CN109400710A - 一种靶向kif20a阳性胰腺癌双特异性抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种靶向kif20a阳性胰腺癌双特异性抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向KIF20A阳性胰腺癌双特异性抗体及其制备方法和应用。所述抗体通过下述方法制备得到：(1)选购Anit‑CD3+，Anti‑KIF20A单克隆抗体；(2)取人源CD3单克隆抗体，溶于交联剂Traut's试剂中，得到人源CD3单链抗体；(3)取人源KIF20A单克隆抗体，溶于交联剂Sulfo‑SMCC中，得到人源KIF20A单链抗体；(4)将人源CD3单链抗体和人源KIF20A单链抗体混合，室温下经Sephrose‑G25凝胶层析柱分离纯化，取出多余的交联剂，得到单链抗体；(5)将纯化得到的单链抗体立即装入含有缓冲液的透析袋中混合，并于4℃下在缓冲液中透析作用18小时，得到双抗体复合物；(6)采用SDS‑PAGE凝胶电泳鉴定得到的双抗体复合物分子量，Sephrose‑G25凝胶柱纯化并超滤浓缩，得到双特异性抗体复合物。

Description

一种靶向KIF20A阳性胰腺癌双特异性抗体及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物医药、细胞生物学、肿瘤临床医学等技术领域，具体涉及一种靶向KIF20A阳性胰腺癌双特异性抗体及其制备方法和应用。
背景技术
胰腺癌，是一种高致死率的恶性肿瘤，五年生存期仅为5％左右，且预后效果极差。手术是目前可以延长生存期的有效方法，但胰腺癌患者可手术人群比例仅为9-22％。因此，迫切需要探索一种疗效更优的治疗方法。
肿瘤免疫治疗因其副作用小、特异性强等特点，被公认为是治疗胰腺癌的有效途径之一，特别是胰腺癌的特异性T淋巴细胞毒性(CTL)效应研究更是学术界关注的焦点，目前关于CTL治疗胰腺癌的众多基础及临床研究正在开展，显示特异性T淋巴细胞具有深远而广阔的应用前景。而针对诱导特异性CTL的肿瘤抗原的筛选及鉴定也成为学术界广泛关注的热点。KIF20A(有丝***驱动蛋白样2)作为一种肿瘤相关抗原，在胰腺癌细胞中高表达而在正常细胞中不表达(或低表达)，对胰腺癌的免疫治疗(CTL)具有很大开发潜力。
发明内容
本发明针对背景技术中的问题，提供一种靶向KIF20A阳性胰腺癌双特异性抗体及其制备方法和应用。
本发明为解决上述问题而采取的技术方案为：
一种靶向KIF20A阳性胰腺癌双特异性抗体，通过下述方法制备得到：
(1)选购Anit-CD3+，Anti-KIF20A单克隆抗体；
(2)取1mg人源CD3单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Traut's试剂中，得到人源CD3单链抗体；
(3)取1mg人源KIF20A单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Sulfo-SMCC中，得到人源KIF20A单链抗体；
(4)将步骤(2)的人源CD3单链抗体和步骤(3)的人源KIF20A单链抗体混合，室温下经Sephrose-G25凝胶层析柱分离纯化，取出多余的交联剂，得到单链抗体；
(5)将步骤(4)纯化得到的单链抗体立即装入含有缓冲液的透析袋中混合，并于4℃下在缓冲液中透析作用18小时，得到双抗体复合物；
(6)采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定步骤(5)得到的双抗体复合物分子量，Sephrose-G25凝胶柱纯化并超滤浓缩，得到双特异性抗体复合物。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的Sephrose-G25凝胶层析柱平衡缓冲体系为20mMTris，100mMNaCl，pH7.3。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的透析袋孔径大小为10kd。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的透析袋中缓冲液的组成为：20mMTris，100mMNaCl,pH7.3。
