CN108034752A

CN108034752A - 与茄子果色上位性基因P紧密连锁的InDel分子标记及应用

Info

Publication number: CN108034752A
Application number: CN201810018063.8A
Authority: CN
Inventors: 孙保娟; 李植良; 黎振兴; 罗少波; 吴俊�
Original assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2018-01-09
Filing date: 2018-01-09
Publication date: 2018-05-15
Anticipated expiration: 2038-01-09
Also published as: CN108034752B

Abstract

本发明公开了与茄子果色上位性基因P紧密连锁的InDel分子标记及应用。InDel分子标记与上位性基因P遗传距离为0.5cM，在父本中核苷酸序列比母本多了50bp和35bp共2处特异***/缺失片段的InDel。本发明对茄子果色上位基因P开发紧密连锁的InDel标记，为茄子果色上位基因的精细定位和克隆奠定了基础；InDel 5513分子标记及分子标记扩增引物可以简便、快速、高通量地应用于茄子果色选育实践中，加速茄子果色性状改良进程。

Description

与茄子果色上位性基因P紧密连锁的InDel分子标记及应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及分子遗传学领域，具体涉及与茄子果色上位性基因P紧密连锁的InDel分子标记及应用。

背景技术

茄子的果色直接影响茄子的品相，是果实重要的商品外观品质。茄子的果色丰富，有紫黑、紫红、绿色和白色等。不同地区由于消费习惯不同，对茄子的果色有着不同的偏好。因此，茄子果色是重要的育种目标。

茄子果色遗传是多基因控制的复杂性状。庞文龙,刘富中,陈钰辉,等.茄子果色性状的遗传研究[J].园艺学报,2008,35(7):979-986.，以3个果色不同的茄子栽培种自交系为试验材料,用色差仪和目测相结合的方法将果色分级,通过P1、P2、F1、B1、B2和F2 6个世代联合分析法,研究茄子果色性状的遗传规律.结果表明:3个杂交组合的F2果色分离世代群体呈双峰或单峰偏态分布,显示茄子果色遗传为多基因控制的数量性状；茄子果色性状遗传符合两对加性-显性-上位性主基因+加性-显性-上位性多基因模型(E模型)；主基因遗传力为35.5％～98.4％,遗传力较高；多基因遗传力较低,为0～57.7％.

目前有关茄子果色上位性基因位点的染色体定位以及具体是什么基因尚不明确，也未开展相关分子标记的研究。因此，开展茄子果色上位性基因的分子标记研究，可以为茄子果色上位性基因分子标记辅助选择育种及基因精细定位克隆奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与茄子果色上位性基因P紧密连锁的InDel分子标记及应用。

本发明所采取的技术方案是：

发明人在育种实践中发现了受上位基因控制的茄子遗传材料，通过对该材料的深入研究，得到了本发明的技术方案。

InDel分子标记作为茄子果色筛选标记的应用，所述InDel分子标记为具有长度为50bp和35bp的2处特异***/缺失片段，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

可识别InDel分子标记的引物组在制备茄子果色筛选试剂中的应用，其中，InDel分子标记如上所述。

作为上述应用的进一步改进，引物组的序列为：

5513F1：5'-GTGTTACGAGGGTTGAAATGGAC-3'

5513R1：5'-ATTGGTAAAAGGAAGATTTGAGG-3'。

一种茄子果色筛选的方法，包括检测茄子8号染色体上InDel分子标记的***/缺失情况，根据InDel分子标记的***/缺失情况确定茄子果色，其中，InDel分子标记如上所述。

使用PCR法检测茄子8号染色体上InDel分子标记的***/缺失情况。

PCR法中使用的引物组的序列为：

5513F1：5'-GTGTTACGAGGGTTGAAATGGAC-3'

5513R1：5'-ATTGGTAAAAGGAAGATTTGAGG-3'。

如果扩增产物中仅有207bp片段，则该植株基因型为pp；如果扩增产物中仅有292bp片段，则该植株基因型为PP；同时有292bp和207bp两个片断的则基因型为Pp。

