CN111588846A - 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种疫苗组合物及其制备方法和应用，所述疫苗组合物包括乳液佐剂和疫苗抗原，所述乳液佐剂包括离子液体、生物相容性油脂和乳化剂。所述乳液佐剂中通过离子液体替代传统乳液中的水相，利用离子液体对抗原的稳定作用显著提高了疫苗抗原的稳定性和乳液体系自身的均一性和稳定性，使乳液佐剂中无需使用其它稳定剂，避免乳液佐剂中复杂的助剂体系对抗原活性的影响，简化了疫苗组合物的成分和制备工艺。所述疫苗组合物中离子液体的引入抑制了疫苗抗原的裂解或聚集，在保证了抗原的免疫活性的同时，还增强了机体对抗原的免疫应答，对于不同类型的疫苗抗原和免疫途径均具有很好的效果。

Description

一种疫苗组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种疫苗组合物及其制备方法和应用。
背景技术
接种疫苗是目前预防和治疗疾病尤其是传染性疾病的主要手段，抗原是疫苗中最重要的组分，根据疫苗中抗原的类型可将疫苗分为减毒活病毒疫苗、灭活病毒疫苗、裂解疫苗或亚单位疫苗等。随着对疫苗研究的不断深入，灭活疫苗、裂解疫苗、亚单位疫苗等抗原纯度和安全性更高的疫苗正逐渐替代传统减毒活疫苗。但是，安全性提高同时也导致抗原的免疫活性的降低，因此，为了增强疫苗对机体的保护作用，通常会加入佐剂来帮助提高抗原的免疫活性。
佐剂在疫苗制剂中能同时对抗原和机体起作用，适当运用佐剂可以调节甚至改变机体免疫***产生抗原特异性的体液或细胞的免疫应答类型，理想的佐剂应该能满足如下条件：在有效剂量内无毒，无致癌、致突变和致畸形作用，能刺激机体产生强大的免疫应答，具有持久的免疫力，不诱导自身免疫等。目前被证明可以发挥佐剂功能的物质包括铝佐剂、油乳佐剂(乳液佐剂)和生物分子佐剂等。
乳液佐剂是目前人用和兽用疫苗中最常见的佐剂类型，乳液佐剂能使抗原在注射部位形成“抗原库”，创造免疫环境，促进细胞因子和趋化因子的产生，增强DC细胞对抗原的摄取，提高机体的体液免疫应答水平。乳液佐剂按照乳液类型分为油包水型(W/O型)、水包油型(O/W型)和水包油包水型(W/O/W型)；其中，已经被公开的W/O型佐剂包括弗氏佐剂、AF03佐剂、Montanide ISA 720和ISA 51佐剂等；O/W型佐剂包括MF59佐剂、AS03佐剂、GLA-SE佐剂、AS02佐剂和W805EC佐剂等；W/O/W型佐剂包括Montanide ISA 201和ISA 206佐剂等。但是，上述乳液佐剂在稳定性、抗原释放以及免疫应答方面仍然存在问题，目前有很多研究工作致力于乳液佐剂的组分和性能研究。
CN105148266A公开了一种W/O型疫苗油佐剂制剂及其制备方法，所述制剂为W/O型乳液，水相为含有抗原的溶液，油相包含白油、乳化剂和稳定剂；所述乳化剂选自司盘60、司盘80和司盘83中的1种或至少2种的组合，所述稳定剂选自硬脂酸、硬酯酸铝和单硬酯酸甘油酯中的1种或至少2种的组合。所述W/O型乳液的平均粒径在0.1～8.22μm之间，尺寸均一可控。
CN104147599A公开了一种水包油型疫苗佐剂、其制备及应用，所述水包油型纳米乳疫苗佐剂按照质量百分比包括0.1～10％的油相、0.1～10％的乳化剂、0.1～3％的稳定剂、0.1～3％的络合剂以及0.01～10％的免疫增强剂；其中，稳定剂为可溶性的二价无机盐，络合剂为乙二胺四乙酸和/或聚丙烯酸钠，免疫增强剂为具有免疫增强作用的蜂胶、多肽、多糖或黄酮类。所述疫苗佐剂副反应小，尤其适用于猪瘟活疫苗，稳定性高，免疫效果好。
CN105688207A公开了一种动物疫苗用复合佐剂及其应用，所述复合佐剂包括注射用大豆油70％、卵磷脂5％、六聚甘油单油酸酸1％、丙二醇1％、聚乙烯吡咯烷酮2％、聚富马酸-癸二酸0.8％、注射用水溶液20％和紫锥菊提取物0.2％，具有良好的免疫效果和安全性。
在现有的乳液佐剂中，为了控制乳液的粒径、维持乳液体系的均一稳定，通常会使用两种以上的乳化剂组合，同时还会增加乳化剂的用量，过量和复杂的乳化剂使用仍可能增加体内代谢的负担。而且，乳液佐剂中通常还需要在包含抗原的水相中加入糖、多元醇或无机盐等作为稳定剂来保持抗原的稳定，而稳定剂的添加会增加乳液体系的复杂程度、改变乳液体系的组成，影响乳液佐剂的免疫效果，甚至会影响抗原的免疫活性。
因此，开发一种在增强抗原免疫活性的同时还能稳定抗原结构的佐剂及包含其的疫苗，是本领域的研究重点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种疫苗组合物及其制备方法和应用，所述疫苗组合物的乳液佐剂中含有离子液体，具有稳定疫苗抗原和增强机体对抗原的免疫应答的作用，使所述疫苗组合物在不添加其它稳定剂的情况下仍具有优异的稳定性、均一性和免疫活性，简化了疫苗组合物的成分和制备工艺。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括乳液佐剂和疫苗抗原，所述乳液佐剂包括离子液体、生物相容性油脂和乳化剂。
