CN110628951A - 一种非洲猪瘟病毒荧光定量pcr现场快速检测试剂盒 - Google Patents

一种非洲猪瘟病毒荧光定量pcr现场快速检测试剂盒 Download PDF

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李翠翠
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Abstract

本发明涉及一种非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂盒，属于兽用生物诊断制品的生产和技术领域，所述试剂盒包括：缓冲液B1、缓冲液B2、PCR反应液、阳性对照和阴性对照；缓冲液B1快速裂解样品，释放病毒核酸；缓冲液B2：用于稳定提取的病毒核酸，消除对PCR反应的抑制作用；PCR反应液：由2×Premix Ex TaqTM酶混合液和ASFV特异性的上下游引物以及荧光探针组成，其中酶混合液中添加有Tli RnaseH。本发明使用易于裂解的两种缓冲体系直接对样品中的核酸DNA进行裂解，不仅大大减少了样品提取核酸DNA的时间和操作步骤，节省了检测时间，且适于运输和保存。

Description

一种非洲猪瘟病毒荧光定量PCR现场快速检测试剂盒
技术领域
本发明属于兽用生物诊断制品的生产和技术领域，涉及一种非洲猪瘟病毒荧光定量PCR快速检测试剂盒的研制及用途，具体涉及一种快速检测猪和猪肉制品中非洲猪瘟病毒核酸的快速检测试剂盒的研制和应用。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African SwineFever Virus,ASFV)引起的一种急性、热性、高度接触性动物传染病，发病迅速，病死率高达90％以上，严重危及到养猪业的发展。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告疫病，被我国列为一类传染病。2018年8月3日，我国首次ASF暴发于沈阳市某猪场，自此以后我国20多个省份又陆续暴发100多起非洲猪瘟疫情，给我国养猪业带来了巨大损失。ASFV基因组庞大，可达160-190kb，产生的结构蛋白超过了50种，且ASFV感染宿主后诱导宿主产生的中和抗体水平很低甚至不产生中和抗体，这些特性加大了非洲猪瘟的防治难度。尽管非洲猪瘟病毒的主要宿主为家猪和野猪以及软蜱，但其存活能力强、传播途径多样，在粪便、血清、鲜肉和肉制品中均可长期存活，并通过泔水、车辆和人员机械携带、***物和分泌物等不断传播，因此，一个地区一旦发生ASFV后就很难消除。
目前针对ASF防控尚无有效的商品化疫苗，因此疫情防控的监测与诊断变得至关重要。实验室检测ASFV方法有血清学方法和病原学方法，血清学方法主要有间接酶联免疫吸附实验、阻断酶联免疫吸附实验和间接荧光抗体试验；病原学检测方法有直接免疫荧光法、双抗体夹心ELISA法、普通PCR法和荧光PCR法。双抗体夹心酶联免疫吸附试验、聚合酶链式反应和实时荧光聚合酶链式反应等方法是检测ASFV的病原学检测方法。但由于ASFV单克隆抗体的质量和性能不高，双抗体夹心酶联免疫吸附试验基本很少使用，目前主要使用聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光聚合酶链式反应(qPCR)进行非洲猪瘟病原检测。另外由于普通聚合酶链式反应的敏感性比实时荧光聚合酶链式反应低100倍左右，因此，qPCR成为目前最常用的检测ASFV的方法。
目前，荧光定量PCR检测试剂盒是比较常用的现场快速检测方法，其中病毒核酸提取方法包括柱式提取法或磁珠法，这些方法提取的病毒核酸纯度较高，但同时也有很多不足之处：1)病毒核酸的提取过程步骤多，时间久；2)提取所用到的仪器种类多，不适宜于大型企业或养殖业的现场快速检测；3)提取所用到的试剂种类多，取用不便，容易出错；4)提取中使用乙醇等试剂，运输和使用都存在安全隐患；5)提取对操作人员的要求很高，需要对基层人员开展大量培训；6)提取方法的敏感性过高，容易导致检测结果差异性太大。
与此同时，面对非洲猪瘟的紧迫压力，作为防控非洲猪瘟关键环节的屠宰场和养殖场对非洲猪瘟的检测要求不断提高，既要保证检测方法具有较高的敏感性，同时又要快速、简便、可操作性强，对人员、仪器、场地设施和操作水平要求低，因此，本发明针对上述要求，研制了一种能够快速准确检测ASFV的荧光定量PCR快速检测试剂盒，并在实际检测工作中经过了大量用户的检验和认可。
