CN112679386B

CN112679386B - 一种用于检测4-甲基苯硫酚的荧光探针及其制备方法

Info

Publication number: CN112679386B
Application number: CN202110103268.8A
Authority: CN
Inventors: 张改清; 阴彩霞
Original assignee: Luliang University
Current assignee: Luliang University
Priority date: 2021-01-26
Filing date: 2021-01-26
Publication date: 2021-12-10
Anticipated expiration: 2041-01-26
Also published as: CN112679386A

Abstract

本发明公开了一种用于检测4‑甲基苯硫酚的荧光探针，是具有以下结构式（I）的化合物。本发明荧光探针在4‑甲基苯硫酚作用下能够释放出荧光基团，方便灵敏地通过荧光信号特异性检测4‑甲基苯硫酚，消除4‑甲基苯硫酚检测过程中其他含巯基物质的干扰，可以用于检测生物体系或环境体系中的4‑甲基苯硫酚，也可以实现活细胞中4‑甲基苯硫酚的外源性检测。

Description

一种用于检测4-甲基苯硫酚的荧光探针及其制备方法

技术领域

本发明属于荧光探针检测技术领域，涉及一种基于异氟尔酮衍生物荧光基团的荧光探针，以及该探针在4-甲基苯硫酚检测中的应用。

背景技术

4-甲基苯硫酚被广泛用作农药生产、制药工程和化学合成生产中的重要中间体。但其的使用不可避免地面临着高毒性和高污染的重要问题。

4-甲基苯硫酚具有强的刺激性和高毒性，对鱼类的半致死剂量（LC₅₀）范围0.01～0.4 mM，对小鼠的半致死剂量（LC₅₀）2.15～46.2 mg·kg^-1。在生物***中，长期接触4-甲基苯硫酚会严重损害中枢神经和其他神经***，包括呼吸急促，肌肉无力，后肢麻痹，昏迷甚至死亡。因此，考虑到其对生物和环境的不良影响，开发一种简单、灵敏和具有选择性的检测4-甲基苯硫酚方法是非常有必要的。

荧光探针检测方法由于具有成本低、高灵敏以及原位可视化等特性，被普遍认为有广泛的应用前景。

其中，异氟尔酮具有优良的光学性能和良好的生物兼容性，被广泛应用于荧光探针的构建，基于异氟尔酮衍生物的荧光探针近年来得到了一定的发展。尽管如此，由于异氟尔酮的发射波长低于550 nm，无法高效成像活体中目标的检测。

尽管近几年关于4-甲基苯硫酚检测的荧光探针研究得到了发展，但是这些荧光探针对于4-甲基苯硫酚的选择性仍然会受到其他含巯基物质的干扰。因此，研究对于4-甲基苯硫酚具有高灵敏性、高选择识别能力的荧光探针，仍然具有一定的挑战性。

CN 105524612A公开了一种异氟尔酮类荧光探针及其制备方法，该荧光探针采用异氟尔酮作为荧光基团，2,4-二硝基苯基作为反应位点，通过与HS^-的亲核取代反应，切割断裂2,4-二硝基苯基部分，释放出荧光基团，实现对目标硫化氢的检测。

但是，由于该荧光探针中2,4-二硝基苯基反应位点的活性较高，容易受其他含有巯基活性物质的干扰，荧光探针的检测专属性不强。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于高选择性检测4-甲基苯硫酚的长波长荧光探针，以消除4-甲基苯硫酚检测过程中其他含巯基物质的干扰。

本发明所述的用于检测4-甲基苯硫酚的荧光探针是具有以下结构式（I）的化合物，其化学名称(E)-2-(3-(4-(4-(2,4-二硝基苯氧基)-3-甲氧基苯乙烯))-5,5-二甲基环己-2-烯-1-亚丙基)丙二腈。

。

进而，本发明还提供了一种所述结构式（I）所示化合物的制备方法，是先以异氟尔酮与丙二腈进行Knoevenagel缩合反应，制备得到结构式（II）所示的第一中间体，再以所述第一中间体与4-羟基-3-甲氧基苯甲醛进行羟醛缩合反应，制备得到结构式（III）所示的第二中间体，最后以所述第二中间体与1-氟-2,4-二硝基苯进行Williamson醚合成反应，制备得到所述结构式（I）所示的化合物。

