CN109464661A - 一种疫苗抗原组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种疫苗抗原组合物，所述组合物包括疫苗抗原和胆碱型离子液体。本发明的疫苗抗原组合物通过添加具有良好生物相容性的胆碱型离子液体作为添加剂，显著提高疫苗抗原的热稳定性、反复冻融稳定性、加速稳定性以及长期储存稳定性，显著提高抗原在溶液和佐剂环境中的稳定性且不影响抗原活性。

Description

一种疫苗抗原组合物及其制备方法
技术领域
本发明属于疫苗研究领域，涉及一种疫苗抗原组合物及其制备方法，尤其涉及一种包含胆碱型离子液体的疫苗抗原组合物及其制备方法。
背景技术
抗原是疫苗的最主要组成成分，基于病毒颗粒的抗原是目前在人用疫苗和兽用疫苗领域应用最为广泛的抗原类型。这类抗原主要包括病毒类疫苗抗原和重组病毒样颗粒疫苗抗原。这类抗原在结构上通常具有组成复杂，颗粒尺寸大的特点。天然的病毒颗粒结构相对稳定，但是作为抗原使用的病毒颗粒经过减毒、灭活或重新组装过程后，其天然结构受到破坏，稳定性下降，极其容易发生裂解或聚集而失活。随着对疫苗质量和安全性要求的提高，需要对原料进行纯化制备高纯度的抗原，而纯化的过程和较高的纯度则又进一步降低了抗原的稳定性。另一方面，抗原通常还需要和佐剂配合使用，佐剂中的成分也通常会对抗原的稳定性造成破坏。
例如，***(Foot and Mouth Disease，FMD)是一种传染性很强的疾病，该疾病具有传染速度快，传播范围广等特点，因此感染该疾病会给畜牧业造成巨大的损失。灭活***病毒疫苗抗原是预防FMD最有效的疫苗。完整的***病毒颗粒沉降系数为146S(即FMDV 146S)，结构组成复杂，颗粒尺寸大(约为30nm)，且稳定性非常差，在加热和pH<7.0时候极其容易发生裂解失活。Harmsen M M等在Vaccine(2015，33(21):2477-2484)中报道了油乳佐剂ISA206会进一步加速***病毒抗原的裂解。这使得疫苗的运输和保存需要严格的冷链，增加了疫苗的研发、生产、运输、储存和使用的难度和成本。因此，提高疫苗抗原稳定性一直是***疫苗的重点研究领域之一。
我国是乙肝大国，目前预防乙肝的疫苗是基因重组的乙肝表面抗原病毒样颗粒(HBsAg-VLP)，由上百个亚基组成，尺寸25nm左右。HBsAg-VLP在分离纯化和储存过程中，很容易发生裂解或聚集。Valenzuela P等在Nature(1982,298(5872):347-350)中报道了裂解或聚集的HBsAg-VLP，活性仅有正常VLP抗原的千分之一。
人***瘤病毒样颗粒(HPV-VLP)作为***疫苗的抗原在预防HPV的入侵上发挥着重要作用。HPV-VLP由基因重组的方法制备获得，其保留了和天然HPV病毒相似的结构和抗原表位。史晶洁等在病毒学报(2018，34(02):252-258)中报道了HPV-VLP颗粒的完整性和热稳定性是HPV疫苗达到理想免疫效果的关键。解聚或聚集的亚基，不仅导致活性的降低，而且成为新的杂质，可能引起产品质量的问题。
如何提高病毒或病毒样颗粒疫苗抗原的结构稳定性，避免亚基解聚或聚集，是确保其活性和安全性的关键。目前提高病毒颗粒抗原稳定性的方法主要有两类，第一是通过对疫苗抗原颗粒结构改造如对造成颗粒不稳定的关键氨基酸位点进行突变或者通过氨基酸突变来增强组成颗粒亚基之间的相互作用力，防止颗粒裂解以提高颗粒的稳定性。但是这类方法仅针对特定种类特定亚型的抗原有效，通用性差，对抗原颗粒的活性影响不可控，且这类方法技术复杂，成本较高，在大规模应用上存在一定难度。第二是通过在抗原中加入特定种类的添加剂，如无机盐、多元醇、蔗糖以及蛋白等。这种方法常用于提高蛋白药物的稳定性，但是对于病毒颗粒抗原，其结构较一般蛋白药物更为复杂，对其稳定性影响因素更多，加入无机盐虽然能一定程度上的提高某些抗原的稳定性，但是无机盐对这种抗原的稳定性提升作用有限，且高浓度的无机盐对抗原的活性影响较大；而蛋白和糖类的添加对抗原的活性提升作用通常有限，且成本较高，加入的同时也引入不必要的大分子杂质，影响疫苗的安全性，在实际应用上仍存在较大难度。
