CN109324038B - 一种用于促***测定试剂盒的磁微粒缓冲液 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于促***测定试剂盒的磁微粒缓冲液，该磁微粒缓冲液是由基础缓冲液、消泡剂和柠檬酸盐组成；其中，在1L基础缓冲液中，消泡剂的加入量按终浓度为0.003％～0.06％v/v加入，所述柠檬酸盐的加入量按终浓度为0.06～0.35mol/L加入。使用该缓冲液的磁微粒不仅在自然重力条件下分散性好，混匀过程中不易起泡，而且在该缓冲液下的免疫磁微粒其检测特异性高。

Description

一种用于促***测定试剂盒的磁微粒缓冲液
技术领域
本发明涉及化学发光免疫分析领域，具体涉及一种用于促***测定试剂盒的磁微粒缓冲液。
背景技术
促***(Human Luteinizing Hormone，LH)是由垂体前叶合成并分泌的糖蛋白激素，由α和β两个亚单位组成。LH合成受下丘脑的性激素释放激素(GnRH)调节，并受类固醇性激素的反馈。LH刺激女性***和卵巢分泌***及孕激素；控制男性睾丸Leydig细胞分泌***。在女性体内，LH含量在***较低；月经中期出现高峰，引起***，***后降至最低。LH在绝经后女性中最高，甚至高于月经中期的LH含量高峰；在去除性腺的男性中LH水平也很高。LH对于分析性腺异常、***发育迟缓、垂体原因的性激素低下、某些垂体肿瘤、以及下丘脑-垂体-性腺功能轴的异常有重要意义。联合检测LH和FSH，对于分析男、女不育症的原因有显著意义。
LH的实验室检测方法有放射免疫(RIA)、酶联免疫(ELISA)、化学发光免疫(CLIA)、荧光或时间分辨荧光免疫(FIA/TRFIA)等，也有现场快速检测方法(POCT)用于指导治疗***症。RIA和ELISA出现较早，但由于污染性、灵敏度低、时间长等缺点，已不再据主体地位。化学发光技术由于灵敏度高、动力学范围宽、适于自动化操作等优点，被多数厂家采用，成为当前LH检测中最主要的技术方法。化学发光免疫技术的经过了几代发展，以磁微粒化学发光法成为主流产品。磁微粒化学发光免疫分析法是指以磁微粒为固相载体，将抗体(或抗原)通过化学键链接到磁微粒上，与待检测物质以及标记了发光物质的抗体(或抗原)发生反应，通过洗涤除去未反应的物质，再利用仪器检测保留下来的结合物的信号，从而实现对待检物质的检测。国内外厂家在此基础上开发出一系列的全自动产品，如Roche公司Cobas系列，Abbott公司Architect系列，Maccura公司IS 1200等。
综上，LH的检测技术主要是用针对不同抗原表面位点的两个或多个单克隆抗体，按夹心法模式进行免疫检测。LH检测的最主要的困难是存在HCG、FSH、TSH等垂体激素的交叉反应干扰。市场上的LH检测试剂质量不一，现有产品存在对HCG较高交叉的问题，因此亟需研发新的LH检测试剂盒以避免交叉反应的干扰。
发明内容
为解决上述现有技术问题，本发明提供了一种用于促***测定试剂盒的磁微粒缓冲液，使用该缓冲液的磁微粒不仅在自然重力条件下分散性好，混匀过程中不易起泡，而且在该缓冲液下的包被有促***抗体的免疫磁微粒其检测特异性高。
一种用于促***测定试剂盒的磁微粒缓冲液，该磁微粒缓冲液是由基础缓冲液、消泡剂和柠檬酸盐组成；其中，在1L基础缓冲液中，消泡剂的加入量按终浓度为0.003％～0.06％v/v加入，所述柠檬酸盐的加入量按终浓度为0.06～0.35mol/L加入。
在一个实施方案中，所述消泡剂为有机硅消泡剂或聚醚类消泡剂。
在一个优选实施方案中，所述消泡剂的加入量为0.005％～0.03％v/v。