发明内容
本发明的要解决的技术问题在于克服传统提取DNA病毒核酸和荧光定量PCR的繁复步骤，简化核酸提取和扩增过程，研制了一种DNA病毒核酸提取率高、检测灵敏度高、检测范围宽广而准确的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR快速检测试剂盒。应用本试剂盒可实现对动物全血、血清、血浆和动物组织等样品中的ASFV-DNA进行快速而准确高效的测定，为ASF疫情的早期诊断提供强有力的判定依据。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括：缓冲液B1、缓冲液B2、PCR反应液、阳性对照和阴性对照；
所述缓冲液B1：用于快速裂解样品，释放病毒核酸；
所述缓冲液B2：用于稳定提取的病毒核酸，消除对PCR反应的抑制作用；
所述PCR反应液：由2×Premix Ex TaqTM酶混合液和ASFV特异性的上下游引物以及荧光探针组成，其中酶混合液中添加有Tli RNaseH；Tli RNaseH为一种耐热性RNaseH，以DNA为模板进行PCR反应时可以很好的消除抑制PCR反应的阻碍物，引物、探针序列如下所示：
上游引物：5'-GCCGAAGGGAATGGATACTGA-3'
下游引物：5'-CCTATCACGGACGCAACGTA-3'
荧光探针：5'-FAM-ATAGCAAGGTTCACGTTCTCATTA–BHQ1-3'
反应阳性对照：为***pMD-18T载体的一段长为171碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，浓度为1.0×103～1.0×106copies/μL，用于PCR反应的阳性质控，扩增序列如下所示：
5'-gccgaagggaatggatactgagggaatagcaaggttcacgttctcattaaaccaaaagcgcaacttaatccagagcgcaagagggggctgatagtatttaggggtttgaggtccattacagctgtaatgaacattacgtcttatgtccagatacgttgcgtccgtgatagg-3'
阴性对照：用于PCR反应的阴性质控；
进一步，所述缓冲液B1的组分为：异硫氰酸胍1-6M，氯化钠0.1-3M，乙二胺四乙酸0.01-0.5M，调整pH值为8.5-12.7；
进一步，所述缓冲液B2的组分为：醋酸铵0.1-1.0M，Tris-Cl 0.01-1M，调整pH值为7.5-8.5。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明使用易于裂解的两种缓冲体系直接对样品中的核酸DNA进行裂解，不仅大大减少了样品提取核酸DNA的时间和操作步骤，节省了检测时间，而且缓冲液B1和B2中不含有乙醇、苯酚等易燃或有毒性的物质，适于运输和保存。同时，本发明又对ASFV的荧光定量PCR扩增体系进行改进，加入了特异性修饰的酶，使一个管内的PCR反应液包括ASFV的检测引物、特异性探针、缓冲液、Taq聚合酶以及特异性的酶，减少了操作步骤，提高了试验结果的稳定性和定量分析的准确性。
附图说明
图1为全血样本的荧光PCR扩增曲线结果图：横坐标代表扩增循环数，纵坐标代表荧光值强度。
图2为脾脏等组织样本的荧光PCR扩增曲线结果图：横坐标代表扩增循环数，纵坐标代表荧光值强度。
图3为3种不同DNA病毒核酸提取方法的比对。分别通过DNA病毒提取试剂盒(柱式)、磁珠法DNA/RNA病毒核酸提取试剂盒、非洲猪瘟病毒荧光定量PCR快速检测试剂盒提取临床血清中的DNA，然后进行荧光定量PCR反应。横坐标代表扩增循环数，纵坐标代表荧光值强度，图中平行且在横坐标上方的直线代表荧光阈值线。
具体实施方式
结合以下实施例和附图对本发明作进一步说明。但本发明的保护范围不受实施例任何形式上限制。
实施例1：临床全血样本的检测
一种非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括：缓冲液B1、缓冲液B2、PCR反应液、阳性对照和阴性对照；
所述缓冲液B1：异硫氰酸胍1-6M，氯化钠0.1-3M，乙二胺四乙酸0.01-0.5M，调整pH值为8.5-12.7；