；

。

上述制备过程可以以下述反应方程式进行表述。

。

本发明上述结构式（I）所示的化合物可以作为荧光探针，用于检测4-甲基苯硫酚。

具体地，本发明所述的荧光探针可以用于检测生物体系或环境体系中存在的微量4-甲基苯硫酚。

更具体地，所述的环境体系包括但不限于是江河湖泊水系、土壤、各种工业或医用废水。

本发明提供的荧光探针在异氟尔酮的苯环上引入了推电子基团甲氧基，并以2,4-二硝基苯酚与其连接，通过甲氧基的推电子能力，钝化了2,4-二硝基苯基的反应活性，构建出了一种仅针对4-甲基苯硫酚具有选择性的特异性反应位点，以其用于4-甲基苯硫酚的荧光检测。

本发明以2,4-二硝基苯作为荧光开关，修饰二氰基异佛尔酮衍生物，获得了用于特异性检测4-甲基苯硫酚的荧光探针。由于2,4-二硝基苯强的吸电子能力导致的部分光致电子转移（PET）过程，所述荧光探针本身基本上只有较弱的荧光。而当4-甲基苯硫酚通过芳香族亲核取代反应与荧光探针发生反应后，2,4-二硝基苯基部分离去，释放出化合物（III），荧光响应信号开启（Turn-on），在594 nm处具有最大荧光发射强度。

进一步地，本发明提供的荧光探针不仅可以定性检测被测对象中是否存在有4-甲基苯硫酚，还可以定量地检测出被测对象中的4-甲基苯硫酚含量。

本发明荧光探针用于检测4-甲基苯硫酚的检出限为0.65 μmol·L^-1。

更进一步地，本发明提供的荧光探针被应用于在活细胞HeLa中成像外源性4-甲基苯硫酚。

具体地，是将荧光探针与HeLa细胞共同孵育，再加入外源性4-甲基苯硫酚孵育，由于荧光探针可以与孵育后进入细胞中的4-甲基苯硫酚进行反应释放出荧光基团，显示红色发射，因而可以检测到孵育后进入细胞中的4-甲基苯硫酚。

本发明提供的荧光探针在与4-甲基苯硫酚反应后，能够释放出荧光基团团发射出红色信号，可用于可视化检测4-甲基苯硫酚。

本发明的荧光探针具有较长的发射波长，与4-甲基苯硫酚反应后表现为近600 nm的红色发射，同时还具有较高的灵敏度，其检出限可以达到0.65 μmol·L^-1。

本发明的荧光探针还具有良好的膜通透性，将其与细胞孵育容易进入细胞中，成功应用到HeLa细胞中实现了对4-甲基苯硫酚的外源性检测。

本发明荧光探针合成方法简便，容易获得。

附图说明

图1是实施例1制备目标产物的核磁共振氢谱图。

图2是实施例1制备目标产物的核磁共振碳谱图。

图3是实施例1制备目标产物的质谱图。

图4是荧光探针与4-甲基苯硫酚作用不同时间的紫外吸收谱图。

图5是荧光探针与4-甲基苯硫酚作用不同时间的荧光发射谱图。

图6是荧光探针与4-甲基苯硫酚作用的动力学图。

图7是在荧光探针测定4-甲基苯硫酚中加入各种分析物的荧光柱状图。

图8是荧光探针测定4-甲基苯硫酚的工作曲线。

图9是荧光探针测定4-甲基苯硫酚的活细胞激光共聚焦成像。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例和应用例作进一步的详细描述。以下实施例和应用例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，从而使本领域技术人员能很好地理解和利用本发明，而不是限制本发明的保护范围。

本发明实施例和应用例中涉及到的实验方法、生产工艺、仪器以及设备，其名称和简称均属于本领域内常规的名称，在相关用途领域内均非常清楚明确，本领域内技术人员能够根据该名称理解常规工艺步骤并应用相应的设备，按照常规条件或制造商建议的条件进行实施。

本发明实施例和应用例中使用的各种原料或试剂，并没有来源上的特殊限制，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明提供了一种荧光探针，用于检测4-甲基苯硫酚，所述荧光探针是具有以下结构式（I）的化合物，以下简称为（I）。

