CN109321657A - 一种胶质瘤预后标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种胶质瘤预后标志物，属于生物技术领域。所述标志物为lnc RNA TCONS_00020456，序列如SEQ ID NO.1所示。用于检测上述标志物表达水平的特异性引物的序列为：F:5'‑CTCAGGTGGTGCCATTCTC‑3'，R:5'‑GACCTTGTCCTGCTCTTCATT‑3'。本发明运用qRT‑PCR检测方法检测lnc RNA TCONS_00020456在患者胶质瘤组织来源中的表达水平，研究证实其在胶质瘤中表达量较高的患者，拥有更高的术后生存率。因此，lnc RNA TCONS_00020456可作为胶质瘤预后标志物，用于胶质瘤患者的预后分析。

Description

一种胶质瘤预后标志物及其应用

技术领域

本发明涉及一种胶质瘤预后标志物，属于生物技术领域。

背景技术

源自神经上皮的肿瘤统称为脑胶质瘤，占颅脑肿瘤的40％～50％，是最常见的颅内恶性肿瘤，年发病率为3～8人/10万人口，具有发病率高、复发率高、死亡率高以及治愈率低的特点。

目前，对胶质瘤的治疗主要是通过手术切除，再辅以放化疗。但是，术后患者的复发率很高。导致胶质瘤难以治愈的主要因素之一是胶质瘤本身呈现侵袭性生长，肿瘤细胞与正常脑组织的界限十分模糊而难以做到手术完全切除，此外，由于胶质瘤细胞的快速增殖导致了局部肿瘤缺氧微环境的形成，在缺氧微环境下存活下来的肿瘤细胞具有更强的肿瘤恶性表型，是胶质瘤复发和术后放化疗抵抗的重要因素。因此，寻找胶质瘤预后标志物，并研制出相应的辅助判断试剂盒，对胶质瘤的治疗和预后非常重要。

长链非编码RNA(lncRNA)与神经胶质瘤的发生和发展密切相关。胶质瘤患者绝大多数均为中晚期，且手术后的生存率不容乐观。为了更好的诊治胶质瘤、并且准确判断患者的生存预后情况，须在分子生物学水平，从遗传信息表达的方面共同揭示并探索其发病机理。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种胶质瘤预后标志物。

技术方案

一种胶质瘤预后标志物，所述标志物为lnc RNA TCONS_00020456，其序列如SEQID NO.1所示。

一种用于检测上述标志物表达水平的特异性引物，所述特异性引物的序列为：

F:5'-CTCAGGTGGTGCCATTCTC-3'，

R:5'-GACCTTGTCCTGCTCTTCATT-3'。

上述特异性引物在制备胶质瘤预后试剂中的应用。

一种胶质瘤预后诊断试剂盒，包括上述引物。

本发明人采用上述诊断试剂盒，运用qRT-PCR检测方法检测lnc RNA TCONS_00020456在患者胶质瘤组织来源中的表达水平，研究证实胶质瘤中lnc RNA TCONS_00020456表达量较高的患者，拥有更高的术后生存率。因此，lnc RNA TCONS_00020456可作为胶质瘤预后标志物，用于胶质瘤患者的预后分析。此法为胶质瘤的预后分析提供了强有力的技术支持，有助于提高胶质瘤患者的术后生活质量，并相应地选择合理的后续治疗方案，提高生存率，具有深远的临床意义和推广性。

附图说明

图1为本发明的标志物lnc RNA TCONS_00020456在胶质瘤组织与正常脑组织中的表达量；

图2为本发明的标志物lnc RNA TCONS_00020456对高级别胶质瘤与WHO为I级的瘤组织的ROC曲线；

图3为生存曲线分析胶质瘤组织来源的lnc RNA TCONS_00020456的表达量与患者生存率的关系。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

胶质瘤预后诊断试剂盒：

①RNA稳定溶液50ml

②TRIzol(Invitrogen公司)50ml

③三氯甲烷(国药集团化学试剂有限公司)100ml

④异丙醇100ml

⑤无核酶水10ml

⑥4×gDNA wiper Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司)400ul

⑦5×HiScriptⅡSuperMixⅡ(南京诺唯赞生物科技有限公司)400ul

⑧2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司)400ul

⑨10μM lnc RNA TCONS_00020456实时荧光定量PCR特异性引物30μl，

lnc RNA TCONS_00020456正向引物：5'-CTCAGGTGGTGCCATTCTC-3'，

lnc RNA TCONS_00020456反向引物：5'-GACCTTGTCCTGCTCTTCATT-3'，上海生工生物工程有限公司合成；

⑩10μM HsActin特异性引物30μl

正向引物：5'-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，

反向引物：5'-GCCCAGGAAGGAAGGCT-3'。

实施例2

2016-2018年徐州医科大学附属医院获取的胶质瘤样本，提取组织RNA，将低级别及癌旁组织作为对照，比较不同级别胶质瘤组织中TCONS_00020456的含量水平：