所述缓冲液B2的组分为：醋酸铵0.1-1.0M，Tris-Cl 0.01-1M，调整pH值为7.5-8.5。
所述PCR反应液：由2×Premix Ex TaqTM酶混合液和ASFV特异性的上下游引物以及荧光探针组成，其中酶混合液中添加有Tli RNaseH；Tli RNaseH为一种耐热性RNaseH，以DNA为模板进行PCR反应时可以很好的消除抑制PCR反应的阻碍物，引物、探针序列如下所示：
上游引物：5'-GCCGAAGGGAATGGATACTGA-3'
下游引物：5'-CCTATCACGGACGCAACGTA-3'
荧光探针：5'-FAM-ATAGCAAGGTTCACGTTCTCATTA阻碍物上方的直线代
反应阳性对照：为***pMD-18T载体的一段长为171碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，浓度为1.0×103～1.0×106copies/μL，用于PCR反应的阳性质控，扩增序列如下所示：
5'-gccgaagggaatggatactgagggaatagcaaggttcacgttctcattaaaccaaaagcgcaacttaatccagagcgcaagagggggctgatagtatttaggggtttgaggtccattacagctgtaatgaacattacgtcttatgtccagatacgttgcgtccgtgatagg-3'
阴性对照：用于PCR反应的阴性质控；
利用上述试剂盒对临床全血样本的检测，具体方法如下：
1)样品DNA病毒核酸的获取：
(1)缓冲液B1裂解：先取1.5ml离心管加入100μL缓冲液B1，取10份全血(EDTA抗凝)样品，每一份取10μL加入到缓冲液B1中混匀，室温涡旋震荡混匀3～5次，室温裂解3分钟。
(2)缓冲液B2终止裂解：向每份样品的上述混合液中各加入100μL缓冲液B2，涡旋混匀后，12000转/分钟离心1分钟，上清即为PCR待检核酸。
2)荧光PCR扩增反应(在荧光定量PCR扩增仪上进行)
(1)取PCR反应管，每管加入18μL PCR反应液，再依次加入2μL阴性对照、待检测核酸上清液、阳性对照，短暂离心。
(2)将PCR管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称。
(3)荧光检测通道选择(以MyGo Pro仪器为例)：选择FAM通道检测ASFV。
(4)荧光定量PCR反应条件为：95℃20秒，1个循环；40个循环(95℃10秒，58℃20秒)，58℃采集FAM荧光信号。
3)试验结果分析
荧光PCR扩增结束后，通过软件进行自动分析各样本的荧光扩增曲线以及各样本的Ct值。本实例中10例临床全血样本的扩增曲线如附图2所示，Ct值统计如下表1所示。
表1.临床全血样本的检测结果
从图1和上表1可以看出，阴性对照扩增无曲线，阳性对照扩增呈特异性曲线S型，Ct值为18.86，8例临床全血样本均有明显的S型扩增曲线，均有Ct值，判定为阳性样本；2例临床全血样本无明显的S型扩增曲线，均无Ct值，判定为阴性样本。
实施例2：临床组织样本的检测
本实施例所用的试剂盒同实施例1。
1)组织样本前处理
采集3份脾脏、3份***、4份肌肉组织样本，每一份样品称取0.1～0.2g-(黄豆粒大小)，加入10倍体积约1～2ml生理盐水(0.9％氯化钠)，制成组织匀浆液，10000转/分钟离心1分钟，取上清进行下一步核酸提取。
2)样品DNA病毒核酸的获取：
(1)缓冲液B1裂解：先取1.5ml离心管加入100μL缓冲液B1，取10份上述步骤中已经处理好的组织匀浆液样品，每一份取20μL加入到缓冲液B1中混匀，室温涡旋震荡混匀3～5次，室温裂解3分钟。
(2)缓冲液B2终止裂解：向每份样品的上述混合液中各加入100μL缓冲液B2，涡旋混匀后，12000转/分钟离心1分钟，上清即为PCR待检核酸。
3)荧光PCR扩增反应(在荧光定量PCR扩增仪上进行)
(1)取PCR反应管，每管加入18μLPCR反应液，再依次加入2μL阴性对照、待检测核酸上清液、阳性对照，短暂离心。
(2)将PCR管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称。
(3)荧光检测通道选择(以MyGo Pro仪器为例)：选择FAM通道检测ASFV。
(4)荧光定量PCR反应条件为：95℃20秒，个循环；40个循环(95℃10秒，58℃20秒)，58℃采集FAM荧光信号。
