CN107561111A

CN107561111A - 一种快速鉴别蜂蜜中掺入木薯糖浆的核磁共振波谱方法

Info

Publication number: CN107561111A
Application number: CN201710747352.7A
Authority: CN
Inventors: 刘芸; 丁涛; 吴斌; 张睿; 张健; 费晓庆; 陈磊; 张晓燕
Original assignee: PROPAGATION AND FOOD TEST CENTER OF JIANGSU ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Current assignee: PROPAGATION AND FOOD TEST CENTER OF JIANGSU ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Priority date: 2017-08-25
Filing date: 2017-08-25
Publication date: 2018-01-09
Anticipated expiration: 2037-08-25
Also published as: CN107561111B

Abstract

本发明一种快速鉴别蜂蜜中掺入木薯糖浆的核磁共振波谱方法，将蜂蜜样品，过滤后用重水配置成0.03‑0.5g/L的溶液；加入含体积分数为0.05‑0.3%的3‑三甲基硅烷基‑1‑丙基磺酸钠内标溶液和0.1‑3.0 mM的叠氮化钠的磷酸盐缓冲溶液，混合，调整pH为2.5‑4.0，经核磁共振谱仪测定得到核磁共振谱；分析蜂蜜样品标记物化学位移，含有¹H化学位移δ为2.65ppm±0.02‑0.05ppm和2.09ppm±0.02‑0.05ppm的两个单峰，则可判断该样品中掺入了木薯糖浆，否则没有，本方法可短时间内分析大量样品，快速鉴别出蜂蜜中是否掺入了木薯糖浆。

Description

一种快速鉴别蜂蜜中掺入木薯糖浆的核磁共振波谱方法

技术领域

本发明涉及食品安全检测领域，具体涉及一种快速鉴别蜂蜜中掺入木薯糖浆的核磁共振波谱方法。

背景技术

根据国家标准GB 14963-2011《食品安全国家标准蜂蜜》中规定，蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜/分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜物质。天然蜂蜜的主要成分是葡萄糖(25.2％～35.3％)、果糖(33.3％～43.0％)、氨基酸、矿物质、维生素和多种活性酶。蜂蜜因其一定的营养价值和保健作用而深受消费者的青睐。近些年来，蜂蜜掺假现象愈加严重，主要是向蜂蜜中掺入一些糖类物质，降低了蜂蜜的品质，损害了消费者的利益。

近几年主要掺入的糖浆是四种：甜菜糖浆、大米糖浆、木薯糖浆、小麦糖浆。由于蜂蜜中的果糖和葡萄糖比例与这些糖浆中的果糖和葡萄糖比例十分相似，可使掺入这些糖浆后的蜂蜜的各项指标完全符合国家标准，给检测造成了很大的困难。

近年来掺假蜂蜜检测常用的方法有：C4(玉米糖浆检测)，SMR(大米糖浆检测)，SMB(甜菜糖浆检测)，C3/C4(碳同位素比率法)，TLC(高果糖淀粉糖浆薄层法)和外来酶法等几种检测方法。但现在出现了的木薯糖浆等C3植物的转化糖浆，其制作工艺中除去了大部分糖类物质和大部分寡糖，其碳同位素值与蜂蜜的碳同位素值在同一范围内，以上其它的方法也很难检出掺有此种糖浆的蜂蜜。因此，为解决蜂蜜生产中出现的掺假问题，建立灵敏度高、检测周期短、适应新掺假手段的蜂蜜中木薯糖浆掺假的鉴别技术就显得十分重要和紧迫。

核磁共振波谱技术就是以一定频率的射频脉冲术，照射在蜂蜜的内部，利用蜂蜜中所含所有物质的原子核在磁场作用下，发生能级***，当吸收的能量与原子核跃迁能级相等时，就会发生原子核能级跃迁从而产生一种能谱，从而采集携带蜂蜜所有信息的核磁共振波谱，最终分析与蜂蜜掺假相关的快速检测。由于核磁共振技术具快速性、无破坏性、可重复性等优点，因此开展核磁共振技术用于蜂蜜中木薯糖浆的检测，对于蜂蜜生产企业在原料的收取检验和产品质量控制方面，以及对于执法部门对市场产品质量检测和打击掺假方面都有较大的影响。

发明内容

本发明提供了一种快速鉴别蜂蜜中掺入木薯糖浆的核磁共振波谱方法，准确率高、分析时间短，可以弥补目前蜂蜜掺假鉴别方法存在的缺陷，极大地提高了掺假蜂蜜中掺入木薯糖浆检测的效率和准确性。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是这样的，一种快速鉴别蜂蜜中掺入木薯糖浆的核磁共振波谱方法，包括如下步骤，