在另一个实施方案中，所述柠檬酸盐为柠檬酸三钠、柠檬酸二钠、柠檬酸三钾、柠檬酸二钾或柠檬酸铁铵。
在另一个优选实施方案中，所述柠檬酸盐的加入量为0.2～0.33mol/L。
在另一个实施方案中，所述基础缓冲液是由缓冲盐、蛋白类物质、糖类物质、表面活性剂、防腐剂和水按比例组成。
在另一个优选实施方案中，在基础缓冲液中，所述缓冲盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾中的一种或多种；所述蛋白类物质选自BSA、酪蛋白、牛血清、羊血清中的一种或多种；所述糖类物质选自甘露醇、葡萄糖、果糖、海藻糖、蔗糖、乳糖或半乳糖；所述表面活性剂为非离子表面活性剂；所述防腐剂为KroVin系列防腐剂、ProClin系列防腐剂或叠氮钠。
所述缓冲盐的加入量为0.2～10g/L；蛋白类物质为BSA或酪蛋白时，加入量为0.1～20g/L；蛋白类物质为牛血清或羊血清时，加入量为0.1％～5％v/v；糖类物质的加入量为0.1～40g/L；所述非离子表面活性剂为Tween-20、Tween-80、Span-60、Triton X-45、TritonX-100或Triton X-305，其加入量为0.01％～0.1％v/v；所述KroVin系列防腐剂优选KroVin100、KroVin 400、KroVin 500或KroVin 750；所述ProClin系列防腐剂优选ProClin50、ProClin150、ProClin200、ProClin300、ProClin950或ProClin5000；当防腐剂为KroVin系列防腐剂或ProClin系列防腐剂时，其加入量为0.05％～0.6％v/v；当防腐剂为叠氮钠时，其加入量为0.5～10g/L。
在另一个实施方案中，该磁微粒缓冲液是由基础缓冲液中加入浓度0.003％～0.06％v/v的有机硅消泡剂和终浓度为0.06～0.35mol/L的柠檬酸盐制备而成；其中，所述基础缓冲液是由0.2～10g/L的缓冲盐、0.1～40g/L的甘露醇、0.1～20g/L的BSA、0.01％～0.1％v/v的非离子表面活性剂、0.05％～0.6％v/v的防腐剂组成，余量为水。
上述的磁微粒缓冲液应用于促***测定试剂盒。
本发明中，基础缓冲液中的缓冲盐、蛋白类物质、糖类物质、表面活性剂和防腐剂是为了保证整个体系中磁微粒与抗体的稳定。然而仅仅使用基础缓冲液作为本发明包被有促***抗体的磁微粒的缓冲液，该免疫磁微粒仍存在易于沉降、搅拌易产生气泡的技术缺陷。因此为了克服上述技术问题，本申请经过大量的实验筛选意外发现，仅添加消泡剂和柠檬酸盐，不仅仅解决了磁微粒互相聚集、沉降、易于起泡的问题，而且适量的基础缓冲液、消泡剂和柠檬酸盐联合使用下，还可以增加包被有促***抗体免疫磁微粒的特异性。
本发明缓冲液中的柠檬酸盐使磁微粒表面形成双电层，起到分散剂的作用，防止磁微粒沉淀，但是如果柠檬酸盐加入量过多，会造成全自动免疫分析仪检测时，磁分离不完全，磁微粒丢失较多，影响检测结果；加入量过少又不能保证磁微粒较好地分散。在加入合适量的柠檬酸盐的前提下，加入适量的有机硅消泡剂，意外地发现该磁微粒缓冲液不仅仅使磁微粒具有较好的分散性和不起泡的优势，而且还有效地增加了磁微粒的特异性，避免了磁微粒与HCG、FSH、TSH等垂体激素的交叉反应。缓冲液中，有机硅消泡剂加入量过多，会漂浮在溶液表面，导致检测结果异常；加入量过少，又起不到消泡作用。
与现有技术相比，使用本发明缓冲液保存的包被有促***抗体磁微粒在自然重力条件下分散性好，不易沉降，便于仪器取样，保证每一个测试中使用的磁微粒用量相同；在磁微粒混匀过程中不易起泡，或起泡后泡沫很快破裂，避免仪器空探导致的结果异常；此外，本发明包被有促***抗体磁微粒特异性高，不与HCG、FSH、TSH等垂体激素发生交叉反应。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
