌和神经内分泌肿瘤，优选PDAC。PDAC是一种癌症形式，其中上皮肿瘤起源于胰管或胰小管的细胞，因此得名。胰管用作腺泡细胞中产生的消化酶和碳酸氢根离子到达小肠的管道。管细胞和腺泡细胞共同代表“外分泌”胰腺，绝大多数胰腺肿瘤都出现于此。腺癌被定义为上皮组织的瘤形成，即异常和过度生长。一旦确诊或高度怀疑PDAC，通常会尝试对肿瘤进行分期。这主要通过腹部的三相CT扫描来实现。美国癌症联合委员会(AJCC)胰腺癌分期的第7版遵循标准的“TNM”(肿瘤大小、***状态、转移)格式，通常用于对肿瘤进行分期和确定预后。在第0期，在胰腺内壁中发现异常细胞。这些异常细胞可能变成癌症并扩散到附近的正常组织中。0期也称为原位癌。在第一阶段，癌症已经形成并且仅在胰腺中发现。根据肿瘤的大小，I期分为IA期和IB期。IA期：肿瘤为2厘米或更小。IB期：肿瘤大于2厘米但不大于4厘米。II期分为IIA期和IIB期，取决于肿瘤的大小和癌症扩散的位置。IIA期：肿瘤大于4厘米。IIB期：肿瘤任意大小，癌症已扩散到附近的1到3个***。在III期，肿瘤任意大小，癌症已扩散到附近的四个或更多***；或胰腺附近的主要血管。在IV期，肿瘤任意大小，癌症已经扩散到身体的其他部位，例如肝脏、肺或腹腔(包含腹部大部分器官的体腔)。复发性胰腺癌是在治疗后复发的癌症。癌症可能会在胰腺或身体的其他部位归来。

本发明的供使用的组合物和治疗方法可用于PDAC的所有阶段，并且可用于治疗0、I、II、III或IV期中的一期或多期。在一个实施方式中，根据本发明的药物组合物用于在0、I、II或IV期中的任一期治疗PDAC。在一个实施方式中，该药物组合物用于治疗早期的PDAC，例如用于治疗0、I或II期的PDAC。

本发明提供包含簇组合物的药物组合物，用于将治疗剂递送至胰腺和治疗胰腺癌的方法中，其中该方法包括相移技术以在体内从施用的簇组合物产生大的相移气泡，并且其促进单独施用的治疗剂的递送和吸收。与不使用本发明组合物的治疗相比，本发明的供使用的组合物和方法增强了单独共同施用的治疗剂的治疗效果，提供了改善的治疗结果。

声簇疗法(ACT)是一种新技术，它利用微泡，更具体地利用通过应用超声波活化的微泡/微滴簇，在肿瘤脉管***中产生局部开口或穿孔，导致血管渗透性的短暂增加，从而让药物更好地穿透肿瘤床。本发明部分基于来自临床前研究的发现，其中申请人研究了ACT增强用于PDAC的在患者来源的异种移植(PDX)小鼠模型中临床使用的化疗方案的治疗效果的活性。申请人发现ACT概念是克服生物屏障以提高治疗剂吸收的有效方式。已发现这对胰腺癌、特别是PDAC的治疗特别有益，因为药物渗透到肿瘤床的速率通常较低，这是由于促***增生和血管化不良的基质在PDAC细胞周围形成保护性屏障。即使Kotopoulis等简要提及了ACT治疗III期PDAC的潜在用途，它没有建议如何实施这种用途，它没有指出这种疾病可能需要的非常具体的治疗益处(如本文的实施例所示)，使用ACT来克服基质***增生，也没有建议治疗疾病的早期或晚期。此外，Kotopoulis等仅指向一种特定的小分子药物，并未教导具有可替代的更大分子/构建治疗剂(例如药物的脂质体制剂)的ACT概念的使用或免疫治疗剂(例如溶瘤病毒或检查点抑制剂)的使用。

当提及用于本发明的ACT技术时，除了单独施用治疗剂之外，这包括施用如下文进一步解释的预混合簇组合物。治疗剂根据护理标准(即根据各自的产品特性总结(SmPC))给药。在本发明的一个实施方式中，这包括在施用于受试者之前使用将带负电荷的微泡与带正电荷的微滴结合的簇制剂。所施用的簇可以通过超声波活化。这些微泡和微滴的混合物导致小微泡-微滴簇通过静电力保持在一起。微滴通常包含沸点<50℃并具有低血液溶解度的油成分。簇组合物，即分散体，旨在与药物(即治疗剂)一起施用。当簇组合物的簇受到超声波的声波作用时，振荡的微泡引发附着的微滴的瞬间汽化(相移)。扩大的所得气泡已显示在体内在毛细管大小的管中形成，并且可以被低频US激发以诱导生物力学效应，从而促进外渗并增加药物在受声波作用的组织中的渗透。

因此，根据本发明，通过使用双组分的双相微泡/微滴制剂***(即簇组合物)来实现将药物递送到胰腺和治疗胰腺癌，其中微泡在第一组分中，通过静电引力，在给药前与第二组分中的微米级乳液微滴物理连接。根据本发明，在治疗PDAC的方法中使用的组合物提供改善的治疗剂吸收，从而产生有益的治疗，包括例如肿瘤体积减少。

在给药前将第一组分与第二组分混合是有效形成微泡/微滴簇并且簇组合物在环境条件下可以稳定的先决条件。簇很容易在体内用低功率、常规医学成像超声活化，即所述超声的MI小于1.9，优选小于0.7，最优选小于0.4，这会诱导可扩散组分的液-气转变(相移)。治疗剂，即化学治疗剂或免疫治疗剂或它们的组合，根据其批准的SmPC分开施用。大的活化气泡暂时嵌入受声波作用组织的微脉管***中，并通过进一步应用低功率低频超声促进药物吸收到胰腺靶组织。活化的相移气泡的直径大约是典型微泡的10倍，从而导致：

-活化气泡在目标(即，受声波作用的)病理的微脉管***中的瞬时沉积/捕获；

-活化气泡与内皮紧密接触；

-与常规造影微泡相比，活化后超声治疗期间的生物力学效应的数量级更大，避免了惯性空化机制。

簇组合物，即第一组分和第二组分的组合，包含气体微泡和油微滴的簇，即是稳定的微泡/微滴簇形式的单独的微泡和微滴的悬浮液或分散体。用于定量检测和表征所述簇的分析方法在实施例1中进行了描述。在本文中，术语“簇”是指在单个粒子、团聚实体中通过静电吸引力永久保持在一起的微泡和微滴的组。在体外组合第一组分和第二组分后，簇组合物中簇的含量和大小在一段时间内(例如>1小时)基本稳定，即它们不会自发分解、形成更大的聚集体或自发活化(相移)，并且在稀释后的一段时间内基本稳定，即使在持续搅拌期间也是如此。因此，可以使用需要稀释和/或搅拌的各种分析技术来检测和表征簇组合物中的簇。此外，簇组合物的稳定性允许执行必要的临床程序(例如，重构、剂量停止和给药)。第一组分和第二组分以及簇组合物是根据良好生产规范(GMP)制备的。

例如通过用乳液形式的微滴组分重构冻干的微泡组分将两种成分结合后(体外)，根据本发明制备的簇组合物显示出适用于其预期用途的使用稳定性，并且在合适的给药时间窗口内(例如从组合组分开始超过1小时或优选超过3小时)显示出稳定的特性。簇组合物将在该时间窗口内施用于受试者。

簇组合物中的每个簇包含至少一个微泡和一个微滴，通常为2-20个单独的微泡/微滴，并且簇的平均直径通常在1至10μm的范围内，因此簇可以在脉管***中自由流动。它们通过圆度参数进一步表征并与单个微泡和微滴分离。二维形状的圆度(例如微泡、微滴或微泡/微滴簇的投影)是与形状具有相同面积的圆的周长除以形状的实际周长的比率。因此，正圆(即球形微泡或微滴的二维投影)具有1的理论圆度值，而任何其他几何形式(例如簇的投影)的圆度小于1。本发明所述簇的圆度<0.9。在WO2015/047103中进一步提供了圆度参数的定义。

根据本发明，被认为是特别有用的组合物包含的簇的平均尺寸在1-10μm的范围内，特别是3-10μm范围内，并且由<0.9的圆度定义，如实施例中所证明的。在一个实施方式中，平均簇直径在3-10μm的范围内，优选4-9μm，更优选5-7μm。这种大小范围内的簇在活化之前在脉管***中自由流动，它们很容易通过超声波声波作用而活化，并且它们产生活化气泡，这些活化气泡足够大以在微脉管***中(例如在胰腺组织或胰腺癌组织中)暂时沉积和停留。簇中的微泡允许超声能量在诊断频率范围(1-10MHz)内(即在活化时)的有效能量转移，允许乳液微滴在低MI(低于1.9，优选低于0.7，更优选低于0.4，但大于0.1)下汽化(相移)，并允许汽化的液体扩散到微泡中和/或允许蒸汽泡和微泡之间的融合。然后，活化的气泡从基质气体(例如血液气体)的向内扩散进一步扩大，以达到大于10μm但小于40μm的体积加权中值直径。

这些簇的形成，即通过在给药前从第一组分和第二组分制备簇组合物，是有效相移事件的先决条件，并且它们的数量和尺寸特征与组合物的功效(即它在体内形成大的、活化的(即相移的)气泡的能力)密切相关，并且已被发现是其体内预期功能的先决条件。可以通过各种配方参数控制数量和尺寸特性，例如但不限于，第一组分中的微泡和第二组分中的微滴之间的吸引力强度(例如微泡和微滴之间的表面电荷差异)：微泡和微滴的尺寸分布：微泡和微滴之间的比率：以及水性基质的组成(例如pH值、缓冲液浓度、离子强度)。当已制备簇组合物并将其给药时，形成的簇的平均等效圆直径应优选大于3μm，更优选在5至7μm之间，但小于10μm。组合制剂(簇组合物)中3至10μm之间的簇的浓度应优选大于1000万/mL，更优选大于2000万/mL。如实施例1所示，根据本发明的供使用的簇组合物具有4000-4400万/mL的簇浓度，在混合第一组分和第二组分0-3小时后测量的平均直径为5.8-6.2μm。在一个实施方式中，基于申请人的WO2015/047103的表5和表6中所示的结果，用于给药的组合物应包含至少60万/ml的直径在5-10μm之间的簇。在另一个实施方式中，大小范围为1-10μm的簇的簇浓度应至少约为2500万/ml。