因此，提供一种安全、生物相容性高、稳定性优异且制备方法简单的疫苗抗原组合物具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种疫苗抗原组合物及其制备方法，通过添加胆碱型离子液体显著提高疫苗抗原的稳定性，降低运输和贮存成本。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种疫苗抗原组合物所述组合物包括疫苗抗原和胆碱型离子液体。
离子液体是一类常温下呈液态的盐，具有良好的溶解性、理化性质可设计性、性质稳定等优点，在催化、合成、萃取分离等领域已被广泛应用。离子液体可用于蛋白的提取分离、结晶、稳定以及酶催化，离子液体可用于提高蛋白质的稳定性，但目前针对离子液体稳定蛋白的研究主要集中于结构简单的模型蛋白如BSA、胰岛素和核酸酶等。
本发明针对病毒类疫苗抗原或重组病毒样颗粒疫苗抗原，该抗原来源于动物或人，是经过减毒、灭活的病毒或重组病毒样颗粒，多为球状病毒颗粒，相比于天然活病毒，其稳定性更差，考虑到疫苗的样品特性，稳定疫苗的试剂不仅需要考虑其对抗原的稳定作用，更需要考虑其安全性。区别于植物病毒疫苗，用于稳定动物或人源疫苗抗原的试剂需要有较好的生物相容性。本发明采用具有良好生物相容性的胆碱型离子液体作为添加剂来提高疫苗抗原稳定性，所述胆碱型离子液体由胆碱阳离子[cho]+与有机或无机阴离子组成，其性质与常规的无机盐或有机物质性质不同，可以更好得结合常规无机盐或有机物质稳定蛋白的优势，同时还具有独特性质。
本发明通过研究，惊喜地发现，采用胆碱型离子液体作为添加剂，能显著提高病毒和重组病毒样颗粒抗原在溶液中的稳定性，防止其聚集或裂解，且不影响抗原本身的活性，该类离子液体具有良好的生物相容性、易于制备、溶解性好且易于添加。因此，胆碱型离子液体作为疫苗抗原的稳定剂添加简便，稳定效果好，具有较大的实用价值。
优选地，所述疫苗抗原包括病毒类疫苗抗原和重组病毒样颗粒疫苗抗原。
优选地，所述病毒类疫苗抗原包***病毒抗原、脊髓灰质炎病毒抗原、乙型脑炎病毒抗原、猪圆环病毒抗原或狂犬病毒抗原。
优选地，所述重组病毒样颗粒疫苗抗原包括重组乙肝表面抗原病毒样颗粒、人***瘤病毒样颗粒或戊肝病毒样颗粒。
本发明中，所述的疫苗抗原可由经细胞培养得到的活病毒经过减毒、灭活制备，或经过基因工程的方法制备病毒样颗粒再经过常规的分离纯化步骤所制备获得。典型但不限于用作***疫苗抗原的灭活***病毒(FMDV)，用作乙肝疫苗抗原的乙肝表面抗原病毒样颗粒(HBsAg-VLP)，用作子***疫苗抗原的人***瘤病毒样颗粒(HPV-VLP)等。
优选地，所述胆碱型离子液体的阳离子为胆碱离子[cho]+。
优选地，所述胆碱型离子液体的阴离子包括三甲胺离子(tma)、乳酸离子(lactate)、丙酸离子(propionate)、己酸离子(hexanoate)、磷酸氢根(HPO4 2-)、磷酸二氢根(H2PO4 2-)、氯离子(Cl-)、溴离子(Br-)、碘离子(I-)、醋酸根离子(CH3COO-)、硫酸根离子(SO4 2-)、三氟甲磺酰亚胺离子(NTf2)或多库酯酸根离子(AOT)中的任一种或至少两种的组合，优选为氯离子和硫酸根离子的组合。
本发明中，发明人发现所述阴离子均可与胆碱离子配合，提高疫苗抗原稳定性，其中氯离子和硫酸根离子的效果最优，可显著提高疫苗抗原的热稳定性。
优选地，所述氯离子和硫酸根离子的摩尔浓度比为10:1-1:10，例如可以是1:1、1:2、1:5、1:6、1:9、2:1、3:1、5:1、7:1、8:1或10:1。
