CN109503435B - 一种新型双发射荧光染料探针及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及双发射荧光染料探针及其制备方法和应用，该探针的结构式如下式I所示：
Figure DDA0001882263560000011
该探针是以双侧异佛尔酮丙二腈为骨架，2,4‑二硝基苯磺酰基作生物硫醇识别位点。与现有技术相比，它的独特之处在于该探针实现了生物硫醇的比率型检测，而不是传统的off‑on型，且成功地进行了活细胞中生物硫醇的荧光共聚焦成像。

Description

一种新型双发射荧光染料探针及其制备与应用
技术领域
本发明属于小分子荧光探针领域，涉及一种比率型生物巯基荧光探针及其制备方法与应用，尤其是涉及一种基于异氟尔酮丙二腈结构的比率型荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
生物硫醇广泛存在于细胞或生物体中，包括半胱氨酸(Cys)，谷胱甘肽(GSH)和高半胱氨酸(Hcy)。它们是通过维持微环境氧化还原稳态来调节细胞功能的关键因素。因此生物硫醇的异常水平将导致许多疾病。例如，GSH作为最丰富的细胞内硫醇(1-10mM)在内源性抗氧化活性中起重要作用，并且GSH水平降低可能与艾滋病，癌症和许多神经***疾病有关，Cys缺乏可导致疾病例如儿童生长缓慢、皮肤病变和虚弱，以及Hcy是心脏病和阿尔茨海默病的危险因素。因此，检测和量化生物***中的硫醇是越来越重要的。
小分子荧光探针是一种生物传感器，具有灵敏度高，方便，成本低，无侵入等优点，能够在生命***中实时检测，操作简单。因此，荧光探测已成为各种检测技术中最方便的方法之一。比率荧光法是通过测量两种不同波长处荧光强度的比值测定目标物的一种分析方法。由于所测得的荧光比值信号能够极大地降低光源强度波动和仪器稳定性变化的影响，从而赋予该方法更高的灵敏度和准确度，因此比率荧光探针的构建引起研究者的广泛关注，已开发出大量用于检测生物硫醇的荧光探针，大多都是Turn-ON型的荧光探针，例如具有蓝色发光的香豆素，具有绿色发光的荧光素，具有绿色或黄色发光的萘酰亚胺，等等，他们大多都是只具有单一波长信号。因此开发具有双发射的荧光染料任然具有较大的意义。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种双发射荧光染料探针及其制备与应用。该探针为以DNBS(2,4-二硝基苯磺酰基)为生物巯基的识别基团，双边异氟尔酮丙二腈为荧光团骨架的一种比率型荧光探针，本发明的荧光染料可以应用于活细胞染色。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种双发射荧光染料探针，其特征在于，该探针的结构式如下式I所示：
Figure GDA0002931753530000021
一种双发射荧光染料探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将异氟尔酮、丙二腈和催化剂加入有机溶剂中，在氮气保护下回流反应10～20h，冷却，将反应液倒入冰水中，析出固体，过滤，得白色固体异氟尔酮丙二腈(式Ⅳ)；
Figure GDA0002931753530000022
(2)将步骤(1)所得异氟尔酮丙二腈与4-羟基间苯二甲醛，以及哌啶加入无水乙醇中，在氮气保护下回流反应2～6h，冷却，减压除去溶剂，用二氯甲烷进行柱层析得到橙红色固体(式Ⅵ)；
Figure GDA0002931753530000023
(3)将2,4-二硝基苯磺酰氯、步骤(2)所得式Ⅵ化合物和三乙胺加入无水乙腈中，并将反应混合物在氮气保护下30～50℃反应0.2～1小时。通过TLC跟踪反应，有浅黄色固体析出，通过过滤，得到目标产物；
Figure GDA0002931753530000031
步骤(1)所述的催化剂包括哌啶，所述的有机溶剂包括乙醇。