定义
本发明的促***测定试剂盒可用于免疫测定，优选地，在一个实施方式中，本发明的促***测定试剂盒包括试剂R1、试剂R2和试剂R3。所述试剂R1为包被有促***抗体的免疫磁微粒，试剂R2为标记有吖啶酯的α亚单位单克隆抗体，试剂R3为分析缓冲液，是由缓冲体系、糖类物质、蛋白类物质、非离子表面活性剂、防腐剂和多元醇按比例混合制备而成。
本发明中，免疫磁微粒的制备方法为常规制备方法，具体如下：将促***与生物素酯连接成生物素抗体，然后将生物素抗体包被于链霉亲和素磁微粒上，形成免疫磁微粒；接着将免疫磁微粒与磁微粒缓冲液按照体积比为1:12.5～1:50混合配制得到试剂R1。本发明的试剂R1浓度需在合适的范围内，不能过高或过低。试剂R1浓度过高，磁微粒太多，在全自动免疫分析仪上混合较为困难，易出现混合不均匀现象，导致测试结果不准确，并且该成分相对较高；浓度过低，磁微粒太少，在全自动免疫分析仪上清洗时磁微粒丢失太多，且随机，造成CV值较大，影响检测结果的准确性。
本发明试剂盒是原理为双抗体夹心法。通过免疫分析两步法实现对样本的检测：首先，将样本、试剂R3和试剂R1混合，形成抗原-抗体复合物；第二步，洗涤后加入吖啶酯标记的α-亚单位单克隆抗体，形成抗体-抗原-抗体免疫复合物；再次洗涤，加入底物液发生化学发光反应，测量相对发光值(RLU)，相对发光值与样本中LH的含量呈正比例关系。通过标准曲线可根据相对发光值计算得到样本中LH的含量。
本发明是的磁微粒缓冲液是由基础缓冲液、消泡剂和柠檬酸盐组成；其中，在1L基础缓冲液中，消泡剂的加入量按终浓度为0.003％～0.06％v/v加入，所述柠檬酸盐的加入量按终浓度为0.06～0.35mol/L加入。
下述实施例中，使用的基础缓冲液按照表1配制而成。
表1为配制1L基础缓冲液的配方
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O 2.56g/L
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.436g/L
氯化钠 6.00g/L
甘露醇 22.00g/L
BSA 8.00g/L
Triton X-100 0.20mL/L
ProClin-300 1.00mL/L
纯化水 定容至1L
实施例1:
一种用于促***测定试剂盒的磁微粒缓冲液，该缓冲液按照表2配制而成。用配置好的磁微粒缓冲液洗涤和分散磁微粒。
表2为实施例1的磁微粒缓冲液配方
Antifoam SE-15 0.1mL/L
柠檬酸三钠 0.24mol/L
基础缓冲液 定容至1L
实施例2
一种用于促***测定试剂盒的磁微粒缓冲液，该缓冲液按照表3配制而成。用配置好的磁微粒缓冲液洗涤和分散磁微粒。
表3为实施例2的磁微粒缓冲液配方
Antifoam SE-15 0.04mL/L
柠檬酸三钠 0.35mol/L
基础缓冲液 定容至1L
实施例3
一种用于促***测定试剂盒的磁微粒缓冲液，该缓冲液按照表4配制而成。用配置好的磁微粒缓冲液洗涤和分散磁微粒。
表4为实施例3的磁微粒缓冲液配方
Antifoam SE-15 0.57mL/L
柠檬酸二钠 0.06mol/L
基础缓冲液 定容至1L
对比实施例1
一种用于促***测定试剂盒的磁微粒缓冲液，该缓冲液按照表5配制而成。
表5为对比实施例1的磁微粒缓冲液配方
柠檬酸三钠 0.3mol/L
基础缓冲液 定容至1L