。

本发明所述荧光探针的化学名称为(E)-2-(3-(4-(4-(2,4-二硝基苯氧基)-3-甲氧基苯乙烯))-5,5-二甲基环己-2-烯-1-亚丙基)丙二腈。

英文名称：(E)-2-(3-(4-(2,4-dinitrophenoxy)-3-methoxystyryl)-5,5-dimethylcyclohex-2-en- 1-ylidene)malononitril。

所述化合物根据以下方程式，按照下述的具体步骤制备得到。

。

1）、在含有乙酸的溶剂乙醇中加入反应用量的异氟尔酮和丙二腈，滴加哌啶回流反应制备结构式（II）的化合物，以下简称为（II）。

2）、在惰性气氛中，向含有反应用量的（II）和4-羟基-3-甲氧基苯甲醛的溶剂乙醇中滴加哌啶，加热回流反应得到结构式（III）的化合物，以下简称为（III）。

3）、以反应用量的（III）和1-氟-2,4-二硝基苯在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，碳酸钾存在下反应制备目标产物（I）。

具体地，所述步骤1）中，异氟尔酮与丙二腈的摩尔用量为1:(1～1.5)。

具体地，所述步骤1）中，所述回流反应在60～80℃下进行，优选的回流反应时间为12～16 h。

具体地，所述步骤2）中，（II）与4-羟基-3-甲氧基苯甲醛的摩尔用量为1:(1～1.5)。

具体地，所述步骤2）中，所述回流反应在60～75℃下进行，优选的回流反应时间为8～10 h。

具体地，所述步骤3）中，（III）与1-氟-2,4-二硝基苯的摩尔用量为1:(1～1.5)。

具体地，所述步骤3）中，所述碳酸钾的用量为（III）质量的2～2.5倍。

具体地，所述步骤3）中，所述反应在常温下进行，优选的反应时间为2～3 h。

实施例1。

向100 mL乙醇中加入异氟尔酮（1.38 g，10 mmol）和丙二腈（0.72 g，12 mmol），滴加几滴冰乙酸，然后滴加入100 μL哌啶，70℃回流反应12 h。反应完成后，将混合溶液冷却至室温，倒入冰水中，保持过夜。将溶液过滤、洗涤，以正庚烷重结晶，获得淡黄色的化合物（II）固体。

氮气氛中，将化合物（II）（1.86 g，10 mmol）和4-羟基-3-甲氧基苯甲醛（1.59 g，13 mmol）溶解在15 mL无水乙醇中，然后滴加100 μL哌啶，加热至70℃回流反应8 h。反应完成后，将溶液真空蒸发并通过柱色谱法纯化（二氯甲烷/乙酸乙酯＝6∶1，V/V），得到黄色的化合物（III）固体。

向溶解有化合物（III）（0.64 g，2.0 mmol）的10 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液中加入1-氟-2,4-二硝基苯（0.39 g，2.1 mmol）和K₂CO₃（0.55 g，4 mmol），室温搅拌反应，反应过程通过TLC监测。2 h后完成反应，除去溶剂，所得粗产品通过柱色谱法纯化（乙酸乙酯/石油醚＝1∶3，V/V），得到深黄色固体(E)-2-(3-(4-(4-(2,4-二硝基苯氧基)-3-甲氧基苯乙烯))-5,5-二甲基环己-2-烯-1-亚丙基)丙二腈（I）目标产物。

通过图1、图2的核磁共振氢谱、碳谱图以及图3的质谱图结构表征，证明上述制备得到了设计结构的目标产物（I）。

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d ₆) δ 8.90 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 8.41 (d, J =9.2 Hz, 1H), 7.67 (d, J = 21.9 Hz, 1H), 7.59–7.47 (m, 1H), 7.45–7.30 (m, 3H),7.03 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 6.93 (s, 1H), 3.83 (d, J = 19.3 Hz, 3H), 2.63 (d, J= 18.8 Hz, 2H), 2.57 (s, 2H), 1.04 (s, 6H)。

¹³C NMR (151 MHz, DMSO-d ₆) δ 170.8, 156.1, 155.4 , 151.4, 142.2,141.6, 138.8, 137.0, 136.4, 130.8, 130.00, 123.6, 123.1, 122.5, 122.3, 118.1,114.3, 113.5, 112.6, 77.2, 56.6, 42.8, 38.7, 32.2, 27.9。