步骤(1)所述异氟尔酮、丙二腈、催化剂和有机溶剂的摩尔比为1：(1～2)：(0.2～0.4)：(25～35)。
所述异氟尔酮、丙二腈、催化剂和有机溶剂的摩尔比优选1：1.5：0.35：32。
步骤(2)所述的异氟尔酮丙二腈与4-羟基间苯二甲醛的摩尔比为1：(1～3)；
所述的异氟尔酮丙二腈与哌啶的摩尔体积比为：1:(0.5～2)mmol/d；
所述的异氟尔酮丙二腈与无水乙醇的摩尔体积比为1:8～12mmol/ml。
步骤(3)所述的Ⅵ化合物、2,4-二硝基苯磺酰氯、三乙胺的摩尔比为1：(1～2)：(1.5～2.5)；
所述的Ⅵ化合物与无水乙腈的摩尔体积比为1：35～40mmol/ml。
步骤(3)所述的Ⅵ化合物、2,4-二硝基苯磺酰氯、三乙胺的摩尔比优选1：1.4：2。
一种双发射荧光染料探针的应用，其特征在于，用于检测体外生物巯基以及生物活细胞内的生物巯基。
与现有技术相比，本发明探针是通过在苯环上修饰两个相同的异佛尔酮丙二腈结构并使用DNBS(2,4-二硝基苯磺酰基)作为识别基团来构建的对生物巯基具有比率检测的荧光探针。其由于DNBS(2,4-二硝基苯磺酰基)的猝灭作用，对位异佛尔酮丙二腈的荧光被猝灭，而其对邻位异佛尔酮丙二腈的猝灭作用相对较小。因此，在添加生物硫醇之前，探针CHT的发射波长为497nm。当加入生物硫醇时，猝灭基团DNBS脱离，对位异佛尔酮丙二腈的荧光恢复，电子云重新分布，497nm处的发射消失，共轭体系由于羟基的暴露而变长。因此发射波长红移至568nm，从而实现对生物巯基(497nm至568nm)的比率检测。
本发明的异氟尔酮丙二腈类染料产品毒性小，原料易得，结构简单，合成路线简洁，后处理简单，易于产业化，且对生物巯基的选择性高，响应时间快。
附图说明
图1是制得探针CHT在四氢呋喃和PBS(pH＝7.4,0.01M)的混合溶液中的紫外吸收谱图，以及分别加入Cys、GSH、Hcy后探针CHT的紫外吸收谱图；
图2是制得探针CHT在四氢呋喃和PBS(pH＝7.4,0.01M)的混合溶液中的荧光发射谱图，以及分别加入Cys、GSH、Hcy后探针CHT的荧光发射谱图；
图3是制得探针CHT的选择性测试图；
图4是制得探针CHT对Cys、GSH、Hcy的时间响应的荧光强度变化的散点图(基于最大值处的峰高，568nm，497nm)；
图5是制得探针CHT的细胞毒性测试图；
图6是制得探针CHT的活细胞成像图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1-6中所使用的化学试剂和溶剂都购自商业途径,不需要进一步纯化即可使用。在硅胶板上进行薄层层析(TLC)，使用300-400目的硅胶(HaiLang，青岛)进行柱层析。用ppm以表示化学位移的Bruker AV-400光谱仪(在氘代二甲基亚枫中,用Me4Si作为内标上记录1H和13C NMR。
实施例1：
荧光探针CHT的合成：
(1)2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯-1-亚基)丙二腈(A)的制备：
在50mL的圆底烧瓶中，分别加入异氟尔酮(1.9g，13.7mmol)，丙二腈(1.36g，20.6mml)，哌啶(450μl)，乙醇(25ml)，在氮气保护下回流反应12h。冷却，将反应液倒入50ml的冰水中，析出固体，过滤，得白色固体(2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯-1-亚基)丙二腈(A))，产率85％。
Figure GDA0002931753530000041
(2)2,2'-(((1E，1'E)-(4-羟基-1,3-亚苯基)双(乙烯-2,1-二基))二(5,5-二甲基-2-烯-3-基-1-亚基))二丙二腈(B)的制备：