优选地，所述胆碱型离子液体的pH值为7.0-8.0，例如可以是7.0、7.2、7.5、7.8或8.0，优选为7.5。
疫苗抗原颗粒相较于结构相对简单的蛋白如单克隆抗体、BSA等，对溶液环境的pH变化更稳敏感，过高或过低的pH均易导致抗原颗粒的裂解或聚集。因此，本发明中，先将胆碱型离子液体的pH值调节至所述范围内，再添加到疫苗抗原中。
所述胆碱型离子液体添加至疫苗抗原溶液中的终浓度为0.001-4mol/L，例如可以是0.001mol/L、0.003mol/L、0.005mol/L、0.007mol/L、0.009mol/L、0.01mol/L、0.015mol/L、0.02mol/L、0.03mol/L、0.05mol/L、0.06mol/L、0.08mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L、0.85mol/L、0.9mol/L、1mol/L、1.1mol/L、1.2mol/L、1.5mol/L、1.8mol/L、2mol/L、2.2mol/L、2.5mol/L、2.7mol/L、2.9mol/L、3mol/L、3.2mol/L、3.5mol/L、3.7mol/L、3.8mol/L或4mol/L，优选为0.005-1mol/L。
本发明中，胆碱型离子液体的添加终浓度在所述范围内，能有效提高疫苗抗原的稳定性且不影响抗原活性，优选范围内，胆碱型离子液体对疫苗抗原稳定性提升效果最为显著。
优选地，所述方法还包括佐剂。
佐剂作为抗原疫苗的助剂，通常对抗原的稳定性也有一定破坏性，本发明所用胆碱型离子液体可以显著提高疫苗抗原的稳定性，添加了胆碱型离子液体的疫苗抗原可以直接保存和使用，也可以进一步同佐剂混合后保存使用，胆碱型离子液体不会影响抗原或佐剂的作用。
优选地，所述佐剂包括油乳佐剂、铝佐剂或颗粒佐剂中的任一种或至少两种的组合。
优选地，所述颗粒佐剂包括聚乳酸颗粒或壳聚糖颗粒。
本发明中，佐剂指与抗原混合后能增加抗原免疫活性的物质，佐剂可包括ISA206乳液佐剂、铝佐剂、颗粒佐剂等。
第二方面，本发明提供一种制备如第一方面所述的疫苗抗原组合物的方法，所述方法包括如下步骤：将胆碱型离子液体溶解于缓冲液中，调节混合溶液的pH值，加入疫苗抗原水溶液中混合均匀，得疫苗抗原组合物。
优选地，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液。
优选地，所述疫苗抗原水溶液的温度为4-25℃，例如可以是4℃、10℃、15℃、20℃或25℃。
优选地，所述pH值为7.0-8.0，优选为7.5。
优选地，胆碱型离子液体在疫苗抗原组合物中的终浓度为0.001-4mol/L。
优选地，所述方法具体包括如下步骤：将胆碱型离子液体溶解于磷酸盐缓冲液中，调节混合溶液的pH值至7.0-8.0，加入疫苗抗原水溶液中，使胆碱型离子液体的终浓度为0.001-4mol/L，混合均匀，得疫苗抗原组合物。
第三方面，本发明提供一种疫苗，所述疫苗包括如第一方面所述的疫苗抗原组合物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的疫苗抗原组合物通过添加具有良好生物相容性的胆碱型离子液体作为添加剂，显著提高疫苗抗原的热稳定性、反复冻融稳定性、加速稳定性以及长期储存稳定性，显著提高抗原在溶液和佐剂环境中的稳定性且不影响抗原活性；
(2)本发明的疫苗抗原组合物可以抑制病毒、重组病毒样颗粒多聚亚基之间发生裂解或聚集，避免疫苗抗原颗粒结构的变化和抗原活性的降低；
(3)本发明的疫苗抗原组合物使用胆碱型离子液体作为添加剂，易于制备、溶解性好且操作简单，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1测试例4中小鼠注射含胆碱型离子液体的FMDV抗原后的抗体滴度(*P<0.05)；
