CN109439559A - 一株产阿魏酸酯酶的乳酸片球菌 - Google Patents

一株产阿魏酸酯酶的乳酸片球菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株从青贮饲料分离得到的可以产阿魏酸酯酶的乳酸片球菌，保藏号为CGMCC12956，具有产阿魏酸酯酶的能力，最适pH 6.4，最适温度37℃，在pH 5‑7，温度25‑50℃条件下可以保持较好的稳定性。本发明菌株可应用于青贮饲料添加剂的制备以及保健食品和药品的制备。

Description

一株产阿魏酸酯酶的乳酸片球菌
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及乳酸菌开发与应用领域，具体是一株产阿魏酸酯酶的乳酸片球菌。
背景技术
阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)是指能将阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中阿魏酸游离出来的一种酶。它可以水解植物细胞壁的木素与木素之间、木素与半纤维素之间、半纤维素与半纤维素之间形成的交联，使细胞壁变松弛，在植物纤维结构的降解中有重要作用。
阿魏酸酯酶对植物细胞壁的降解具有重要作用，主要降解植物细胞壁多糖如***木聚糖、果胶等中的***糖或半乳糖与羟基肉桂酸之间的酯键。在细胞壁的降解过程中不仅有微生物所分泌的纤维素酶和糖苷酶参与降解纤维素和半纤维素分子，而且微生物还可以产生阿魏酸酯酶来有效降解这种致密网状交联结构，这类酶与其他的糖类水解酶等联合作用可较彻底降解植物细胞壁。当其作用于天然木质纤维素原料时，可以水解阿魏酸与半纤维素之间的酯键，将阿魏酸从植物细胞壁中游离出来，从而破坏细胞壁的骨架结构，使得原料结构疏松，这样各种胞壁降解酶类更容易接近底物而加速降解细胞壁。
阿魏酸(ferulic acid)，是植物界普遍存在的一种酚酸；研究表明阿魏酸可以作为抗氧化剂，用于油脂的抗氧化，除此之外，阿魏酸还具有的抗肿瘤、消炎、促进伤口愈合等保健作用，所以阿魏酸可作为功能因子开发功能性的食品。使用阿魏酸酯酶或使用阿魏酸酯酶与其他酶协同作用从植物中提取阿魏酸。
利用阿魏酸酯酶处理植物性的原材料，可以将阿魏酸从植物细胞壁的结构中游离出来，从而破坏了细胞壁的骨架结构，使其结构变得比处理前疏松。在饲料工业中，变得疏松的原料更容易被牲畜消化吸收利用，可以提高饲料的利用效率。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株具有产阿魏酸酯酶能力的乳酸片球菌，以期在青贮饲料发酵生产中得到进一步开发利用。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术步骤如下。
(1)出发菌株：以本实验室从青贮饲料中分离获得并且保藏的各种乳酸菌为起始菌株，主要包括植物乳杆菌，短乳杆菌，副干酪乳杆菌，乳酸片球菌，戊糖片球菌等。
(2)筛选试验：将上述乳酸菌接种到以阿魏酸乙酯为唯一碳源的平板培养基，适宜条件下培养，产生透明菌圈的可初步判定为产阿魏酸酯酶。
(3)液体培养产酶：将(2)中初筛得到的菌株接种到含阿魏酸甲酯的培养基中进行发酵产酶。
(4)将(3)中培养后的酶液进行酶活测定，选出1株产酶活性高的菌株乳酸片球-FE2， (拉丁文命名为Pediococcus acidilactici)。
(5)对产酶活性高的1株菌株的生理生化特性和酶学性质进行分析测定。
(6)将菌株FE2的16S rRNA基因序列在Genbank进行注册，获得Genbank数据库菌株FE2的序列号：MF 093220。
本发明所述具有产阿魏酸酯酶能力的乳酸片球菌已于2016年9月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC12956。
本发明所获得的乳酸片球菌FE2，可以应用于发酵工业生产当中，特别是应用于青贮饲料的发酵中。乳酸菌生物制剂已广泛应用于青贮饲料生产中，并对提高青贮饲料发酵品，改善青贮饲料适口性，提高家畜采食量具有重要作用。由于大多数商业乳酸菌缺乏降解纤维素的酶，所以新型的产纤维分解酶乳酸菌的研究和利用已成为目前国内外研究热点。在青贮饲料生产中，使用产阿魏酸酯酶乳酸菌不仅可以提高青贮饲料发酵品质，同时又能降解青贮饲料中的纤维，提高动物对青贮饲料的消化率。因此，筛选具有产阿魏酸酯酶的乳酸菌菌株具有重要的开发和应用价值。
附图说明
