CN109504806A - 一种非洲猪瘟荧光pcr检测试剂及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及非洲猪瘟检测技术领域，且公开了一种非洲猪瘟荧光PCR检测试剂及其检测方法，检测试剂包括一对PCR特异性引物、一条特异性探针、一条内标探针和PCR混合液，检测试剂是以高度保守的非洲猪瘟病毒VP72基因为靶基因。该非洲猪瘟荧光PCR检测试剂及其检测方法，具备非洲猪瘟荧光PCR检测试剂使用简单、不需要多种专业仪器，检测时间较短，检测效率较高，且不需要多人合作，节省劳动力等优点。
Description
技术领域
本发明涉及非洲猪瘟检测技术领域，具体为一种非洲猪瘟荧光PCR检测试剂及其检测方法。
背景技术
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的猪的一种烈性、出血性传染病，病死率接近100％，1921年Montgomery在非洲肯尼亚首先发现，由于对养猪业危害较大，而且尚无有效的疫苗防治，因此它被OIE列为猪的法定上报传染病之首，并受到世界各国的高度关注。由于非洲猪瘟病毒具有复杂的免疫逃避机制，缺乏典型的中和抗体，又没有有效的疫苗用于防疫，所以建立一种快速、准确的检测方法就显得尤为重要，虽然目前我国还未发现此病，但是随着国际交流的日益频繁，传入的风险日益加大。
现有的非洲猪瘟病毒检测操作过于繁琐不便，检测不够准确，合格率较低，且检测耗时较久，非洲猪瘟病毒检测效率较低，且需要多人合作检测，耗费劳动力。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种非洲猪瘟荧光PCR检测试剂及其检测方法，具备非洲猪瘟荧光PCR检测试剂使用简单、不需要多种专业仪器，检测时间较短，检测效率较高，且不需要多人合作，节省劳动力等优点，解决了非洲猪瘟病毒检测不便、检测准确性较低，检测效率较低，浪费劳动力的问题。
(二)技术方案
为实现上述非洲猪瘟荧光PCR检测试剂使用简单、不需要多种专业仪器，检测时间较短，检测效率较高，且不需要多人合作，节省劳动力的目的，本发明提供如下技术方案：一种非洲猪瘟荧光PCR检测试剂，所述检测试剂包括一对PCR特异性引物、一条特异性探针、一条内标探针和PCR混合液，所述检测试剂是以高度保守的非洲猪瘟病毒VP72基因为靶基因。
优选的，所述PCR特异性引物为SFU和ASFL。
一种非洲猪瘟荧光PCR检测试剂的检测方法，包括以下步骤：
步骤一，制作样本样本；
步骤二，检测试剂准备；
步骤三，把制作的样本和检测试剂混合，进行PCR检测扩增
步骤四，记录检测数据；
步骤五，比对检测数据，并判断检测结果。
优选的，所述步骤一中样本制作，首先从猪身上抽取血液，然后对血液中细胞进行破碎离心处理，最后取出血清作为检测样本，样本收集后可立即检测；若不能立即检测，可置于2～8℃冷藏过夜保存；如需长期保存，标本应冻存于-80℃以下，避免反复冻融，然后利用RNA提取试剂提取样本DNA。
优选的，所述步骤二中检测试剂准备中，首先从冰箱中取出试剂盒,从试剂盒中取出实验所需试剂,充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体，然后核算当次实验所需要的反应数(n)，并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量，反应数(n)计算公式为；
n＝阴性对照数+阳性对照数+误差预留量+样本数。
优选的，所述步骤三把样本DNA和检测试剂依次加入PCR反应管内，之后在PCR反应样本管中分别加入处理好的待测标本DNA各5微升、终体积25微升/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上，阴性对照和阳性对照管则各加5微升试剂盒自带的阴性对照或阳性对照品，终体积为25微升/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上，之后取含有样本的PCR反应管，放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相应位置，并记录放置顺序，然后进行PCR扩增。
优选的，所述步骤四中记录检测数据，然后进行数据统计，记录检测试剂的检测结果。
优选的，所述步骤五中，根据检测数据得出检测结果，若检测结果呈阳性，则标本中检出非洲猪瘟病毒DNA，若检测结果呈阴性，则标本中没有检出非洲猪瘟病毒DNA。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种非洲猪瘟荧光PCR检测试剂及其检测方法，具备以下有益效果：
该非洲猪瘟荧光PCR检测试剂及其检测方法，荧光PCR检测试剂通过一对PCR特异性引物、一条特异性探针、一条内标探针和PCR混合液组成，PCR混合液分开包装，避免其长时间混合失效，提高检测试剂的保存时间，且通过非洲猪瘟病毒的高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含非洲猪瘟病毒基因组模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号，利用荧光定量PCR仪对PCR过程中相应通道信号进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析，同时检测试剂通过单人操作，进行检测数据的记录和比对，使用专业的检测仪器较少，且检测非洲猪瘟的整个过程中，从DNA提取到出现检测结果，则只需2-2.5h，大大减少手工操作和缩短时间，提高了非洲猪瘟病毒检测效率。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种非洲猪瘟荧光PCR检测试剂，检测试剂包括一对PCR特异性引物、一条特异性探针、一条内标探针和PCR混合液，检测试剂是以高度保守的非洲猪瘟病毒VP72基因为靶基因。
PCR特异性引物为SFU和ASFL。
一种非洲猪瘟荧光PCR检测试剂的检测方法，包括以下步骤：
步骤一，制作样本样本；
步骤二，检测试剂准备；
步骤三，把制作的样本和检测试剂混合，进行PCR检测扩增