一种靶向KIF20A阳性胰腺癌双特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)选购Anit-CD3+，Anti-KIF20A单克隆抗体；
(2)取1mg人源CD3单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Traut's试剂中，得到人源CD3单链抗体；
(3)取1mg人源KIF20A单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Sulfo-SMCC中，得到人源KIF20A单链抗体；
(4)将步骤(2)的人源CD3单链抗体和步骤(3)的人源KIF20A单链抗体混合，室温下经Sephrose-G25凝胶层析柱分离纯化，取出多余的交联剂，得到单链抗体；
(5)将步骤(4)纯化得到的单链抗体立即装入含有缓冲液的透析袋中混合，并于4℃下在缓冲液中透析作用18小时，得到双抗体复合物；
(6)采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定步骤(5)得到的双抗体复合物分子量，Sephrose-G25凝胶柱纯化并超滤浓缩，得到双特异性抗体复合物。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的Sephrose-G25凝胶层析柱平衡缓冲体系为20mMTris，100mMNaCl，pH7.3。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的透析袋孔径大小为10kd。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的透析袋中缓冲液的组成为：20mMTris，100mMNaCl,pH7.3。
本发明靶向KIF20A阳性胰腺癌双特异性抗体用于治疗胰腺癌。
本发明用于治疗胰腺癌之前首选对非特异性DC-T细胞进行前处理，具体的处理方法包括以下步骤：
(1)抽取人体外周血，利用淋巴细胞分离液将单个核细胞PBMC进行分离1900-2300/min,离心10-20分钟；
(2)PBMC细胞加30-50ml淋巴细胞培养液，过夜培养，第二天悬浮的细胞倒入另一个无菌细胞培养瓶中Tc1，贴壁细胞用于培养DC细胞Dc1；
(3)上述Dc1细胞培养过程中加入0.5-1.2mM维生素C，与Dc1混合培养3-5天；
(4)上述Tc1细胞加入CD3+单克隆抗体，700-1500U/ml白介素二(IL-2)，培养3-5天；
(5)将(1-3)与(1-4)细胞混合培养，利用(1-3)培养的Dc1细胞增强Tc1细胞，联合培养5-9天；
(6)检测T细胞亚群及细胞因子分泌能力，流式鉴定T细胞亚型及细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4分泌水平。
为进一步表明本发明对胰腺癌的治疗作用，本发明进行了如下验证：双特异性抗体复合物诱导CTL(细胞毒性T淋巴细胞)并对高表达KIF20A胰腺癌细胞株体外杀伤，验证的具体步骤如下：
(1)收集上述培养的T细胞，用生理盐水洗涤2次，利用本发明制备的“双特异抗体复合物”对T细胞进行“装载”，诱导高效靶向KIF20A的CTL；
(2)荧光定量PCR鉴定胰腺癌细胞株：PANC1、SW1990，肺癌细胞株A549，肠癌细胞株DLD1，白血病细胞株K562中KIF20A抗原基因表达水平，作Westren blot鉴定，以胰腺癌细胞株作为靶细胞，LDH法检测不同效靶比下对肿瘤细胞杀伤活性，荧光显微镜观察T细胞靶向KIF20A胰腺癌细胞能力；
(3)结果显示，利用上述双特异性抗体装载的T细胞，对KIF20A高表达的胰腺癌细胞具有较强的杀伤活性，同时显微镜观察记录结果显示，利用“Anti-CD3+*Anti-KIF20A”双抗体复合物装载T细胞后，具有很强的趋向性，能够显示较强的T细胞浓度差异，具体表现如图(1-9)，说明T细胞可以自发寻找肿瘤细胞，同时根据不同浓度效靶比及时间梯度观察结果显示，利用一定浓度VC影响后DC细胞诱导的T细胞，具有较强的细胞因子分泌能力及肿瘤细胞杀伤能力，实验结果显示12小时后肿瘤细胞基本完全杀灭。