本发明提供的疫苗组合物包括乳液佐剂和疫苗抗原，所述乳液佐剂中使用离子液体替代传统乳液中的水相，使疫苗抗原分散于离子液体中，利用离子液体对蛋白的稳定作用来稳定乳液中疫苗抗原，同时通过离子液体来增强机体对抗原的免疫应答；所述疫苗组合物中疫苗抗原的含量可以根据实际需求设定，所述疫苗组合物可以包含任意比例的疫苗抗原。本发明所述乳液佐剂相比于传统乳液具有如下优势：(1)疫苗抗原分散于离子液体中，离子液体对疫苗抗原具有良好的稳定作用，因此本发明所述疫苗组合物中无需加入其它稳定剂，从而简化了疫苗组合物中乳液佐剂的成分，避免稳定剂对抗原活性和体系稳定性的影响，同时也简化了疫苗组合物的制备工艺；(2)所述离子液体结合了有机和无机盐的特性，使其在相同的条件下，相比于传统的水相，更有利于和生物相容性油脂形成稳定均一的乳液佐剂，从而可以减少乳化剂的使用量和种类，进一步简化了疫苗组合物的制备工艺；(3)所述离子液体具有可设计性，通过离子液体阴阳离子的选择，可以针对不同的免疫途径设计出更有利于提高免疫活性的离子液体和乳液佐剂。综上，本发明提供的疫苗组合物中，包含离子液体的乳液佐剂可以提高所述疫苗组合物和疫苗抗原的稳定性，有效改善机体对抗原的免疫应答，且适用于不同的免疫途径，具有广阔的应用前景。
本发明中，所述疫苗组合物为乳液体系。
优选地，所述乳液体系的类型包括油包离子液体型(IL/O型)、离子液体包油型(O/IL型)、油包离子液体包油型(O/IL/O型)或离子液体包油包离子液体型(IL/O/IL型)。
本发明中，所述疫苗组合物的乳液类型为油包离子液体型的结构示意图如图1所示，所述疫苗组合物的乳液类型为离子液体包油型的结构示意图如图2所示，所述疫苗组合物的乳液类型为油包离子液体包油型的结构示意图如图3所示，所述疫苗组合物的乳液类型为离子液体包油包离子液体型的结构示意图如图4所示；图1～4中，1为疫苗抗原，2为离子液体，3为生物相容性油脂，4为乳化剂。
优选地，所述乳液体系中分散相的粒径为1nm～100μm，例如5nm、10nm、30nm、50nm、60nm、80nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、800nm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、5μm、8μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm或95μm，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值，进一步优选为0.05～3μm。
优选地，所述乳液体系的类型为油包离子液体型，所述乳液体系中分散相的粒径为0.8～3μm，例如0.9μm、1μm、1.1μm、1.3μm、1.5μm、1.7μm、1.9μm、2μm、2.1μm、2.3μm、2.5μm、2.7μm或2.9μm，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述乳液体系的类型为离子液体包油型，所述乳液体系中分散相的粒径为50～500nm，例如60nm、80nm、100nm、120nm、150nm、180nm、200nm、220nm、250nm、280nm、300nm、320nm、350nm、380nm、400nm、420nm、450nm、470nm或490nm，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述乳液体系的类型为离子液体包油包离子液体型，所述乳液体系中分散相的粒径为0.2～3μm，例如0.3μm、0.5μm、0.7μm、0.9μm、1μm、1.1μm、1.3μm、1.5μm、1.7μm、1.9μm、2μm、2.1μm、2.3μm、2.5μm、2.7μm或2.9μm，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述乳液佐剂由离子液体溶液、生物相容性油脂和乳化剂组成。
优选地，所述离子液体溶液的浓度为0.001～6mol/L，例如0.005mol/L、0.01mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L、1mol/L、1.2mol/L、1.5mol/L、1.8mol/L、2mol/L、2.2mol/L、2.5mol/L、2.8mol/L、3mol/L、3.2mol/L、3.5mol/L、3.8mol/L、4mol/L、4.2mol/L、4.5mol/L、4.8mol/L、5mol/L、5.2mol/L、5.5mol/L或5.8mol/L，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值，进一步优选为1～5mol/L。
优选地，所述乳液佐剂中离子液体溶液的体积百分含量为10～90％，例如15％、20％、25％、30％、33％、35％、38％、40％、42％、45％、48％、50％、52％、55％、58％、60％、62％、65％、68％、70％、75％、80％、85％或88％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值，进一步优选为40～60％。
优选地，所述疫苗组合物中乳化剂的体积百分含量为0.1～30％，例如0.3％、0.5％、0.8％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、18％、20％、22％、25％、27％或29％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述离子液体溶液的pH值为3.0～9.0，例如3.2、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.2、5.5、5.8、6.0、6.2、6.5、6.8、7.0、7.2、7.5、7.8、8.0、8.2、8.5或8.8，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述离子液体溶液的溶剂包括水或缓冲液。
