CN109444200A - 一种采用核磁共振氢谱指纹图谱鉴别东北椴树蜜的方法 - Google Patents

一种采用核磁共振氢谱指纹图谱鉴别东北椴树蜜的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种采用核磁共振氢谱指纹图谱鉴别东北椴树蜜的方法，属于蜂蜜检测技术领域，包括步骤：称取待鉴别的蜂蜜或糖浆样品，用磷酸盐缓冲液稀释，涡旋后静置；用盐酸或氢氧化钾溶液将稀释后的溶液滴定至pH＝2.5‑5.0；量取处理后的样品，加入含2,2,3,3‑四氘代三甲基硅烷丙烯酸和叠氮化钠的重水溶液定容，涡旋均匀后装入核磁管；采用液体核磁共振仪测定核磁管中的样品，获得核磁共振氢谱指纹图谱，在3.0±0.02ppm位移附近存在一个山形的三指峰，则证明所鉴别的蜂蜜或糖浆样品为东北椴树蜜。本发明提供的鉴别方法经济高效，样品处理方式灵活，能够直观准确地鉴定出纯正东北椴树蜜。

Description

一种采用核磁共振氢谱指纹图谱鉴别东北椴树蜜的方法
技术领域
本发明属于蜂蜜检测技术领域，具体涉及一种采用核磁共振氢谱指纹图谱鉴别东北椴树蜜的方法。
背景技术
椴树蜜是蜜蜂从椴树花上采集的花蜜，常温下为透明浅黄色粘稠液体，低温下易呈乳白色凝脂状结晶，色泽如油脂，味道清香，口感甘甜，是我国东北山区森林盛产的特色野生蜜种。东北椴树蜜曾在清朝时作为皇家贡蜜而闻名于世，因富含葡萄糖及果糖、多种维生素、无机盐、有机酸酶及促进人体生长和活力的生物素，比一般蜂蜜更能补血润肺，促进细胞再生，增加食欲等，也因此深受消费者的青睐。然而，在商业利益的驱使下，很多不法商贩利用各种糖、糖浆以及低廉的油菜蜜等对纯品东北椴树蜜种进行掺假，导致市场上销售的椴树蜜品牌五花八门，价格参差不齐，严重损害了蜂蜜行业的品质信誉和消费者的健康及利益。因此很有必要发明一种简单高效的检测技术实现对纯品蜜种的快速鉴定，以保证消费者买到放心正宗的高品质纯东北椴树蜜。
目前国内蜂蜜检测方面的研究多集中于糖浆掺入分析，而有关蜂蜜品种鉴定的报道则相对有限，专利一种快速识别蜂蜜品种和掺假蜂蜜的方法(申请号为201810462442.6)公开了一种利用荧光发射光谱鉴别蜂蜜品种及糖浆掺假的方法，方法简便快速，但是由于其分析用糖浆及蜂蜜样品数量有限，并不能统一衡量不同品种蜂蜜或掺假蜂蜜的特征，因而易出现结果不准确的现象。专利一种基于核磁共振技术用于荆条蜜、油菜蜜和洋槐蜜的鉴别(申请号为201710742918.7)公开了一种利用核磁共振技术鉴别特定蜂蜜的方法，准确高效，但蜂蜜样品涉及复杂的过滤处理，且样品准备过程使用大量昂贵的重水(0.03-0.5g/L蜂蜜重水溶液)，成本相对较高。核磁共振氢谱(1H NMR)指纹图谱技术作为一种先进的检测手段，具有无损、快捷、准确度高、重现性好的优势，已被用于多种蜂蜜产品的安全性或糖浆掺假研究，而国内利用该项技术鉴别纯正东北椴树蜜尚未见诸报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种采用核磁共振氢谱指纹图谱鉴别东北椴树蜜的方法，经济高效，样品处理方式灵活，能够直观准确地鉴定出纯正东北椴树蜜。
本发明提供了如下的技术方案：
一种采用核磁共振氢谱指纹图谱鉴别东北椴树蜜的方法，包括以下步骤：
S1、称取待鉴别的蜂蜜或糖浆样品，用磷酸盐缓冲液稀释，经充分涡旋后静置处理；
S2、用1mol/L的盐酸或氢氧化钾溶液将S1中稀释后的溶液滴定至pH＝2.5-5.0；