①提取组织RNA：取适量样本经180℃烘烤6-8h后的研钵中加入液氮研磨标本，研磨至粉末状后于研钵中加入1ml TRIzol研钵标本，研磨成液体状后移至tube管，加氯仿200μl于Tube中，用手震荡15-30s，冰上放置15min，4℃12000rpm离心15min；小心取上层水相入新tube中，加入预冷的异丙醇0.5ml混匀，冰上静置20min，4℃12000rPm离心10min；弃上清，加入75％DEPC水稀释的乙醇1-2ml混匀，4℃，7500rPm离心5min，尽量弃上清，室温干燥5-10min，加入无核酶水10-20μl溶解RNA，-80℃保存。

②lnc RAN TCONS_00020456逆转录：使用诺唯赞公司的逆转录试剂盒。20μl逆转录反应的体系如下：

用移液器轻轻吹打混匀。42℃,2min。

在第1步的反应管中直接加入5×HiScriptⅡSuperMixⅡ

用移液器轻轻吹打混匀。

逆转录第二步程序：25℃10分钟，42℃30分钟，85℃5分钟。

③采用生工生物工程(上海)有限公司合成的lnc RAN TCONS_00020456特异性引物,进行实时定量PCR：先将逆转录产物稀释10倍，混匀。20μl反应体系如下：

实时荧光定量PCR特异性引物：

正向引物：5'-CTCAGGTGGTGCCATTCTC-3'，

反向引物：5'-GACCTTGTCCTGCTCTTCATT-3'；

HsActin特异性引物：

正向引物：5'-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，

反向引物：5'-GCCCAGGAAGGAAGGCT-3'。

用罗氏480PCR***进行实时荧光定量分析。反应条件设置如下：95℃预变性30s；95℃变性20s，60℃退火15s；72℃延伸15s，扩增40个循环；

⑤根据熔解曲线和标准曲线判断其Real-time PCR反应的可靠性，然后读取循环数(Ct)，每个样品设置3个复孔；根据公式ΔCt＝Ct(目的基因)－Ct(内参基因)和ΔΔCt＝ΔCt(研究组)－ΔCt(对照组)计算出2-^△△ct值，以HsActin基因作内参基因。通过荧光定量PCR对15例胶质瘤组织(其中，6例高级别，6例低级别和3例正常脑组织进行分析发现，lncRAN TCONS_00020456在三者中的表达差异明显(P<0.05)，见图1。

实施例3

对2006-2009年徐州医科大学附属医院确诊为胶质瘤患者，并行手术切除，术后将148例组织制作获得胶质瘤组织芯片阵列，留作研究使用。研究采用原位杂交结合免疫组化，对组织芯片进行TCONS_00020456着色，后对结果进行一一评分(根据阳性细胞比例和颜色深浅)，然后做出高级别胶质瘤组织与WHO为I级的瘤组织的ROC曲线，见图2，图2为本发明的标志物对高级别胶质瘤与WHO为I级的瘤组织的ROC曲线，可以看出，AUC为0.89(CI＝0.82–0.97，灵敏度＝79％,特异度＝89％)，这说明，TCONS_00020456对恶性胶质瘤具有较高的诊断价值。

对原位杂交中148例芯片结果处理如下：为了避免观察者视野间的误差，由一位资深病理老师对免疫组化实验结果进行判读并进行lnc免疫组化评分，其中病理类型为胶质母细胞瘤、弥漫性星形细胞瘤、间变型星形细胞瘤并有随访资料的有17例，结合ROC所确定的截断值3.5，对其进行生存曲线分析，见图3，星形胶质瘤中lnc评分小于3.5分，其五年生存率低于lnc评分高于3.5分，P＝0.0313，差异有统计学意义，这说明TCONS_00020456可作为恶性胶质瘤预后标志物。

序列表

<110> 徐州医科大学

<120> 一种胶质瘤预后标志物及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4623

<212> DNA

<213> 胶质瘤(Glioma)