图2为测试例7中，实施例12在4℃放置2个月后HBsAg-VLP的凝胶高效液相色谱图谱；
图3为测试例7中，对比例9在4℃放置2个月后HBsAg-VLP的凝胶高效液相色谱图谱；
图4为测试例8中，实施例13在4℃放置1天后HBsAg-VLP的透射电镜图；
图5为测试例8中，对比例9在4℃放置1天后HBsAg-VLP的透射电镜图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1
一种FMDV溶液，其制备方法如下：
1)将一定量的胆碱型离子液体[cho][Cl]和[cho][SO4]分别溶解于20mM，pH7.5的磷酸盐缓冲液中，并用4mol/L的NaOH或者2mol/L的HCl将其pH调至pH 7.5，配制出浓度为1mol/L的胆碱型离子液体；
2)向1mL 100μg/mLFMDV溶液(pH 7.5)中各添加0.5mL上述离子液体[cho][Cl]和[cho][SO4]，混匀，得到添加有0.5mol/L复合胆碱型离子液体的FMDV溶液。
实施例2
与实施例1相比，除了胆碱型离体液体为[cho][Cl]和[cho][HPO4]之外，其他条件同实施例1。
实施例3
与实施例1相比，除了胆碱型离体液体为[cho][SO4]和[cho][Br]之外，其他条件同实施例1。
实施例4
一种FMDV溶液，其制备方法如下：
1)将一定量的胆碱型离子液体[cho][Cl]溶解于20mM，pH 7.5的磷酸盐缓冲液中，并用4mol/L的NaOH或者2mol/L的HCl将其pH调至pH 7.5，配制出浓度为1mol/L的胆碱型离子液体；
2)向1mL 100μg/mL FMDV溶液(pH 7.5)中添加1mL上述胆碱型离子液体，混匀，得到添加有0.5mol/L胆碱型离子液体的FMDV溶液。
实施例5
与实施例4相比，除了胆碱型离子液体为[cho][SO4]之外，其他条件同实施例4。
实施例6
与实施例4相比，除了胆碱型离子液体为[cho][Br]之外，其他条件同实施例4。
实施例7
与实施例4相比，除了胆碱型离子液体为[cho][HPO4]之外，其他条件同实施例4。
对比例1
与实施例4相比，除了离子液体为非胆碱型离子液体TMAP(trimethylammoniumdihydrogen phosphate,TMAP)之外，其他条件同实施例4。
对比例2
与实施例4相比，除了离子液体为非胆碱型离子液体TEAA(triethylammoniumacetate,TEAA)之外，其他条件同实施例4。
对比例3
与实施例4相比，除了离子液体为非胆碱型离子液体TEAP(triethylammoniumdihydrogen phosphate,TEAP)之外，其他条件同实施例4。
对比例4
向1mL100μg/mL的FMDV溶液中加入1mLpH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液。
测试例1不同类型离子液体对FMDV热稳定性的影响
在96-孔板中，每个孔中加入0.2μL25倍稀释的Sypro Orange染料，分别添加实施例1-7和对比例1-4的FMDV溶液19.8μL，采用差示扫描荧光(DSF)法评价FMDV的热稳定性。DSF实验中的温度范围为25℃至95℃，升温速率为1℃/min，平衡时间为10min，用第一个热变性温度(即：Tm1)来评价FMDV颗粒的热稳定性，结果见表1。
表1添加不同类型离子液体对FMDV热稳定性的影响
Tm1/℃ Tm1/℃
实施例1 56.5 实施例7 54.0
实施例2 56.1 对比例1 49.7
实施例3 56.0 对比例2 53.2
实施例4 55.8 对比例3 53.4
实施例5 54.4 对比例4 53.0
实施例6 53.9
