CN109402170A - 一种鱼类雄性不育模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鱼类雄性不育模型的建立方法，利用CRISPR/Cas9技术对减数***相关基因spo11进行敲除，杂合体可育，杂合体自交得到的纯合体群体中的雄性个体不育，从而建立鱼类雄性不育模型。通过本发明的方法，可以特异性获得雄性不育个体，可以通过建立敲除家系，源源不断提供雄性不育个体，操作简单，节省时间。
Description
技术领域
本发明涉及一种鱼类雄性不育模型的建立方法，属于分子生物学领域。
背景技术
鱼类从外界获取能量，一部分用于生长，一部分用于生殖，在生殖期间，生长缓慢甚至停止，且诸多鱼类的生殖期处于生长期之间。因鱼类全雄性生长较快，个体相对较大，因而成为大家争相养殖的对象，所以近几年，鱼类雄性不育系如何建立是较为热门的研究方向之一。spo11是Ⅱ型拓扑异构酶的同源蛋白，参与DNA双链断裂复合物（DSBs）的形成，在减数***同源重组的发生中发挥重要功能。在大多数有性生殖的生物的减数***中，重组扮演着至关重要的角色，它是遗传多样性的重要来源，能够产生单倍体的配子，同时姐妹染色单体交叉互换也增加了配子的多样性。发明人在多年的实验中，发现敲除一个减数***相关基因spo11，导致斑马鱼雄性特异性不育，雌性几乎不受影响，而目前还没有人报道基因spo11具有这种功能。
发明内容
针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种鱼类雄性不育模型的建立方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：鱼类雄性不育模型的建立方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术对减数***相关基因spo11进行敲除，杂合体可育，杂合体自交得到的纯合体群体中的雄性个体不育，从而建立鱼类雄性不育模型。
优选地，建立时，利用PCR技术区分纯合雄性和杂合雄性。
优选地，上述通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除斑马鱼spo11基因的步骤如下：
（1）通过ensembl在线数据库查找斑马鱼spo11基因组序列no:ENSDART00000005373.9,在该基因第一个外显子上设计敲除靶位点，靶位点序列为SEQ ID NO：1，即：TGGAAACGGTCGACAGATGCCAGG；
（2）按常规方法检测靶位点是否存在单核苷酸多态性；
（3）gRNA的获得：
以gRNA-plasmid为模板，以gRNA-F/gRNA-R为引物，gRNA-F的序列为SEQ ID NO：2：TAATACGACTCACTATAGGGTGGAAACGGTCGACAGATGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAAG；gRNA-R的核苷酸序列为SEQ ID NO：3：AGCACCGACTCGGTGCCACT,利用KOD Plus（TAKARA）高保真酶进行PCR扩增，扩增产物割胶回收，回收产物连接pMD18-T载体(TAKARA)后转化感受态大肠杆菌，挑取5个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，然后质粒DNA测序进行序列验证，序列正确克隆扩大培养后提取质粒DNA作为下一步转录gRNA的模板；再利用MEGAscript® T7Transcription Kit (InvitrogenTM)将构建好的含有spo11靶序列的质粒体外逆转录20ｕl反应体系如下：
10x Reaction Buffer 2ｕl；
Plasmid DNA 4ｕl (约1ｕg）；
T7 Enzyme 2ｕl；
10mmol/L NTP 1ｕl；
DEPC water 11ｕl；
以上体系37℃反应一个小时后纯化备用；
（4）体外转录获得Cas9 mRNA ：
Cas9质粒来自AddgeneTM(#63154),使用MAXIscript®T7/T3 Transcription Kit(InvitrogenTM),合成Cas9 mRNA，体系及反应条件同步骤3；
（5）Cas9 mRNA和gRNA显微共注射：首先配置显微注射体系如下：