图1为乳酸片球菌FE2粗酶液的最适反应pH。
图2为乳酸片球菌FE2粗酶液的最适反应pH稳定性。
图3为乳酸片球菌FE2粗酶液的最适反应温度。
图4为乳酸片球菌FE2粗酶液的最适反应温度稳定性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
培养基配方：乳酸细菌培养基(MRS)(张刚，2007)：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，吐温-80 1mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 6.2-6.6。制法：将除琼脂外所有成分加入水中加热溶解，调pH 6.2～6.4，加入琼脂，121℃灭菌15min，趁热倒平板。
实施例1：产阿魏酸酯酶菌株的筛选实验。
1.将乳酸菌活化2-3次，在MRS固体培养基上进行划线，37℃条件下培养2天。
2.挑取单菌落于不加葡萄糖，以阿魏酸乙酯为唯一碳源的MRS固体培养基上，每个板子加入0.3ml的阿魏酸乙酯溶液，将阿魏酸乙酯溶于二甲基甲酰胺，制成质量体积比为10％的溶液，30℃下培养72h，观察平板上是否出现透明菌圈。
3.产生透明菌圈的可初步判定为产阿魏酸酯酶。供试的一株乳酸片球菌FE2产生透明圈。
实施例2：液体培养产酶及酶活分析测定。
1.初筛后的菌株乳酸片球菌FE2在MRS液体培养基中，37℃，过夜培养，3000rpm离心5min，收集菌体。
2.用0.85％生理盐水洗涤菌体3次，重悬于去离子水中。
3.取菌悬液(定菌数1×109cfu/ml)接种到含阿魏酸甲酯的培养基中(100ml培养基中加5ml阿魏酸甲酯(1％W/V二甲基甲酰胺))，菌种接种量为2％(V/V)，进行发酵。发酵条件为37℃，48h，振荡频率为120rpm。
4.吸取9ml发酵液于10ml离心管中，10000rpm离心10min，上清液即为阿魏酸酯酶粗酶液，用于酶活测定。
5.取2ml粗酶液，50℃水浴10min。
6.加入2ml pH为6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制成的0.5mg/ml阿魏酸甲酯溶液， 50℃水浴20min。
7.沸水浴10min终止反应。
8.10000rpm离心20min，得到酶解液。
高效液相测酶活：色谱条件：C18色谱柱，Synergi 4um Hydro-RP 80；250×4.6mm4 micro 393548-11；流动相：A甲醇—B 1％冰乙酸(28:72)；柱温40℃，检测波长320nm；进样量10μl，流速0.6ml/min。
10.酶活定义为：在50℃反应条件下，每分钟降解阿魏酸甲酯，生成1μmol阿魏酸所需的酶量为一个酶活单位(U)。
表1本发明乳酸菌阿魏酸酯酶酶活。
实施例3：产FAE的乳酸片球菌理化性质测定。
1.糖发酵、精氨酸产氨、硝酸盐还原和葡萄糖产气。
采用细菌微量生化反应管。
菌株活化2-3次，划线培养2-3d，用接种环挑取单菌落于生化管中，用灭菌的甘油封口，37℃培养2-3d观察其变色情况。
表2本发明乳酸菌对糖源的利用能力。
注：“+”表示利用该糖；“—”表示不利用该糖。
2.不同温度条件下菌株生长特性。
乳酸菌活化2-3次后，37℃过夜培养，定菌数为1×108cfu/ml，以3％的接种量接种到灭菌的MRS液体培养基中，摇匀，封口膜封口，各设2个重复。分别放在温度为4、10、15、25、35、45、50℃的恒温培养箱中培养，其中4、10、15℃培养7d，25、35℃培养2d，45、50℃培养4d。分光光度计600nm处测定其OD值。
表3本发明乳酸菌不同温度下生长特性。
注：++,+,w,－分别表示生长良好(OD﹥0.5),生长(0.1<OD<0.5)微量生长(0.05﹤OD﹤0.1),不生长(OD<0.05)。
3.不同pH条件下菌株生长特性。
乳酸菌活化2-3次后，37℃过夜培养，定菌数为1×108cfu/ml，以3％的接种量接种到灭菌的MRS液体培养基中，摇匀，封口膜封口，各设2个重复。MRS液体培养基用盐酸或氢氧化钠调pH值至所需酸碱度，即pH值分别为：3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、8.5、 9.0。于37℃恒温培养箱中培养7d，测其OD值，观察菌株的耐酸碱能力。
表4本发明乳酸菌不同pH下生长特性。
注：++,+,w,－分别表示生长良好(OD﹥0.5),生长(0.1<OD<0.5)微量生长(0.05﹤OD﹤0.1),不生长(OD<0.05)。