S3、量取经S2处理后的样品500-900μL，加入含0.1-0.2％2,2,3,3-四氘代三甲基硅烷丙烯酸和0.01-0.02％叠氮化钠的重水溶液，定容到1mL，涡旋均匀后量取500-600μL装入核磁管；
S4、采用液体核磁共振仪测定核磁管中的样品，测定条件为：
采用预饱和方法压制水峰；
脉冲程序为：noesygppr1d；
O1：4.7-4.8；
NS：BBI探头16或32，BBO探头32或64；
DS＝2或4；
D1＝4s；
S5、获得核磁共振氢谱指纹图谱，图谱中在3.0±0.02ppm位移附近存在一个山形的三指峰，则证明所鉴别的蜂蜜或糖浆样品为东北椴树蜜，如果无此特征峰形，则可认定为非东北椴树蜜、糖浆或掺假东北椴树蜜、糖浆。
优选的，所述S1中，当待鉴别的蜂蜜或糖浆样品为结晶形态时，需在低于60℃的恒温水浴中融化冷却后称量。
优选的，所述S1中磷酸盐缓冲液为超纯水配制的0.5mol/L的磷酸二氢钾。
优选的，所述S2中的1mol/L盐酸或氢氧化钾溶液由超纯水配制。
优选的，所述S3中的液体核磁共振仪的测定温度为20-30℃。
本发明的有益效果是：
(1)本发明提供的方法，氘代试剂消耗少，成本低。
(2)本发明提供的方法中，待鉴别的蜂蜜或糖浆样品的处理方式灵活，简单高效。
(3)通过设定液体核磁共振仪的相关测定参数，观察和分析所获得的图谱，可直观准确地区分出东北椴树蜜与非东北椴树蜜。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为实施例1中4个东北椴树蜜样品在2.68-3.12ppm内的核磁谱图；
图2为实施例1中油菜蜜、荆条蜜和洋槐蜜样品在2.68-3.12ppm内的核磁谱图；
图3为实施例1中葵花蜜、棉花蜜和枣花蜜样品在2.68-3.12ppm内的核磁谱图；
图4为实施例1中茴香蜜、花椒蜜和荞麦蜜样品在2.68-3.12ppm内的核磁谱图；
图5为实施例2中4个东北椴树蜜样品在2.68-3.12ppm内的核磁谱图；
图6为实施例2中柠檬蜜、柑橘蜜和龙眼蜜样品在2.68-3.12ppm内的核磁谱图；
图7为实施例2中党参蜜、橡胶蜜和马占相思树蜜样品在2.68-3.12ppm内的核磁谱图；
图8为实施例2中8个糖浆样品在2.68-3.12ppm内的核磁谱图。
具体实施方式
实施例1
1、主要仪器：
400MHz液体核磁共振谱仪(瑞士布鲁克公司)，BBI探头，配有适用于微量滴定的BTpH Unit；IT0079电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；5mm核磁管(美国Wilmad-labglass公司)。
2、试剂：
叠氮化钠(NaN3，分析纯)购于天津福晨化学试剂厂。重水(D2O，99.9％氘代)购于上海安耐吉化学有限公司。2,2,3,3-氘代三甲基硅烷丙酸钠盐(TSP，98％氘代)、磷酸二氢钾(KH2PO4，分析纯)购于上海国药集团化学试剂有限公司。37％HCl溶液(优级纯)购于上海国药集团化学试剂有限公司。KOH(分析纯)购于上海国药集团化学试剂有限公司。其中，0.5mol/L的KH2PO4缓冲液，1mol/L的HCl及KOH溶液分别由超纯水配制而成。0.15％TSP及0.015％NaN3的混合溶液用重水配置。
3、样品收集
3.1纯正东北椴树蜜的采集：所用东北椴树蜜原料分别采自中国吉林、辽宁及黑龙江地区，分别于20-25℃的环境下保存1-2年；