本发明采用上述技术方案，利用双抗体偶联技术，选择Anti-CD3+单抗及胰腺癌高表达抗原KIF20A的单克隆抗体Anti-KIF20A单抗，利用SMCC定向偶联技术，构建“Anti-CD3+×Anti-KIF20A双特异性抗体”，并用以诱导特异性T淋巴细胞毒性效应，对高表达KIF20A胰腺癌细胞株进行体杀伤检测，以验证该技术不仅能高靶向性杀灭肿瘤细胞，对肿瘤的发展、转移也能起到抑制性作用，利用抗原-抗体特异性吸附引发的ADCC效应诱导特异性CTL，具有极强的靶向性及抗原特异性，可在抗原-抗体分子水平做到“精准治疗”。同时该技术的建立，可针对不同肿瘤表达的特异性抗原偶联合成“双特异性抗体复合物”，为广大肿瘤患者治疗带来新的希望。
因此，与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明利用SMCC化学偶联法制备Anti-CD3+*Anti-KIF20A双特异性抗体复合物，抗体偶联产率高，技术可行性较强，不需要复杂的基因工程技术，该技术所选抗体均为已商业化单抗药物或试剂，保证了本双抗体复合物的安全性及有效性；
(2)本发明可诱导高效的T淋巴细胞毒性效应，同时通过抗原-抗体反应使T细胞具备强效的肿瘤靶向性，可对抗原特异表达肿瘤进行高效的杀灭，并且该技术实施过程中抗体使用量少，具备很好的市场推广前景；
(3)本发明通过双抗体偶联技术与过继免疫细胞治疗紧密结合，通过T细胞体外扩增技术大量培养CD3+T细胞，再进行双抗体靶向诱导，可将T细胞快速吸附在肿瘤细胞上，为肿瘤的“精准治疗”探索一条安全、可行、简便、高效的治疗方法及模式；
(4)本发明根据患者肿瘤细胞表达抗原不同选择不同的单克隆抗体，制备不同的双抗体复合物，同时该双抗体复合物可以单独使用，可为一种新药的研发提供前期基础研究。
附图说明
图1是本发明VC-DC可增强T细胞分泌细胞因子功能对照图；
图2是本发明VC的浓度梯度显示0.5mM为最佳浓度；
图3是本发明VC可增强T细胞的肿瘤杀伤能力；
图4是本发明贴壁培养的KIF20A+胰腺癌细胞；
图5是本发明未加双特异性抗体的T细胞与KIF20A+胰腺癌细胞混合。未见明显杀伤及T细胞的浓度趋向性；
图6是本发明添加双特异性抗体组结果显示，T细胞具有较强的趋向性；
图7是本发明添加双特异性抗体组结果显示，T细胞具有较强的趋向性，同时发挥高效肿瘤细胞杀伤功能；
图8是本发明在低倍显微镜下观察，视野中肿瘤细胞被双特异性抗体诱导的T细胞紧密包围；
图9是本发明时间梯度验证结果显示，双特异性抗体装载的T细胞杀伤肿瘤细胞能力显著高于未经装载的T细胞。
具体实施方式
实施例1
一种靶向KIF20A阳性胰腺癌双特异性抗体，通过下述方法制备得到：
(1)选购Anit-CD3+，Anti-KIF20A单克隆抗体；
(2)取1mg人源CD3单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Traut's试剂中，得到人源CD3单链抗体；
(3)取1mg人源KIF20A单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Sulfo-SMCC中，得到人源KIF20A单链抗体；
(4)将步骤(2)的人源CD3单链抗体和步骤(3)的人源KIF20A单链抗体混合，室温下经平衡缓冲体系为20mMTris，100mMNaCl，pH7.3的Sephrose-G25凝胶层析柱分离纯化，取出多余的交联剂，得到单链抗体；
(5)将步骤(4)纯化得到的单链抗体立即装入含有缓冲液的孔径大小为10kd的透析袋中混合，并于4℃下在缓冲液中透析作用18小时，得到双抗体复合物，透析袋中缓冲液的组成为：20mMTris，100mMNaCl,pH7.3；
(6)采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定步骤(5)得到的双抗体复合物分子量，Sephrose-G25凝胶柱纯化并超滤浓缩，得到双特异性抗体复合物。
实施例2
一种靶向KIF20A阳性胰腺癌双特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)选购Anit-CD3+，Anti-KIF20A单克隆抗体；