优选地，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液或碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述缓冲液的浓度为1～200mmol/L，例如2mmol/L、5mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L、70mmol/L、90mmol/L、100mmol/L、120mmol/L、140mmol/L、150mmol/L、170mmol/L或190mmol/L，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
本发明中，所述离子液体的阳离子包括含氮有机阳离子和/或含磷有机阳离子。
优选地，所述含氮有机阳离子包括咪唑类离子、吡啶类离子、季铵类离子、吡咯类离子或胆碱类离子中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述含磷有机阳离子包括季磷类离子。
优选地，所述离子液体的阴离子包括有机阴离子和/或无机阴离子。
优选地，所述有机阴离子包括乳酸根离子、甲酸根离子、C1～C10(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10)烷基羧酸根离子、三氟甲磺酰亚胺离子、多库酯酸根离子、烟碱酸离子或香叶酸根离子中的任意一种或至少两种的组合。
所述C1～C10烷基羧酸根离子示例性地包括但不限于：乙酸根离子、丙酸根离子或己酸根离子等。
优选地，所述无机阴离子包括硫酸根离子、碳酸根离子、碳酸氢根离子、卤素离子(例如F-、Cl-、Br-或I-)、磷酸氢根离子或磷酸二氢根离子中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，所述生物相容性油脂包括肉豆蔻酸异丙酯、生育酚、生育酚类似物、维生素E、角鲨烯、大豆油、花生油、油酸乙酯、油酸、亚油酸乙酯、月桂酸异丙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸甘油三酯、杏仁油、薏仁油、月见草油、芝麻油、棉籽油、蓖麻油、低芥酸菜子油、肉桂酸甘油酯、棕榈酸甘油酯、鲸蜡醇十六酸酯或葵花籽油中的任意一种或者至少两种的组合。
优选地，所述生物相容性油脂选自角鲨烯、大豆油、肉豆蔻酸异丙酯或生育酚中的任意一种或者至少两种的组合。
本发明中，所述乳化剂指能使生物相容性油脂和离子液体的混合物形成稳定乳液的化合物，所述乳化剂包括油溶性乳化剂和/或水溶性乳化剂。其中，所述油溶性乳化剂为亲水亲油平衡值(HLB值)为2～6的乳化剂，所述水溶性乳化剂为HLB值为8～16的乳化剂。
优选地，所述乳化剂包括离子型乳化剂和/或非离子型乳化剂。
优选地，所述离子型乳化剂包括十二烷基苯磺酸钠、硬脂酸、季铵类化合物、卵磷脂、氨基酸型乳化剂、甜菜碱型乳化剂、硫酸化蓖麻油、油酸、月桂酸或三乙醇胺皂中的任意一种或者至少两种的组合。
优选地，所述非离子型乳化剂包括烷基葡萄糖苷、脂肪酸酯、司盘、吐温、蔗糖酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物或脂肪醇中的任意一种或者至少两种的组合。
本发明中，所述疫苗抗原包括减毒活病毒疫苗抗原、灭活病毒疫苗抗原、裂解疫苗抗原、病毒样颗粒疫苗抗原、亚单位疫苗抗原、多糖结合疫苗抗原、核酸疫苗抗原或合成肽疫苗抗原中的任意一种或者至少两种的组合。
优选地，所述减毒活病毒疫苗抗原包括麻疹减毒活疫苗抗原、甲型肝炎减毒活疫苗抗原、水痘减毒活疫苗抗原、乙型脑炎减毒活疫苗抗原、风疹减毒活疫苗抗原、腮腺炎减毒活疫苗抗原、脊髓灰质炎减毒活疫苗抗原、狂犬病减毒活疫苗抗原或流感减毒活疫苗抗原中的任意一种或者至少两种的组合。
优选地，所述灭活病毒疫苗抗原包括灭活***病毒抗原、灭活流感病毒抗原、灭活狂犬病病毒抗原或灭活甲肝病毒抗原中的任意一种或者至少两种的组合。
优选地，所述裂解疫苗抗原包括流感裂解疫苗抗原。
优选地，所述病毒样颗粒疫苗抗原包括重组乙肝表面抗原病毒样颗粒、人***瘤病毒样颗粒、戊肝病毒样颗粒、重组手足口病病毒样颗粒或重组猪圆环病毒样颗粒中的任意一种或者至少两种的组合。
优选地，所述多糖结合疫苗抗原包括b型流感嗜血杆菌结合疫苗抗原、脑膜炎球菌结合疫苗抗原或肺炎球菌结合疫苗抗原中的任意一种或者至少两种的组合。
优选地，所述疫苗抗原的制备方法包括鸡胚培养、细胞培养、重组基因表达或化学合成中的任意一种或者至少两种的组合。
另一方面，本发明提供一种如上所述的疫苗组合物的制备方法，所述疫苗组合物通过制备方法I、制备方法II、制备方法III中的任意一种制备得到。
所述制备方法I为：将生物相容性油脂和乳化剂混合得到油性混合物；将离子液体和疫苗抗原混合得到离子液体相混合物；将所述油性混合物和离子液体相混合物进行混合、乳化，得到所述疫苗组合物。
所述制备方法II为：将生物相容性油脂和乳化剂混合后再与离子液体进行混合、乳化，得到乳液混合物；将所述乳液混合物与疫苗抗原混合均匀，得到所述疫苗组合物。
所述制备方法III为：将生物相容性油脂和乳化剂I混合得到油性混合物；将离子液体、乳化剂II和疫苗抗原混合得到离子液体相混合物；将所述油性混合物和离子液体相混合物进行混合、乳化，得到所述疫苗组合物。