ESI-MS m/z：[（I）-H]^-理论值[C₂₆H₂₂N₄O₆-H]^-485.1461；实测值为485.14702。

实施例2。

向100 mL乙醇中加入异氟尔酮（2.76 g，20 mmol）和丙二腈（1.50 g，25 mmol），滴加几滴冰乙酸，然后滴加入200 μL哌啶，75℃回流反应12 h。反应完成后，将混合溶液冷却至室温，倒入冰水中，保持过夜。将溶液过滤、洗涤，将粗产物通过柱色谱法纯化（淋洗液二氯甲烷），获得淡黄色的化合物（II）固体。

氮气氛中，将化合物（II）（1.86 g，10 mmol）和4-羟基-3-甲氧基苯甲醛（1.83 g，15 mmol）溶解在20 mL无水乙醇中，然后滴加100 μL哌啶，加热至70℃回流反应12 h。反应完成后，将溶液真空蒸发并通过柱色谱法纯化（二氯甲烷/乙酸乙酯＝6∶1，V/V），得到黄色的化合物（III）固体。

向溶解有化合物（III）（0.64 g，2.0 mmol）的10 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液中加入1-氟-2,4-二硝基苯（0.46 g，2.5 mmol）和K₂CO₃（0.55 g，4 mmol），室温搅拌反应，反应过程通过TLC监测。2 h后完成反应，除去溶剂，所得粗产品通过柱色谱法纯化（乙酸乙酯/石油醚＝1∶3，V/V），得到深黄色固体(E)-2-(3-(4-(4-(2,4-二硝基苯氧基)-3-甲氧基苯乙烯))-5,5-二甲基环己-2-烯-1-亚丙基)丙二腈（I）目标产物。

实施例3。

向100 mL乙醇中加入异氟尔酮（1.38 g，10 mmol）和丙二腈（0.90 g，15 mmol），滴加几滴冰乙酸，然后滴加入100 μL哌啶，65℃回流反应12 h。反应完成后，将混合溶液冷却至室温，倒入冰水中，保持过夜。将溶液过滤、洗涤，以正庚烷重结晶，获得淡黄色的化合物（II）固体。

氮气氛中，将化合物（II）（1.67 g，9 mmol）和4-羟基-3-甲氧基苯甲醛（1.58 g，13mmol）溶解在15 mL无水乙醇中，然后滴加100 μL哌啶，加热至70℃回流反应8 h。反应完成后，将溶液真空蒸发并通过柱色谱法纯化（二氯甲烷/乙酸乙酯＝6∶1，V/V），得到黄色的化合物（III）固体。

向溶解有化合物（III）（0.64 g，2.0 mmol）的10 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液中加入1-氟-2,4-二硝基苯（0.56 g，3.0 mmol）和K₂CO₃（0.55 g，4 mmol），室温搅拌反应，反应过程通过TLC监测。2 h后完成反应，除去溶剂，所得粗产品通过柱色谱法纯化（乙酸乙酯/石油醚＝1∶3，V/V），得到深黄色固体(E)-2-(3-(4-(4-(2,4-二硝基苯氧基)-3-甲氧基苯乙烯))-5,5-二甲基环己-2-烯-1-亚丙基)丙二腈（I）目标产物。

应用例1。

配制pH=7.4、浓度10 mM的PBS缓冲溶液。

配制浓度2 mM的（I）的DMSO溶液，作为荧光探针溶液。

配制浓度4 mM的4-甲基苯硫酚DMSO溶液。

在紫外比色皿和荧光比色皿中各加入上述PBS缓冲溶液1.0 mL、DMSO溶液1.0mL混匀，微量进样器吸取5 μL荧光探针溶液，加入到紫外比色皿和荧光比色皿中，检测荧光探针自身的紫外吸收值和荧光强度。

荧光探针溶液在405 nm处有强的紫外吸收，但无荧光发射。放置1 h后，荧光探针溶液的紫外吸收值保持不变，并依然没有荧光发射。

以微量进样器吸取10 μL 4-甲基苯硫酚DMSO溶液，分别加入到上述紫外比色皿和荧光比色皿中，在紫外分光光度仪和荧光分光光度仪上每间隔10 min进行一次检测，考察紫外吸收值以及荧光发射峰位置和荧光强度值随时间的变化。