<400> 1

gtttcacttg gaaaaaacat acatcatatt gcaatataat ttactttgag atttcaattt 60

ggaaaatggc atggaaataa tccagcttga acatcgtcct cctcacctcc tggactaggg 120

cgagggcccc ttatatttct tcatggcaat tgtgtcacag ttcaaacgct cgtaccctga 180

ctccatctgg gatttggaat gcactcaggg aagtggctgt gcatggagac tagaaatgga 240

agaggcttcc aaggtcatgc ctttcaggct cccttcaaat tctacagcta ctgtgaagag 300

agttgcattc ccacagagaa catgtcagac tggaggaaaa ttgtgacaaa aggtctcccc 360

aaagatcgag gaaaggaggt ttgcctgaaa aggagccaga gtggttccgc ccagactgac 420

gtgcttctgg cagccggtgt gtactgcttg gtgactgctc tttcatttca ggtggtgatt 480

taccaaatgc cgcttttttt ctgtatgaca caggcgtggc caaacatagt caccactcag 540

aatgttgggg aagtttctcg tccccatcaa acagagggag caacccttgg tggttcaaca 600

atgaagcctc cattagctga gaagtctaac tgtgatttat cattccctac ctataaagat 660

tgtaaacaaa tcaggaagct ttctgagtct cttagtcctc tacttccagg tagaagtggt 720

aagaatgtca accttccctc acaacattgt aagaaggaat gattatttga attgattata 780

aaaagatgct ctgcattatt catcattagg gaattgcaaa ttaaaacaac aaggagataa 840

cggctacata cctattagga cggctaatat ccaaaacgct gacagtacca aatggtagag 900

caacaggaac cctccttcat tgctggtgaa aatgtaaaat ggttcgacca ctgtggaaaa 960

cagtttggca gttttttaca aatctaaaca cacttttatc atatcattct gcaatcatgc 1020

tccttgatat tctcccaaat gagttgaaaa cttaggtcca cccagaaacc tctgcacaaa 1080

agtttatagc agctttattc ataattgcca aaacttagaa gccaccaagg tgtccgtcaa 1140

taggtgaatg gataaataaa ctgtagtata ttcatacagt ggaatagtat tgagcactta 1200

aaaaagaaaa agagctatta agccacaaaa aagaaacgga ggaagcataa aggcatatta 1260

ctaagtgcaa gaagccaatc tgaaaaggct acagactgta tgattccaac tataagacat 1320

tctggggagg taaaattatg cagacagtaa aggatcagtg tttgccaggg ttttgggaag 1380

atggaaggag gaattaatag atggaacacg ggatttttaa gccaatggaa ctatattgaa 1440

tgacactgaa agggtagcta catggcatga tagatctgtc aaagcccaca gactgtacaa 1500

cacaaacagt gaaccatatg taaactgtgg gctttggtca caaagagcga actgtaatgt 1560

aaactgtgga ctttggttga acatgaggca tcaatattac ttcatcagtt gtaacaaaac 1620

atactgtgac atgttggtgg tggaaggggc tgggtgtgtg ttgggggatg gttatgtgga 1680

aactgtactt tctgctcaat tttattgtga gcctaaaact tgtaaaaaat gaaacttatt 1740

aattaaaact aaatcgattt taaaatctag ataaaagtta ttatgaagca gaaagtgaat 1800

ataatcatat aattatataa attaataaaa ataattgttg aatgcatgct ttaggattaa 1860

gttcagttgt acacaacaca gaaaacaaca acaagtgtgg tttagacaag atagaagaat 1920

atgtttctca tgtatgcaaa ataagcctag aagtaggcag tccggagttg gaatggtgac 1980

tccacagaga ctttggggac caaggcttct ggctttgctg agactcccat ctcagcatct 2040

tactcccatc tcttggtctg atataattgc cagaactcca gccattacat ctgcattcta 2100

aacagcagag agcgaggaag gaggaaatac tggcatgcct cctcccttaa atgcagactt 2160

acaggaagtt tcatattata gttctgcttt tatcttattg gtcaagaact tagacaaatt 2220

ggcacatcta cctgtgaagg agtctcacaa ttttttacct gttgaatgta cacaaaattt 2280

aaaaaatctg cagagaggtc cagctaaaaa tcagggctct gtttctaaat aaaaagaaag 2340

aaagggatgt tggagtaggc agctagccat ctgagacttt gagcaactgt tgctaagtta 2400

aaaatacagt gctagaggca gaggatgaaa aacacattag atcaatagga gaaataaaca 2460