(2)取1mg人源CD3单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Traut's试剂中，得到人源CD3单链抗体；
(3)取1mg人源KIF20A单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Sulfo-SMCC中，得到人源KIF20A单链抗体；
(4)将步骤(2)的人源CD3单链抗体和步骤(3)的人源KIF20A单链抗体混合，室温下经平衡缓冲体系为20mMTris，100mMNaCl，pH7.3的Sephrose-G25凝胶层析柱分离纯化，取出多余的交联剂，得到单链抗体；
(5)将步骤(4)纯化得到的单链抗体立即装入含有缓冲液的孔径大小为10kd的透析袋中混合，并于4℃下在缓冲液中透析作用18小时，得到双抗体复合物，透析袋中缓冲液的组成为：20mMTris，100mMNaCl,pH7.3；
(6)采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定步骤(5)得到的双抗体复合物分子量，Sephrose-G25凝胶柱纯化并超滤浓缩，得到双特异性抗体复合物。
实施例3
一种靶向KIF20A阳性胰腺癌双特异性抗体用于治疗胰腺癌，在治疗胰腺癌之前首选对非特异性DC-T细胞进行前处理，具体的处理方法包括以下步骤：
(1)抽取人体外周血，利用淋巴细胞分离液将单个核细胞PBMC进行分离1900-2300/min,离心10-20分钟；
(2)PBMC细胞加30-50ml淋巴细胞培养液，过夜培养，第二天悬浮的细胞倒入另一个无菌细胞培养瓶中Tc1，贴壁细胞用于培养DC细胞Dc1；
(3)上述Dc1细胞培养过程中加入0.5-1.2mM维生素C，与Dc1混合培养3-5天；
(4)上述Tc1细胞加入CD3+单克隆抗体，700-1500U/ml白介素二(IL-2)，培养3-5天；
(5)将(1-3)与(1-4)细胞混合培养，利用(1-3)培养的Dc1细胞增强Tc1细胞，联合培养5-9天；
(6)检测T细胞亚群及细胞因子分泌能力，流式鉴定T细胞亚型及细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4分泌水平。
本发明对VC-DC可增强T细胞分泌细胞因子功能对照图，具体见图1，图1中对无DC组、PBS-DC组和VC-DC组对增强T细胞分泌细胞因子功能进行对比，通过对比发现VC可以显著提升DC-T细胞分泌细胞因子能力。
为进一步表明本发明对胰腺癌的治疗作用，本发明进行了如下验证：双特异性抗体复合物诱导CTL(细胞毒性T淋巴细胞)并对高表达KIF20A胰腺癌细胞株体外杀伤，验证的具体步骤如下：
(1)收集上述培养的T细胞，用生理盐水洗涤2次，利用本发明制备的“双特异抗体复合物”对T细胞进行“装载”，诱导高效靶向KIF20A的CTL；
(2)荧光定量PCR鉴定胰腺癌细胞株：PANC1、SW1990，肺癌细胞株A549，肠癌细胞株DLD1，白血病细胞株K562中KIF20A抗原基因表达水平，作Westren blot鉴定，以胰腺癌细胞株作为靶细胞，LDH法检测不同效靶比下对肿瘤细胞杀伤活性，荧光显微镜观察T细胞靶向KIF20A胰腺癌细胞能力；
(3)结果显示，利用上述双特异性抗体装载的T细胞，对KIF20A高表达的胰腺癌细胞具有较强的杀伤活性，同时显微镜观察记录结果显示，利用“Anti-CD3+*Anti-KIF20A”双抗体复合物装载T细胞后，具有很强的趋向性，能够显示较强的T细胞浓度差异，具体表现如图(1-9)，说明T细胞可以自发寻找肿瘤细胞，同时根据不同浓度效靶比及时间梯度观察结果显示，利用一定浓度VC影响后DC细胞诱导的T细胞，具有较强的细胞因子分泌能力及肿瘤细胞杀伤能力，实验结果显示12小时后肿瘤细胞基本完全杀灭。

Claims (10)

1.一种靶向KIF20A阳性胰腺癌双特异性抗体，其特征是通过下述方法制备得到：
(1)选购Anit-CD3+，Anti-KIF20A单克隆抗体；
(2)取1mg人源CD3单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Traut's试剂中，得到人源CD3单链抗体；