可通过改变第一组分和第二组分的不同配方参数和所制备的簇的尺寸特征来设计活化气泡的尺寸(体内)(参见实施例1)。在给药后，通过在成像控制下施加例如来自临床超声成像***的外部超声能量，所述簇被活化以产生大气泡。产生的大相移气泡的直径通常为10μm或更大。完全在诊断成像暴露限制(MI<1.9)内的低MI能级足以活化簇，使该技术与其他可用的相变技术(例如声学微滴汽化(ADV))显著不同。由于活化气泡的尺寸很大，它们会暂时停留在微脉管***中，并且通过用于活化簇的超声能量的空间定位应用，它们可以在空间上定位在感兴趣的组织或器官中，例如胰腺，或者更优选地，胰腺中的癌组织(例如肿瘤)。因此，在施用簇组合物后，通过向腹部和胰腺部位施加超声能量，簇在胰腺内、胰腺处或胰腺附近被活化。产生的大型活化气泡(直径10μm或更大)在低超声频率(1MHz或更小)下具有声学共振。

应当理解，对于本发明的供使用的组合物和方法，大活化气泡通过应用低频超声而进一步受声波作用，这进一步增强了治疗剂的吸收。因此，已经发现，接近大的活化气泡的共振频率的低频超声的应用可用于产生机械和/或热生物效应机制，以增加脉管***的渗透性和/或胰腺癌组织的声孔效应和/或内吞作用，从而增加治疗剂向目标组织的递送和停留。因此，频率分量在0.05到2MHz范围内，优选在0.1到1.5MHz范围内，更优选在0.1到1.0MHz范围内，甚至更优选在0.2到1MHz范围内，最优选在0.4至0.6MHz，例如特别是0.33至0.65MHz，用于进一步的声波作用以增强吸收。令人惊讶的是，当活化的气泡通过应用超声波(例如在0.4到0.6MHz的范围内，例如实施例中使用的500Hz)受到声波作用以诱导增强的吸收时，已经发现了更大的治疗益处。因此，由于基质的***形成的问题得到了解决。已经发现超声引导允许治疗剂更好地穿透胰腺的肿瘤床。该增强步骤的MI优选低于0.5，更优选低于0.4，最优选低于0.3但高于0.15，优选高于0.2。如果在增强步骤期间应用的MI低于0.2，则预计产生的生物力学效应将不足，因此会显著降低治疗益处。

应当理解，虽然直接作用机制，即产生的机械和/或热生物效应增加了治疗剂的递送并增强分布，但这些生物力学效应的性质是簇组合物的化学属性的直接结果，即簇的化学组成和性质的结果。例如，气泡在含水基质中的寿命与基质中气体的溶解度和扩散系数成反比，与气体的密度成正比。因此，由具有低溶解度和扩散率的重气体制成的气泡将比由具有高溶解度和扩散率的轻气体制成的气泡更大并且持续时间更长。例如，全氟丁烷的5μm微泡在水中的持续时间是空气的5μm微泡的500倍。因此，微滴组分的化学组成将决定活化气泡在体内的寿命，从而决定可诱导的生物力学力的水平以及通过ACT程序可实现的治疗效果水平。由此，全氟油将特别适用于第二组分的微滴，因为来自其中的气体的水溶性和扩散率非常低，并且密度高。

如果将本发明的组合物和方法与其中使用自由流动、常规造影微泡的方法进行比较，则由本发明的施用的簇在体内产生的大相移微泡被截留在血管的一部分内，且活化的气泡表面与内皮紧密接触。此外，活化气泡的体积通常是常规微泡的1000倍。在相同的力学指数(MI)下，对于两种气泡类型(相移微泡为0.5MHz，常规造影剂微泡为3MHz)以接近共振的频率进行声波作用，已经表明，在振荡过程中的绝对体积位移(即施加的生物力学力)，相移气泡比常规造影微泡大三个数量级。因此，相移气泡的声波作用将产生完全不同水平的生物力学效应，其效应大小和穿透深度明显大于常规造影微泡的声波作用。用自由流动、常规造影微泡观察到的生物效应可能取决于空化机制，随之而来的安全问题是微出血和不可逆的血管损伤。然而，来自簇的较大相移气泡可以以更柔和的方式振荡(较低的MI，例如<0.4)，避免了空化机制，但仍会产生足够的机械力来增强药物从脉管***吸收并进入胰腺靶组织。大相移气泡的捕获也将充当沉积示踪剂。这进一步允许对活化的簇的数量和组织的灌注进行量化，并允许组织脉管***的造影剂成像，以识别要治疗的病理的空间范围。

所施用的簇的化学组成以及簇活化过程中发生的过程，对于簇的效果至关重要。例如，封装油滴的化学会影响在超声声波作用下沉积的活化气泡的数量以及它们在体内的寿命。油的物理化学属性，例如蒸气压、沸点和水溶性都与沉积的活化气泡的数量和它们保持沉积的时间相关。对于C4-C6同系物全氟烃链，活化气泡的数量和它们的寿命随着链的长度而增加，因为水溶性和蒸气压降低，沸点升高。此外，应注意，簇的大活化气泡机械地作用于脉管***的细胞，可能产生生化信号，导致治疗剂的吸收增加。

簇组合物被设计成以受控方式进行聚集和相移。当在靶向胰腺病理处暴露于超声波时(例如标准医学成像频率和强度)，所施用的簇组合物的微泡将声能传递给附着的油微滴，并且可以充当蒸发核，或与微泡合并，从而使油经历液相到气相的相移(汽化)。产生的气泡由于油的汽化而经历最初的快速膨胀，随后由于血液气体的向内扩散而缓慢膨胀，并暂时阻塞微循环(后小动脉和毛细血管网络)约1分钟或更长时间，优选2-3分钟或更长时间，最优选3-6分钟或更长时间。在本发明的方法或供使用的药物组合物中，进一步向受试者施用一种治疗剂，例如与簇组合物共同施用或预施用或后施用。通过施加外部超声能量，这些簇被活化以产生大气泡，这些被困在肿瘤的微脉管***中(例如在胰腺中)。在捕获后进一步应用低频超声有助于治疗剂外渗到胰腺的靶组织。因此，现有技术在有效治疗胰腺实体瘤方面的主要限制是，由于肿瘤间质液压力、缺乏血管形成或灌注、或存在致密的基质矩阵，无法充分递送到目标位置，这可以通过本发明的技术克服，因为已经发现治疗剂对肿瘤的可及性显著增加。

簇组合物的第一组分：

第一组分包括气体微泡和稳定微泡的第一稳定剂。因此，第一组分是可注射的水性介质，包括分散的气体和稳定气体的材料。微泡可能类似于市场上的常规超声造影剂，这些造影剂已获准用于多种临床应用，例如Sonazoid、Optison、Definity或Sonovue，或用于临床前应用的类似试剂，例如Micromarker和Polyson L。生物相容性气体可以存在于气体分散体中，如本文所用的术语“气体”包括在37℃的正常人体温度下至少部分(例如大部分)或完全以气态(包括蒸气)形式存在的任何物质(包括混合物)。例如，气体可以包括：空气；氮；氧；二氧化碳；氢；惰性气体，例如氦气、氩气、氙气或氪气；氟化硫，例如六氟化硫、十氟化二硫或五氟化三氟甲基硫；六氟化硒；任选卤化的硅烷，例如甲基硅烷或二甲基硅烷；低分子量烃(例如含有最多7个碳原子)，例如，烷烃如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷或戊烷，环烷烃如环丙烷、环丁烷或环戊烷，烯烃如乙烯，丙烯、丙二烯或丁烯，或炔烃如乙炔或丙炔；醚如二甲醚；酮；酯；卤代低分子量烃(例如，最多含有7个碳原子)；或上述任意的混合物。优选地，气体是卤化气体，更优选地是全氟化气体。有利地，卤代气体中的至少一些卤素原子是氟原子；因此，生物相容的卤代烃气体可以例如选自溴氯二氟甲烷、氯二氟甲烷、二氯二氟甲烷、溴三氟甲烷、氯三氟甲烷、氯五氟乙烷、二氯四氟乙烷、氯三氟乙烯、氟乙烯、乙基氟、1,1-二氟乙烷和全氟化碳。代表性的全氟化碳包括全氟烷烃，例如全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷(例如全氟正丁烷，任选与其他异构体例如全氟异丁烷混合)、全氟戊烷、全氟己烷或全氟庚烷；全氟烯烃，例如全氟丙烯、全氟丁烯(例如全氟丁-2-烯)、全氟丁二烯、全氟戊烯(例如全氟戊-1-烯)或全氟-4-甲基戊-2-烯；全氟炔烃，例如全氟丁-2-炔；以及全氟环烷烃，例如全氟环丁烷、全氟甲基环丁烷、全氟二甲基环丁烷、全氟三甲基-环丁烷、全氟环戊烷、全氟甲基-环戊烷、全氟二甲基-环戊烷、全氟环己烷、全氟甲基环己烷或全氟环庚烷。其他卤化气体包括氯甲烷、氟化(例如全氟化)酮(例如全氟丙酮)和氟化(例如全氟化)醚(例如全氟二***)。

考虑到公认的含有此类气体的微泡在血流中的高稳定性，特别有利的是使用全氟化气体，例如六氟化硫和全氟化碳(例如全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷和全氟己烷)。在一个实施方式中，第一组分的气体选自氟化硫和卤代低分子量烃(例如，最多含有7个碳原子)。具有使它们在血流中形成高度稳定的微泡的物理化学特性的其他气体同样可能是有用的。最优选地，分散气体包括六氟化硫、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷(即C3-6全氟化碳)、氮气、空气或它们的混合物。甚至更优选地，分散气体包含六氟化硫、全氟丙烷或全氟丁烷，或它们的混合物。甚至更优选地，分散气体是全氟丁烷。

分散的气体可以是任何方便的形式，例如使用任何合适的含气超声造影剂制剂作为含气组分，例如Sonazoid、Optison、Sonovue或Definity，或临床前试剂，例如Micromarker或PolySon L。第一组分还将包含用于稳定微泡分散体的材料，在本文中称为“第一稳定剂”。此类制剂的代表性实例包括气体微泡，其由第一稳定剂稳定(例如至少部分包封)，第一稳定剂如抗聚结表面膜(例如明胶)、成膜蛋白(例如白蛋白如人血清白蛋白)、聚合物材料(例如合成的可生物降解聚合物、弹性界面合成聚合物膜、微粒可生物降解聚醛、聚氨基酸的微粒N-二羧酸衍生物-多环酰亚胺)、非聚合且不可聚合的成壁材料或表面活性剂(例如聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂如Pluronic、聚合物表面活性剂或成膜表面活性剂如磷脂)。优选地，分散气体为磷脂、蛋白质或聚合物稳定的气体微泡的形式。因此，在一个实施方式中，第一稳定剂选自磷脂、蛋白质和聚合物的组。特别有用的第一稳定剂选自表面活性剂组，该组包括包含具有净总负电荷的分子的磷脂，例如天然存在的(例如大豆或蛋黄衍生的)、半合成的(例如部分或完全氢化的)和合成的磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸和/或心磷脂。或者，用于稳定化的磷脂可以带有整体中性的电荷并添加负表面活性剂，例如脂肪酸，例如磷脂酰胆碱加棕榈酸，或者是不同电荷磷脂的混合物，例如磷脂酰乙醇胺和/或磷脂酰胆碱和/或磷脂酸。对于第一稳定剂，即稳定第一组分的微泡，WO2015/047103的实施例5以及表9和10中展示了不同的实施例，其中已经测试了具有不同赋形剂的各种微泡制剂。结果表明，本发明中使用的ACT概念适用于多种微泡制剂，也适用于稳定膜的组成。