3)试验结果分析
荧光PCR扩增结束后，通过软件进行自动分析各样本的荧光扩增曲线以及各样本的Ct值。本实例中10例临床组织样本的扩增曲线如附图3所示，Ct值统计如下表2所示。从图2和表2可以看出，阴性对照扩增无曲线，阳性对照扩增呈特异性曲线S型，Ct值为20，5例临床全血样本均有明显的S型扩增曲线，均有Ct值，判定为阳性样本；2例临床全血样本无明显的S型扩增曲线，均无Ct值，判定为阴性样本。
表2.临床组织样本检测结果
实施例3：不同DNA病毒基因组提取方法对ASFV检测的影响
目前市场上DNA提取试剂盒的种类很多，如柱式提取法、磁珠法等。本实施例选择常见的柱式提取法、磁珠法提取的ASFV核酸以及相应的ASFV荧光定量PCR方法与本发明研制的基于核酸免提取直接扩增的ASFV荧光定量PCR快速检测试剂盒进行比较，探讨不同DNA病毒核酸提取方法对ASFV检测的影响。本实施例选取了2份ASFV临床阳性血清样本作为待检测样品，通过三种方法分别提取DNA后，进行荧光PCR反应。检测步骤如下：
1.样本中DNA的提取
方法1.免提取直接扩增法(同实施例1的试剂盒)
(1)缓冲液B1裂解：取1.5ml离心管依次加入100μL缓冲液B1，然后加入样20μL血清样品混匀，室温涡旋震荡混匀3～5次，室温裂解3分钟。
(2)缓冲液B2终止裂解：向上述混合液中加入100μL缓冲液B2，涡旋混匀后，12000转/分钟离心1分钟，上清为PCR待检核酸。
方法2.柱式提取法
①取200μL全血样本，加入20μL蛋白酶K溶液，混匀，56℃水浴裂解15分钟；
②加入200μL缓冲溶液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟；
③加入200μL无水乙醇，充分震荡混匀15秒；
④将上述溶液加入到一个吸附柱中，12000转/分钟离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；
⑤加入500μLGD到吸附柱中，12000转/分钟离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；
⑥加入600μL漂洗液PW到吸附柱中，12000转/分钟离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；
⑦复步骤⑥；
⑧将吸附柱放回收集管中，空离吸附柱12000转/分钟离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱***一新的离心管内，室温静置2分钟以彻底挥发酒精；
⑨向吸附柱膜中央滴加50μLTE，室温静置2分钟，12000转/分钟离心2分钟，收集洗脱液即提取的核酸。
方法3.磁珠提取法
①200μL血清至1.5ml离心管中，向离心管内加入15μL磁珠悬浮液G，离心管内加入20μL Proteinase K
②样本中加入300μL Carrier RNA工作液，震荡混匀10秒。
③室温孵育10分钟，期间每三分钟上下颠倒混匀10秒，使磁珠与核酸充分结合。短暂离心以收集附着在管壁及管盖的液体。
④离心管从磁力架上取下，加入500μL漂洗液PWC，振荡混匀1分钟，将离心管放置于磁力架上静置1分钟，磁珠完全吸附后，小心吸去液体。
⑤离心管从磁力架上取下，加入500μL漂洗液PWE振荡混匀1分钟。
⑥将离心管放置于磁力架上静置1分钟，磁珠完全吸附后，小心吸去液体。
⑦重复步骤⑤和⑥一次。
⑧离心管于磁力架上，56℃晾干5～10分钟。
⑨将离心管从磁力架上静置2分钟，待磁珠完全吸附后，小心将核酸溶液转移至一个新的离心管中，保存备用。
⑩将离心管从磁力加上取下，加入100μL RNase-Free ddH2O，56℃振荡混匀5分钟。
2.荧光PCR扩增反应(在荧光定量PCR扩增仪上进行)
(1)取PCR反应管，每管加入18μLPCR反应液，再依次加入2μL阴性对照、待检测核酸上清液、阳性对照，短暂离心。
(2)将PCR管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称。
(3)荧光检测通道选择(以MyGo Pro仪器为例)：选择FAM通道检测ASFV。
(4)荧光定量PCR反应条件为：95℃20秒，1个循环；40个循环(95℃10秒，58℃20秒)，58℃采集FAM荧光信号。
3.试验结果分析