4.菌株的耐盐特性。
乳酸菌活化2-3次后，37℃过夜培养，定菌数为1×108cfu/ml，以3％的接种量接种到灭菌的MRS液体培养基中，摇匀，封口膜封口，各设2个重复。MRS液体培养基加入NaCl，使其盐浓度分别为：3％、4％、6.5％、8％、12％、18％。于37℃恒温培养箱中培养7d，测其OD值，观察菌株的耐盐能力。
表5本发明乳酸菌耐盐特性。
注：++,+,w,－分别表示生长良好(OD﹥0.5),生长(0.1<OD<0.5)微量生长(0.05﹤OD﹤0.1),不生长(OD<0.05)。
实施例4：乳酸片球菌阿魏酸酯酶粗酶液的酶学性质分析。
1.最适pH及pH稳定性。
(1)最适pH值的测定：将加入阿魏酸甲酯的0.5mL酶液分别与0.5mL的不同pH 缓冲液混合，在50℃下放置0.5h，测定残留酶活，以所测的最高酶活为100％，计算相对酶活。
(2)pH值稳定性的测定：将酶液置于pH 3.6－8的缓冲液中，在4℃放置0、0.5、1、2、3、4、6、8、20h，测定残留酶活(MFA为底物，50℃)，以各pH值的初始酶活为100％，计算相对酶活。
缓冲液是pH3.6、pH4.0、pH4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，pH5.0、pH5.6、pH6.0、pH6.4、pH7.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，pH 8.0的Tris-HCl缓冲液。
乳酸片球菌A2粗酶液在不同pH(3.6～8.0)条件下水解MFA，其酶活如图1所示，菌株FE2的最适pH为6.4，其在偏酸性条件下，阿魏酸酯酶酶活性较低，中性条件下酶活性则较高。其pH稳定性见图2，发现阿魏酸酯酶在pH为5.0～7.0时稳定性良好。当pH＜5.0 时，酶活损失达50％以上。当pH为8.0时，酶活力迅速下降，2h后相对活力只有33％。
2.最适温度及温度稳定性。
(1)最适反应温度的测定：将加入阿魏酸甲酯的酶液0.5mL与0.5mL的pH 6.4的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液混合，在25～65℃(25、30、37、40、45、50、55、65℃)保温 0.5h后，测定残留酶活。以所测的最高酶活为100％，计算相对酶活。
(2)温度稳定性的测定：在pH 6.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液中，分别将酶液置于25～65℃保温0、0.5、1、2、3、4、6、8、20h，测定残留酶活，以初始酶活为100％，计算相对酶活。
以MFA为底物测定乳酸片球菌FE2粗酶液在温度25～65℃条件下的酶活及温度稳定性。从图3可以看出其最适温度为37℃，在低温下呈上升趋势，但超过50℃时酶活急剧下降。从图4可以看出在25～50℃下酶具有很高的稳定性。
SEQUENCE LISTING
<110> 兰州大学
<120> 一株产阿魏酸酯酶的乳酸片球菌
<130> 2
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1321
<212> DNA
<213> 乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）
<400> 1
acgaagtgag tggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcccagaa gcaggggata 60
acacctggaa acagatgcta ataccgtata acagagaaaa ccgcctggtt ttcttttaaa 120
agatggctct gctatcactt ctggatggac ccgcggcgca ttagctagtt ggtgaggtaa 180
cggctcacca aggcgatgat gcgtagccga cctgagaggg taatcggcca cattgggact 240
gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgcaa 300
gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaag ctctgttgtt 360
aaagaagaac gtgggtgaga gtaactgttc acccagtgac ggtatttaac cagaaagcca 420
cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta tccggattta 480
ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggtcttt taagtctaat gtgaaagcct tcggctcaac 540
cgaagaagtg cattggaaac tgggagactt gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg 600
tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctgtctggt 660
ctgtaactga cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat accctggtag 720
tccatgccgt aaacgatgat tactaagtgt tggagggttt ccgcccttca gtgctgcagc 780
taacgcatta agtaatccgc ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc aaaagaattg 840
acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagctacgc gaagaacctt 900
accaggtctt gacatcttct gccaacctaa gagattaggc gttcccttcg gggacagaat 960
gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1020
cgagcgcaac ccttattact agttgccagc attcagttgg gcactctagt gagactgccg 1080
gtgacaaacc ggaggaaggt ggggacgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc 1140
tacacacgtg ctacaatgga tggtacaacg agtcgcgaaa ccgcgaggtt tagctaatct 1200
cttaaaacca ttctcagttc ggactgtagg ctgcaactcg cctacacgaa gtcggaatcg 1260
ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1320
c 1321

Claims (6)

1.一种产阿魏酸酯酶的乳酸片球菌，保藏编号为CGMCC12956。
2.一种如权利要求1所述的产阿魏酸酯酶的乳酸片球菌，其特征在于所述乳酸片球菌FE2的阿魏酸酯酶酶活性的最适pH为6.4，最适酶活性温度为37℃。
3.一种如权利要求1所述产阿魏酸酯酶的乳酸片球菌，其特征在于所述乳酸片球菌的筛选及其理化特性为，将菌株FE2的16S rRNA基因序列在Genbank进行注册，获得Genbank数据库菌株FE2的序列号：MF 093220。
4.一种如权利要求1所述的产阿魏酸酯酶的乳酸菌片球菌可用于降解纤维和制备阿魏酸。
5.一种如权利要求1所述的产阿魏酸酯酶的乳酸片球菌在制备保健食品和药品中的应用。
6.根据权利要求1所述的一种产阿魏酸酯酶的乳酸片球菌，其特征在于所述乳酸片球菌按下述工艺步骤制备获得：
（1）出发菌株：以本实验室从青贮饲料中分离获得并且保藏的各种乳酸菌为起始菌株，主要包括植物乳杆菌，短乳杆菌，副干酪乳杆菌，乳酸片球菌，戊糖片球菌等；
（2）筛选试验：将上述乳酸菌接种到以阿魏酸乙酯为唯一碳源的平板培养基，适宜条件下培养，产生透明菌圈的可初步判定为产阿魏酸酯酶；
（3）液体培养产酶：将（2）中初筛得到的菌株接种到含阿魏酸甲酯的培养基中进行发酵产酶；
（4）将（3）中培养后的酶液进行酶活测定，选出1株产酶活性高的菌株乳酸片球-FE2，（拉丁文命名为Pediococcus acidilactici）；
（5）对产酶活性高的1株菌株的生理生化特性和酶学性质进行分析测定；
（6） 将菌株FE2的16S rRNA基因序列在Genbank进行注册，获得Genbank数据库菌株FE2的序列号：MF 093220。
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