(3)取1mg人源KIF20A单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Sulfo-SMCC中，得到人源KIF20A单链抗体；
(4)将步骤(2)的人源CD3单链抗体和步骤(3)的人源KIF20A单链抗体混合，室温下经Sephrose-G25凝胶层析柱分离纯化，取出多余的交联剂，得到单链抗体；
(5)将步骤(4)纯化得到的单链抗体立即装入含有缓冲液的透析袋中混合，并于4℃下在缓冲液中透析作用18小时，得到双抗体复合物；
(6)采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定步骤(5)得到的双抗体复合物分子量，Sephrose-G25凝胶柱纯化并超滤浓缩，得到双特异性抗体复合物。
2.根据权利要求1所述的一种靶向KIF20A阳性胰腺癌双特异性抗体，其特征是所述的Sephrose-G25凝胶层析柱平衡缓冲体系为20mMTris，100mMNaCl，pH7.3。
3.根据权利要求1所述的一种靶向KIF20A阳性胰腺癌双特异性抗体，其特征是所述的透析袋孔径大小为10kd。
4.根据权利要求1所述的一种靶向KIF20A阳性胰腺癌双特异性抗体，其特征是所述的透析袋中缓冲液的组成为：20mMTris，100mMNaCl,pH7.3。
5.权利要求1-4中任意一项所述的一种靶向KIF20A阳性胰腺癌双特异性抗体的制备方法，其特征是包括以下步骤：
(1)选购Anit-CD3+，Anti-KIF20A单克隆抗体；
(2)取1mg人源CD3单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Traut's试剂中，得到人源CD3单链抗体；
(3)取1mg人源KIF20A单克隆抗体，溶于0.3-0.6mM交联剂Sulfo-SMCC中，得到人源KIF20A单链抗体；
(4)将步骤(2)的人源CD3单链抗体和步骤(3)的人源KIF20A单链抗体混合，室温下经Sephrose-G25凝胶层析柱分离纯化，取出多余的交联剂，得到单链抗体；
(5)将步骤(4)纯化得到的单链抗体立即装入含有缓冲液的透析袋中混合，并于4℃下在缓冲液中透析作用18小时，得到双抗体复合物；
(6)采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定步骤(5)得到的双抗体复合物分子量，Sephrose-G25凝胶柱纯化并超滤浓缩，得到双特异性抗体复合物。
6.根据权利要求5所述的一种靶向KIF20A阳性胰腺癌双特异性抗体的制备方法，其特征是所述的Sephrose-G25凝胶层析柱平衡缓冲体系为20mMTris，100mMNaCl，pH7.3。
7.根据权利要求5所述的一种靶向KIF20A阳性胰腺癌双特异性抗体的制备方法，其特征是所述的透析袋孔径大小为10kd。
8.根据权利要求5所述的一种靶向KIF20A阳性胰腺癌双特异性抗体的制备方法，其特征是所述的透析袋中缓冲液的组成为：20mMTris，100mMNaCl,pH7.3。
9.权利要求1-4中任意一项所述的一种靶向KIF20A阳性胰腺癌双特异性抗体的应用，其特征是用于治疗胰腺癌。
10.根据权利要求9所述的一种靶向KIF20A阳性胰腺癌双特异性抗体的应用，其特征是用于治疗胰腺癌之前首选对非特异性DC-T细胞进行前处理，具体的处理方法包括以下步骤：
(1)抽取人体外周血，利用淋巴细胞分离液将单个核细胞PBMC进行分离1900-2300/min,离心10-20分钟；
(2)PBMC细胞加30-50ml淋巴细胞培养液，过夜培养，第二天悬浮的细胞倒入另一个无菌细胞培养瓶中Tc1，贴壁细胞用于培养DC细胞Dc1；
(3)上述Dc1细胞培养过程中加入0.5-1.2mM维生素C，与Dc1混合培养3-5天；
(4)上述Tc1细胞加入CD3+单克隆抗体，700-1500U/ml白介素二(IL-2)，培养3-5天；
(5)将(1-3)与(1-4)细胞混合培养，利用(1-3)培养的Dc1细胞增强Tc1细胞，联合培养5-9天；
(6)检测T细胞亚群及细胞因子分泌能力，流式鉴定T细胞亚型及细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4分泌水平。
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