3种方法提取DNA后进行荧光PCR扩增反应，通过软件进行自动分析各样本的荧光扩增曲线以及各样本的Ct值。本实例中ASFV检测Ct值统计如下图3和表3所示：
图3显示3种不同DNA病毒核酸提取方法的比对。分别通过DNA病毒提取试剂盒(柱式)、磁珠法DNA/RNA病毒核酸提取试剂盒、非洲猪瘟病毒荧光定量PCR快速检测试剂盒提取临床血清中的DNA，然后进行荧光定量PCR反应。横坐标代表扩增循环数，纵坐标代表荧光值强度，图中平行且在横坐标上方的直线代表荧光阈值线。
表3.3种DNA病毒核酸提取方法检测结果
从上表3可以明显看出，方法1-3提取的核酸DNA进行ASFV检测都有明确的Ct值，表明这3种方法都可以从血液样品中检测出非洲猪瘟病毒。且方法2和3的血液样本中的ASFV检测结果没有明显差异，表明这2种方法的敏感性没有明显差异。但比较这3种方法的检测时间可以看出，方法1仅用时32分钟左右，方法2用时90分钟左右，而方法3用时45分钟左右，显然，方法1更适合临床ASFV-DNA的快速检测。这一结果也看出本发明研制的试剂盒的便捷性所在。
序列表
<110> 青岛立见诊断技术发展中心
<120> 一种非洲猪瘟病毒荧光定量PCR现场快速检测试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccgaaggga atggatactg a 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cctatcacgg acgcaacgta 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atagcaaggt tcacgttctc atta 24
<210> 4
<211> 171
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccgaaggga atggatactg agggaatagc aaggttcacg ttctcattaa accaaaagcg 60
caacttaatc cagagcgcaa gagggggctg atagtattta ggggtttgag gtccattaca 120
gctgtaatga acattacgtc ttatgtccag atacgttgcg tccgtgatag g 171

Claims (1)

1.一种非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括：缓冲液B1、缓冲液B2、PCR反应液、阳性对照和阴性对照；
所述缓冲液B1：用于快速裂解样品，释放病毒核酸；
所述缓冲液B2：用于稳定提取的病毒核酸，消除对PCR反应的抑制作用；
所述PCR反应液：由2×Premix Ex TaqTM酶混合液和ASFV特异性的上下游引物以及荧光探针组成，其中酶混合液中添加有Tli RNaseH；引物、探针序列如下所示：
上游引物：5'-GCCGAAGGGAATGGATACTGA-3'
下游引物：5'-CCTATCACGGACGCAACGTA-3'
荧光探针：5'-FAM-ATAGCAAGGTTCACGTTCTCATTA–BHQ1-3'
反应阳性对照：为***pMD-18T载体的一段长为171碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，浓度为1.0×103～1.0×106copies/μL，用于PCR反应的阳性质控，扩增序列如下所示：
5'-gccgaagggaatggatactgagggaatagcaaggttcacgttctcattaaaccaaaagcgca acttaatccagagcgcaagagggggctgatagtatttaggggtttgaggtccattacagctgtaatga acattacgtcttatgtccagatacgttgcgtccgtgatagg-3'
阴性对照：用于PCR反应的阴性质控；
所述缓冲液B1的组分及终浓度为：异硫氰酸胍1-6M，氯化钠0.1-3M，乙二胺四乙酸0.01-0.5M，pH值为8.5-12.7；
所述缓冲液B2的组分及终浓度为：醋酸铵0.1-1.0M，Tris-Cl 0.01-1M，pH值为7.5-8.5。
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