本发明中，通过所述制备方法I得到的疫苗组合物为油包离子液体型的乳液体系；通过所述制备方法II得到的疫苗组合物为离子液体包油型的乳液体系；通过所述制备方法III得到的疫苗组合物为离子液体包油包离子液体型的乳液体系。
优选地，制备方法I、制备方法II、制备方法III所述乳化的方法各自独立地包括研钵法、振荡法、搅拌法、注射器互推法、超声法、膜乳化法、喷雾法或均质法中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，制备方法I、制备方法II、制备方法III所述疫苗抗原均为疫苗抗原的溶液。
优选地，所述疫苗抗原的溶液中抗原浓度为2～100μg/mL，例如3μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL、50μg/mL、55μg/mL、60μg/mL、65μg/mL、70μg/mL、75μg/mL、80μg/mL、85μg/mL、90μg/mL、95μg/mL或98μg/mL，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述溶液的溶剂包括缓冲液。
优选地，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液或碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述缓冲液的浓度为1～200mmol/L，例如2mmol/L、5mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L、70mmol/L、90mmol/L、100mmol/L、120mmol/L、140mmol/L、150mmol/L、170mmol/L或190mmol/L，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，制备方法I中所述乳化剂为油溶性乳化剂。
优选地，制备方法I中所述离子液体和疫苗抗原的体积比为9:1～1:9，例如9:1、8.5:1.5、8:2、7.5:2.5、7:3、6.5:3.5、6:4、5.5:4.5、5:5、4.5:5.5、4:6、3.5:6.5、3:7、2.5:7.5、2:8、1.5:8.5或1:9等，进一步优选为6:4～4:6。
优选地，制备方法II中所述乳化剂为水溶性乳化剂。
优选地，制备方法II中所述乳液混合物与疫苗抗原的体积比为9:1～1:9，例如9:1、8.5:1.5、8:2、7.5:2.5、7:3、6.5:3.5、6:4、5.5:4.5、5:5、4.5:5.5、4:6、3.5:6.5、3:7、2.5:7.5、2:8、1.5:8.5或1:9等。
优选地，制备方法III中所述乳化剂I为油溶性乳化剂。
优选地，制备方法III中所述乳化剂II为水溶性乳化剂。
优选地，制备方法III中所述离子液体与疫苗抗原的体积比为9:1～1:9，例如9:1、8.5:1.5、8:2、7.5:2.5、7:3、6.5:3.5、6:4、5.5:4.5、5:5、4.5:5.5、4:6、3.5:6.5、3:7、2.5:7.5、2:8、1.5:8.5或1:9等。
优选地，制备方法III中所述油性混合物和离子液体相混合物的体积比为9:1～1:9，例如9:1、8.5:1.5、8:2、7.5:2.5、7:3、6.5:3.5、6:4、5.5:4.5、5:5、4.5:5.5、4:6、3.5:6.5、3:7、2.5:7.5、2:8、1.5:8.5或1:9等。
另一方面，本发明提供一种疫苗制剂，所述疫苗制剂包括如上所述的疫苗组合物。
优选地，所述疫苗制剂包括人用疫苗制剂或兽用疫苗制剂。
优选地，所述疫苗制剂的接种途径包括肌肉注射、皮下注射、皮内注射、腹腔注射、鼻粘膜给药、口服给药、直肠给药、***给药、局部透皮给药或全身透皮给药。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的疫苗组合物包括乳液佐剂和疫苗抗原，所述乳液佐剂中通过离子液体替代传统乳液中的水相，利用离子液体对抗原的稳定作用显著提高了疫苗抗原的稳定性和乳液体系自身的均一性和稳定性，使乳液佐剂中无需使用其它稳定剂，且减少了乳化剂的用量，从而避免乳液佐剂中复杂的助剂体系对抗原活性的影响，大大简化了疫苗组合物的成分和制备工艺。
(2)所述疫苗组合物中离子液体的引入抑制了疫苗抗原的裂解或聚集，在保证了抗原的免疫活性的同时，还增强了机体对抗原的免疫应答，对于不同类型的疫苗抗原和免疫途径均具有很好的效果。
(3)本发明所述疫苗组合物具有优异的均一性和稳定性，能够使疫苗抗原的热变性温度和热稳定性显著提升，疫苗抗原的热变性温度比在其缓冲液中提高2℃以上；所述疫苗组合物中的乳液佐剂稳定储存5个月以上而不发生聚集，有利于疫苗的存储和使用。所述疫苗组合物对机体的体液免疫应答水平、黏膜免疫应答水平和细胞免疫应答水平均具有明显的改善效果，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明所述疫苗组合物的乳液类型为油包离子液体型的结构示意图，其中，1为疫苗抗原，2为离子液体，3为生物相容性油脂，4为乳化剂；
图2为本发明所述疫苗组合物的乳液类型为离子液体包油型的结构示意图，其中，1为疫苗抗原，2为离子液体，3为生物相容性油脂，4为乳化剂；
图3为本发明所述疫苗组合物的乳液类型为油包离子液体包油型的结构示意图，其中，1为疫苗抗原，2为离子液体，3为生物相容性油脂，4为乳化剂；