分散气体组分的微泡尺寸应优选小于7μm，更优选小于5μm，最优选小于3μm，以促进无阻碍地通过肺***，即使在微泡/微滴簇中时也是如此。

簇组合物的第二组分：

第二组分包括含有油相的微滴和稳定所述微滴的第二稳定剂，其中油包括可扩散组分。该可扩散组分能够扩散到第一组分的气体微泡中，从而至少暂时增大其尺寸。对于第二组分，“可扩散组分”合适地是气体/蒸汽、挥发性液体、挥发性固体或其能够例如在给药时产生气体的前体，主要要求是该组分应具有或能够在体内产生足够的气体或蒸气压(例如，至少50托，优选大于100托)，以便能够促进气体或蒸气分子向内扩散进入分散的气体。“可扩散组分”优选配制成微滴在适当的水性介质中的乳液(即稳定的悬浮液)，因为在这样的***中，可扩散组分的水相中的蒸气压将基本上等于纯组分材料的蒸气压，即使在非常稀的乳液中。

这种微滴中的可扩散组分在加工和储存温度下有利地为液体(如果水相包含适当的防冻材料，该加工和储存温度可以例如低至-10℃)，同时在体温下为气体或表现出显著的蒸气压。例如，合适的化合物可以选自专利申请WO-A-9416379或WO2015/047103中给出的可乳化低沸点液体的各种列表，其内容通过引用并入本文。可乳化的可扩散组分的具体实施例包括：脂肪族醚如***；多环油或醇，例如薄荷醇、樟脑或桉油精；杂环化合物，例如呋喃或二氧六环；脂肪烃，可以是饱和的或不饱和的、直链或支链的，例如如正丁烷、正戊烷、2-甲基丙烷、2-甲基丁烷、2,2-二甲基丙烷、2,2-二甲基丁烷、2,3-二甲基丁烷、1-丁烯、2-丁烯、2-甲基丙烯、1,2-丁二烯、1,3-丁二烯、2-甲基-1-丁烯、2-甲基-2-丁烯、异戊二烯、1-戊烯、1,3-戊二烯、1,4-戊二烯、丁烯、1-丁炔、2-丁炔或1,3-丁二炔；脂环族烃，例如环丁烷、环丁烯、甲基环丙烷或环戊烷；以及卤代低分子量碳氢化合物，例如最多含有7个碳原子。代表性的卤代烃包括二氯甲烷、溴甲烷、1,2-二氯乙烯、1,1-二氯乙烷、1-溴乙烯、1-氯乙烯、溴乙烷、氯乙烷、1-氯丙烯、3-氯丙烯、1-氯丙烷、2-氯丙烷和叔丁基氯。有利地，至少一些卤素原子是氟原子，例如二氯氟甲烷、三氯氟甲烷、1,2-二氯-1,2-二氟乙烷、1,2-二氯-1,1,2,2-四氟乙烷、1,1,2-三氯-1,2,2-三氟乙烷、2-溴-2-氯-1,1,1-三氟乙烷、2-氯-1,1,2-三氟乙基二氟甲醚、1-氯-2,2,2-三氟乙基二氟甲醚，部分氟化的烷烃(例如五氟丙烷如1H,1H,3H-五氟丙烷、六氟丁烷、九氟丁烷如2H-九氟叔丁烷和十氟戊烷如2H,3H-十氟戊烷)，部分氟化烯烃(例如七氟戊烯，例如1H,1H,2H-七氟戊-1-烯，九氟己烯，例如1H,1H,2H-九氟己-1-烯)，氟化醚(例如2,2,3,3,3-五氟丙基甲基醚或2,2,3,3,3-五氟丙基二氟甲基醚)，更优选全氟化碳。全氟化碳的实施例包括：全氟烷烃，例如全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷(例如全氟-2-甲基戊烷)、全氟庚烷、全氟辛烷、全氟壬烷、全氟癸烷；全氟环烷烃，例如全氟环丁烷、全氟二甲基环丁烷、全氟环戊烷和全氟甲基环戊烷；全氟烯烃，例如全氟丁烯(例如全氟丁-2-烯或全氟丁-1,3-二烯)、全氟戊烯(例如全氟戊-1-烯)和全氟己烯(例如全氟-2-甲基戊-2-烯或全氟-4-甲基戊-2-烯)；全氟环烯烃，例如全氟环戊烯或全氟环戊二烯；以及全氟醇，例如全氟叔丁醇。因此，第二组分的油(可扩散组分)可以选自脂肪醚、杂环化合物、脂肪烃、卤代低分子量烃和全氟化碳。在一个实施方式中，第二组分的油相包含全氟化碳。

在本发明中特别有用的是水溶性低于1·10^-4M、更优选低于1·10^-5M的可扩散组分。然而，应当注意，如果使用可扩散组分和/或共溶剂的混合物，则混合物的大部分可能包含具有较高水溶性的化合物。基于水溶性，合适的油(可扩散组分)的实施例是：全氟二甲基环丁烷、全氟甲基环戊烷、2-(三氟甲基)全氟戊烷和全氟己烷。

可以理解，如果需要，根据本发明可以使用两种或更多种可扩散组分的混合物；本文提及的“可扩散组分”应解释为包括此类混合物。

第二组分也将包含用于稳定微滴分散体的材料，在本文中称为“第二稳定剂”。第二稳定剂可以与用于稳定气体分散体的任何材料相同或不同，例如，表面活性剂，例如磷脂、聚合物或蛋白质。任何此类材料的性质可能会显著影响多种因素，诸如分散气相的生长速率。通常，多种表面活性剂可用作稳定剂，例如选自EP-A-0727225中给出的广泛列表，其内容通过引用并入本文。有用的表面活性剂的代表性实施例包括脂肪酸(例如直链饱和或不饱和脂肪酸，例如含有10-20个碳原子)及其碳水化合物和甘油三酯、磷脂(例如卵磷脂)、含氟磷脂、蛋白质(例如白蛋白，如人血清白蛋白)、聚乙二醇和聚合物例如嵌段共聚物表面活性剂(例如聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，例如Pluronics，延伸聚合物例如酰氧基酰基聚乙二醇，例如聚乙二醇甲基醚16-十六烷酰氧基-十六烷酸酯，例如其中聚乙二醇部分具有2300、5000或10000的分子量)和含氟表面活性剂(例如，以商品名Zonyl和Fluorad销售，或如WO-A-9639197(其内容通过引用并入本文)中所述)。特别有用的表面活性剂包括磷脂，尤其是包含具有总体中性电荷的分子的磷脂，例如，二硬脂酰-sn-甘油-胆碱磷酸(DSPC)。对于第二组分，可以使用一系列不同的稳定剂来稳定微滴。此外，为了促进合适的表面电荷，可以使用宽范围的离子物质，优选阳离子物质。

应当理解，为了促进有吸引力的静电相互作用以实现第一组分中的微泡和第二组分中的乳液微滴之间的聚集，它们应该具有相反的表面电荷。因此，如果第一组分的微泡带负电，则第二组分的微滴应该带正电，反之亦然。在一个优选实施方式中，第一组分的微泡的表面电荷为负，第二组分的微滴的表面电荷为正。为了促进油微滴的合适表面电荷，可以将阳离子表面活性剂添加到稳定结构中。可以使用范围广泛的阳离子物质，例如至少有些疏水和/或基本上不溶于水的具有碱性氮原子的化合物，例如伯胺、仲胺或叔胺和生物碱。特别有用的阳离子表面活性剂是硬脂胺。在一个实施方式中，第二稳定剂是添加有阳离子表面活性剂的中性磷脂，例如具有硬脂胺的DSPC膜。

在一个实施方式中，第一稳定剂和第二稳定剂各自独立地包含磷脂、蛋白质、聚合物、聚乙二醇、脂肪酸、带正电荷的表面活性剂、带负电荷的表面活性剂或其混合物。

在一个实施方式中，第一组分包含选自六氟化硫、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷、氮气和空气或其混合物的组的分散气体，其由选自磷脂、蛋白质和聚合物的组的第一稳定剂稳定；第二组分包括选自全氟化碳(例如全氟环烷烃)的组的可扩散组分，用选自例如包括磷脂、聚合物和蛋白质的表面活性剂的组的第二稳定剂稳定。更具体地，任一种稳定剂均选自磷脂。

第一组分和第二组分在预期使用之前不久组合，以制备簇组合物，并在适当的时间窗口中使用。还应当理解，第一组分和第二组分的混合可以根据组分的形式以各种方式实现；例如混合两种流体组分，将一种干粉形式的组分与一种流体形式的组分重构，在与流体(例如注射用水或缓冲溶液)重构之前将两种干燥形式的组分混合。此外，应当理解，其他组分可能会影响微泡和微滴在混合时形成簇的能力，包括但不限于：微泡/微滴的表面电荷水平，两种组分中微泡/微滴的浓度，微泡/微滴的大小，液体基质的组成和离子浓度，pH，赋形剂(例如缓冲剂或张力组分)的组成和浓度等(参见WO2015/047103，实施例1)。组分的这些特性和组成也可能影响所生成簇的大小和稳定性(体外和体内)，并且可能是影响生物学属性(例如功效和安全性)的重要因素。还应了解，簇组合物中并非所有微泡/微滴都可以簇形式存在，但大部分微泡和/或微滴可以以游离(非聚集)形式与许多微泡/微滴簇共存。此外，这两种组分的混合方式可能会影响这些方面，包括但不限于；均质化过程中施加的剪切应力(例如软手动均质化或强机械均质化)和均质化时间范围。簇组合物将在组合两种组分后簇的特性基本不变的时间窗口内(例如在5小时内，例如在3小时内)施用于受试者。申请人的使用稳定性研究表明，该簇显示至少3小时的稳定特性，请参见实施例1。