在25mL的圆底烧瓶中，分别加入4-羟基间苯二甲醛(0.300g，2mmol)，2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯-1-亚基)丙二腈(A)(0.744g，4mml)，哌啶(2d)，无水乙醇(20mL)，在氮气保护下回流反应4h。冷却，减压除去溶剂。用二氯甲烷进行柱层析得到橙红色固体，产率45％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ10.72(s,1H),8.13(d,J＝1.2Hz,1H),7.53(d,J＝6.8Hz,1H),7.44(d,J＝3.2Hz,2H),7.26(d,J＝16.4Hz,2H),6.93(d,J＝8.4Hz,1H),6.84(d,J＝10.8Hz,2H),2.60(s,4H),2.53(s,4H),1.02(d,J＝3.6Hz,12H)；
Figure GDA0002931753530000051
(3)2,4-双((E)-2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)苯基2,4-二硝基苯磺酸盐(CHT)的制备：
将2,4-二硝基苯磺酰氯(0.770g，0.29mmol)，步骤(2)制得的化合物B 2,2'-(((1E，1'E)-(4-羟基-1,3-亚苯基)双(乙烯-2,1-二基))二(5,5-二甲基-2-烯-3-基-1-亚基))二丙二腈(0.100g，0.21mmol)，三乙胺(0.042g，0.40mmol)在无水乙腈(8ml)中混合，并将反应混合物在氮气保护下40℃反应0.5小时。通过TLC跟踪反应，有浅黄色固体析出，通过过滤，得到目标产物，产率40％。
Figure GDA0002931753530000052
探针的基本数据如下：
浅黄色固体粉末
1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ9.179(d,J＝2.4,1H),8.612(d,J＝2Hz,1H),8.248(d,J＝1.6Hz,2H),7.757(d,J＝2Hz,1H),7.534(d,J＝16Hz,1H),7.383(d,J＝8.8Hz,1H),7.326(d,J＝3.6Hz,1H),7.286(d,J＝4Hz,1H),7.020(d,J＝16.4Hz,1H),6.940(s,1H),6.816(s,1H),2.503(d,J＝3.2Hz,8H),1.011(d,J＝14Hz,12H)；
13CNMR(400MHz，DMSO-d6)，δ170.70，170.47，155.52，154.40，152.10，148.59，146.90，136.88，134.09，133.60,128.21，128.00，124.84，124.13，121.25，114.09，113.92，113.40，113.13，78.69，77.88，42.75，42.57，38.70，38.46，32.16，27.89，27.75HRMS(ES+):C39H33N6O7S[M]计算值：716.2053，实际值：716.1953。
实施例2：
探针CHT在四氢呋喃和PBS(pH＝7.4,0.01M)的混合溶液中的紫外吸收谱图，以及分别加入Cys、GSH、Hcy后探针CHT的紫外吸收的变化。
将探针CHT溶于四氢呋喃配置成1×10﹣3M的探针母液，测试时取30μl的探针母液加入到3mL四氢呋喃和PBS(pH＝7.4,0.01M)的混合溶液中，其中四氢呋喃和PBS的体积比为1:1，使得探针最终浓度为10μM，测得探针的紫外吸收光谱，在375nm处有最大吸收。当加入Cys、GSH、Hcy(500μM)后探针的紫外吸收在375nm处逐渐降低，在475nm处逐渐上升，在425nm处出现等吸收点，如图1所示。
实施例3：
探针CHT在四氢呋喃和PBS(pH＝7.4,0.01M)的混合溶液中的荧光发射光谱，以及分别加入Cys、GSH、Hcy后探针CHT的荧光发射的变化。