对比实施例2
一种用于促***测定试剂盒的磁微粒缓冲液，该缓冲液按照表6配制而成。
表6为对比实施例2的磁微粒缓冲液配方
Antifoam SE-15 0.2mL/L
基础缓冲液 定容至1L
对比实施例3
一种用于促***测定试剂盒的磁微粒缓冲液，该缓冲液按照表7配制而成。
表7为对比实施例3的磁微粒缓冲液配方
Figure GDA0001894058900000061
Figure GDA0001894058900000071
对比实施例4
一种用于促***测定试剂盒的磁微粒缓冲液，该缓冲液按照表8配制而成。
表8为对比实施例4的磁微粒缓冲液配方
Antifoam SE-15 6μL/L
柠檬酸三钠 0.3mol/L
基础缓冲液 定容至1L
对比实施例5
一种用于促***测定试剂盒的磁微粒缓冲液，该缓冲液按照表9配制而成。
表9为对比实施例5的磁微粒缓冲液配方
Antifoam SE-15 0.2mL/L
柠檬酸三钠 0.6mol/L
基础缓冲液 定容至1L
对比实施例6
一种用于促***测定试剂盒的磁微粒缓冲液，该缓冲液按照表10配制而成。
表10为对比实施例6的磁微粒缓冲液配方
Antifoam SE-15 0.2mL/L
柠檬酸三钠 0.05mol/L
基础缓冲液 定容至1L
下面的实施例中，使用的试剂盒除免疫磁微粒缓冲液不同外，其余试剂完全相同。
实施例4
将实施例1～3、对比实施例1～6缓冲液配置的磁微粒和用基础缓冲液配置的磁微粒对照，进行如下实验：
实验数据均是测量三次后数值的平均值。
4.1自然重力下的沉降试验
取包被有促***抗体的磁微粒7mL，分别使用基础缓冲液、实施例1～3、对比实施例1～6的缓冲液洗涤3次，每次待上清完全澄清后再移除上清，再以相应缓冲液重悬，混匀，平分为7份，每份1mL。隔一段时间取100μL上清液用多功能读数仪(Thermo)测定其在550nm处的吸光度值，具体结果如表11所示。
表11为包被有促***抗体的磁微粒在不同缓冲液的自然沉降速率测定
Figure GDA0001894058900000081
从表11可以看出，包被有促***抗体的磁微粒在基础缓冲液中的自然沉降速率较其在实施例1～3磁微粒缓冲液中快，且在30min时，可以清晰的观察到磁微粒在基础缓冲液中自然沉降30min时，接近液面的上清液已经澄清透明，而在实施例1磁微粒缓冲液中上清仍是混悬液，没有明显的分层界线。综上，可以认为本申请的磁微粒缓冲液相对于基础缓冲液在自然重力下分散性好，不易沉降。
从表中还可以看出，与其他磁微粒缓冲液相比，对比实施例6磁微粒缓冲液沉降明显更快，且在30min时，可以清晰的观察到对比实施例6磁微粒在基础缓冲液中自然沉降30min时，接近液面的上层液已经澄清透明，而其他磁微粒缓冲液上层液仍是混悬液。由此可见，消泡剂的加入量多少基本不影响磁微粒的自然沉降，只有当柠檬酸盐加入过少时，该缓冲液配制的磁微粒易沉降。
4.2磁场作用下的磁分离试验
该试验方法基本同自然重力下的沉降试验，只是将平分后的包被有促***抗体的磁微粒置于2800高斯的磁场下，磁分离0s、10s、20s、30s和45s时取100μL磁分离后的上清液，测定其在550nm处的吸光度值，具体结果如表12所示。
表12为包被有促***抗体的磁微粒在不同缓冲液中磁分离速度测定
Figure GDA0001894058900000091
Figure GDA0001894058900000101
从表12可以看出，在磁场环境下时，包被有促***抗体的磁微粒在基础缓冲液和实施例1～3的磁微粒缓冲液中的磁分离速率差异不明显，30s时的磁分离率都在92％以上。消泡剂加入量的多少并不影响磁微粒的磁分离速率，只有在分散剂加入过量时，如对比实施例5的实验数据可以看出，其磁分离率在90％以下，在清洗过程中容易导致磁微粒丢失。因此综上，分散剂柠檬酸盐加入过多时，不利于磁分离。