3.2其它单一纯正蜂蜜的采集：油菜蜜、荆条蜜、洋槐蜜、葵花蜜(新疆)、棉花蜜、枣花蜜、茴香蜜、花椒蜜和荞麦蜜；亲自到原料产地采集或由中国蜂蜜知名生产企业提供，保证来源真实可靠，且每种蜜种包含至少20个样品，储存期为1-2年。
4、样品检测
S1、分别称取0.1g东北椴树蜜(椴树蜜1、椴树蜜2、椴树蜜3和椴树蜜4)和其它蜂蜜样品，结晶样品需在低于60℃的水浴条件下融化冷却后称量，加入0.5mol/L的KH2PO4缓冲液1mL，充分涡旋，静置；
S2、用1mol/L盐酸或氢氧化钾溶液将S1中稀释过的样品溶液滴定至pH＝2.8±0.1；
S3、量取S2中滴定处理过的样品800μL，加入含0.15％2,2,3,3-四氘代三甲基硅烷丙烯酸盐(TSP)和0.015％叠氮化钠(NaN3)的重水溶液200μL，涡旋均匀后量取550μL装入核磁管；
S4、采用液体核磁共振仪测定核磁管中的样品，测定条件为：
测定温度：25℃；
采用预饱和方法压制水峰；
脉冲程序为：noesygppr1d；
O1：4.7-4.8(视水峰压制条件而定)；
P1＝10.4μs；
TD＝64K；
NS＝16或32；
DS＝4；
SWH＝8023Hz；
D1＝4s；
D8＝0.01s；
S5、使用软件Topspin3.5分析所有原料蜜种的核磁共振氢谱(1H NMR)数据，将内标TSP的化学位移设置为0，然后进行基线校正和相位校正；获得的核磁共振氢谱指纹图谱中，只有纯正的东北椴树蜜在3.0±0.02ppm位移附近存在一个山形的三指峰(见附图1)，油菜蜜、荆条蜜、洋槐蜜、葵花蜜(新疆)、棉花蜜、枣花蜜、茴香蜜、花椒蜜和荞麦蜜均无此特征峰形(见附图2、3、4)，因此该特征峰的存在可以作为鉴别东北椴树蜜的标志。
实施例2
1、主要仪器：
400MHz液体核磁共振谱仪(德国布鲁克公司)，BBO探头；IT0079电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；ET-18电位滴定仪(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；5mm核磁管(美国Wilmad-labglass公司)。
2、试剂：
叠氮化钠(NaN3，分析纯)购于天津福晨化学试剂厂。重水(D2O，99.9％氘代)购于上海安耐吉化学有限公司。2,2,3,3-氘代三甲基硅烷丙酸钠盐(TSP，98％氘代)、磷酸二氢钾(KH2PO4，分析纯)购于上海国药集团化学试剂有限公司。37％HCl溶液(优级纯)购于上海国药集团化学试剂有限公司。KOH(分析纯)购于上海国药集团化学试剂有限公司。其中，0.5mol/L的KH2PO4缓冲液，1mol/L的HCl及KOH溶液分别由超纯水配制而成。0.15％TSP及0.015％NaN3的混合溶液用重水配置。
3、样品收集
3.1纯正东北椴树蜜的采集：所用东北椴树蜜原料分别采自中国吉林、辽宁及黑龙江地区，分别于20-25℃的环境下保存1-2年；
3.2其它单一纯正蜂蜜的采集：龙眼蜜、柑橘蜜、柠檬蜜、马占相思树蜜、橡胶蜜、党参蜜；亲自到原料产地采集或由中国蜂蜜知名生产企业提供，保证来源真实可靠，且每种蜜种包含至少20个样品，储存期为1-2年；
3.3各类糖浆的收集：包括甜菜类、淀粉类及其他各类型糖浆8个，分别来自国内各糖浆生产商。
4、样品检测