将探针CHT溶于四氢呋喃配置成1×10﹣3M的探针母液，测试时取30μl的探针母液加入到3mL四氢呋喃和PBS(pH＝7.4,0.01M)的混合溶液中，其中四氢呋喃和PBS的体积比为1:1，使得探针最终浓度为10μM，采用等吸收点的吸收波长425nm为激发波长，发现探针在497nm处有最大的发射峰，当加入Cys、GSH、Hcy(500μM)后探针在497nm处的发射峰逐渐降低，而在568nm处的发射峰逐渐升高，如图2所示，探针体现出对生物巯基很好的比率型的响应。
实施例4：
探针CHT的选择性测试。
接下来，为了测试其他物质是否干扰检测，我们进一步研究了探针CHT对其他分析物的荧光响应。在甘氨酸(Gly)，L-脯氨酸(Pro)，天冬氨酸(Asp)，L-酪氨酸(Tyr)，L存在下，探针CHT没有明显的荧光变化。-精氨酸(精氨酸)，L-谷氨酸(Glu)，L-丙氨酸(Ala)，L-苏氨酸(Thr)，苯丙氨酸(Phe)，DL-丝氨酸(Ser)，L-蛋氨酸(Met)，谷氨酰胺(Gln)。相反，在加入含硫醇的氨基酸(Cys，GSH，Hcy)后，可以看到发射波长从原始的497nm红移到568nm。相同的结果可以用荧光强度的比率表示，并且更直观，如图3所示。上述实验证明探针CHT对三种含硫醇的氨基酸具有高选择性。
实施例5：
制得探针CHT对Cys、GSH、Hcy的时间响应。
我们研究了探针CHT对Cys，GSH，Hcy的时间依赖性荧光变化，如图4所示。将500μM生物硫醇加入到含有10μM CHT的PBS和THF缓冲溶液中后，我们可以在6min内快速观察到CHT的荧光强度比变化，对Cys的响应速度快于GSH和Hcy，在90s内达到稳定状态。说明了探针CHT对生物巯基有有着快速的响应机制。
实施例6：
探针CHT的细胞毒性测试。
采用MTT法测试探针CHT的细胞毒性，收集对数期CHO-k1细胞，铺板，96孔板每孔加入100μl完全培养基(10％小牛血清和90％F-12培养基)，5％CO2，37℃孵育,至细胞单层贴壁，加入浓度梯度的探针CHT，分别孵育12h和24h，每孔加入100μl的MTT(1g/L)溶液，在37℃烘箱中孵育4h，吸去MTT溶液，每空加入150μl的DMSO溶液，并在摇床中摇晃10min，用酶标仪测吸光度，origin处理数据得到图5.
从图5可以得出，当探针的浓度为70μM时，孵育24h，细胞存活率仍然在80％以上，说明该探针的生物相容性高，利于探针在后续生物样品测试中的应用。
实施例7：
制得探针CHT的活细胞共聚焦成像。
首先将CHO-K1细胞与50μM探针CHT孵育30分钟，使它们进入细胞中，用PBS洗涤三次，并通过激光共聚焦显微镜观察。观察到绿色荧光发射通道(通道1：450-510nm)有信号表达，红色荧光通道(通道2：550-700nm)具有信号表达。将细胞与探针CHT一起温育10分钟后，再加入Cys(200μM)一起温育20分钟，通过激光共聚焦显微镜观察，发现绿色通道变暗，红色通道变亮。当用NEM(200μM)预处理CHO-K1细胞30分钟，然后加入探针CHT一起孵育30分钟时，通过激光共聚焦显微镜观察，红色通道变暗并且绿色通道变亮。当将Cys添加到先前用NEM处理的CHO-K1细胞中时，通过激光共聚焦显微镜观察，红色通道重新打开并且绿色通道变暗。另外两种含硫醇的氨基酸(GSH，Hcy)显示出相同的情况，细胞图如图6所示。
上述验证结果表明，探针CHT可以实现对生物体中含巯基氨基酸的比率检测。
其中NEM为N-乙基马来酰亚胺，可以消除细胞内含有巯基的物质。
实施例8
一种双发射荧光染料探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将异氟尔酮、丙二腈和催化剂加入有机溶剂中，在氮气保护下回流反应10～20h，冷却，将反应液倒入冰水中，析出固体，过滤，得白色固体异氟尔酮丙二腈(式Ⅳ)；所述的催化剂包括哌啶，所述的有机溶剂包括乙醇；所述异氟尔酮、丙二腈、催化剂和有机溶剂的摩尔比为1：(1～2)：(0.2～0.4)：(25～35)。