Cas9 mRNA 300 ng/ｕl；
gRNA 30ng/ｕl；
Phenol-red 0.2ｕl；
DEPC Water up to 2ｕl；
将上述溶液配好混匀后，显微注射单细胞时期的斑马鱼受精卵中，养殖24小时后检测spo11基因的突变效率；
（6）spo11 F1代杂合突变个体的筛选及突变类型确定：
经过步骤（5）显微注射后斑马鱼受精卵，养殖3个月至性成熟后，与野生型个体杂交获得杂交F1代，F1代个体养殖2个月后，剪取部分尾鳍组织，提取基因组DNA，以F-spo11/R-spo11为引物，F-spo11：5’-ATGGCTTACCAGTTTACTG-3’; R-spo11: 5’-CGTAGCTCTTTCAGTAACTC-3’，利用KOD PLUS高保真酶(TAKARA)进行PCR扩增,PCR产物连接pMD18-T载体(TAKARA)后转化感受态大肠杆菌，分别挑取10个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，然后质粒DNA测序比对后筛选获得10条F1代个体突变效率和突变类型；
（7）spo11 F2代纯合突变个体的获得：
待spo11 F1代杂合突变个体性成熟后，选取突变类型一致的雌雄F1代个体各一条进行人工受精，获得spo11 F2代纯合突变个体；
（8）雄性不育雄性个体的选取：
spo11 F2代纯合突变群体中所有的雄性个体均为雄性不育个体，但是雌性个体中有卵子，且与野生雄鱼能够正常受精。
与现有技术相比，本发明的有益效果：通过本发明的方法，可以特异性获得雄性不育个体，可以通过建立敲除家系，源源不断提供雄性不育个体，操作简单，节省时间。
附图说明
图1为本发明涉及到的相关靶位点、突变类型及靶位点突变基因序列所对应的氨基酸变化，其中A为CRISPR/Cas9技术作用靶位点；B为靶位点序列突变检测（虚线所框为建立家系所选突变类型）；C为靶位点突变基因序列所对应的氨基酸变化（虚线所框为建立家系所选氨基酸突变型）
图2为spo11雌鱼生殖细胞（100倍）显微镜图：其中A为对照性成熟雌鱼性腺组织中的***，B为spo11性成熟雌鱼性腺组织中的***；
图3为spo11雄鱼生殖细胞（100倍）显微镜图：其中A为对照性成熟雄与性腺组织中***数量，B为spo11性成熟雄鱼性腺组织中无***。
具体实施方式
现结合具体实施例来说明本发明的技术方案和技术效果，但并不是限制本发明保护范围的依据。
实施例一
鱼类雄性不育模型的建立方法，是利用CRISPR/Cas9技术对减数***相关基因spo11进行敲除，spo11的序列号为no:ENSDART00000005373.9；杂合体可育，利用PCR技术区分杂合体自交得到的纯合体雄性和杂合体雄性，其中纯合体群体中的雄性个体不育，从而建立鱼类雄性不育模型，建立方法的具体步骤如下：
（1）通过ensembl在线数据库查找斑马鱼spo11基因组序列no:ENSDART00000005373.9,在该基因第一个外显子上设计敲除靶位点，靶位点序列为序列1：TGGAAACGGTCGACAGATGCC[AGG]，中括号内为PAM序列。
（2）按常规方法检测靶位点是否存在单核苷酸多态性（SNP）：
随机选取6条斑马鱼分别提取尾鳍组织的基因组DNA，以此为PCR模板，以F-spo11/R-spo11为引物，F-spo11：5’-ATGGCTTACCAGTTTACTG-3’; R-spo11: 5’-CGTAGCTCTTTCAGTAACTC-3’，利用KOD PLUS高保真酶(TAKARA)进行PCR扩增,PCR产物连接pMD18-T载体(TAKARA)后转化感受态大肠杆菌，分别挑取5个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，然后质粒DNA测序比对后发现所选靶位点中无SNP位点。
（3）gRNA的获得：