由表1可知，比较实施例1与实施例2-7可知，组合使用[cho][Cl]、[cho][SO4]胆碱型离子液体更有助于提高胆碱型离子液体对FMDV热稳定性；比较实施例1与对比例1-3可知，胆碱型离子液体较非胆碱型离子液体对抗原疫苗的稳定性提高显著；比较实施例1与对比例4可知，胆碱型离子液体能显著提高抗原的热稳定性3.5℃。
测试例2反复冻融稳定性测试
采用最优实施例1作为研究对象，将实施例1与对比例4分别置于-80℃超低温冰箱中，3天后取出置于4℃完全融化后，取样，采用凝胶高效液相色谱法(HPSEC，中国专利：201510025994.7)测定样品中剩余的FMDV含量。按此方法反复冻融5次，测定每次冻融后剩余的FMDV含量。样品缓冲液为pH 7.5的磷酸盐缓冲液，结果如表2所示。
表2反复冻融5次后抗原含量
由表2可知，添加胆碱型离子液体可显著提高FMDV的反复冻融稳定性，5次超低温反复冻融后，FMDV抗原剩余含量与初始值相差无几，而不添加胆碱型离子液体的对比例4在冻融1次后，抗原含量显著降低，仅剩24μg/mL。
测试例3 37℃加速裂解稳定性测试
测试胆碱型离子液体与其他常用于蛋白的稳定剂，对于FMDV加速稳定性的影响。选择实施例1、对比例4和常用的稳定剂包括终浓度为1％的BSA、10％的山梨醇、10％的蔗糖，溶液pH均为7.5；FMDV抗原浓度为200μg/mL。将样品置于37℃无菌保存。采用凝胶高效液相色谱法，测定溶液中完整的FMDV抗原含量的变化情况。以初始FMDV抗原含量为100％，计算放置不同时间后，剩余的抗原含量。
表3 37℃放置过程中颗粒含量百分比
时间(h) 对比例4 1％BSA 10％蔗糖 10％山梨醇 实施例1
0 100 100 100 100 100
2 70 97.8 93.9 96.4 99.7
4 55.3 87.9 88 80.9 98.1
9 — 75.8 70 72.1 98.5
17 — — 67.4 69.8 93
22 — — 58.5 67.9 87.6
30 — — — — 76.3
40 — — — — 71.3
48 — — — — 68.7
由表3可知，[cho][Cl]和[cho][SO4]的组合可以显著提高FMDV在37℃下的加速稳定性，效果显著优于其他常用于蛋白质的添加剂，本发明的胆碱型离子液体37℃条件下48h后抗原颗粒含量仍高达68.7％，而其他对照组抗原颗粒急剧下降，无法检出。
对比例5
向FMDV溶液加入pH8.0的PBS缓冲液，使FMDV终浓度为50μg/mL。
对比例6
将FMDV溶液通过56℃加热，完全裂解为FMDV 12S。
测试例4胆碱型离子液体对FMDV抗原活性
将24只Balb/c小鼠分成4组，每组6只。将实施例1、实施例4、对比例5和对比例6分别与ISA206佐剂等体积均匀混合乳化后，采用腹腔注射免疫小鼠，注射剂量为100μL。在初次免疫后14天进行二次免疫。利用ELISA试剂盒，对二免后14天小鼠的血清进行抗体含量的测定。如图1所示，对比例6为完全裂解后的FMDV颗粒，实验结果表明基本无免疫活性。添加胆碱型离子液体的实施例1和4，未降低FMDV的免疫活性，且与对比例5相比抗体滴度还有所提升，此外实施例1的抗体滴度略高于实施例4，说明复合胆碱型离子液体对FMDV稳定性提高的作用优于单一胆碱型离子液体。
在该实施例中，同时监测了离子液体对FMDV在ISA206佐剂中稳定性的影响。通过采用凝胶高效液相色谱，测定与ISA206乳化后的对比例5、实施例1和实施例4抗原含量随时间变化情况，结果显示在4℃放置14天后，抗原含量分别为初始值的60％、95％、95％。表明，添加离子液体可以提高FMDV抗原在IS206佐剂中的稳定性。
实施例8
一种HPV-VLP溶液，其制备方法如下：
1)将一定量的胆碱型离子液体[cho][Cl]溶解于20mM，pH 7.5的磷酸盐缓冲液中，并用4mol/L的NaOH或者2mol/L的HCl将其pH调至pH 7.5，配制出浓度为2mol/L的胆碱型离子液体；