所述异氟尔酮、丙二腈、催化剂和有机溶剂的摩尔比优选1：1.5：0.35：32。
Figure GDA0002931753530000081
(2)将步骤(1)所得异氟尔酮丙二腈与4-羟基间苯二甲醛，以及哌啶加入无水乙醇中，在氮气保护下回流反应2～6h，冷却，减压除去溶剂，用二氯甲烷进行柱层析得到橙红色固体(式Ⅵ)；
所述的异氟尔酮丙二腈与4-羟基间苯二甲醛的摩尔比为1：(1～3)；
所述的异氟尔酮丙二腈与哌啶的摩尔体积比为：1:(0.5～2)mmol/d；
所述的异氟尔酮丙二腈与无水乙醇的摩尔体积比为1:8～12mmol/ml。
Figure GDA0002931753530000091
(3)将2,4-二硝基苯磺酰氯、步骤(2)所得式Ⅵ化合物和三乙胺加入无水乙腈中，并将反应混合物在氮气保护下30～50℃反应0.2～1小时。通过TLC跟踪反应，有浅黄色固体析出，通过过滤，得到目标产物；
所述的Ⅵ化合物、2,4-二硝基苯磺酰氯、三乙胺的摩尔比为1：(1～2)：(1.5～2.5)；
所述的Ⅵ化合物与无水乙腈的摩尔体积比为1：35～40mmol/ml。
步骤(3)所述的Ⅵ化合物、2,4-二硝基苯磺酰氯、三乙胺的摩尔比优选1：1.4：2。
Figure GDA0002931753530000092
得到的探针，用于检测体外生物巯基以及生物活细胞内的生物巯基。
实施例8
一种双发射荧光染料探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将异氟尔酮、丙二腈和催化剂加入有机溶剂中，在氮气保护下回流反应10h，冷却，将反应液倒入冰水中，析出固体，过滤，得白色固体异氟尔酮丙二腈(式Ⅳ)；所述的催化剂包括哌啶，所述的有机溶剂包括乙醇；所述异氟尔酮、丙二腈、催化剂和有机溶剂的摩尔比为1：1：0.2：25。
Figure GDA0002931753530000101
(2)将步骤(1)所得异氟尔酮丙二腈与4-羟基间苯二甲醛，以及哌啶加入无水乙醇中，在氮气保护下回流反应2h，冷却，减压除去溶剂，用二氯甲烷进行柱层析得到橙红色固体(式Ⅵ)；
所述的异氟尔酮丙二腈与4-羟基间苯二甲醛的摩尔比为1：1；
所述的异氟尔酮丙二腈与哌啶的摩尔体积比为：1:0.5mmol/d；
所述的异氟尔酮丙二腈与无水乙醇的摩尔体积比为1:8mmol/ml。
Figure GDA0002931753530000102
(3)将2,4-二硝基苯磺酰氯、步骤(2)所得式Ⅵ化合物和三乙胺加入无水乙腈中，并将反应混合物在氮气保护下30℃反应1小时。通过TLC跟踪反应，有浅黄色固体析出，通过过滤，得到目标产物；
所述的Ⅵ化合物、2,4-二硝基苯磺酰氯、三乙胺的摩尔比为1：1：1.5；
所述的Ⅵ化合物与无水乙腈的摩尔体积比为1：35mmol/ml。
Figure GDA0002931753530000103
得到的探针，用于检测体外生物巯基以及生物活细胞内的生物巯基。
实施例9
一种双发射荧光染料探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将异氟尔酮、丙二腈和催化剂加入有机溶剂中，在氮气保护下回流反应20h，冷却，将反应液倒入冰水中，析出固体，过滤，得白色固体异氟尔酮丙二腈(式Ⅳ)；所述的催化剂包括哌啶，所述的有机溶剂包括乙醇；所述异氟尔酮、丙二腈、催化剂和有机溶剂的摩尔比为1：2：0.4：35。
Figure GDA0002931753530000111
(2)将步骤(1)所得异氟尔酮丙二腈与4-羟基间苯二甲醛，以及哌啶加入无水乙醇中，在氮气保护下回流反应6h，冷却，减压除去溶剂，用二氯甲烷进行柱层析得到橙红色固体(式Ⅵ)；
所述的异氟尔酮丙二腈与4-羟基间苯二甲醛的摩尔比为1：3；