以gRNA-plasmid为模板，以gRNA-F/gRNA-R为引物，gRNA-F的核苷酸序列如序列2：TAATACGACTCACTATAGGGTGGAAACGGTCGACAGATGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAAG；gRNA-R的核苷酸序列如序列3：AGCACCGACTCGGTGCCACT,利用KOD Plus（TAKARA）高保真酶进行PCR扩增，扩增产物割胶回收，回收产物连接pMD18-T载体(TAKARA)后转化感受态大肠杆菌，挑取5个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，然后质粒DNA测序进行序列验证，序列正确克隆扩大培养后提取质粒DNA作为下一步转录gRNA的模板；再利用MEGAscript® T7 Transcription Kit(InvitrogenTM)将构建好的含有spo11靶序列的质粒体外逆转录20ｕl反应体系如下：
10x Reaction Buffer 2ｕl；
Plasmid DNA 4ｕl (约1ｕg）；
T7 Enzyme 2ｕl；
10mmol/L NTP 1ｕl；
DEPC water 11ｕl；
以上体系37℃反应一个小时后纯化备用。
（4）体外转录获得Cas9 mRNA ：
Cas9质粒来自AddgeneTM(#63154),使用MAXIscript®T7/T3 Transcription Kit(InvitrogenTM),合成Cas9 mRNA，体系及反应条件同步骤3。
（5）Cas9 mRNA和gRNA显微共注射：首先配置显微注射体系如下：
Cas9 mRNA 300 ng/ｕl；
gRNA 30ng/ｕl；
Phenol-red 0.2ｕl；
DEPC Water up to 2ｕl；
将上述溶液配好混匀后，显微注射单细胞时期的斑马鱼受精卵中，养殖24小时后检测spo11基因的突变效率。方法如下：随机选取8个胚胎提取基因组DNA，以F-spo11/R-spo11为引物，F-spo11：5’-ATGGCTTACCAGTTTACTG-3’; R-spo11: 5’-CGTAGCTCTTTCAGTAACTC-3’，利用KOD PLUS高保真酶(TAKARA)进行PCR扩增,PCR产物连接pMD18-T载体(TAKARA)后转化感受态大肠杆菌，分别挑取20个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，然后质粒DNA测序比对后获得突变效率。
（6）spo11 F1代杂合突变个体的筛选及突变类型确定：
经过步骤（5）显微注射后斑马鱼受精卵，养殖3个月至性成熟后，与野生型个体杂交获得杂交F1代，F1代个体养殖2个月后，剪取部分尾鳍组织，提取基因组DNA，以F-spo11/R-spo11为引物，F-spo11：5’-ATGGCTTACCAGTTTACTG-3’; R-spo11: 5’-CGTAGCTCTTTCAGTAACTC-3’，利用KOD PLUS高保真酶(TAKARA)进行PCR扩增,PCR产物连接pMD18-T载体(TAKARA)后转化感受态大肠杆菌，分别挑取10个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，然后质粒DNA测序比对后筛选获得10条F1代个体突变效率和突变类型。
（7）spo11 F2代纯合突变个体的获得：
待spo11 F1代杂合突变个体性成熟后，选取突变类型一致的雌雄F1代个体各一条进行人工受精，获得spo11 F2代纯合突变个体。选择附图1B中标出的突变类型，该突变类型在突变位点附近产生了终止密码，即突变个体中只能产生spo11突变位点之前序列对应的氨基酸。
（8）雄性不育雄性个体的选取：
spo11 F2代纯合突变群体中所有的雄性个体均为雄性不育个体，如附图2，spo11 F2代纯合突变雄性个体***中无***，但是雌性个体中有卵子，且与野生雄鱼能够正常受精。
序列表
<110> 湖南文理学院
<120> 一种鱼类雄性不育模型的建立方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggaaacggt cgacagatgc cagg 24
<210> 2
<211> 47
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaacgaccac aagggggaaa cggcgacaga gccgagagca gaaaaag 47
<210> 3
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcaccgacc gggccac 17
Claims (3)