4.3免疫试验验证
将包被有促***抗体的磁微粒分别分散于基础缓冲液和磁微粒缓冲液中，得到试剂R1，然后结合试剂盒中的其他组分，采用全自动免疫分析化学发光仪测定主校准品和50例临床样本，观察磁微粒缓冲液在免疫试验应用中是否有影响，结果如表13和表14所示。
表13为主校准品的免疫试验验证
Figure GDA0001894058900000102
表14为临床样本的免疫试验验证
Figure GDA0001894058900000103
Figure GDA0001894058900000111
Figure GDA0001894058900000121
表15临床样本在不同磁微粒缓冲液下的免疫试验验证
Figure GDA0001894058900000122
Figure GDA0001894058900000131
Figure GDA0001894058900000141
免疫试验结果表明，与基础缓冲液相比，用实施例1～3配制的磁微粒缓冲液不影响免疫反应性。而由于消泡剂或柠檬酸盐加入量过高或过低时，均可能会导致测定结果异常。从表15可以看出，当消泡剂或柠檬酸盐加入量过高或过低时，会出现个别检测结果异常，导致检测结果不准确。
4.4消泡效果验证实验
对于大包装的化学发光磁微粒试剂，每次测定前均需对磁微粒组份进行混匀，当剩余体积较少时，磁微粒混匀后易产生气泡，导致随后测定过程中出现试剂针空探现象。为解决此类问题，我们以促***免疫磁微粒为例，使用实施例1～3配制的磁微粒缓冲液，以基础缓冲液和对比实施例3～6为对照，在迈克生物股份有限公司I3000全自动化学发光仪上执行磁微粒混匀程序，5秒内裸眼观察起泡比例，结果下表所示。
表16为缓冲液的起泡比例
Figure GDA0001894058900000142
Figure GDA0001894058900000151
表17为不同缓冲液的起泡比例对比
Figure GDA0001894058900000152
从表16和17中可以看出，与基础缓冲液相比，实施例1～3的磁微粒缓冲液在磁微粒混匀过程中产生起泡的比例明显低于基础缓冲液。当消泡剂加入适量时，柠檬酸盐的多少对磁微粒缓冲液起泡无影响。只有消泡剂加入量少时，其磁微粒缓冲液在磁微粒混匀过程中容易起泡。
4.5对特异性的影响
将包被有促***抗体的免疫磁微粒分别分散于基础缓冲液和磁微粒缓冲液中形成试剂R1，结合试剂盒其他组分，采用全自动免疫分析化学发光仪测定浓度为204IU/L的促卵泡生成素(FSH)，浓度为200mIU/L的促甲状腺素(TSH)和1032IU/L的人绒毛***(HCG)的三种样本，具体的测定方法与免疫分析两步法相同，仅更换了样本。以基础缓冲液为对照，观察实施例1～3、对比实施例1～6的磁微粒缓冲液对特异性的影响，结果如表18和19所示。
表18为不同缓冲液下包被有促***抗体的磁微粒其免疫特异性
Figure GDA0001894058900000161
表19为不同缓冲液下包被有促***抗体的磁微粒其免疫特异性
Figure GDA0001894058900000162
从表18和19中可以看出，与基础缓冲液相比，用实施例1～3和对比实施例1～2配制的磁微粒缓冲液均能不同程度的提高特异性，也就是说当加入适量消泡剂和/或柠檬酸盐时，其缓冲液中的磁微粒的交叉反应均明显有所抑制，但当柠檬酸三钠与消泡剂同时存在时(即实施例1～3)，磁微粒基本不产生交叉反应。而且，当消泡剂加入量过多或过少时，该缓冲液中的磁微粒检测重复性差，CV值高；当柠檬酸盐加入量过多或过少时，其交叉反应测试结果不稳定，准确性低，且结果易出现异常。