所述的异氟尔酮丙二腈与哌啶的摩尔体积比为：1:2mmol/d；
所述的异氟尔酮丙二腈与无水乙醇的摩尔体积比为1:12mmol/ml。
Figure GDA0002931753530000112
(3)将2,4-二硝基苯磺酰氯、步骤(2)所得式Ⅵ化合物和三乙胺加入无水乙腈中，并将反应混合物在氮气保护下50℃反应0.2小时。通过TLC跟踪反应，有浅黄色固体析出，通过过滤，得到目标产物；
所述的Ⅵ化合物、2,4-二硝基苯磺酰氯、三乙胺的摩尔比为1：2：2.5；
所述的Ⅵ化合物与无水乙腈的摩尔体积比为1：40mmol/ml。
Figure GDA0002931753530000113
。
得到的探针，用于检测体外生物巯基以及生物活细胞内的生物巯基。

Claims (9)

1.一种双发射荧光染料探针，其特征在于，该探针的结构式如下式I所示：
Figure FDA0002931753520000011
2.一种如权利要求1所述的双发射荧光染料探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将异氟尔酮、丙二腈和催化剂加入有机溶剂中，在氮气保护下回流反应10～20h，冷却，将反应液倒入冰水中，析出固体，过滤，得白色固体异氟尔酮丙二腈(式Ⅳ)；
Figure FDA0002931753520000012
(2)将步骤(1)所得异氟尔酮丙二腈与4-羟基间苯二甲醛，以及哌啶加入无水乙醇中，在氮气保护下回流反应2～6h，冷却，减压除去溶剂，用二氯甲烷进行柱层析得到橙红色固体(式Ⅵ)；
Figure FDA0002931753520000013
(3)将2,4-二硝基苯磺酰氯、步骤(2)所得式Ⅵ化合物和三乙胺加入无水乙腈中，并将反应混合物在氮气保护下30～50℃反应0.2～1小时；通过TLC跟踪反应，有浅黄色固体析出，通过过滤，得到目标产物；
Figure FDA0002931753520000021
3.根据权利要求2所述的双发射荧光染料探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的催化剂为哌啶，所述的有机溶剂为乙醇。
4.根据权利要求2所述的双发射荧光染料探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述异氟尔酮、丙二腈、催化剂和有机溶剂的摩尔比为1：(1～2)：(0.2～0.4)：(25～35)。
5.根据权利要求4所述的双发射荧光染料探针的制备方法，其特征在于，所述异氟尔酮、丙二腈、催化剂和有机溶剂的摩尔比为1：1.5：0.35：32。
6.根据权利要求2所述的双发射荧光染料探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的异氟尔酮丙二腈与4-羟基间苯二甲醛的摩尔比为1：(1～3)；
所述的异氟尔酮丙二腈与哌啶的摩尔体积比为：1:(0.5～2)mmol/滴；
所述的异氟尔酮丙二腈与无水乙醇的摩尔体积比为1:8～12mmol/ml。
7.根据权利要求2所述的双发射荧光染料探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的Ⅵ化合物、2,4-二硝基苯磺酰氯、三乙胺的摩尔比为1：(1～2)：(1.5～2.5)；
所述的Ⅵ化合物与无水乙腈的摩尔体积比为1：35～40mmol/ml。
8.根据权利要求7所述的双发射荧光染料探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的Ⅵ化合物、2,4-二硝基苯磺酰氯、三乙胺的摩尔比为1：1.4：2。
9.一种如权利要求1所述的双发射荧光染料探针非疾病诊断和治疗方法的应用，其特征在于，用于检测体外生物巯基以及生物活细胞内的生物巯基。
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