图4为本发明所述疫苗组合物的乳液类型为离子液体包油包离子液体型的结构示意图，其中，1为疫苗抗原，2为离子液体，3为生物相容性油脂，4为乳化剂。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
一种疫苗组合物，为离子液体包油型(O/IL型)，制备方法如下：
(1)将胆碱型离子液体[Cho][Nicotinic]溶解于磷酸盐缓冲液(20mmol/L，pH值为8.0)中，配制成浓度为4mol/L的离子液体溶液，将其pH调至8.0；
(2)将4.5mL角鲨烯和0.5mL吐温-80混合，用涡旋振荡器充分混合均匀，得到油性混合物；
(3)将5mL步骤(1)得到的离子液体溶液加入到步骤(2)得到的油性混合物中，并采用超声法进行乳化，得到乳液混合物；
(4)取10mL灭活***病毒抗原溶液(抗原浓度为40μg/mL，pH值为8.0)与步骤(3)得到的乳液混合物混合，用涡旋振荡器使其充分混匀，得到所述疫苗组合物。
采用动态光散射仪测试本实施例提供的疫苗组合物的分散相粒径，具体方法为：将所述疫苗组合物用离子液体稀释2000倍后，取1mL置于比色皿中进行测定，得到其分散相的粒径为168.6nm。
实施例2～7
一种疫苗组合物，乳液体系的类型为O/IL型，具体组分、乳化方法和得到的疫苗组合物的分散相粒径如表1和表2所示，其他制备步骤与实施例1中相同。
表1
Figure BDA0002502854390000131
Figure BDA0002502854390000141
表1中，实施例4和实施例5中的离子液体为咪唑类离子液体，实施例6和实施例7中的离子液体为季铵类离子液体。
表2
Figure BDA0002502854390000142
实施例8
一种疫苗组合物，为油包离子液体型(IL/O型)，制备方法如下：
(1)将胆碱型离子液体[Cho][Cl]溶解于磷酸盐缓冲液(10mmol/L，pH值为8.0)中，配制成浓度为4mol/L的离子液体溶液，将其pH调至8.0；
(2)将4.5mL肉豆蔻酸异丙酯和0.5mL司盘-80混合，用涡旋振荡器充分混合均匀，得到油性混合物；
(3)将5mL灭活***病毒抗原溶液(抗原浓度为40μg/mL，pH值为8.0)加入到5mL步骤(1)得到的离子液体溶液中，用涡旋振荡器充分混合得到离子液体相混合物；
(4)将步骤(3)得到的离子液体相混合物加入到步骤(2)得到的油性混合物中，在涡旋振荡器上充分混合后，用注射器互推法进行乳化，得到所述疫苗组合物。
采用动态光散射仪测试本实施例提供的疫苗组合物的分散相粒径，得到其分散相的粒径为3.0μm。
实施例9～13
一种疫苗组合物，乳液体系的类型为IL/O型，具体组分、乳化方法和得到的疫苗组合物的分散相粒径如表3和表4所示，其他制备步骤与实施例8中相同。
表3
Figure BDA0002502854390000151
Figure BDA0002502854390000161
表3中，实施例11中的离子液体为咪唑类离子液体和胆碱类离子液体的混合物，实施例12中的离子液体为咪唑类离子液体，实施例13中的离子液体为季铵类离子液体。
表4
Figure BDA0002502854390000162
实施例14
一种疫苗组合物，为油包离子液体型(IL/O/IL型)，制备方法如下：
(1)将胆碱型离子液体[Cho][Cl]溶解于HEPES缓冲液(80mmol/L，pH值为7.0)中，配制成浓度为0.3mol/L的离子液体溶液，将其pH调至8.0；
(2)取5mL步骤(1)得到的离子液体[Cho][Cl]、0.2mL吐温-20和5mL灭活流感病毒抗原(抗原浓度为50μg/mL，pH值为7.0)进行混合，得到离子液体相混合物；
(3)将5mL大豆油和0.3mL蔗糖介酸脂ER 290进行混合，得到油性混合物；
(4)将步骤(2)得到的离子液体相混合物和步骤(3)得到的油性混合物进行混合，采用机械搅拌的方法进行乳化，得到所述疫苗组合物。
采用动态光散射仪测试本实施例提供的疫苗组合物的分散相粒径，具体方法为：将所述疫苗组合物用离子液体稀释2000倍后，取1mL置于比色皿中进行测定，得到其分散相的粒径为2μm。
对比例1
一种疫苗组合物，为水包油型(O/W型)，制备方法如下：
(1)分别取4.5mL角鲨烯和0.5mL吐温-80，用涡旋振荡器充分混合，得到油性混合物；
(2)将5mL磷酸盐缓冲液(20mmol/L，pH值为8.0)加入到步骤(1)得到的油性混合物中，采用超声法进行乳化，得到乳液混合物；
(3)取10mL灭活***病毒抗原溶液(抗原浓度为40μg/mL，pH值为8.0)与步骤(2)得到的乳液混合物混合，用涡旋振荡器使其充分混匀，得到所述疫苗组合物。
对比例2
一种疫苗组合物，乳液类型为O/W型，其与对比例1的区别仅在于，将步骤(3)中的灭活***病毒抗原溶液用等量的流感裂解疫苗抗原溶液替换；其他组分及制备方法均与对比例1相同。
对比例3
一种疫苗组合物，为油包水型(W/O型)，制备方法如下：
(1)分别取4.5mL肉豆蔻酸异丙酯和0.5mL司盘-80，用涡旋振荡器充分混合，得到油性混合物；
(2)将5mL灭活***病毒抗原溶液(抗原浓度为40μg/mL，pH值为8.0)加入到步骤(1)得到的油性混合物中，用涡旋振荡器使其充分混匀，采用注射器互推法进行乳化，得到所述疫苗组合物。
对比例4
一种疫苗组合物，以商品化的MF59乳液为佐剂，制备方法如下：