图4给出了荧光探针的紫外吸收光谱随时间的变化趋势。图中，刚加入4-甲基苯硫酚DMSO溶液时，荧光探针仅在405 nm处有一个强的紫外吸收峰。随着时间的增加，405 nm处的紫外吸收峰值逐渐下降且红移至442 nm处，同时在598 nm处出现了新的紫外吸收且峰值逐渐升高，并伴随着溶液颜色由浅黄色变为深黄色。说明荧光探针与4-甲基苯硫酚反应生成了新的化合物。90 min后，紫外吸收值不再发生变化。

从图4中还可以看出，荧光探针在420 nm处具有最大吸收波长。因此，本发明选择420 nm作为荧光发射的激发波长。

图5给出了420 nm紫外光激发下，荧光探针的荧光发射光谱随时间的变化趋势。图中，刚加入4-甲基苯硫酚DMSO溶液时，基本没有荧光发射。随着时间的增加，在594 nm处开始出现明显的荧光发射峰，并随着时间增加，荧光强度不断增强。约90 min后，荧光强度值基本上不再改变。

因此，本发明确定在荧光探针与4-甲基苯硫酚反应90 min后，作为检测荧光探针荧光强度的最佳测试时间。

图6则利用荧光光谱法提供了以荧光探针检测4-甲基苯硫酚的光动力学特性。

图6中，在持续光照1.5 h后，荧光探针的荧光强度基本不变，证明荧光探针具有一定的光稳定性。

将不同浓度（0、5、10、15、20、25和30 μmol·L^-1）的4-甲基苯硫酚溶液加入到含有5μmol·L^-1荧光探针的检测体系中，可以看出，在4-甲基苯硫酚浓度为20 μmol·L^-1，时间约90 min时，荧光响应信号基本达到一个动态平衡状态。

应用例2。

在一系列共40个荧光比色皿中，各加入1.0 mL PBS缓冲溶液、1.0mL DMSO溶液和5μL荧光探针溶液，再分别加入100 μM的以下各种分析物，在420 nm紫外光激发下检测各溶液在594 nm处的荧光强度。

a）1. 未加其他分析物，2. K⁺，3. Ca²⁺，4. Zn²⁺，5. Ag⁺，6. Mg²⁺，7. Cl^-，8. F^-，9.Br^-，10. S₂O₃ ^2-，11. HSO₄ ^-，12. SO₄ ^2-，13. NO₂ ^-，14. CO₃ ^2-，15. HCO₃ ^-；1. 20 μM 4-甲基苯硫酚，2. 20 μM 4-甲基苯硫酚+K⁺，3. 20 μM 4-甲基苯硫酚+Ca²⁺，4. 20 μM 4-甲基苯硫酚+Zn²⁺，5. 20 μM 4-甲基苯硫酚+Ag⁺，6. 20 μM 4-甲基苯硫酚+Mg²⁺，7. 20 μM 4-甲基苯硫酚+Cl^-，8. 20 μM 4-甲基苯硫酚+F^-，9. 20 μM 4-甲基苯硫酚+Br^-，10. 20 μM 4-甲基苯硫酚+S₂O₃ ^2-，11. 20 μM 4-甲基苯硫酚+HSO₄ ^-，12. 20 μM 4-甲基苯硫酚+SO₄ ^2-，13. 20 μM 4-甲基苯硫酚+NO₂ ^-，14. 20 μM 4-甲基苯硫酚+CO₃ ^2-，15. 20 μM 4-甲基苯硫酚+HCO₃ ^-。各溶液的荧光强度见图7中的 a。

b）1. Cys，2. Hcy，3. GSH，4. H₂S，5. 未加其他分析物；1. 20 μM 4-甲基苯硫酚+Cys，2. 20 μM 4-甲基苯硫酚+Hcy，3. 20 μM 4-甲基苯硫酚+GSH，4. 20 μM 4-甲基苯硫酚+ H₂S, 5. 未加其他分析物。各溶液的荧光强度见图7中的 b。

根据图7的荧光强度可以看出，其他分析物不能引起荧光探针在594 nm处的荧光强度增强，而只有在4-甲基苯硫酚（20 μM）存在的情况下，荧光探针在594 nm处的荧光强度才能增强。