用于静脉注射的乳液中分散的可扩散组分的微滴尺寸应优选小于7μm，更优选小于5μm，最优选小于3μm，并且大于0.5μm，更优选大于1μm，以便以促进畅通无阻地通过肺***，但仍保留足够的体积以将活化的气泡保留在微脉管***中。

例如，分散的气相在体内的生长可能伴随着任何封装材料的膨胀(如果它具有足够的柔韧性)和/或将过量的表面活性剂从施用的材料中提取到生长的气-液界面。然而，也有可能的是，封装材料的拉伸和/或材料与超声波的相互作用可以显著增加其孔隙率。尽管迄今为止在许多情况下发现封装材料的这种破坏通过由此暴露的气体的向外扩散和溶解导致回声反射性的快速丧失，但我们发现当使用根据本发明的组合物时，暴露的气体表现得非常稳定。虽然不希望受理论计算的束缚，但我们相信暴露的气体(例如以释放的微泡的形式)可以稳定，例如通过由可扩散组分产生的过饱和环境来对抗微泡的坍塌，这提供了向内的压力梯度，以抵消微泡气体向外扩散的趋势。由于基本上没有封装材料，暴露的气体表面可能会导致活化的气泡表现出异常有利的声学特性，这在常规的诊断成像频率通过高反向散射和低能量吸收(例如，由高反向散射：衰减率表示)而证实；这种回声效应可能会持续很长一段时间，即使在持续的超声波声波作用中也是如此。

体内活化和增强：

本发明提供了一种如上文所公开的药物组合物，用于声学簇疗法(ACT)治疗，包括以下步骤：

(i)将药物组合物施用于患有胰腺癌的哺乳动物受试者；其中至少一种治疗剂独立于簇组合物而预先、和/或共同和/或后给药；

(ii)任选地使用超声成像对所述药物组合物的簇进行成像，以识别所述受试者内的感兴趣区域用于治疗；

(iii)通过对所述受试者内的感兴趣区域进行超声波声波作用来活化来自步骤(i)的簇组合物的第二组分的可扩散组分的相移，

(iv)通过进一步的超声照射促进在步骤(i)中施用的治疗剂的外渗。

在本发明的方法中，为了治疗或递送，该方法包括上述步骤。

簇的微泡组分的声学共振在诊断频率范围内(1-10MHz)。当已将簇组合物施用于受试者时，簇的活化很容易通过例如在常规医学超声腹部和心脏应用中使用的标准诊断超声成像脉冲获得，此时力学指数为中等至低，即MI低于1.9并且优选低于0.7，更优选低于0.4，但高于0.1。临床成像***(使用成像脉冲达到毫米空间分辨率)可以实现将簇活化到相移，以产生更大(直径为10μm或更大)的相移气泡。活化后，微滴中的油会汽化，产生的大的活化气泡会瞬时沉积在微脉管***中。在活化和沉积后进一步应用低频超声，通过有效克服生物屏障来提高药物递送到癌性胰腺组织的效率，从而促进递送机制的增强。这些机制可能包括声穿孔过程，即一个过程，其中血管隔室中微泡的声波作用和随后的体积振荡提高了血管屏障的渗透性。换言之，ACT程序增加了内皮壁的渗透性，因此增强了治疗药物的外渗、分布和细胞吸收。也可以诱导其他机制，例如用于增强治疗效果的细胞信号产生、增强药物渗透的间质结构的机械分解等。

簇在低MI(低于约0.1的簇活化阈值)时不被活化，从而允许执行标准的医学超声造影剂成像，例如在不活化簇的情况下识别肿瘤微血管病变。因此，在一个实施方式中，该方法包括使用低MI造影剂成像模式(MI<0.15)成像微泡组分(即分散气体)的步骤，而无需活化簇，以识别用于治疗的病理位置。因此，由于簇在低MI(低于活化阈值)下未被活化，因此可以在活化步骤之前执行标准医学超声造影剂成像，例如以识别肿瘤微血管病变。使用成像脉冲在医学超声成像控制下的活化允许空间靶向活化组织区域中被超声场询问的簇。活化后，产生的大相移气泡由于它们的大小而暂时被困在胰腺的微脉管***中。产生的大相移气泡大约是蒸发的乳液微滴体积的1000倍(20μm直径的气泡来自2μm直径的油微滴)。这些大相移气泡的散射横截面比活化前簇中包含的微米级微泡的散射横截面大几个数量级。因此，大相移气泡会产生大量的反向散射信号，并且很容易使用诊断成像***在基本成像模式下成像。大相移气泡的机械共振频率也比活化前簇中包含的微泡的共振频率低一个数量级(1MHz或更低)。与较大相移气泡的共振频率相称的声场的应用在医疗诊断范围内在MI处产生相对较大的径向振荡。因此，在0.05至2MHz，优选0.1至1.5MHz，更优选0.1至1.0MHz，甚至更优选0.2至1MHz，最优选0.4至0.6MHz，特别是0.33-0.65MHz的范围内的低频超声可以用于产生生物效应机制，其增强给药药物的吸收，从而促进外渗。已经发现，在体内活化后，大部分活化的气泡的直径包含在10至20μm的范围内。这种尺寸的游离微泡的Minnaert共振频率为0.65至0.33MHz。因此，低频增强步骤的最优选频率范围是0.33-0.65MHz。与其他技术相比，利用活化气泡的共振效应，可以更好地控制这些生物效应在较低声强和较低频率下的启动。再加上大相移气泡在成像控制下被活化并沉积在组织微脉管***中的事实(允许对组织中的大活化气泡进行空间靶向)，以及它们延长的停留时间，允许药物输送机制更有效和受控地实施。

设想用于将药物递送至胰腺和治疗PDAC的ACT概念，即本发明的供使用的组合物，是适用于组分(第一和第二)的广泛组合以及广泛范围的治疗剂的概念。

治疗剂：

待递送至受试者的治疗剂，也称为“药物”，选自化学治疗剂和免疫治疗剂的组。这作为相对于簇组合物独立的组合物施用。本发明使用的治疗剂类别和特定试剂的实施例包括但不限于以下：

烷基化剂

氮芥：盐酸二氯甲基二乙胺(Mustargen)

亚硝基脲：卡莫司汀(BiCNU)、链脲菌素(Zanosar)、环己亚硝脲(CeeNU)

四嗪：达卡巴嗪(DITC-Dome)、替莫唑胺(Tomodar)

氮丙啶：噻替派(Thioplex)、丝裂霉素(Mutamycin)、氮丙啶基苯醌(AZQ)

顺铂：顺铂(Platinol)、卡铂(Paraplatin)、奥沙利铂(Eloxatin)

抗代谢物

抗叶酸剂：甲氨蝶呤(Otrexup、Rasuvo、Trexall)、培美曲塞(Altima)

氟嘧啶：氟二氧嘧啶(Adrucil)、卡培他滨(Xeloda)

脱氧核苷酸类似物：阿糖胞苷(Cytosar-U)、地西他滨(Dacogen)、阿扎胞苷(Vidaza)、吉西他滨(Gemzar)、氟达拉滨(Fludara)、奈拉滨(Arranon)、喷司他丁(Nipent)

硫嘌呤：硫鸟嘌呤(Tabloid)、巯基嘌呤(Purinethol、Purixan)

抗微管

长春花生物碱：长春瑞滨(Navelbine)、长春新碱(Oncovin,VincasarPfs)、长春地辛(Eldisine)、长春氟宁(Javlor)

紫杉烷：紫杉醇或白蛋白结合型紫杉醇(Onxol,Abraxane)、卡巴他赛(Jevtana)、多西他赛(Docetaxel,Docefrez)

足叶草毒素：依托泊苷(Eposin、Etoposide)、替尼泊苷(Vumon)

拓扑异构酶抑制剂

拓扑异构酶I：伊立替康(Onivyde)、拓扑替康(Act Topotecan、Hycamtin)

拓扑异构酶II：多柔比星(Adriamycin，Caelyx)、米托蒽醌(Novantrone)、替尼泊苷(Vumon)、新生霉素(Novobiocin Sodium)、美巴龙、阿柔比星

细胞毒性抗生素

蒽环类：多柔比星(Adriamycin，Caelyx)，道诺霉素(Cerubidine，DaunoXome)，表柔比星(Ellence)，伊达比星(Idamycin)，博来霉素(Blenoxane)，丝裂霉素(Mitosol，Mutamycin)

免疫疗法

CAR-T细胞疗法：Sipuleucel-T(Provenge)、替沙仑赛(Kymriah)、阿基仑赛(Yescarta)

抗体疗法：阿仑单抗(Campath CD52)、阿特珠单抗(Tecentriq PD-L1)、易普利姆玛(Yervoy CTLA4)、派姆单抗(Keytruda PD-1)、德瓦鲁单抗(Imfinizi lgG1k)

溶瘤病毒：拉他莫基(OncoVEXGM-CSF/T-vecIMLYGIC)

Ad2/5dl1520(Onyx-015)、GLV-1h68(GL-ONC1)、CV706

癌症疫苗：Oncophage,Sipuleucel-T(Provenge)

细胞因子治疗

干扰素：IFNα(Infergen)、IFNβ(Actimmune)

白细胞介素：没有商业产品，在试验中。

在一个实施方式中，治疗剂选自烷基化剂、抗代谢物、抗微管、拓扑异构酶抑制剂、细胞毒性抗生素、免疫治疗剂和细胞因子治疗剂的组。

在一个实施方式中，治疗剂被配制在载体中，例如包括在用作治疗剂载体的脂质体、缀合物、纳米颗粒或微球的形式中。因此，治疗剂可以是较大药物构建体的一部分，例如纳米药物，例如在脂质体或微粒制剂中，或作为单克隆抗体。因此，在一个实施方式中，治疗剂被配制在封闭的脂质球体中，例如将治疗剂包括在脂质体制剂中。

如实施例2所示，发明人已经评估了将ACT与大型构建体、纳米药物白蛋白结合型紫杉醇(紫杉醇与纳米颗粒中的白蛋白结合)和纳米药物脂质体伊立替康组合的协同效应。正如所指出的，ACT概念对于与此类较大的药物分子或构建体组合可能特别有用，也如实施例3所示。

合适的经批准的治疗剂的实施例，其中这些被配制为载体的形式，有：

脂质体化疗药物Doxil^TM，其中多柔比星被包裹在脂质体中；

脂质体化疗药物

其中伊立替康被包裹在脂质体中；和

紫杉醇白蛋白结合颗粒悬浮液

此外，优选一种或几种化学治疗剂与一种或几种免疫治疗剂之间的联合方案。此外，本发明涵盖了包含两种抗癌药物和单一脂质体的新一代脂质体，以及包含与脂质体缀合的抗体的免疫脂质体。