步骤四，记录检测数据；
步骤五，比对检测数据，并判断检测结果。
步骤一中样本制作，首先从猪身上抽取血液，然后对血液中细胞进行破碎离心处理，最后取出血清作为检测样本，样本收集后可立即检测；若不能立即检测，可置于2～8℃冷藏过夜保存；如需长期保存，标本应冻存于-80℃以下，避免反复冻融，然后利用RNA提取试剂提取样本DNA。
步骤二中检测试剂准备中，首先从冰箱中取出试剂盒,从试剂盒中取出实验所需试剂,充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体，然后核算当次实验所需要的反应数(n)，并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量，反应数(n)计算公式为；
n＝阴性对照数+阳性对照数+误差预留量+样本数。
步骤三把样本DNA和检测试剂依次加入PCR反应管内，之后在PCR反应样本管中分别加入处理好的待测标本DNA各5微升、终体积25微升/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上，阴性对照和阳性对照管则各加5微升试剂盒自带的阴性对照或阳性对照品，终体积为25微升/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上，之后取含有样本的PCR反应管，放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相应位置，并记录放置顺序，然后进行PCR扩增。
步骤四中记录检测数据，然后进行数据统计，记录检测试剂的检测结果。
步骤五中，根据检测数据得出检测结果，若检测结果呈阳性，则标本中检出非洲猪瘟病毒DNA，若检测结果呈阴性，则标本中没有检出非洲猪瘟病毒DNA。
综上所述，该非洲猪瘟荧光PCR检测试剂及其检测方法，通过非洲猪瘟病毒的高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含非洲猪瘟病毒基因组模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号，利用荧光定量PCR仪对PCR过程中相应通道信号进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析，同时检测试剂通过单人操作，进行检测数据的记录和比对，使用专业的检测仪器较少，且检测非洲猪瘟的整个过程中，从DNA提取到出现检测结果，则只需2-2.5h，大大减少手工操作和缩短时间，提高了非洲猪瘟病毒检测效率。
需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (8)
1.一种非洲猪瘟荧光PCR检测试剂，其特征在于：所述检测试剂包括一对PCR特异性引物、一条特异性探针、一条内标探针和PCR混合液，所述检测试剂是以高度保守的非洲猪瘟病毒VP72基因为靶基因。
2.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟荧光PCR检测试剂，其特征在于：所述PCR特异性引物为SFU和ASFL。
3.一种非洲猪瘟荧光PCR检测试剂的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一，制作样本样本；
步骤二，检测试剂准备；
步骤三，把制作的样本和检测试剂混合，进行PCR检测扩增
步骤四，记录检测数据；
步骤五，比对检测数据，并判断检测结果。
4.根据权利要求3所述的一种非洲猪瘟荧光PCR检测试剂的检测方法，其特征在于：所述步骤一中样本制作，首先从猪身上抽取血液，然后对血液中细胞进行破碎离心处理，最后取出血清作为检测样本，样本收集后可立即检测；若不能立即检测，可置于2～8℃冷藏过夜保存；如需长期保存，标本应冻存于-80℃以下，避免反复冻融，然后利用RNA提取试剂提取样本DNA。
5.根据权利要求3所述的一种非洲猪瘟荧光PCR检测试剂的检测方法，其特征在于：所述步骤二中检测试剂准备中，首先从冰箱中取出试剂盒,从试剂盒中取出实验所需试剂,充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体，然后核算当次实验所需要的反应数(n)，并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量，反应数(n)计算公式为；
n＝阴性对照数+阳性对照数+误差预留量+样本数。
6.根据权利要求3所述的一种非洲猪瘟荧光PCR检测试剂的检测方法，其特征在于：所述步骤三把样本DNA和检测试剂依次加入PCR反应管内，之后在PCR反应样本管中分别加入处理好的待测标本DNA各5微升、终体积25微升/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上，阴性对照和阳性对照管则各加5微升试剂盒自带的阴性对照或阳性对照品，终体积为25微升/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上，之后取含有样本的PCR反应管，放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相应位置，并记录放置顺序，然后进行PCR扩增。
7.根据权利要求3所述的一种非洲猪瘟荧光PCR检测试剂的检测方法，其特征在于：所述步骤四中记录检测数据，然后进行数据统计，记录检测试剂的检测结果。
8.根据权利要求3所述的一种非洲猪瘟荧光PCR检测试剂的检测方法，所述步骤五中，根据检测数据得出检测结果，若检测结果呈阳性，则标本中检出非洲猪瘟病毒DNA，若检测结果呈阴性，则标本中没有检出非洲猪瘟病毒DNA。
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| CN111254220A (zh) * | 2020-02-06 | 2020-06-09 | 成都导胜生物技术有限公司 | 一种用于检测非洲猪瘟病毒dna的组合物及试剂盒 |
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