一种培育不同果色茄子的方法，包括在茄子8号染色体引入InDel分子标记***/缺失，其中，InDel分子标记如上所述。

本发明的有益效果是：

本发明将控制茄子果色的1个上位性基因P定位于茄子的8号染色体上的较小关联区域内，并提供了与茄子果色上位性基因P紧密连锁的分子标记InDel 5513，该标记距离目标基因P的遗传距离为0.5cM，可直接用于茄子果色上位性基因P分子标记辅助育种体系的建立。本发明的分子标记及分子标记扩增引物可以简便、快速、高通量地应用于茄子果色选育实践中，同时为克隆茄子果色上位性基因P及其功能研究奠定了良好的基础。

附图说明

图1为母本材料Female果色为白色，而且在整个生育期，下胚轴、叶脉，花，萼片都观察不到花青素的合成；父本Male果色为白色，苗期下胚轴微紫、叶脉泛紫，花色微紫，F₁代材料下胚轴、叶脉、花色和果色都呈现***。

图2为InDel 5513标记在F2分离群体绿茎白果色单株中的PCR扩增结果：F2代分离群体绿茎白果色单株单株(基因型有DDpp、Ddpp、ddpp)；M为100bp DNAladder；父本扩增长度为292bp(基因型PP)、母本扩增长度为207bp(基因型pp)；F1代单株扩增带型为292bp和207bp两条带(基因型Pp)；1-22为F2绿茎白果色单株。

图3为InDel 5513标记在F2分离群体紫红茎白果色单株中的PCR扩增结果：紫红茎白果色单株(基因型有ddPP、ddPp)；M为100bp DNAladder；1-22为F2紫红茎白果色单株。

图4为InDel 5513标记在F2分离群体紫红果色单株中的PCR扩增结果：M为100bpDNA ladder；1-22为F2代紫红果色单株(基因型有DDPP、DDPp、DdPP和DdPp)，带“*”为交换单株。

具体实施方式

在已有参考文献(Tigchelaar E C,Janick J,Erichson H T.The genetics ofanthocyanin coloration in eggplant(Solanum melongena L.).Genetics,1968,60:475-491)中把控制茄子果色上位性基因位点分别定义为D基因和P基因，本研究根据亲本材料表型特征及遗传规律沿用该基因命名。

下面结合实验对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括DNA提取、PCR扩增、PAGE凝胶电泳等实验，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J,Russell DW，Janssen K,Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。

一、遗传群体的构建及遗传分析

1、供试材料

植物材料：以广东省农业科学院蔬菜研究所经多代严格套袋自交选育的2份白果色的茄子纯化自交系为父本(Male，基因型为ddPP)和母本(Female，基因型为DDpp)，配制杂交组合F₁，F₁单株自交得到F₂。母本材料Female果色为白色，而且在整个生育期，下胚轴、叶脉，花，萼片都观察不到花青素的合成；父本Male果色为白色，苗期下胚轴微紫、叶脉泛紫，花色微紫，F₁代材料下胚轴、叶脉、花色和果色都呈现***(图1)。F₂分离世代紫红和白果色植株的分离比经卡方检验符合9:7。

2、遗传分析

在F₂代分离群体果色分为紫红果色(有花青素)和白果色(无花青素)。486个单株组成的F₂群体中，紫红果色单株和白果色单株分别为259株和227株，卡平方(X²)检验其是否符合9：7比率，结果X²＝1.73(P＝0.19)，小于X² _0.05＝3.84(df＝1)，所以紫红果色单株总数和白果色单株总数符合9：7比率。因此，明确了本研究中所用的茄子材料果色遗传是受2个相互作用的上位性基因(D和P)控制的。

二、茄子果色上位基因定位

1、亲本及F2紫红果色池和白果色池DNA制备

2个白茄父、母本各取10株苗期叶片，分别提取叶片DNA，每株取等量DNA混合，构成父本池和母本池；F₂分离群体，苗期单株取叶片，分别提取DNA，坐果期进行果色调查，然后取100株果色为紫红的单株DNA等量混合构成紫红果色池，取100株果色为白的单株DNA等量混合构成白果色池。