在一个优选的实施方式中，治疗剂选自大分子(例如蛋白质或抗体)或纳米构建体药物的组，包括但不限于白蛋白结合型紫杉醇/吉西他滨的组合、脂质体伊立替康、脂质体多柔比星和单克隆抗体。

在第二个优选实施方式中，治疗剂选自免疫治疗剂的组，例如溶瘤病毒，包括但不限于腺病毒、呼肠孤病毒、麻疹、单纯疱疹、新城疫病毒和牛痘。病毒可以导致癌细胞“爆裂”，杀死癌细胞并释放癌症抗原。然后，这些抗原可以刺激免疫反应，从而寻找并消除附近以及可能在身体其他任何地方的任何剩余肿瘤细胞。

在一个实施方式中，治疗剂包含与吉西他滨组合的白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)。在另一个实施方式中，治疗剂是脂质体伊立替康

在又一个实施方式中，几种治疗剂作为联合方案施用。合适的联合方案的实施例包括包含亚叶酸、氟二氧嘧啶、伊立替康和奥沙利铂(FOLFIRINOX)的联合方案，包含亚叶酸、氟二氧嘧啶和伊立替康(FOLFIRI)的联合方案，以及包含亚叶酸、氟二氧嘧啶和奥沙利铂(FOLFOX)的联合方案。

在又一个实施方式中，治疗剂是免疫治疗剂，例如检查点抑制剂，例如抗PD1、抗CTLA4或抗PDL1检查点抑制剂。

在本发明的一个实施方式中，该方法包括用至少一种化疗剂治疗，并结合用免疫疗法治疗受试者。

免责声明：在一个实施方式中，治疗剂不是紫杉醇，即作为游离的非白蛋白结合形式。在一个实施方式中，治疗剂不是吉西他滨与白蛋白结合型紫杉醇的组合。

除了单独施用的治疗剂之外，在一个实施方式中，簇组合物的第二组分包括包含在微滴中的其他的治疗剂。

给药途径：

簇组合物不经肠道地、优选静脉内施用于所述哺乳动物受试者。给药途径还可以选自动脉内、肌肉内、腹膜内、肿瘤内或皮下给药。为了施用于受试者，治疗剂作为单独的组合物独立于簇组合物地预先和/或共同和/或后施用。治疗剂根据各自批准的产品特性概要给药。通常，该途径选自包括但不限于静脉内、腹膜内、肿瘤内和肌肉内给药的组。两种组合物，即簇组合物(a)和治疗剂组合物(b)因此可以通过相同或不同的给药途径给药。

治疗计划：

应当理解，本发明的供使用的组合物、治疗方法和/或药物递送方法可以例如被用作多种药物治疗方案的一部分。在一个实施方式中，根据本发明的供使用的药物组合物包括使用多于一种治疗剂。这样的化学治疗联合方案可以例如包括亚叶酸、氟二氧嘧啶、伊立替康(FOLFIRI)。

此外，在一个实施方式中，可以在施用治疗剂期间进行若干次ACT治疗，例如，如图5和图6所示。在一个实施方式中，治疗方法包括1至5次，例如2至4次ACT治疗。“ACT治疗”或“ACT程序”至少包括施用簇组合物、通过常规医学成像超声波声波作用和随后的低频超声波声波作用活化簇以诱导增强的吸收。图5和图6提供了治疗计划的实施例。

图5示出了在使用以下化疗联合方案FOLFOX治疗期间进行的ACT治疗的图表：2小时输注奥沙利铂和亚叶酸，然后团注氟二氧嘧啶(5-FU)，48小时输注5-FU。ACT程序在化疗给药期间应用了3次，如灰色

声孔条所示。

图5的面板A：每个ACT程序包括

a.：注入簇组合物，

b.：通过60秒的常规医学成像超声波声波作用活化簇，以及

c.：使用5分钟的400至600kHz超声波声波作用的增强步骤。

图5的面板B：y轴以峰值百分比示出施用的化学治疗剂的血浆浓度，x轴以分钟示出时间。在此实施例中，三个ACT程序在大约50分钟、80分钟和110分钟时执行，以涵盖所有三种药物。在图6中，示出了用于治疗PDAC的标准护理联合方案的类似示意图；吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇。

发明人已经发现重复ACT程序而不是对治疗剂的每次施用应用单个ACT程序是有益的。在ACT活化期间使用US成像，发明人已经观察到ACT气泡在肿瘤中沉积的显著效果。观察到在同一动物中从注射到注射的沉积模式差异很大；沉积的ACT气泡的密度在肿瘤的各个部分之间不同，并且这种模式在注射之间发生了变化。尽管尚未完全阐明，但假设这些影响是由于不同肿瘤部分的灌注的时间变化所致。基于这些观察，为了达到尽可能多的肿瘤体积，在实施例中，发明人已经连续三次不间断应用ACT程序。这也表明在临床使用期间应用多个ACT程序的好处，如上文对FOLFOX和NAB/GEM方案所述。

因此，在一个实施方式中，多于一种治疗剂、例如1至5种治疗剂，在一定时间跨度(例如长达3小时)内同时或顺序施用，其中至少一个、例如1至5个ACT治疗在同一时期进行。

在一个实施方式中，提供了以下ACT程序；

簇组合物给药，例如静脉内给药，随后用常规医学成像超声波对肿瘤进行局部超声波声波作用(活化)，然后进行低频超声波声波作用以诱导增强的吸收(促进外渗)，这些步骤连续执行2-5次，如连续3次。因此，ACT治疗的步骤(i)至(iv)重复一至四次。这与治疗剂的施用结合进行。活化，即最初的超声波声波作用，应在每次施用簇组合物后(例如在一分钟内)立即开始，并持续例如30-120秒。低频超声波的声波作用在活化步骤之后，通常应持续3至10分钟，例如约5分钟。优选在步骤(iii)之后立即开始步骤(iv)。双频换能器可有利地用于治疗中，用于活化步骤和增强步骤。通过使用这样的仪器，可以毫无延迟地从步骤(iii)中的活化声波作用切换到步骤(iv)中的增强声波作用。在活化后立即应用增强场，这对于得到的治疗益处可能很重要。在这方面，使用宽带或双频超声换能器同时应用活化和增强声波作用将是有益的。即，能够在规定的优选范围所需的所有频率上提供足够的US压力(即MI)的换能器。例如，能够在1至10MHz和400至600kHz下提供高达0.4的MI的换能器。

在另一个实施方式中，多药方案包含抗PD1、抗PDL1或CTLA4单克隆抗体和化学治疗剂，例如派姆单抗+顺铂加奥沙利铂(5-FU)或卡培他滨。因此，可以使用几种治疗药物，并且可以在治疗方案期间应用几次ACT程序。在一个优选的实施方式中，当活性治疗分子在给药后在血液中显示最大或接近最大浓度时进行ACT程序。因此，ACT治疗的时间可能会因治疗剂的药代动力学而异。

治疗剂独立于簇组合物地预先和/或共同和/或后施用。在一个优选的实施方式中，在施用至少一种簇组合物之一之后施用治疗剂。意外地，在实施例2中发现，在施用治疗剂之前进行ACT治疗，即簇的施用和声波作用，显示出与施用治疗剂之后开始ACT治疗(即，当治疗剂在血流中时)相似的效应大小。这一发现表明，由ACT引起的生物力学效应，即血管屏障的提高的渗透性，在超声程序结束后会持续一段时间。这在临床实践中可能是有益的，因为可以在治疗剂施用和治疗开始之前进行ACT治疗。因此，在一个实施方式中，在簇组合物已经被施用并且在体内经受超声波声波作用之后施用治疗剂。在另一个实施方式中，簇组合物在施用治疗剂(例如化学疗法)之前或之后立即施用。

结果：

发明人已经发现，与单独使用治疗剂(即不使用要求保护的方法或组合物)相比，在相同的剂量下，将ACT概念应用于PDAC的治疗中与使用化学治疗剂和/或免疫治疗剂中的至少一种的治疗联合，即如根据本发明提供的，得到了治疗效果的显著增加。所使用的药物组合物和治疗方法例如由于促进了治疗剂的外渗导致治疗剂的吸收提高，治疗效果显著增强。该治疗可显著抑制肿瘤生长，诱导肿瘤缩小，从而减少肿瘤体积。作为总体结果，该方法可以提供存活时间的改进。使用本发明的方法，可以实现PDAC肿瘤体积减少50％以上，例如75％以上，例如90％。如实施例2和3所示，在初始药物给药后第50天，与单独使用药物治疗相比，使用本发明的方法实现了85％或甚至90％的肿瘤体积减小。此外，如实施例2所示，与没有ACT的治疗相比，甚至可以实现完全缓解，因此完全反应者的比例显著增加。使用本发明的方法，看到完全缓解的治疗受试者的比例，例如在初始药物给药后第120天，至少40％，例如至少50％，或甚至至少60％。应该注意的是，这些效应水平与在小鼠的临床前研究中观察到的一样，在人类中的效应水平可能更低。该方法的另一个好处是，与通常使用的剂量相比，可以减少治疗剂的剂量，从而降低全身副作用，同时仍保持或改善治疗效果。在实施例3中，免疫治疗剂溶瘤呼肠孤病毒显示了与ACT组合的类似协同效应。

在一个实施方式中，本发明的药物组合物用于将治疗剂递送至胰腺，特别是递送至被诊断患有PDAC的受试者。供使用的组合物和使用ACT技术提供治疗剂的位点特异性递送，以达到治疗剂的有效局部浓度，并进一步提供在感兴趣区域的改进吸收。

因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种用于递送治疗剂的方法的药物组合物，其中该方法包括以下步骤：

(i)将第一方面中定义的药物组合物施用于患有PDAC的哺乳动物受试者；其中在步骤ii)至iii)之前或在步骤ii)至iii)中的任一个之后，至少一种治疗剂预先和/或共同和/或后施用到簇组合物；

(ii)任选地使用超声成像对所述药物组合物的簇进行成像，以识别所述受试者内的用于治疗的感兴趣区域；

(iii)通过对所述受试者内的感兴趣区域进行超声波声波作用，活化来自步骤(i)的簇组合物的第二组分的可扩散组分的相移，使得：

(a)所述簇的微泡通过步骤(iii)的所述可扩散组分而扩大，以产生扩大的气泡，由于所述扩大的气泡在所述感兴趣区域的微循环中的暂时沉积，所述扩大的气泡定位在所述感兴趣区域；和

