CN109055559A - 一种检测膀胱癌的特异性引物和试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种检测膀胱癌的特异性引物和试剂盒及其检测方法，其中特异性引物包括β‑GRS基因扩增引物和探针、NAG基因扩增引物和探针、HOXA13基因扩增引物和探针、UBE2C基因扩增引物和探针；β‑GRS基因扩增引物序列如SEQ ID NO：1‑2所示，β‑GRS基因探针如SEQ ID NO：3所示；NAG基因扩增引物序列如SEQ ID NO：4‑5所示，NAG基因探针如SEQ ID NO：6所示；HOXA13基因扩增引物序列如SEQ ID NO：7‑8所示，HOXA13基因探针如SEQ ID NO：9所示；UBE2C基因扩增引物序列如SEQ ID NO：10‑11所示，UBE2C基因探针如SEQ ID NO：12所示。应用上述引物和探针制备的试剂盒具有检测速度快、敏感性高及特异性好等优点；同时该方法不依赖膀胱镜检查，直接针对标记物进行荧光定量检测，操作简单，因此适合在临床检验工作中普及应用。
Description
技术领域
本发明属于核酸体外扩增检测领域，具体涉及一种检测膀胱癌的特异性引物和试剂盒及其检测方法。
背景技术
膀胱癌是全世界五种最常见的恶性肿瘤之一。2010年仅在美国的膀胱癌病例预计为67,160例，预计死亡13,750例(A.Jemal等,Cancer Statistics,2010CA:A CancerJournal for Clinicians 60,277-300,2010)。当早期检查到时，5年内的存活率大约为94％，因此及时的介入可以显著提高患者存活的概率。目前，超过80％的***是非浸润性的***瘤(pTa或pT1)，但是剩余部分在诊断期间展现出肌肉浸润并具有更不太有利的预后。尽管肌肉浸润性疾病需要根治性手术，非肌肉浸润性肿瘤在有或没有膀胱灌注疗法的情况下，通过经尿道切除肿瘤可以更保守地治疗；然而，70％以上的患有早期阶段疾病的患者会在诊断后的前两年复发，这使得膀胱癌成为最常见的癌症之一。如果不及时治疗，这些最初非浸润性病变可演变为肌肉浸润性病变(F.Millan-Rodriguez等,J.Urol.164,680-84,2000)。膀胱癌的复发现象意味着患者需要至少每年一次的严格监控。为了生命的质量和积极的临床结果，及时发现疾病复发和初步诊断同样重要。
目前，用于膀胱癌检测的最可靠的方法为膀胱镜检查联合以受损部位的活组织切片检查。但是，该技术费时、为浸润性且其敏感性仅为约90％，这意味着约10％的癌症患者不能用这些方法得以检测。浅表性方法中的尿细胞学方法，可通过显微镜检测片状脱落的恶性细胞，为目前的优选方法。尽管细胞学方法的特异性约为95％，但其对低度损伤的敏感性很低，非常依赖样本质量且受到观测者间的高度差异的影响。
现有技术中已尝试对膀胱活组织标本中的遗传标记物进行检测。最常用的方法为微阵列分析，方法中将含有与推断的遗传标记的部分互补的寡核苷酸的阵列，与获自患者样本的mRNA或cDNA样本进行接触。用这些方法，一些近期的报告已鉴定出多种推测的膀胱癌标记物。但是，阵列技术相对而言为非定量性且变异较大。
对可指示膀胱癌存在的血液或尿液标记物进行荧光定量检测提供了用于改进该疾病检测的一种潜在方法。特异癌标记物也可提供用于监控疾病进程并保证所监控的外科、放疗和化疗治疗的功效的方法。如经过肝脏解毒与葡萄糖醛酸结合，失活的致癌物质可受尿中β-GRS裂解还原，使致癌活动部分重新释放，引发膀胱癌，因此，尿液中β-GRS升高标志有发生膀胱癌的趋向；NAG活性与***的病理分级有一定的关系，***分级越高，生长越快，其外周部分血供越差，越容易坏死，故尿中NAG也相应较高；HOXA13、UBE2C可在***组织和其它肿瘤组织中高度或持续地累积，对尿液中HOXA13、UBE2C进行检测和定量可提高膀胱癌检测的敏感性和特异性。但是，现有技术中对膀胱癌而言，依然存在着可用的标记物敏感性和特异性不足、荧光定量检测引物特异性差、定量检测灵敏度低等问题。
发明内容
针对现有技术中的技术空白，本发明的目的是提供一种检测膀胱癌的特异性引物和试剂盒及其检测方法，该方法无需依赖昂贵、繁琐且通常患者不易接受的膀胱镜检查，直接针对尿液或组织标记物进行荧光定量检测，检测灵敏度高、特异性强。
为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现地：
本发明的第一个目的在于提出一组用于检测膀胱癌的特异性引物和探针，包括β-GRS基因扩增引物和探针、NAG基因扩增引物和探针、HOXA13基因扩增引物和探针、UBE2C基因扩增引物和探针；所述β-GRS基因扩增引物序列如SEQ ID NO：1-2所示，β-GRS基因探针如SEQ ID NO：3所示；所述NAG基因扩增引物序列如SEQ ID NO：4-5所示，NAG基因探针如SEQID NO：6所示；所述HOXA13基因扩增引物序列如SEQ ID NO：7-8所示，HOXA13基因探针如SEQID NO：9所示；所述UBE2C基因扩增引物序列如SEQ ID NO：10-11所示，UBE2C基因探针如SEQID NO：12所示。