取10mL灭活***病毒抗原溶液(抗原浓度为40μg/mL，pH值为8.0)加入到10mLMF59乳液中，用涡旋振荡器充分混合，得到所述疫苗组合物。
对比例5
一种疫苗组合物，其与对比例4的区别仅在于，将其中的灭活***病毒抗原溶液用等量的流感裂解疫苗抗原溶液替换；其他组分及制备方法均与对比例4相同。
对比例6
一种疫苗组合物，以商品化的ISA 206乳液为佐剂，制备方法如下：
取10mL灭活***病毒抗原溶液(抗原浓度为40μg/mL，pH值为8.0)加入到10mLISA 206乳液中，用涡旋振荡器充分混合，得到所述疫苗组合物。
测试例1
本测试例为疫苗组合物的热稳定性评价测试，具体为采用差示扫描荧光法(DSF)评价疫苗组合物中灭活***病毒抗原的热稳定性，方法如下：
(1)用去离子水将荧光染料SYBR Green稀释100倍后取2μL，将其加至18μL含灭活***病毒抗原的溶液中(抗原的缓冲液均为20mmol/L、pH值为8.0的磷酸盐缓冲液，抗原浓度均为80μg/mL)，得到染色疫苗抗原溶液；
(2)制备含有步骤(1)得到的染色疫苗抗原溶液的疫苗组合物，制备方法分别为实施例1、实施例8、对比例3、对比例4、对比例6中疫苗组合物的制备方法，得到染色疫苗组合物；
(3)取步骤(2)得到的染色疫苗组合物30μL，加至96孔板并用光学封板膜封好，放入荧光定量PCR仪，升温速度为1℃/min，升温范围为25～95℃；直接对磷酸盐缓冲液中的抗原进行测试，作为参比。采用Origin 8.0软件对数据进行分析，热变性温度Tm值通过对荧光曲线进行一阶求导后获得；测试数据如表5所示。
表5
乳液类型 热变性温度T<sub>m</sub>(℃)
实施例1 O/IL 50.8
实施例8 IL/O 50.4
对比例3 W/O 47.1
对比例4 MF59乳液 46.2
对比例6 ISA 206乳液 44.1
参比 磷酸盐缓冲液 48.4
由表5的测试数据可知，灭活***病毒抗原在常规的乳液佐剂中热稳定性均会降低(对比例3、4、6)；而本发明提供的疫苗组合物中，采用离子液体替换替代传统乳液中的水相，能够使抗原的热稳定性显著提高，抗原的Tm值比在该抗原在缓冲液中提高了约2℃，使灭活***病毒抗原的热变性温度达到50℃以上。
测试例2
本测试例为疫苗组合物的加速稳定性评价测试，具体为灭活***病毒抗原的37℃加速稳定性，方法如下：
将实施例1和对比例6提供的疫苗组合物在37℃条件下放置，分别在不同时间点取样进行破乳，破乳条件为：取900μL疫苗组合物加入10μL正戊醇，在涡旋振荡器上充分混匀后，于4℃条件下静置30min后9000rpm离心10min，待乳液体系的油水两相分层后，用带针头的注射器吸取不少于200μL的溶液，并用采用凝胶高效液相色谱法(具体色谱方法参考CN104634891A)测定溶液中完整抗原的含量的剩余情况(％)；以在磷酸盐缓冲液中的抗原作为参比。测试数据如表6所示。
表6
Figure BDA0002502854390000201
由表6的测试数据可知，本发明提供的疫苗组合物中，灭活***病毒抗原的加速稳定性相比于在ISA 206乳液和在磷酸盐缓冲液中均有显著提升。在37℃放置36小后，实施例1中完整的抗原含量仍大于50％，而ISA 206乳液和磷酸盐缓冲液中的完整抗原含量分别仅剩6.5％和16.4％。
测试例3
本测试例为疫苗组合物中乳液佐剂的均一性和稳定性评价实验，具体方法为：
将实施例1中的乳液佐剂(即实施例1中步骤(3)得到的乳液混合物)和对比例1中的乳液佐剂(即对比例1中步骤(2)得到的乳液混合物)分别置于25℃条件中，采用动态光散射(DLS)测定放置5个月过程中乳液粒径的变化，测定方法为：用磷酸盐缓冲液将乳液稀释2000倍后取1mL放入比色皿进行测定，测定温度为25℃，粒径分布以Intensity表示，乳液佐剂的均一性以聚合物分散性指数(PDI)值表示，测试结果如表7所示。
表7
Figure BDA0002502854390000211
根据表7的测试数据可知，在生物相容性油脂和乳化剂的类型、用量以及乳化方法相同的情况下，实施例1中通过离子液体构建的乳液佐剂相比于对比例1中的传统乳液佐剂具有更小的粒径和更好的均一度。在25℃放置5个月过程中，本发明实施例1中的乳液佐剂粒径均在160～180nm之间，而对比例1中的传统乳液的粒径和PDI值则不断增大。上述结果表面，在制备方法相同的情况下，本发明所述疫苗组合物中的乳液佐剂具有更好的均一性和稳定性，更有利于疫苗组合物的储存和使用。
测试例4
本测试例为疫苗组合物的用于灭活***疫苗注射免疫的效果评价测试，具体方法为：
选用6～8周龄的雌性Balb/c小鼠，在SPF级动物房中适应环境5天后分为5组，每组5只小鼠，分别对应实施例1、实施例8、对比例1、对比例6和对照组(直接注射抗原溶液)；采用背部皮下注射的方式进行免疫，每只注射体积均为40μL，分别在第0天和14天进行疫苗接种，并在首次接种后14天和28天对小鼠进行眼眶取血并分离血清，采用酶联免疫法(ELISA)测定血清中特异性IgG抗体的水平；测试数据如表8所示。
表8
Figure BDA0002502854390000221
由表8的数据可知，采用实施例1和实施例8提供的疫苗组合物作为灭活***疫苗注射免疫，能显著提高机体的体液免疫应答，产生的特异性IgG滴度高于使用传统O/W乳液佐剂的对比例1和使用ISA 206佐剂的对比例6，而且也显著高于直接注射抗原溶液的对照组。由此可以证明，本发明提供的疫苗组合物中，含有离子液体的乳液佐剂与疫苗抗原协同配合，能够增强机体对抗原的免疫应答。