(b)促进在步骤(i)中施用的治疗剂的外渗；和，

(iv)通过进一步的超声波声波作用促进步骤(i)中施用的治疗剂的进一步外渗。

同样，本发明提供一种将至少一种治疗剂递送至哺乳动物受试者的方法，包括以下步骤：

(i)将第一方面中定义的药物组合物施用于哺乳动物受试者；

(ii)任选地使用超声成像对所述药物组合物的微泡进行成像，以识别所述受试者内的感兴趣区域用于治疗；

(iii)通过对所述受试者内的感兴趣区域进行超声照射来活化来自步骤(i)的簇组合物的第二组分的可扩散组分的相移，使得：

(a)所述簇的微泡被步骤(iii)的所述可扩散组分扩大以产生扩大的气泡，由于所述扩大的气泡暂时阻塞所述感兴趣区域处的微循环，所述扩大的气泡定位在所述感兴趣区域；和

(b)步骤(iii)的所述活化促进在步骤(i)中施用的治疗剂的外渗；和，

(iv)通过进一步的超声照射促进在步骤(i)中施用的治疗剂的进一步外渗。

本发明的方法和供使用的组合物可以伴随诊断成像，例如如上所述的通过进行包括使用簇的微泡作为造影剂的超声成像，但也可以与其他类型的成像研究相结合，通常用于诊断和/或评估治疗的结果。这种成像可以包括腹部计算机断层扫描(CT)(例如作为识别胰腺肿块的初步测试)，或有或没有胰胆管造影(MRCP)的腹部核磁共振成像(MRI)，腹部超声(US)，以及有或没有内窥镜胰胆管造影(ERCP)的内窥镜超声(EUS)。EUS和ERCP是上述测试中最具侵入性的，但也是列出的研究中唯一允许进行活检以提供准确诊断的。

在一个方面的上下文中描述的、例如用于涉及治疗用组合物的方面的实施方式和特征，也适用于本发明的涉及在递送或治疗或递送方法中的使用的其他方面。

提供以下实施例以根据本发明的原理说明本发明，但不应被认为以任何方式进行限制。

实施例

参考申请人的申请WO2015/047103，特别是其实施例，其内容通过引用并入本文，提供用于表征簇组合物的分析方法的描述、使用簇的结果等。

在以下实施例中，第一组分被指定为C1，第二组分被指定为C2，簇组合物，即由第一组分和第二组分的组合得到的组合物，被指定为DP(药物产品)。

实施例1描述了用于表征和定量DP中的微泡/微滴簇的分析方法，并解释了相关的响应和属性，包括浓度、大小和圆度。它还提供了有关表征和量化活化气泡尺寸和浓度的分析方法的细节。此外，还提供了制备后簇稳定性的数据，将预混合与共注射DP的特性比较。它还详细介说明了DP中簇含量和尺寸的受控操作的工程步骤。

实施例1进一步提供了来自体内研究的结果，阐明了簇特征对产品功效(即在微循环中沉积大的活化气泡的能力)的影响。它进一步分析了这些数据并得出结论：平均大小在3到10μm之间的簇(由小于0.9的圆度限定)有助于簇组合物的功效。

实施例1簇制备、分析工具和基本特征

在组合C1和C2时形成的(即存在于DP中的)微泡/微滴簇，对于组合物的关键质量属性(即其用于递送药物的功能)至关重要。因此，关于浓度和大小表征和控制形成的簇的分析方法是评估当前发明以及药物质量控制(QC)的必要工具。我们已经确定了可用于此目的的三种不同分析工具；库尔特计数、流动粒子图像分析(FPIA)和显微镜/图像分析。

除了用于表征簇组合物中的簇的这些技术，还开发了分析方法来研究体外簇的活化，即在超声照射下产生大的活化气泡。这种方法“声测法”在WO2015/047103的E1-6中有详细说明。声测法分析的主要报告响应是活化气泡的数量和体积及其大小分布，两者都与活化后的时间相比。如WO2015/047103的E1-5中详述的，也可以通过显微镜/图像分析来探索活化反应。

组分和组合物：

在包含的实施例中研究的组合物中的第一组分(C1)由全氟丁烷(PFB)微泡组成，该微泡由氢化卵磷脂酰丝氨酸钠(HEPS-Na)膜稳定并嵌入冻干蔗糖中。HEPS-Na带有带负电荷的头部基团，随后微泡带表面负电荷。每瓶C1包含大约16μL或2·10⁹个微气泡，平均直径约为2.0μm。冷冻干燥的制剂在环境室温下储存时显示出长的保质期，更特别是3年。

本实施例研究的组合物中的第二组分(C2)由全氟甲基-环戊烷(pFMCP)微滴组成，该微滴由1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-胆碱磷酸(DSPC)膜稳定，其添加有3％mol/mol硬脂胺(SA)以提供正表面电荷。C2中的微滴分散在5mM TRIS缓冲液中。在这些研究中研究的C2标准配方包含每毫升大约4μL或0.8·10⁹个微滴，平均直径约为1.8μm。第2组分在冷藏储存时显示出较长的保质期，尤其是18个月或更长。

在某些情况下，为了阐明对簇特征的影响，各种配方变量，如SA含量、微滴尺寸、微滴浓度、TRIS浓度和pH以受控方式变化。如果使用了此类样本，这些方面将在正文中进行详细说明。

通过用2mL C2重建C1小瓶，然后手动均化30秒，无菌地制备簇组合物(DP)。使用无菌的一次性注射器和针头从C2小瓶中取出2mL。通过C1小瓶的塞子加入注射器的内容物，并将所得DP均质化，制备用于给药的组合物。

如WO2015/047103所示，第一组分和第二组分，即微泡配方和微滴配方，可以变化。例如。如WO2015/047103的表9和10所示，第一组分的气体和稳定膜都可以变化，以制备具有合适性质的预期可用于根据本发明的治疗的簇。

分析期间簇组合物中簇的稳定性：

DP中的簇通过微泡和微滴之间的静电吸引力形成并保持在一起。这些力是有限的，并且簇在形成后可能会通过各种途径/影响(例如机械应力或热(布朗)运动)而破裂。对于精确和准确的表征，重要的是在分析期间簇保持稳定。已经使用上述所有方法研究了这种稳定性。为了评估稳定性，对单个DP样品重复3到5次分析，时间跨度大于5分钟。在这些重复中未观察到浓度或尺寸的显著变化，证明微泡、微滴和簇在所述分析条件下(即在PBS或水中稀释后并在连续均质化(搅拌)下)稳定>5分钟。

配方方面

可以探索许多不同的配方方面来控制DP中的簇含量和尺寸，并针对最佳特性。可用于设计簇含量和大小分布的参数包括但不限于：微泡和微滴之间的表面电荷差异，例如SA％：C2的微滴尺寸：pH：C2中TRIS的浓度：以及微泡和微滴的浓度。此外，组分例如在高温下长时间储存期间的化学降解，可能会影响C1和C2在DP制备过程中形成簇的能力。

如WO2015/047103中报道的，从30种不同组合物的体外表征中，可以提取阐明***性质和特征的几个重要相关性。我们发现形成的簇的尺寸也与***的反应性密切相关。只有小簇(即1-5μm)和中等大小的簇(即5-10μm)在相对低水平的反应性(例如<20％)下形成。随着反应性的增加，更大的簇开始形成；R>约20％，10-20μm簇开始形成，R>约50％，20-40μm簇开始形成。当较大的簇形成时，是以较小和中等大小的簇为代价的；我们发现簇浓度1-5μm和5-10μm的含量与反应性的明显最佳值。我们发现形成更大的簇(即大于10μm，或大于20μm)不利于组合物的功效，因此必须相应地平衡聚集电势。

根据申请人的实验，以及WO2015/047103表5和表6中所示的结果，簇组合物的功效(灰度单位(GS)的线性增强)与簇平均尺寸和簇的浓度(百万/毫升)相关。灰度增强是在体内施用和活化簇组合物后通过US成像观察到的亮度(对比度)增加，并且是成像组织中活化气泡量的量度。报告的结果来自在静脉注射簇组合物和在左心室中活化时各种大小级别的簇对狗心肌的超声信号的线性增强(灰度单位)的贡献的多变量主成分分析(PCA)。请参见WO2015/047103的实施例2。对该PCT申请的表5和表6中详述的30个样品的数据执行PCA。结果表明，小和中等大小的簇(<10μm)对簇组合物的功效有显著贡献，而较大的簇(>10μm)则没有。这些结果和结论也适用于本发明。簇大小分布很重要，平均大小应在3-10μm范围内，优选4-9μm，更优选5-7μm。

分析根据实施例1制备的簇组合物的簇浓度和平均直径，发现其数小时的簇浓度为约4000-4400万/mL，簇平均直径为约5.8-6.2μm。结果如下表1所示，与WO2015/047103表6的结果一致。表1的数据表明，制备的簇组合物具有可接受的稳定性，并且可以达到最佳的簇尺寸和浓度。

表1：

簇的尺寸影响功效。图1示出了簇尺寸相比产品功效的可视化，表明平均直径在3到10μm范围内的簇具有最佳功效。因此，在图1中提供了产品功效相比簇直径。Y轴示出左心室中注射和活化簇后狗心肌的US成像与灰度增强的相关系数，并反映了沉积的活化气泡的量。X轴以μm示出簇直径。灰色框代表评估的不同簇尺寸箱：1到5μm、5到10μm、10到20μm和20到40μm。实线表示功效相比簇直径的连续函数。误差条是标准误差。图1是WO2015/047103的图12(左侧)的替代可视化，并且基于下表2中提供的数据。

表2：

通道组	平均通道直径	功效系数
			1至5μm	3	0.4
5至10μm	7.5	0.55
			10至20μm	15	0.12
20至40μm	30	-0.15

应用本发明的概念，即通过在施用前由C1和C2制备簇组合物，从而形成微泡/微滴簇，这与WO/9953963所教导的两种组分的共同注射相反，实现a>10倍的功效增加。在第一组分和第二组分组合时形成微泡/微滴簇并施用这些预制簇，是其体内预期功能的先决条件。簇组合物将在簇的特征基本不变的时间窗口内(例如在组合两种组分后的3小时内)施用于受试者。

实施例2.PDAC的患者来源的异种移植小鼠模型中的治疗效果-带有化学疗法的声簇疗法。

研究设计：研究了根据本发明的声簇疗法(ACT)和供使用的组合物(称为ACT)的两种不同化疗方案的治疗效果水平。

使用了以下ACT程序；簇组合物的静脉内给药+肿瘤的局部超声(US)声波作用在化疗给药之前或之后立即连续进行3次。实验装置(钻具)和治疗计划如图2所示，其中图2A)提供了装置照片，图2B)提供了研究中用于超声活化和增强的装置的装置草图。在图2B中，数字表示以下内容：1是双频超声换能器(2.7MHz和500kHz输出)，2是超声波导，3是水浴，4是超声凝胶，5是超声吸收垫，图6是具有簇组合物的注射器，7是VeVo成像台，8是导管，9是肿瘤。