2)向1mL 200μg/mL HPV-VLP溶液(pH 7.5)中添加1mL上述离子液体[cho][Cl]，混匀，得到添加有1mol/L胆碱型离子液体的HPV-VLP溶液。
实施例9
与实施例8相比，除了胆碱型离子液体的浓度为0.1mol/L之外，其他条件同实施例8。
实施例10
与实施例8相比，除了胆碱型离子液体的浓度为0.5mol/L之外，其他条件同实施例8。
对比例7
向HPV-VLP溶液中加入pH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液，HPV-VLP的终浓度为100μg/mL。
测试例5胆碱型离子液体对HPV-VLP疫苗抗原的稳定性的影响
在人***瘤病毒样颗粒(HPV-VLP)疫苗抗原中，添加不同浓度的[cho][Cl]，测试其对疫苗抗原的热稳定性影响，其中HPV-VLP是子***疫苗的抗原。热稳定性测定采用差示扫描量热(DSC)法进行，对实施例8-10和对比例7进行测试，DSC的温度范围为25℃至95℃，升温速率为1℃/min，平衡时间为10min，添加不同浓度[cho][Cl]对HPV-VLPs的热稳定性的影响见表4。
表4不同浓度的[cho][Cl]后HPV-VLP热变性温度变化
由表4可知，胆碱型离子液体[cho][Cl]可以提高HPV-VLP的热稳定性，且稳定作用在本发明所述添加量范围内成浓度依赖性。
实施例11
将实施例8的HPV-VLP溶液和铝佐剂混合，样品中含HPV-VLPs浓度为100μg/mL。
对比例8
将对比例7的HPV-VLP溶液和铝佐剂混合，样品中含HPV-VLPs浓度为100μg/mL。
测试例6胆碱型离子液体对铝佐剂中HPV-VLP稳定性的影响
测试胆碱型离子液体对与和铝佐剂混合后的HPV-VLP稳定性的影响。将实施例11和对比例8的样品分别置于4℃无菌避光保存，测定放置0、2、4、8、12、16、20、24天时HPV-VLP粒径的变化情况，粒径测定采用动态光散射仪(Dynamic Light Scattering，DLS)进行，结果见表5。
表5 4℃放置过程中HPV-VLP粒径的变化(nm)
时间(天) 实施例11 对比例8
0 95 95
2 95 94
4 94 92
8 92 90
12 92 85
16 90 81
20 88 78
24 88 72
由表5可知，添加胆碱型离子液体能抑制HPV-VLP颗粒的裂解，提高其稳定性。
实施例12
一种HBsAg-VLP溶液，其制备方法如下：
1)将一定量的胆碱型离子液体[cho][Cl]溶解于20mM，pH 7.5的PBS缓冲液中，并用4mol的NaOH或者2mol的HCl将其pH调至pH 7.5，配制出浓度为1mol/L的胆碱型离子液体；
2)向1mL 100g/mL HBsAg-VLP溶液(pH 7.5)中添加1mL上述离子液体，混匀，得到添加有0.5mol/L胆碱型离子液体的HBsAg-VLP溶液。
对比例9
与实施例12相比，除了不添加胆碱型离子液体之外，其他条件同实施例12，即对比例9仅含有HBsAg-VLP和PBS缓冲液。
测试例7胆碱型离子液体对防止HBsAg-VLP裂解的影响
采用实施例12与对比例9，通过HPSEC方法测定放置2个月后，完整HBsAg-VLP颗粒的变化情况。结果显示，实施例12胆碱型离子液体中的HBsAg-VLP并未出现明显的裂解(见图2)，而对比例9PBS中的HBsAg-VLP则观察到明显的裂解(见图3)。由图2和图3可知，添加胆碱型离子液体可以有效防止HBsAg-VLP裂解。
实施例13
一种HBsAg-VLP溶液，其制备方法如下：
在含0.3mol/L(NH4)2SO4的HBsAg-VLP溶液中加入0.005mol/mL[cho][AOT]。