上述结果表明，本发明荧光探针可以较好的选择性识别4-甲基苯硫酚，其他分析物的存在不干扰荧光探针对4-甲基苯硫酚的检测。

应用例3。

向6个荧光比色皿中1.0 mL PBS（pH 7.4）缓冲溶液与1.0 mL DMSO的混合体系中加入5 μL荧光探针溶液，再分别加入0、2、4、6、8、10 μL的4-甲基苯硫酚（2 mM）溶液，在荧光分光光度仪上测定各溶液在594 nm处对应的荧光强度。

以4-甲基苯硫酚溶液的浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，得到图8所示的4-甲基苯硫酚浓度工作曲线图。

荧光探针与4-甲基苯硫酚浓度之间呈现出良好的线性关系，线性回归方程y =144.24949 + 25.3204 c，R² = 0.99825，c的单位为μM。

经计算，可以得出4-甲基苯硫酚的检测限为0.65 μmol·L^-1。

将1.0 mL pH 7.4的PBS缓冲溶液、1.0 mL DMSO混合均匀，与5 μL荧光探针溶液一起加入到干净的荧光比色皿中，用微量进样器吸取V µL待测样品溶液，加入到此荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上进行检测。

以测得的荧光强度代入上述线性回归方程中得到浓度c，则待测样品c_待测样=2000 µL × c × 10^-6/ VµL，即可求得待测样品中4-甲基苯硫酚的浓度。

应用例4。

将HeLa细胞接种在激光共聚焦培养皿中，并将细胞于37℃、5% CO₂孵育箱中继续培养24 h以进行荧光成像实验。

荧光成像通过共聚焦激光扫描显微镜进行。

在种有HeLa细胞的激光共聚焦培养皿中，用荧光探针溶液预处理20 min，以PBS缓冲溶液洗涤细胞，然后外加20 μM 4-甲基苯硫酚溶液，37℃下孵育30 min，用458 nm激发获得在红色通道中的活细胞激光共聚焦成像。

如图9所示，相比最初只有荧光探针溶液时没有明显的荧光信号，随着外孵育4-甲基苯硫酚，在红色通道观察到了细胞内明显的荧光信号。

由此可见，本发明的荧光探针表现出良好的细胞渗透性，以及对细胞内外源性4-甲基苯硫酚的检测能力，4-甲基苯硫酚进入细胞内后，加入荧光探针可以通过发射荧光信号的方式定位4-甲基苯硫酚在细胞内的分布，进一步为生物体内各组织成像提供可能。

本发明以上实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制本发明仅为以上所述实施例。本领域普通技术人员在不脱离本发明原理和宗旨的情况下，针对这些实施例进行的各种变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于检测4-甲基苯硫酚的荧光探针，是具有以下结构式（I）的化合物，化学名称(E)-2-(3-(4-(4-(2,4-二硝基苯氧基)-3-甲氧基苯乙烯))-5,5-二甲基环己-2-烯-1-亚丙基)丙二腈：

。

2.权利要求1所述荧光探针的制备方法，是先以异氟尔酮与丙二腈进行Knoevenagel缩合反应，制备得到结构式（II）所示的第一中间体，再以所述第一中间体与4-羟基-3-甲氧基苯甲醛进行羟醛缩合反应，制备得到结构式（III）所示的第二中间体，最后以所述第二中间体与1-氟-2,4-二硝基苯进行Williamson醚合成反应，制备得到所述结构式（I）所示的化合物：

；

。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是包括：

1）、在含有乙酸的溶剂乙醇中加入反应用量的异氟尔酮和丙二腈，滴加哌啶回流反应制备结构式（II）所示的第一中间体；

2）、在惰性气氛中，向含有反应用量的第一中间体和4-羟基-3-甲氧基苯甲醛的溶剂乙醇中滴加哌啶，加热回流反应得到结构式（III）所示的第二中间体；

3）、以反应用量的第二中间体和1-氟-2,4-二硝基苯在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，碳酸钾存在下反应制备得到结构式（I）所示的化合物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是所述异氟尔酮与丙二腈的摩尔用量为1:(1～1.5)，第一中间体与4-羟基-3-甲氧基苯甲醛的摩尔用量为1:(1～1.5)，第二中间体与1-氟-2,4-二硝基苯的摩尔用量为1:(1～1.5)。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是所述步骤1）回流反应在60～80℃下进行，反应时间12～16 h，步骤2）回流反应在60～75℃下进行，反应时间8～10 h，步骤3）反应在常温下进行，反应时间2～3 h。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是所述碳酸钾的用量为第二中间体质量的2～2.5倍。