此外，图2C提供了治疗计划的概述，其中通过用2mL全氟甲基环戊烷(PFMCP)乳液(每毫升含有6.8毫克PFMCP)重构一小瓶Sonazoid^TM(GE Healthcare)(如实施例1中概述的组分1)来混合簇组合物。PFMCP液滴用二硬脂酰磷脂酰胆碱和3M硬脂胺(如实施例1中概述的组分2)稳定。

在图2C中，使用了以下命名：

a.：小鼠麻醉和导尿，

b.：注入簇组合物，

c.：在2.7MHz超声活化60秒，和

d.：在500kHz超声增强5分钟。

如所示，在ACT治疗前或后，注射吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇。或者，如所示，在ACT治疗前注射脂质体伊立替康。

每个ACT程序包括注射2mL/kg的簇组合物，然后是US活化和增强步骤。

将PDAC患者来源的肿瘤异种移植物皮下植入无胸腺裸鼠中，当肿瘤大小达到163±3(平均值的标准误差)mm³之间时，这些裸鼠被纳入治疗研究。小鼠(7至10只小鼠/组，参见表3)用化学治疗剂(单独地或与ACT联合)治疗。此外，进行了生理盐水+ACT对照组。测试了两种化疗方案：

·白蛋白结合型紫杉醇(NAB，15mg/kg，静脉注射，每周×3)和吉西他滨(GEM，60mg/kg，腹腔注射，每周×3)组合(NAB/GEM)，

以及

·脂质体伊立替康(ONI，15mg/kg，静脉注射，每周×3)。

表3提供了治疗组和每组中的动物数量的概述。

吉西他滨腹腔给药(吉西他滨IP)，白蛋白结合型紫杉醇静脉给药(白蛋白结合型紫杉醇IV)，脂质体伊立替康静脉给药(脂质体伊立替康IV)。

表3：研究的治疗组，每组动物的数量(n)

在研究开始，每天测量监测动物的体重和肿瘤大小(通过卡尺)，持续49天。在第49天，将表现出进展性疾病的动物剔除，而对表现出显著缓解(定义为肿瘤大小<60mm³)的动物进行长达120天的监测。在第120天，确定每组中完全反应者(定义为没有可测量的剩余肿瘤块的动物)的比例。在第一个治疗日(第0天)，肿瘤体积标准化为150mm³。

结果：

平均肿瘤体积和平均值标准误差(SEM)的结果列于下表4和表5。

表4：给药脂质体伊立替康(ONI)、盐水对照和脂质体伊立替康加ACT(ONI+ACT)的治疗组的平均肿瘤体积和平均值的标准误差(SEM)对比时间的结果。

表5：给药白蛋白结合型紫杉醇/吉西他滨(NAB/GEM)、盐水对照和白蛋白结合型紫杉醇/吉西他滨+药物施用之前或之后的ACT(分别为ACT+NAB/GEM和NAB/GEM+ACT)的治疗组的平均肿瘤体积和平均值的标准误差(SEM)对比时间的结果。

表4和5中提供的结果分别在图3和图4中可视化。

图3提供了ACT与脂质体伊立替康联合用于治疗患者来源的胰腺导管腺癌的疗效。Y轴示出以mm³为单位的肿瘤体积。X轴以天为单位示出从研究开始的时间。在第0、7和14天进行治疗。治疗组是：盐水对照(空心方块)、单独的脂质体伊立替康(实心方块)和脂质体伊立替康与ACT(实心圆圈)。

图4提供了ACT与吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇联合治疗胰腺导管腺癌的疗效。Y轴以mm³为单位示出肿瘤体积。X轴以天为单位示出从研究开始的时间。在第0、7和14天进行治疗。治疗组是：盐水对照(空心方块)、单独的吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇(实心方块)、在给药前应用ACT的吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇(空心圆)和给药后应用ACT的吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇(实心圆)。

总之，结果表明，仅使用白蛋白结合型紫杉醇/吉西他滨(ABX/GEM)或脂质体伊立替康(ONI)的治疗在所用剂量下显示出对肿瘤生长的显著抑制。然而，此外，在化疗治疗之前或之后应用根据本发明的ACT显著增强了活性和治疗效果，并甚至在最后剂量的治疗后>100天显著诱导了肿瘤缩小。在初始给药后第50天，与单独使用ABX/GEM相比，在ABX/GEM给药后应用ACT可使肿瘤体积减少90％(P＝0.001)。一些小鼠完全缓解。在第120天，ABX/GEM+ACT组中50％的小鼠仍处于稳定的完全缓解，肿瘤体积<50mm³，而仅ABX/GEM的组中为10％。ONI处理也观察到类似的活性。在研究开始后的第50天，与仅ONI相比，ONI+ACT诱导肿瘤体积减少了85％(P＝0.024)。在第120天，ONI+

治疗组中60％的小鼠仍处于稳定的完全缓解，肿瘤体积<50mm³，而仅ONI的组为10％。因此，完全响应者的比例显著增加。在化疗药物给药前应用ACT也显示出疗效的改善，但略低于化疗后应用。总体而言，这些发现证明了ACT在改善PDAC中的如ABX/GEM和ONI治疗等化疗药物的疗效方面的潜在效用，并提供了支持患者评估的可靠临床前证据。它还为临床试验的设计提供了启示。

实施例3肝细胞癌(HCC)的皮下小鼠模型中的治疗效果-呼肠孤病毒的癌症免疫治疗±声簇治疗。

本实施例报告了ACT与溶瘤病毒联合治疗HCC的效果。这种疾病模型在许多重要特征上与PDAC相似，参见“J Gastrointest Oncol。2018年2月；9(1):180-195.doi:10.21037/jgo.2017.06.09”，因此提供了支持本发明的相关数据。

溶瘤病毒是一种癌症免疫疗法，它使用病毒感染和破坏癌细胞。病毒是颗粒，它感染或进入我们细胞，然后利用细胞的遗传机制复制自身，然后传播到周围未感染的细胞。最近，病毒已被用于靶向和攻击已经形成的肿瘤。这些病毒被称为溶瘤病毒，它们代表了治疗癌症的有希望的方法。癌细胞通常具有受损的抗病毒防御能力，使它们容易受到感染。感染后，这些溶瘤病毒会导致癌细胞“爆裂”，杀死癌细胞并释放癌症抗原。然后，这些抗原可以刺激免疫反应，从而寻找并消除附近以及可能在身体其他任何地方的任何剩余肿瘤细胞。

来自呼肠孤病毒家族的病毒(呼肠孤病毒)已被广泛探索用于治疗PDAC(NCT01280058、NCT02620423、NCT03723915)，具有明确的证据或治疗益处。然而，可能降低呼肠孤病毒功效的一个因素是癌细胞的有限吸收。在这方面，设想将ACT与病毒疗法相结合可以强烈增加病毒吸收，从而提高治疗效果。

研究设计：研究了根据本发明的声簇疗法(ACT)和供使用的组合物(称为ACT)与溶瘤呼肠孤病毒组合的治疗效果水平。

所应用的ACT程序如实施例2中所述。

通过皮下注射将HCC肿瘤异种移植物植入balb/C小鼠。1x10⁷个癌细胞被注射到侧面，并在加入研究之前让其自由生长约21天。小鼠(每组N＝5)用呼肠孤病毒单独治疗或与ACT联合治疗。此外，研究了磷酸盐缓冲盐水对照组。在第0、5、7、10、14和16天给予病毒六次。在ACT治疗前立即静脉内给予每天1x10⁷个斑块形成单位(PFU)的剂量。在研究期间(25天)通过卡尺测量每周两次监测动物的体重和肿瘤大小(体积)。

结果：

平均肿瘤体积和平均值标准误差(SEM)的结果列于下表6，并在图7中可视化。

表6：详述的治疗组的平均肿瘤体积和平均标准误差(SEM)对比时间的结果。

图7提供了ACT联合溶瘤呼肠孤病毒治疗肝细胞癌的疗效。Y轴以mm³为单位示出肿瘤体积。X轴以天为单位示出从研究开始的时间。X轴下方的灰色三角形表示治疗天数。治疗组是：盐水对照组(倒三角形)、溶瘤呼肠孤病毒(实心方块)和溶瘤呼肠孤病毒与ACT(实心圆圈)。

从表6中显示以及在图7中可视化的结果可以看出，与PBS对照组相比，单独使用呼肠孤病毒治疗在所研究的剂量下没有显示出对肿瘤生长的显著抑制。然而，当将相同剂量的病毒与ACT治疗相结合时，观察到了可标记的且显著的肿瘤抑制，与仅病毒相比，第25天肿瘤体积的减少>95％。在第25天，使用双尾ANOVE检验在95％置信区间(具有Dunns多重比较校正的非参数Kruskal-Wallis检验)计算p值为p＝0.037。

因此，该研究证实了当将免疫疗法治疗与呼肠孤病毒和根据本发明的ACT相结合时，强烈的协同效应。对于PDAC的治疗，预计会有类似的协同效应，因为该实施例中使用的疾病模型在许多重要特征方面与PDAC相似。

实施例4(预期)在胰腺癌同基因小鼠模型中声簇治疗(ACT)以及PD-1抗体的初步研究。

简介：尽管在许多癌症类型中取得了巨大成功，但例如免疫检查点抑制剂的癌症免疫疗法在胰腺导管腺癌(PDAC)患者中并未显示出任何有意义的益处。导致这种无效的3个主要因素是1)低肿瘤免疫原性，2)低T细胞募集和3)T细胞被细胞因子灭活。间质***形成具有高间质液压力，物理上阻碍T细胞浸润，并以化学方式引起肿瘤内缺氧，从而通过基质细胞释放免疫抑制细胞因子，排斥T细胞活化[Hilmi等，World J Gastroenterol24,2137-2151]。声簇疗法(ACT)[Sontum等，International Journal ofPharmaceutics495(2015)1019–1027]，一种用于超声(US)介导的药物递送的新方法，使用带负电荷的微泡和带正电荷的微滴簇的分散体在局部超声声波作用下诱导脉管***的局部渗透性增强，从而允许药物外渗到肿瘤组织中。通过使用ACT方法来增加PDAC的脉管***渗透性，我们可以潜在地增加T细胞浸润，并增加免疫治疗剂的递送以改善T细胞活化。因此，这可能会对PDAC患者免疫治疗的治疗结果产生重大影响。