实施例5
使用本发明实施例1～3和基础缓冲液的磁微粒缓冲液替换总三碘甲状腺原氨酸测试试剂盒中试剂R1的磁微粒缓冲液。测试样本中T4浓度不低于643.6nmol/L、rT3浓度不低于50ng/mL。
总三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒检测特异性要求：与总甲状腺素(T4)：浓度不低于643.6nmol/L的T4，测定结果应不高于3.00nmol/L；与反三碘甲状腺原氨酸(rT3)：浓度不低于50ng/mL的rT3，测定结果应不高于3.00nmol/L。结果如下表：
表20为不同缓冲液配制的免疫磁微粒免疫测定结果
Figure GDA0001894058900000171
本发明的磁微粒缓冲液相对于基础缓冲液来说，应用到其他测试项目的试剂盒中，并不能提高磁微粒检测特异性，显著降低其交叉反应。
综上，本发明的磁微粒缓冲液仅能增加包被有促***抗体免疫磁微粒的特异性。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

Claims (8)

1.一种用于促***测定试剂盒的磁微粒缓冲液，其特征在于：该磁微粒缓冲液是由基础缓冲液、消泡剂和柠檬酸盐组成；其中，在1L基础缓冲液中，消泡剂的加入量按终浓度为0.003％～0.06％v/v加入，所述柠檬酸盐的加入量按终浓度为0.06～0.35mol/L加入；
所述消泡剂为有机硅消泡剂。
2.根据权利要求1所述的用于促***测定试剂盒的磁微粒缓冲液，其特征在于：所述消泡剂的加入量为0.005％～0.03％v/v。
3.根据权利要求1所述的用于促***测定试剂盒的磁微粒缓冲液，其特征在于：所述柠檬酸盐为柠檬酸三钠、柠檬酸三钾、柠檬酸二钠、柠檬酸二钾或柠檬酸铁铵。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的用于促***测定试剂盒的磁微粒缓冲液，其特征在于：所述柠檬酸盐的加入量为0.2～0.33mol/L。
5.根据权利要求1所述的用于促***测定试剂盒的磁微粒缓冲液，其特征在于：所述基础缓冲液是由缓冲盐、蛋白类物质、糖类物质、表面活性剂、防腐剂和水按比例组成。
6.根据权利要求5所述的用于促***测定试剂盒的磁微粒缓冲液，其特征在于：在基础缓冲液中，所述缓冲盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠中的一种或多种；所述蛋白类物质选自BSA、酪蛋白、牛血清、羊血清中的一种或多种；所述糖类物质选自甘露醇、葡萄糖、果糖、海藻糖、蔗糖、乳糖或半乳糖；所述表面活性剂为非离子表面活性剂；所述防腐剂为KroVin系列防腐剂、ProClin系列防腐剂、Kathon或叠氮钠。
7.一种用于促***测定试剂盒的磁微粒缓冲液，其特征在于：该磁微粒缓冲液是由基础缓冲液中加入终浓度为0.003％～0.06％v/v的有机硅消泡剂和终浓度为0.06～0.35mol/L的柠檬酸盐制备而成；其中，所述基础缓冲液是由0.2～10g/L的缓冲盐、0.1～40g/L的甘露醇、0.1～20g/L的BSA、0.01％～0.1％v/v的非离子表面活性剂、0.05％～0.6％v/v的防腐剂组成，余量为水。
8.权利要求1～7任意一项所述的磁微粒缓冲液应用于促***测定试剂盒。
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