2、SLAF-seq结合BSA分析方法定位茄子果色上位性基因

本研究前期委托北京百迈客生物科技有限公司利用其自主研发的SLAF-seq技术进行简化基因组测序(Sun et al.,2013)，并结合集群分离分析方法(BSA)对茄子果色上位性基因进行定位。利用2014年9月公开的茄子基因组SME_r2.5.1(http://eggplant.kazusa.or.jp)序列信息，将1117个Scaffold上共231490个SNP对应到基因组上相应的Scaffold。然后过滤掉低深度的SNP位点，过滤掉亲本基因型相同以及杂合的SNP位点，最后过滤掉不符合分离比的SNP位点，共得到784个SNP位点。将过滤得到的784个SNP用ED法进行关联分析，计算关联值，根据99百分位数确定关联阈值0.822。根据卡方检验和关联计算结果，将控制茄子果色的1个上位性基因P定位于茄子基因组的8号染色体上。

3、分子标记InDel5513开发

基于父、母本基因组重测序结果，在关联区域附近寻找InDel标记，找到了1个InDel标记，其在父本中比母本中多了1个50个碱基的***。根据上述InDel标记设计了一组特异性引物对(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)，该引物对可在母本中扩增出长度为207bp的片段(基因型pp)，序列为：GTGTTACGAGGGTTGAAATGGACAAGCTGTCAAGGAGGGCTCGATCTTACCTTATCAATCGTAATTATACCAAACCTCTACCAATTAACTACCATGAAGAAAATAAGAGTTAGAGAGAGAATTTTATTATGATATTACAGATGAAGGCAAAATTATAAAATCAAGAACAAAGTTGAATTATCAACCTCAAATCTTCCTTTTACCAAT(SEQ ID NO.5)；可在父本中扩增出长度为292bp的片段(基因型PP)，序列为：

在F1同时有292bp和207bp两个片断扩增，基因型为Pp。进一步的分析表明，父母本间存在2处InDel，长度分别为50bp和35bp，序列分别为：CTTACCTTATCAATCGTAATTGTACCAAACCTCTACCAGTTAACTACCAT(SEQ ID NO.1)和ACCGTCAAAATTTATCACACACTGTTATGATATTT(SEQ IDNO.2)。

所述引物对的核苷酸序列如下所示：

5513F1：5'-GTGTTACGAGGGTTGAAATGGAC-3'(SEQ ID NO.3)，

5513R1：5'-ATTGGTAAAAGGAAGATTTGAGG-3'(SEQ ID NO.4)。

分子标记InDel 5513的应用

1、F2单株DNA制备

以广东省农业科学院蔬菜研究所经多代严格套袋自交选育的2份白果色的茄子纯化自交系为父本(Male，基因型为ddPP)和母本(Female，基因型为DDpp)，配制杂交组合F₁，F₁单株自交得到F₂，F₂分离群体，共400株。父本、母本、F₂单株苗期取叶片，分别提取DNA，坐果期进行果色调查。

2、分子标记InDel 5513在父本、母本、F2分离群体单株中PCR扩增检测

扩增体系为20μL：ddH₂O 5μL，PCR mix10μL(广州展晨生物科技有限公司)，5513F1引物(10μmol/L)1.5μL，5513R1引物(10μmol/L)1.5μL，DNA模板(500ng/μL)2μL。PCR反应程序为:94℃预变性2min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃再延伸5min。反应结束后，分别取20μL产物在1.2％琼脂糖上电泳，Goldview染色后用凝胶成像***观察拍照。

3、PAGE胶电泳及显色

PCR产物检测利用8％变性聚丙烯酰氨凝胶电泳检测，上样量为1μL，采用160V恒电压电泳2h。PAGE胶染色采用快速银染法，具体为：(1)从玻璃板上拆下胶置于蒸馏水中漂洗，并重复一次；(2)0.1％AgNO₃溶液中染色10min；(3)蒸馏水漂洗2次；(4)1x显色液200ml+800μL甲醛中显色10分钟；(5)自来水漂洗2次后读带。