1)将搅拌均匀的蜂蜜样品，滤布过滤，除去蜂蜜中固体杂质后，用重水配置成0.03-0.5g/L的溶液；所述的蜂蜜样品为荆条蜜、油菜蜜和洋槐蜜；

2)取一定体积的上述溶液，加入浓度为0.5-2.0mol/L的磷酸盐缓冲溶液，两者的体积比为800-1500：100-300，其中，磷酸盐缓冲溶液中含体积分数为0.05-0.3％的3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸钠内标溶液和0.1-3.0mM的叠氮化钠，涡旋振荡至均匀混合，调整最终溶液的pH值为2.5-4.0，置于核磁管中；

3)将核磁管放置于核磁共振谱仪中，检测得到核磁共振谱；核磁共振波谱的分析条件为：采用BBI探头；测定温度:室温20-35℃；环境湿度:20-35％；观察频率400MHz；采用预饱和方法压制水峰；脉冲程序为：noesygppr1d或者zg30或者zgpr；谱宽:6410Hz；90°脉冲宽度:pl＝6.45μs；脉冲延迟时间:dl＝15s；发射中心:O1＝4.7；累加次数:16或者64；

4)分析蜂蜜样品标记物化学位移，含有¹H化学位移δ为2.65ppm±0.02-0.05ppm和2.09ppm±0.02-0.05ppm的两个单峰，则可判断该样品中掺入了木薯糖浆，否则没有。

优选地，对于结晶的蜂蜜样品，搅拌均匀前，在密闭情况下，置于不超过40-60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化，搅拌均匀后，再迅速冷却至室温。

优选地，蜂蜜样品过滤采用孔径为0.10mm-0.14mm的尼龙滤布。

优选地，步骤2)调整最终溶液的pH值所采用的浓度为1.0mol/L盐酸或强氧化钠。

本方法对于蜂蜜中所掺入的木薯糖浆最低检出量为10％w/w。

有益效果：与现有技术相比，本发明的方法准确率高、分析时间短，可以弥补目前蜂蜜掺假鉴别方法存在的缺陷。极大地提高了掺假蜂蜜中掺入木薯糖浆检测的效率和准确性。

附图说明

图1为甘肃洋槐的核磁谱图；

图2为木薯糖浆的核磁谱图；

图3为掺入10％木薯糖浆的甘肃洋槐蜂蜜的核磁谱图。

具体实施方式

通过以下具体实施方式对本发明进一步的解释，并对本发明优点进行证明。

实验设备包括：Advance 400型核磁共振仪(瑞士布鲁克公司)，14.1T超导磁体，5mm双核z-梯度探头及Topspin 2.3试验控制及数据处理软件；5mm核磁共振样品管；高速离心机(Sigma，德国公司)；涡旋混合器(XW-80A型，上海医科大学仪器厂)；LP403分析天平(赛多利斯，德国公司)；

实验溶剂包括：氘代水(氘带度为99.8％，又名重水)购于Cambrideg IsotopeLaboratories公司；3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸钠(TSPSA)购于Aldich-Sigma公司；磷酸氢二钾和磷酸二氢钠(优级纯)购于Aldich-Sigma公司。

1.木薯糖浆标志物的确证

1、1样品的前处理

分别选取纯木薯糖浆、纯蜂蜜和掺入10％木薯糖浆的蜂蜜作为实验样品，其中，蜂蜜为甘肃洋槐蜂蜜，对于样品中无结晶的，过滤前将其搅拌均匀即可，而对有结晶的，在密闭情况下，置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温；将融化后的样品，经0.10mm-0.14mm孔径尼龙滤布过滤，除去蜂蜜中固体杂质。取0.1g样品于离心管中，加入1mL重水，溶解完全；

取上述溶液800μl，加入100μl浓度为0.5mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝2.0)，其中缓冲溶液中含体积分数为0.05％的3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸钠内标溶液和0.1mM的叠氮化钠，涡旋振荡至均匀混合，然后用1.0mol/L的盐酸和强氧化钠，调整最终溶液的pH值为2.5，取其中600μl于核磁管中。

1、2核磁指纹图谱数据库的建立

调整好核磁波谱仪并把核磁管放置于核磁共振波谱仪中，旋转核磁管以备¹HNMR检测，得到样品的核磁信号；采用BBI探头；测定温度(探头温度):室温20-35℃；环境湿度:20-35％；观察频率400MHz；采用预饱和方法压制水峰；脉冲程序为：noesygppr1d或者zg30或者zgpr；谱宽:6410Hz；90°脉冲宽度:pl＝6.45μs；脉冲延迟时间:dl＝15s；发射中心:O1＝4.7；累加次数:16或者64。