测试例5
本测试例为疫苗组合物的用于流感裂解疫苗注射免疫的效果评价测试，具体方法为：
选用6～8周龄的雌性Balb/c小鼠，在SPF级动物房中适应环境5天后分为4组，每组5只小鼠，分别对应实施例3、对比例2、对比例5和对照组(直接注射抗原溶液)；采用背部皮下注射的方式进行免疫，每只注射体积均为40μL，分别在第0天和14天进行疫苗接种，并在首次接种后14天和28天对小鼠进行眼眶取血并分离血清，采用酶联免疫法(ELISA)测定血清中特异性IgG抗体的水平；测试数据如表9所示。
表9
Figure BDA0002502854390000231
由表9的数据可知，采用实施例3提供的疫苗组合物作为流感裂解疫苗注射免疫，能显著提高机体的体液免疫应答，产生的特异性IgG滴度高于使用传统O/W乳液佐剂的对比例2和使用MF59乳液佐剂的对比例5，而且也显著高于直接注射抗原溶液的对照组。由此可以证明，本发明提供的疫苗组合物中，含有离子液体的乳液佐剂与疫苗抗原协同配合，能够有效增强机体对抗原的免疫应答。
测试例6
本测试例为疫苗组合物的用于流感裂解疫苗鼻黏膜免疫的效果评价测试，具体方法为：
选用6～8周龄的雌性Balb/c小鼠，在SPF级动物房中适应环境5天后分为4组，每组6只小鼠，分别对应实施例3、对比例2、对比例5和对照组(直接滴抗原溶液)；滴鼻前先用异氟烷将小鼠麻醉后进行滴鼻，每只小鼠滴鼻剂量为30μL，左右鼻孔各15μL，分三次滴完。分别在第0天和14天进行疫苗接种，并在首次接种后14天和28天对小鼠进行眼眶取血并分离血清，采用酶联免疫法(ELISA)测定血清中特异性IgG抗体、鼻洗液中特异性IgA(sIgA)和脾细胞中IFN-γ的水平，测试数据如表10所示。
表10
乳液类型 血清IgG sIgA IFN-γ(pg/mL)
实施例3 O/IL乳液 73.6 102400 35.5
对比例2 O/W乳液 12 36800 20.1
对比例5 MF59乳液 12.8 37867 20.6
对照组 磷酸盐缓冲液 3.0 1000 14.3
由表10的数据可知，采用实施例3提供的疫苗组合物作为流感裂解疫苗鼻黏膜免疫，产生的sIgA、IgG和IFN-γ水平显著高于使用传统O/W乳液佐剂的对比例2和使用MF59乳液佐剂的对比例5，而且也显著高于直接滴鼻抗原溶液的对照组。由此可见，本发明提供的疫苗组合物中，含有离子液体的乳液佐剂与疫苗抗原协同配合，不仅能显著提高机体的粘膜免疫应答，同时还能显著提高机体的细胞和体液免疫应答。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种疫苗组合物及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括乳液佐剂和疫苗抗原，所述乳液佐剂包括离子液体、生物相容性油脂和乳化剂。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物为乳液体系；
优选地，所述乳液体系的类型包括油包离子液体型、离子液体包油型、油包离子液体包油型或离子液体包油包离子液体型；
优选地，所述乳液体系中分散相的粒径为1nm～100μm，进一步优选为0.05～3μm；
优选地，所述乳液体系的类型为油包离子液体型，所述乳液体系中分散相的粒径为0.8～3μm；
优选地，所述乳液体系的类型为离子液体包油型，所述乳液体系中分散相的粒径为50～500nm；
优选地，所述乳液体系的类型为离子液体包油包离子液体型，所述乳液体系中分散相的粒径为0.2～3μm。
3.根据权利要求1或2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述乳液佐剂由离子液体溶液、生物相容性油脂和乳化剂组成；
优选地，所述离子液体溶液的浓度为0.001～6mol/L，进一步优选为1～5mol/L；
优选地，所述乳液佐剂中离子液体溶液的体积百分含量为10～90％，进一步优选为40～60％；
优选地，所述疫苗组合物中乳化剂的体积百分含量为0.1～30％；
优选地，所述离子液体溶液的pH值为3.0～9.0；
优选地，所述离子液体溶液的溶剂包括水或缓冲液；
优选地，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液或碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述缓冲液的浓度为1～200mmol/L。
4.根据权利要求1～3任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述离子液体的阳离子包括含氮有机阳离子和/或含磷有机阳离子；
优选地，所述含氮有机阳离子包括咪唑类离子、吡啶类离子、季铵类离子、吡咯类离子或胆碱类离子中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述含磷有机阳离子包括季磷类离子；
优选地，所述离子液体的阴离子包括有机阴离子和/或无机阴离子；