4、检测结果

检测结果如图2和图3所示。特异性引物对对母本的扩增长度为207bp的片段(基因型pp)、父本的扩增长度为292bp的片段(基因型PP)；F1代单株的扩增带型为292bp和207bp(基因型Pp)；对F2代白果色单株的扩增带型分2种情况考虑：一种情况是绿茎白果色单株，其可能基因型有DDpp、Ddpp、ddpp，因此P基因分子标记InDel 5513扩增结果仅有1种情况，207bp(基因型pp)(图2)；另一种情况是紫红茎白果色单株，其可能基因型有ddPP、ddPp，因此P基因分子标记InDel 5513扩增结果为292bp(基因型PP)单条带、292bp和207bp(基因型Pp)杂合带(图3)。

对F2代紫红果色单株的扩增带型：F2代紫红果色单株可能基因型有DDPP、DDPp、DdPP和DdPp，因此P基因分子标记InDel 5513扩增结果有2种情况，既仅有292bp(基因型PP)、292bp和207bp杂合(基因型Pp)，如图4所示。

InDel标记检测结果符合F₂分离世代的果色分离与基因型的对应关系，说明本方法准确性高，可应用于茄子果色上位性基因P分子标记的辅助育种。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所

<120> 与茄子果色上位性基因P紧密连锁的InDel分子标记及应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> 茄子

<400> 1

cttaccttat caatcgtaat tgtaccaaac ctctaccagt taactaccat 50

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 茄子

<400> 2

accgtcaaaa tttatcacac actgttatga tattt 35

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 3

gtgttacgag ggttgaaatg gac 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 4

attggtaaaa ggaagatttg agg 23

<210> 5

<211> 207

<212> DNA

<213> 茄子

<400> 5

gtgttacgag ggttgaaatg gacaagctgt caaggagggc tcgatcttac cttatcaatc 60

gtaattatac caaacctcta ccaattaact accatgaaga aaataagagt tagagagaga 120

attttattat gatattacag atgaaggcaa aattataaaa tcaagaacaa agttgaatta 180

tcaacctcaa atcttccttt taccaat 207

<210> 6

<211> 292

<212> DNA

<213> 茄子

<400> 6

gtgttacgag ggttgaaatg gacaagctgt cgaggagggc tcgatcttac cttatcaatc 60

gtaattgtac caaacctcta ccaattaact accatcttac cttatcaatc gtaattgtac 120

caaacctcta ccagttaact accatgaaga aaataagagt tagagagaga atttttttct 180

accgtcaaaa tttatcacac actgttatga tatttgatat tacagatgaa ggcaaaatta 240

taaaatcaag aacaaagttg aattatcaac ctcaaatctt ccttttacca at 292

Claims

1.InDel分子标记作为茄子果色筛选标记的应用，所述InDel分子标记为具有长度为50bp和35bp的2处特异***/缺失片段，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

2.可识别InDel分子标记的引物组在制备茄子果色筛选试剂中的应用，其中，InDel分子标记如权利要求1所述。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：引物组的序列为：

5513 F1：5'-GTGTTACGAGGGTTGAAATGGAC-3'

5513 R1：5'-ATTGGTAAAAGGAAGATTTGAGG-3'。

4.一种茄子果色筛选的方法，包括检测茄子8号染色体上InDel分子标记的***/缺失情况，根据InDel分子标记的***/缺失情况确定茄子果色，其中，InDel分子标记如权利要求1所述。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：使用PCR法检测茄子8号染色体上InDel分子标记的***/缺失情况。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：PCR法中使用的引物组的序列为：

5513 F1：5'-GTGTTACGAGGGTTGAAATGGAC-3'

5513 R1：5'-ATTGGTAAAAGGAAGATTTGAGG-3'。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：如果扩增产物中仅有207bp片段，则该植株基因型为pp；如果扩增产物中仅有292bp片段，则该植株基因型为PP；同时有292bp和207bp两个片断的则基因型为Pp。

8.一种培育不同果色茄子的方法，包括在茄子8号染色体引入InDel分子标记***/缺失，其中，InDel分子标记如权利要求1所述。