1、3谱图预处理

用核磁共振谱仪自带的数据处理软件对所得的核磁共振信号进行傅立叶变得换，变换点数为131072，指数线宽因子为1Hz，得到样品的核磁图谱。

用topspin软件(Topspin软件中各参数设置如下：PULPROG＝Jresgpprqf,AQ_mod＝DQD,TD＝32K,NS＝8*N,DS＝4,TD0＝1,SW＝6000Hz,D1＝3s,DE＝4μs,D8＝0.1s,信号累加16次)将获得的原始指纹图谱进行预处理，包括谱峰对齐、基线校正和相位校正。以3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸钠做内标物，化学位移设为0.00进行谱峰对齐；基线校正选择polynomial fit拟合方式；相校正选择global和metabonomics算法先自动优化，后针对特定区域进行手动校正，使尽可能多的积分值为正值；所得的甘肃洋槐蜂蜜、木薯糖浆和掺入10％木薯糖浆的甘肃洋槐蜂蜜的核磁共振图谱，如图1、图2和图3所示。

1、4核磁共振谱图的比较分析

通过比较研究甘肃洋槐蜂蜜、木薯糖浆和掺入10％木薯糖浆的甘肃洋槐蜂蜜样品的核磁共振谱图，发现被检测的木薯糖浆样品和掺入10％木薯糖浆的蜂蜜样品中均含有两个较高的谱峰，其¹H化学位移δ分别为2.65ppm和2.09ppm的两个单峰，而纯蜜种样品在此化学位移处均无干扰。

为了确证所找的木薯糖浆标志物的准确性，收集了国内不同产地和蜜源的蜂蜜共计150种(包括槐蜜、油菜蜜、椴树蜜、荆条蜜、紫云英蜜、荔枝蜜、龙眼蜜、枣花蜜、枸杞蜜、葵花蜜、黄芪蜜、益母草蜜、枇杷蜜、党参蜜、小茴香蜜和杂花蜜16种蜜源的蜂蜜，分别来自辽宁、河北、内蒙古、山东、湖南、安徽等共计26个省市)，分析发现均含有化学位移2.65ppm和2.09ppm处均无干扰，说明结果表明，所找的木薯糖浆标志物在所有纯蜂蜜中都无干扰，天然蜂蜜中不存在木薯糖浆特征物；也通过在不同产地和蜜源的蜂蜜中添加不同浓度的木薯糖浆来确证最终的木薯糖浆浆标志物，最终确定为¹H化学位移δ为¹H化学位移δ为2.65ppm和2.09ppm的两个单峰，是木薯糖浆显著区别与纯蜂蜜的特征性差异物质，可以使用这两谱峰作为木薯糖浆的特征标志物，同时通过蜂蜜中添加不同浓度的木薯糖浆蜂蜜样品的检测，确认了蜂蜜中所掺入的木薯糖浆最低检出量为10％。

2.实际样品检测

运用建立的快速鉴别蜂蜜中掺入木薯糖浆的方法对未知蜂蜜样品进行检测。将待鉴别的42份蜂蜜样品按上述步骤1.2～1.4的方法进行操作，获得所有样品的核磁共振谱图，依据找到的木薯糖浆标记物对未知样品进行判断，木薯糖浆中的标记物1H化学位移为2.65ppm和2.09ppm，在相同的实验条件下检测的样品与纯木薯糖浆标志物的化学位移△δ在0.02-0.05ppm范围以内，则认为该样品中掺入了木薯糖浆，依据此对未知样品进行检测分析，具体结果如表1所示。

表1

样品类型	真实结果	检出结果
			真实蜂蜜样品(16个)	阴性	阴性
木薯糖浆样品(10个)	阳性	阳性
			掺入木薯糖浆的蜂蜜样品(16个)	阳性	阳性

结果分析：所有真实蜂蜜中均没有检出¹H化学位移为2.65ppm和2.09ppm的木薯糖浆的特征标志物，而所有木薯糖浆谱图中均检出了¹H化学位移为2.65ppm和2.09ppm的两个谱峰，其它掺入木薯糖浆的掺假蜂蜜谱图中也检出了木薯糖浆的标志物，说明该方法的准确率为100％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种快速鉴别蜂蜜中掺入木薯糖浆的核磁共振波谱方法，其特征在于，包括如下步骤，

2.根据权利要求1所述的一种快速鉴别蜂蜜中掺入木薯糖浆的核磁共振波谱方法，其特征在于，对于结晶的蜂蜜样品，搅拌均匀前，在密闭情况下，置于不超过40-60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化，搅拌均匀后，再迅速冷却至室温。

3.根据权利要求1所述的一种快速鉴别蜂蜜中掺入木薯糖浆的核磁共振波谱方法，其特征在于，蜂蜜样品过滤采用孔径为0.10mm-0.14mm的尼龙滤布。

4.根据权利要求1所述的一种快速鉴别蜂蜜中掺入木薯糖浆的核磁共振波谱方法，其特征在于，步骤2)调整最终溶液的pH值所采用的浓度为1.0mol/L盐酸或强氧化钠。

5.根据权利要求1所述的一种快速鉴别蜂蜜中掺入木薯糖浆的核磁共振波谱方法，其特征在于，本方法对于蜂蜜中所掺入的木薯糖浆最低检出量为10％w/w。