目的：本研究的目的是评估ACT联合PD-1抗体在胰腺癌同基因小鼠模型中的抗肿瘤活性。

实验设计：

A-在胰腺癌同基因小鼠模型中评估ACT联合PD-1抗体的抗肿瘤活性所应用的ACT程序将如实施例2中所述。

本研究将使用同基因鼠PDAC模型。该模型使用源自KPC基因工程小鼠模型的鼠PDAC细胞系，该模型已被证明与人类PDAC非常接近[Hingorani等，Cancer Cell 7,469-483][Lee等，Curr Protoc Pharmacol 73,14 3911-14 39 20]。将细胞皮下接种到C57BL/6J(BLACK6)小鼠的侧腹。为了评估基于ACT的治疗的功效，将小鼠分为四个治疗组：(1)同型IgG对照，(2)同型IgG+仅ACT，(3)PD-1抗体，(4)PD-1抗体+ACT，每组14只小鼠。

在第0、3、7和10天腹腔内给予PD-1抗体(0.2mg/小鼠)。将使用卡尺测量肿瘤，并使用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝(a x b²/2)，其中“b”是最小直径，“a”是最大直径。一旦建立的肿瘤达到大约50-150mm³，小鼠将被配对到不同的治疗组中，以减少每组肿瘤大小的差异性。同一天，抗体和ACT将按照计划给药(共4剂)。当每只小鼠的单个肿瘤达到近似终点(肿瘤体积>1,500mm³)时，用调节的CO₂处死小鼠。一旦在对照组中达到预定终点，将通过比较对照组的肿瘤测量与其他研究组来计算肿瘤生长抑制(TGI)。

B-评估增加的免疫细胞存在与ACT的活性

为了评估治疗后肿瘤免疫微环境的变化，在第10天最后一次给药后一小时，处死来自每组的4只小鼠。采集血液和肿瘤组织。每只小鼠的一半肿瘤组织将被快速冷冻，另一半将被***固定石蜡包埋(FFPE处理)。FFPE组织将使用免疫组织化学(IHC)分析，包括苏木精和伊红(H&E)染色并且免疫标志物为：F4/80、CD3、CD4、CD8和Foxp3。

结果(预期)：结果将表明，与单独抗PD1治疗相比，与ACT联合导致可达到以下一个或多个疗效终点；TGI显著增加，中位总生存显著增加，免疫细胞的肿瘤浸润显著增加。

因此，该研究将证实：当根据本发明将免疫疗法治疗与抗PD1与ACT联合时，具有强协同效应。

实施例5(预期)制造具有各种微泡和微滴组分的簇组合物。

为了表明本发明适用于C1和C2的多种化学组合物，将制造或商业采购几种配方，并探索所得簇组合物的体外属性。

C1实施例：

市售的微泡超声成像剂Sonovue(Bracco Spa，意大利)和Micromarker(VisualSonics Inc.，美国)将作为C1组分采购和使用。Sonovue是一种用二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油钠、棕榈酸和PEG4000膜稳定的六氟化硫微泡，并且以冻干的形式呈现，以便用5毫升的水性基质重构。Micromarker是一种用磷脂、聚乙二醇和脂肪酸稳定的全氟丁烷/氮微泡，并以冻干形式呈现，以便用0.7mL水性基质重构。

C2实施例：

具有可扩散组分的微滴(C2)组分；全氟二甲基环丁烷、2-(三氟甲基)全氟戊烷和全氟己烷将如下生产：

将790mg二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和8.1mg硬脂胺(SA)称入到250ml圆底烧瓶中，并加入50ml氯仿。样品将在热自来水下加热，直到获得澄清溶液。氯仿将通过在旋转蒸发器上在350mmHg和40℃下蒸发至干燥来去除，然后在干燥器中在50mmHg下进一步干燥过夜。此后，将加入160毫升水，并将烧瓶再次置于旋转蒸发器上，并在满旋转速度和80℃水浴温度下使脂质再水合25分钟。将所得脂质分散体转移到合适的小瓶中，并储存在冰箱中直至使用。

通过将冷脂质分散体的1ml等分试样转移到2ml色谱瓶中来制备乳液。6个小瓶中的每一个将加入100μl的碳氟油，如上文详述。色谱瓶将在CapMix(Espe,GmbH)上抖动75秒。所得乳液将通过离心和除去下层漂浮物洗涤三次，然后加入等体积的5mM TRIS缓冲水溶液。将小瓶立即在冰上冷却、合并并保持冷却直至使用。

将进行库尔特计数分析以确定微滴的体积浓度和直径，然后将乳液用5mM TRIS缓冲液稀释至4μl微滴/ml的分散相浓度。

通过分别用5或0.7mL的上述每种C2组分重构Sonovue或Micromarker来制备簇组合物。

结果(预期)

混合组分C1和C2后，所有六种组合物预计每毫升包含超过1000万个簇，平均直径在3到10μm之间。

Claims

1.一种用于治疗胰腺癌的方法的药物组合物，其中所述药物组合物包括：

(i)第一组分，其包含气体微泡和用于稳定所述微泡的第一稳定剂；和

(ii)第二组分，其包含含有油相的微滴和稳定所述微滴的第二稳定剂，其中所述油包含能够扩散到所述气体微泡中以至少暂时增加其尺寸的可扩散组分；

其中所述第一组分和所述第二组分的所述微泡和所述微滴具有相反的表面电荷，并通过有吸引力的静电相互作用形成所述簇；

(b)选自化疗剂和免疫治疗剂或其组合的组的治疗剂，作为独立于(a)的组合物提供。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，用于根据权利要求1所述的用途，其中所述第一组分的气体微泡的气体包括六氟化硫、C3-6全氟化碳、氮气、空气或它们的混合物。

3.根据权利要求1或2的药物组合物，用于根据权利要求1所述的用途，其中第一稳定剂和第二稳定剂各自具有与另一个相反的净静电荷。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，用于根据权利要求1所述的用途，其中所述第一稳定剂和所述第二稳定剂各自独立地包含磷脂、蛋白质、聚合物、聚乙二醇、脂肪酸、带正电荷的表面活性剂、带负电荷的表面活性剂或其混合物。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，用于根据权利要求1所述的用途，其中所述第二组分的微滴的油相包括部分或完全卤化的烃或其混合物。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，用于根据权利要求1所述的用途，其中所述簇的平均直径在3-10μm范围内，优选在4-9μm范围内。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的药物组合物，用于根据权利要求1所述的用途，其中尺寸范围为1-10μm的簇的簇浓度为至少2500万/ml。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的药物组合物，用于根据权利要求1所述的用途，其中所述治疗剂选自烷基化剂、抗代谢物、抗微管、拓扑异构酶抑制剂、细胞毒性抗生素、免疫治疗剂和细胞因子治疗剂的组。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的药物组合物，用于根据权利要求1所述的用途，其中所述治疗剂被配制在载体中，例如以脂质体、缀合物、纳米颗粒或微球的形式包含。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的药物组合物，用于根据权利要求1所述的用途，其中所述治疗剂选自白蛋白结合型紫杉醇、脂质体伊立替康和免疫治疗剂如检查点抑制剂的组。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，其中所述用途是用于治疗胰腺导管腺癌(PDAC)。

12.根据权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，其中所述用途是用于治疗处于0期至IV期的任一阶段的胰腺导管腺癌。

13.根据权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，其中所述用途包括声簇疗法(ACT)治疗，其包括以下步骤：

(i)将药物组合物施用于患有胰腺癌的哺乳动物受试者；其中至少一种治疗剂是独立于簇组合物预先和/或共同和/或后施用的；

(iii)通过对所述受试者内的感兴趣区域进行超声波声波作用，活化来自步骤(i)的簇组合物的第二组分的可扩散组分的相移，

(iv)通过进一步的超声照射，促进在步骤(i)中施用的治疗剂的外渗。

14.根据权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，用于根据权利要求13所述的用途，其中在组合第一组分和第二组分后3小时的时间窗口内施用簇组合物。

15.根据权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，用于根据权利要求13或14所述的用途，其中活化相移的步骤(iii)通过频率为1至10MHz 且力学指数为0.1至0.7的超声波声波作用而进行。

16.根据权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，用于根据权利要求13至15所述的用途，其中促进外渗的步骤(iv)通过频率为330至650kHz且力学指数为0.15至的0.4超声波声波作用而进行。

17.根据权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，用于根据权利要求13至16所述的用途，其中所述ACT治疗的步骤(i)至(iv)重复一至四次。

18.根据权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，用于根据权利要求13至17中任一项所述的用途，用作多药治疗的一部分。

19.根据权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，用于根据权利要求13至18中任一项所述的用途，其中活化相移的步骤(iii)的声波作用在步骤(i)之后立即开始，并且紧随其后的是促进外渗的步骤(iv)的声波作用。

20.根据权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，用于根据权利要求13至19中任一项所述的用途，其中步骤(iii)的声波作用持续30-120秒，然后是持续3-10分钟的步骤(iv)的声波作用。

21.根据权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，用于根据权利要求13至20中任一项所述的用途，其中1至5种治疗剂同时或在一定时间跨度内依次地施用，其中至少一种、例如1种至5种ACT治疗在同一时期进行。

22.根据权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，用于根据权利要求13至21中任一项所述的用途，其中宽带或双频超声换能器用于步骤(iii)的活化声波作用和步骤(iv)的增强声波作用。

23.根据权利要求1-10中任一项所述的药物组合物，其用于递送治疗剂的方法中，其中所述方法包括以下步骤：

(i)将根据权利要求1所述的药物组合物施用于患有PDAC的受试者；其中至少一种治疗剂独立于所述簇组合物预先和/或共同和/或后施用，并且在步骤ii)至iii)之前或在步骤ii)至iii)中的任一个之后施用；

(iii)通过对所述受试者内的感兴趣区域进行超声照射，活化来自步骤(i)的簇组合物的第二组分的可扩散组分的相移，使得：

(a)所述簇的微泡被步骤(iii)的所述可扩散组分扩大以产生扩大的气泡，由于所述扩大的气泡暂时阻塞所述感兴趣区域处的微循环，所述扩大的气泡被定位在所述感兴趣区域；和

(b)促进在步骤(i)中施用的治疗剂的外渗；

24.根据权利要求1-10中任一项所述的药物组合物，用于根据权利要求1-22中任一项所述的用途，其中与单独使用所述治疗剂相比，所述用途以以下一种或更多的形式提供治疗效果的增加：改善治疗剂的吸收、抑制肿瘤生长、诱导肿瘤缩小、减少肿瘤体积、改善存活时间、观察到完全缓解的治疗受试者的比例增加。