tgcaagcacg cggctattat atatggtggc aatttgttaa tggcacaagg atttcaaaag 2520

aggatgtgcg tatgcccagt tgggattgat cagagaagcc ctcctagagg gaaggatatt 2580

ttacaaagac ctagaaggat ggagagaatt tgaatggtag gaagtggtgg aaaaaaaggc 2640

aaacttggca taggaaatgg catgagagaa agcaagttgt tatttgataa agagggatat 2700

gcctgttatt ggtgcatttt atagtctgca cagatacaga aagtgcctag gcaggaagaa 2760

gtttatgtct gtagtttgga catctacccc aatgacatca gtttctctat tcacaatctg 2820

tccatcattc ccatggggtg ggaggtgagg aagaattcca ttcaacaaca cacacttaga 2880

gtatctcagg caaagagact ttttttcttt tgtatttatg ataaaacacc caaatatgta 2940

tccaagtggg attaccagcc tgggttggat ccaagagact ttggttacta gaactatttc 3000

tcatcataaa tccccaaaca agttgagttt ttcacttcct ctcctaatct gccatggagc 3060

acagccgagt tgcttgaagt catctacttc ttggcagtgg ctacaattcc aagatgatgg 3120

aacgattctt ttccatatac atcattatta tttctagtat aaatatttat caagcactca 3180

ctgtgcaata gagaagagct cctgcttggt ggtctttcca gctgaacaaa acaaacatga 3240

gtagaggttg agggaagagg tgggaagaga acctcagctg gtgggaaaca ataggaattg 3300

cttccccacc ccacctcctt ttattcatgt tggatgttgt ttggacttga ctgccatatt 3360

tcagatacgt aaaatgtgtt tttatttgtt taacatatgc tttatagggc ttaccatgtg 3420

ctgtgcactg ttctaagctc tttacaaata ttaacacatt caatcctcat agaatcctgt 3480

gaaataagtc attttattat ccctatttgc agatgaggaa actgaggcac acagtaattt 3540

gcccaaggtc gctaactggg cacagtgact ctagagcaac actgttcagt agaactttcc 3600

ctgatgtcag aagtgttcca tatttgcgct gcccaatagg gtaaccactg gatacgtgta 3660

gctgttgagc acttgaaatg tggcttgtat gactgaggaa gtgaacttct gaaagttcag 3720

aaggccaccc acctcaccct cccaaagtgc tgagattaca ggcatgagcc accacaccca 3780

ggccgccttt ctttcctttc ctctcccttc ctccctccct cccttttttc tttctttctt 3840

tcttgcttgc ctgcctgcct tccttccttc cttccttcct tttctttctc tctctttctt 3900

tccatccctc cctcctctct ctctctttct ttctttcctt ttcttttcct ttcttttctt 3960

ttctttttcc ttccttcctt cccttttctc cttccttcct tctcttctct tctcttttct 4020

ttctctttct ttttttgaag gagcaagagc caagaatata gagattcttt tgtaaaacag 4080

tgatccttcc tggtgcattt gctgtttaat tatgataaac aacatgagat ataagtttat 4140

agaaaaatat gagcaagtca ctcaggtggt gccattctct attccctggc tattaaatag 4200

gactacaaaa aagctctatc tccaatgcaa gttttctcac aattggtagc agatgaggag 4260

gtcaaagagg agaaatcaac ggctggttag gtcatgcaca tttggtagca cagaccattg 4320

ttaaaagcaa aaagcaacat tatagtatct ggtgcctgct tgggaaaatg aagagcagga 4380

caaggtcatg tgtgttatct tgctgtcatc aagactacta ctccctcttt tctctctttc 4440

cctcccatct taatgcttct ctactttact cagctttcat ggttaaactc aaattccact 4500

tcttccttga aagctgccct cctgtctcca tgtgaaagca tcctccctac aatatgactg 4560

tatgtttctt ctggtactca atgggttcta tactatataa tagctaagta agtacaagtc 4620

cta 4623

Claims (5)

1.一种胶质瘤预后标志物，其特征在于，所述标志物为lnc RNA TCONS_00020456。

2.如权利要求1所述的胶质瘤预后标志物，其特征在于，所述lnc RNA TCONS_00020456的序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种用于检测权利要求1或2所述胶质瘤预后标志物表达水平的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的序列为：

F:5'-CTCAGGTGGTGCCATTCTC-3'，

R:5'-GACCTTGTCCTGCTCTTCATT-3'。

4.权利要求3所述特异性引物在制备胶质瘤预后试剂中的应用。

5.一种胶质瘤预后诊断试剂盒，包括权利要求3所述引物。