1.一种鱼类雄性不育模型的建立方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术对减数***相关基因spo11进行敲除，杂合体可育，杂合体自交得到的纯合体群体中的雄性个体不育，从而建立鱼类雄性不育模型。
2.根据权利要求1所述的鱼类雄性不育模型的建立方法，其特征在于，建立时，利用PCR技术区分纯合雄性和杂合雄性。
3.根据权利要求2所述的鱼类雄性不育模型的建立方法，其特征在于，上述通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除斑马鱼spo11基因的步骤如下：
（1）通过ensembl在线数据库查找斑马鱼spo11基因组序列no:ENSDART00000005373.9,在该基因第一个外显子上设计敲除靶位点，靶位点序列为序列1，即：TGGAAACGGTCGACAGATGCCAGG；
（2）按常规方法检测靶位点是否存在单核苷酸多态性；
（3）gRNA的获得：
以gRNA-plasmid为模板，以gRNA-F/gRNA-R为引物，gRNA-F的序列如序列2：TAATACGACTCACTATAGGGTGGAAACGGTCGACAGATGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAAG；gRNA-R的核苷酸序列如序列3：AGCACCGACTCGGTGCCACT,利用KOD Plus（TAKARA）高保真酶进行PCR扩增，扩增产物割胶回收，回收产物连接pMD18-T载体(TAKARA)后转化感受态大肠杆菌，挑取5个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，然后质粒DNA测序进行序列验证，序列正确克隆扩大培养后提取质粒DNA作为下一步转录gRNA的模板；再利用MEGAscript® T7 Transcription Kit(InvitrogenTM)将构建好的含有spo11靶序列的质粒体外逆转录20ｕl反应体系如下：
10x Reaction Buffer 2ｕl；
Plasmid DNA 4ｕl (约1ｕg）；
T7 Enzyme 2ｕl；
10mmol/L NTP 1ｕl；
DEPC water 11ｕl；
以上体系37℃反应一个小时后纯化备用；
（4）体外转录获得Cas9 mRNA ：
Cas9质粒来自AddgeneTM(#63154),使用MAXIscript®T7/T3 Transcription Kit(InvitrogenTM),合成Cas9 mRNA，体系及反应条件同步骤3；
（5）Cas9 mRNA和gRNA显微共注射：首先配置显微注射体系如下：
Cas9 mRNA 300 ng/ｕl；
gRNA 30ng/ｕl；
Phenol-red 0.2ｕl；
DEPC Water up to 2ｕl；
将上述溶液配好混匀后，显微注射单细胞时期的斑马鱼受精卵中，养殖24小时后检测spo11基因的突变效率；
（6）spo11 F1代杂合突变个体的筛选及突变类型确定：
经过步骤（5）显微注射后斑马鱼受精卵，养殖3个月至性成熟后，与野生型个体杂交获得杂交F1代，F1代个体养殖2个月后，剪取部分尾鳍组织，提取基因组DNA，以F-spo11/R-spo11为引物，F-spo11：5’-ATGGCTTACCAGTTTACTG-3’; R-spo11: 5’-CGTAGCTCTTTCAGTAACTC-3’，利用KOD PLUS高保真酶(TAKARA)进行PCR扩增,PCR产物连接pMD18-T载体(TAKARA)后转化感受态大肠杆菌，分别挑取10个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，然后质粒DNA测序比对后筛选获得10条F1代个体突变效率和突变类型；
（7）spo11 F2代纯合突变个体的获得：
待spo11 F1代杂合突变个体性成熟后，选取突变类型一致的雌雄F1代个体各一条进行人工受精，获得spo11 F2代纯合突变个体；
（8）雄性不育雄性个体的选取：
spo11 F2代纯合突变群体中所有的雄性个体均为雄性不育个体，但是雌性个体中有卵子，且与野生雄鱼能够正常受精。
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