测试例8胆碱型离子液体对防止HBsAg-VLP聚集的影响
本测试描述离子液体[cho][AOT]对HBsAg-VLP在高盐浓度下聚集的影响。将实施例13和对比例9在4℃条件下放置1天，采用透射电镜观察颗粒的形态变化情况。结果显示，在[cho][AOT]环境中的HBsAg-VLP颗粒仍保持较分散的状态(见图4)，而在PBS环境中则观察到颗粒出现聚集的情况(见图5)。由图4-5可知，胆碱型离子液体能有效防止HBsAg-VLP聚集。
综上，本发明采用具有良好生物相容性的胆碱型离子液体作为添加剂来提高疫苗抗原的稳定性。该种离子液体稳定剂具有性质稳定性、溶解度高、生物相容性好等优点，能显著提高抗原在溶液和佐剂环境中的稳定性，防止其聚集或裂解，且不影响抗原的活性，该种添加剂还易于制备、溶解性好且易于添加。因此，胆碱型离子液体作为疫苗抗原的稳定剂添加简便，稳定效果好，具有较大的实用价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种疫苗抗原组合物，其特征在于，所述组合物包括疫苗抗原和胆碱型离子液体。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述疫苗抗原包括病毒类疫苗抗原和重组病毒样颗粒疫苗抗原。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述病毒类疫苗抗原包括***病毒抗原、脊髓灰质炎病毒抗原、乙型脑炎病毒抗原、猪圆环病毒抗原或狂犬病毒抗原；
优选地，所述重组病毒样颗粒疫苗抗原包括重组乙肝表面抗原病毒样颗粒、人***瘤病毒样颗粒或戊肝病毒样颗粒。
4.根据权利要求1-3任一项所述的组合物，其特征在于，所述胆碱型离子液体的阴离子包括三甲胺离子、乳酸离子、丙酸离子、己酸离子、磷酸氢根、磷酸二氢根、氯离子、溴离子、碘离子、醋酸根离子、硫酸根离子、三氟甲磺酰亚胺离子或多库酯酸根离子中的任一种或至少两种的组合，优选为氯离子和硫酸根离子的组合；
优选地，所述氯离子和硫酸根离子的摩尔浓度比为1:10-10:1。
5.根据权利要求1-4任一项所述的组合物，其特征在于，所述胆碱型离子液体的pH值为7.0-8.0，优选为7.5。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其特征在于，所述胆碱型离子液体添加至疫苗抗原溶液中的终浓度为0.001-4mol/L，优选为0.005-1mol/L。
7.根据权利要求1-6任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括佐剂。
8.根据权利要求1-7任一项所述的组合物，其特征在于，所述佐剂包括油乳佐剂、铝佐剂或颗粒佐剂中的任一种或至少两种的组合；
优选地，所述颗粒佐剂包括聚乳酸颗粒或壳聚糖颗粒。
9.一种制备如权利要求1-8任一项所述的疫苗抗原组合物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将胆碱型离子液体溶解于缓冲液中，调节混合溶液的pH值，加入疫苗抗原水溶液中混合均匀，得疫苗抗原组合物；
优选地，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液；
优选地，所述疫苗抗原水溶液的温度为4-25℃；
优选地，所述pH值为7.0-8.0，优选为7.5；
优选地，胆碱型离子液体在疫苗抗原组合物中的终浓度为0.001-4mol/L。
10.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包括如权利要求1-8任一项所述的疫苗抗原组合物。
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