优选地，所述有机阴离子包括乳酸根离子、甲酸根离子、C1～C10烷基羧酸根离子、三氟甲磺酰亚胺离子、多库酯酸根离子、烟碱酸离子或香叶酸根离子中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述无机阴离子包括硫酸根离子、碳酸根离子、碳酸氢根离子、卤素离子、磷酸氢根离子或磷酸二氢根离子中的任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求1～4任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述生物相容性油脂包括肉豆蔻酸异丙酯、生育酚、生育酚类似物、维生素E、角鲨烯、大豆油、花生油、油酸乙酯、油酸、亚油酸乙酯、月桂酸异丙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸甘油三酯、杏仁油、薏仁油、月见草油、芝麻油、棉籽油、蓖麻油、低芥酸菜子油、肉桂酸甘油酯、棕榈酸甘油酯、鲸蜡醇十六酸酯或葵花籽油中的任意一种或者至少两种的组合；
优选地，所述生物相容性油脂选自角鲨烯、大豆油、肉豆蔻酸异丙酯或生育酚中的任意一种或者至少两种的组合。
6.根据权利要求1～5任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述乳化剂包括油溶性乳化剂和/或水溶性乳化剂；
优选地，所述乳化剂包括离子型乳化剂和/或非离子型乳化剂；
优选地，所述离子型乳化剂包括十二烷基苯磺酸钠、硬脂酸、季铵类化合物、卵磷脂、氨基酸型乳化剂、甜菜碱型乳化剂、硫酸化蓖麻油、油酸、月桂酸或三乙醇胺皂中的任意一种或者至少两种的组合；
优选地，所述非离子型乳化剂包括烷基葡萄糖苷、脂肪酸酯、司盘、吐温、蔗糖酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物或脂肪醇中的任意一种或者至少两种的组合。
7.根据权利要求1～6任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗抗原包括减毒活病毒疫苗抗原、灭活病毒疫苗抗原、裂解疫苗抗原、病毒样颗粒疫苗抗原、亚单位疫苗抗原、多糖结合疫苗抗原、核酸疫苗抗原或合成肽疫苗抗原中的任意一种或者至少两种的组合；
优选地，所述减毒活病毒疫苗抗原包括麻疹减毒活疫苗抗原、甲型肝炎减毒活疫苗抗原、水痘减毒活疫苗抗原、乙型脑炎减毒活疫苗抗原、风疹减毒活疫苗抗原、腮腺炎减毒活疫苗抗原、脊髓灰质炎减毒活疫苗抗原、狂犬病减毒活疫苗抗原或流感减毒活疫苗抗原中的任意一种或者至少两种的组合；
优选地，所述灭活病毒疫苗抗原包括灭活***病毒抗原、灭活流感病毒抗原、灭活狂犬病病毒抗原或灭活甲肝病毒抗原中的任意一种或者至少两种的组合；
优选地，所述裂解疫苗抗原包括流感裂解疫苗抗原；
优选地，所述病毒样颗粒疫苗抗原包括重组乙肝表面抗原病毒样颗粒、人***瘤病毒样颗粒、戊肝病毒样颗粒、重组手足口病病毒样颗粒或重组猪圆环病毒样颗粒中的任意一种或者至少两种的组合；
优选地，所述多糖结合疫苗抗原包括b型流感嗜血杆菌结合疫苗抗原、脑膜炎球菌结合疫苗抗原或肺炎球菌结合疫苗抗原中的任意一种或者至少两种的组合；
优选地，所述疫苗抗原的制备方法包括鸡胚培养、细胞培养、重组基因表达或化学合成中的任意一种或者至少两种的组合。
8.一种如权利要求1～7任一项所述的疫苗组合物的制备方法，其特征在于，所述疫苗组合物通过制备方法I、制备方法II、制备方法III中的任意一种制备得到；
所述制备方法I为：将生物相容性油脂和乳化剂混合得到油性混合物；将离子液体和疫苗抗原混合得到离子液体相混合物；将所述油性混合物和离子液体相混合物进行混合、乳化，得到所述疫苗组合物；
所述制备方法II为：将生物相容性油脂和乳化剂混合后再与离子液体进行混合、乳化，得到乳液混合物；将所述乳液混合物与疫苗抗原混合均匀，得到所述疫苗组合物；
所述制备方法III为：将生物相容性油脂和乳化剂I混合得到油性混合物；将离子液体、乳化剂II和疫苗抗原混合得到离子液体相混合物；将所述油性混合物和离子液体相混合物进行混合、乳化，得到所述疫苗组合物。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，制备方法I、制备方法II、制备方法III所述乳化的方法各自独立地包括研钵法、振荡法、搅拌法、注射器互推法、超声法、膜乳化法、喷雾法或均质法中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，制备方法I、制备方法II、制备方法III所述疫苗抗原均为疫苗抗原的溶液；
优选地，所述疫苗抗原的溶液中抗原浓度为2～100μg/mL；
优选地，所述溶液的溶剂包括缓冲液；
优选地，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液或碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述缓冲液的浓度为1～200mmol/L；
优选地，制备方法I中所述乳化剂为油溶性乳化剂；
优选地，制备方法I中所述离子液体和疫苗抗原的体积比为9:1～1:9，进一步优选为6:4～4:6；
优选地，制备方法II中所述乳化剂为水溶性乳化剂；
优选地，制备方法II中所述乳液混合物与疫苗抗原的体积比为9:1～1:9；
优选地，制备方法III中所述乳化剂I为油溶性乳化剂；
优选地，制备方法III中所述乳化剂II为水溶性乳化剂；
优选地，制备方法III中所述离子液体与疫苗抗原的体积比为9:1～1:9；
优选地，制备方法III中所述油性混合物和离子液体相混合物的体积比为9:1～1:9。
10.一种疫苗制剂，其特征在于，所述疫苗制剂包括如权利要求1～7任一项所述的疫苗组合物；
优选地，所述疫苗制剂包括人用疫苗制剂或兽用疫苗制剂。
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