S1、分别称取8g东北椴树蜜(椴树蜜5、椴树蜜6、椴树蜜7和椴树蜜8)和其它蜂蜜及各类糖浆样品，结晶样品需在低于60℃的水浴条件下融化冷却后称量，加入0.5mol/L的KH2PO4缓冲液25mL，充分涡旋，静置；
S2、用1mol/L盐酸或氢氧化钾溶液将S1中稀释过的样品溶液滴定至pH＝2.8±0.1；
S3、量取S2中滴定处理过的样品700μL，加入含0.15％2,2,3,3-四氘代三甲基硅烷丙烯酸盐(TSP)和0.015％叠氮化钠(NaN3)的重水溶液300μL，涡旋均匀后量取600μL装入核磁管；
S4、采用液体核磁共振仪测定核磁管中的样品，测定条件为：
测定温度：20℃；
采用预饱和方法压制水峰；
脉冲程序为：noesygppr1d；
O1：4.7-4.8(视水峰压制条件而定)；
P1＝10.5μs；
TD＝64K；
NS＝32或64；
DS＝2；
SWH＝8012Hz；
D1＝4s；
D8＝0.01s；
S5、使用软件Topspin3.5分析所有原料蜜种的核磁共振氢谱(1H NMR)数据，将内标TSP的化学位移设置为0，然后进行基线校正和相位校正；获得的核磁共振氢谱指纹图谱中，只有纯正的东北椴树蜜在3.0±0.02ppm位移附近存在一个山形的三指峰(见附图5)，龙眼蜜、柑橘蜜、柠檬蜜、马占相思树蜜、橡胶蜜、党参蜜和8个糖浆样品均无此特征峰形(见附图6、7、8)，因此该特征峰的存在可以作为鉴别东北椴树蜜的标志。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种采用核磁共振氢谱指纹图谱鉴别东北椴树蜜的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、称取待鉴别的蜂蜜或糖浆样品，用磷酸盐缓冲液稀释，经充分涡旋后静置处理；
S2、用1mol/L的盐酸或氢氧化钾溶液将S1中稀释后的溶液滴定至pH＝2.5-5.0；
S3、量取经S2处理后的样品500-900μL，加入含0.1-0.2％2,2,3,3-四氘代三甲基硅烷丙烯酸和0.01-0.02％叠氮化钠的重水溶液，定容到1mL，涡旋均匀后量取500-600μL装入核磁管；
S4、采用液体核磁共振仪测定核磁管中的样品，测定条件为：
采用预饱和方法压制水峰；
脉冲程序为：noesygppr1d；
O1：4.7-4.8；
NS：BBI探头16或32，BBO探头32或64；
DS＝2或4；
D1＝4s；
S5、获得核磁共振氢谱指纹图谱，图谱中在3.0±0.02ppm位移附近存在一个山形的三指峰，则证明所鉴别的蜂蜜或糖浆样品为东北椴树蜜，如果无此特征峰形，则可认定为非东北椴树蜜、糖浆或掺假东北椴树蜜、糖浆。
2.根据权利要求1所述的一种采用核磁共振氢谱指纹图谱鉴别东北椴树蜜的方法，其特征在于，所述S1中，当待鉴别的蜂蜜或糖浆样品为结晶形态时，需在低于60℃的恒温水浴中融化冷却后称量。
3.根据权利要求1所述的一种采用核磁共振氢谱指纹图谱鉴别东北椴树蜜的方法，其特征在于，所述S1中磷酸盐缓冲液为超纯水配制的0.5mol/L的磷酸二氢钾。
4.根据权利要求1所述的一种采用核磁共振氢谱指纹图谱鉴别东北椴树蜜的方法，其特征在于，所述S2中的1mol/L盐酸或氢氧化钾溶液由超纯水配制。
5.根据权利要求1所述的一种采用核磁共振氢谱指纹图谱鉴别东北椴树蜜的方法，其特征在于，所述S3中的液体核磁共振仪的测定温度为20-30℃。
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