进一步地，还包括内参基因引物对和TaqMan探针，所述内参基因引物序列如SEQID NO：13-14所示，所述内参基因的TaqMan探针序列如SEQ ID NO：15所示。
本发明的第二个目的在于提出一种检测膀胱癌的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测膀胱癌的特异性引物和探针，具体包括β-GRS基因扩增引物和探针、NAG基因扩增引物和探针、HOXA13基因扩增引物和探针、UBE2C基因扩增引物和探针；所述β-GRS基因扩增引物序列如SEQ ID NO：1-2所示，β-GRS基因探针如SEQ ID NO：3所示；所述NAG基因扩增引物序列如SEQ ID NO：4-5所示，NAG基因探针如SEQ ID NO：6所示；所述HOXA13基因扩增引物序列如SEQ ID NO：7-8所示，HOXA13基因探针如SEQ ID NO：9所示；所述UBE2C基因扩增引物序列如SEQ ID NO：10-11所示，UBE2C基因探针如SEQ ID NO：12所示。
进一步地，所述试剂盒还包括内参基因引物对和TaqMan探针，所述内参基因引物序列如SEQ ID NO：13-14所示，所述内参基因的TaqMan探针序列如SEQ ID NO：15所示。
进一步地，所述试剂盒还包括外控基因引物和探针，所述外控基因引物序列如SEQID NO:16-17所示，所述外控基因序列如SEQ ID NO:18。
进一步地，所述试剂盒还包括PCR MIX反应液和去离子水。
更进一步地，所述PCRMIX反应液包括Taq DNA聚合酶、buffer、dNTPs和MgCl2；所述Taq DNA聚合酶的浓度为5U/μl；所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，它们的浓度均为2.5μM；所述MgCl2的浓度为250mM。
本发明的第三个目的在于提出一种膀胱癌的检测方法，该方法利用权利要3-7中任一项所述的试剂盒检测组织或尿液中β-GRS、NAG、HOXA13、UBE2C至少一种标记物的表达量，包括如下步骤：
(1)配制反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ、反应液Ⅳ、反应液Ⅴ，所述反应液Ⅰ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO:1-2、探针SEQ ID NO:3、内参混合物SEQ ID NO:13-15；所述反应液Ⅱ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO:4-6、探针SEQ IDNO:6、内参混合物SEQ ID NO:13-15；所述反应液Ⅲ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO:7-8、探针SEQ ID NO:9、内参混合物SEQ ID NO:13-15；所述反应液Ⅳ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO:10-11、探针SEQ ID NO:12、内参混合物SEQ IDNO:13-15；所述反应液Ⅴ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、外控混合物SEQ ID NO:16-18；
(2)提取纯化待测样本DNA，并对提取的DNA进行浓度及纯度测定；所述待测样本为尿液中膀胱脱落细胞；
(4)将步骤(2)中已知浓度的DNA样本用TE稀释成2～20ng/μl；
(4)分别向反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ、反应液Ⅳ、反应液Ⅴ中各加入2μl步骤(3)中已稀释备用的样本DNA作为模板；
(5)设置PCR程序，实时荧光PCR检测；
(5)检测结果分析。
进一步地，所述步骤(1)中反应液中每一种引物的终浓度均为100-400nm，每一种探针的终浓度均为100-400nm。
进一步地，所述步骤(5)中荧光检测通道选择FAM、VIC检测通道，其中突变和外控通道选择FAM通道，内参选择VIC通道。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果如下：
(1)本发明的技术方案通过设计特异性高的引物及荧光探针，再配置成使用方便、检测结果可靠的试剂盒，设计出科学合理的PCR反应体系，使得本发明具有检测速度快、检测敏感性高及特异性好等优点；同时该方法无需依赖昂贵、繁琐且通常患者不易接受的膀胱镜检查，直接针对尿液或组织标记物进行荧光定量检测，操作简单；因此该方法特别适合在临床检验工作中普及应用。
(2)本发明设计的外控反应液能准确反映待测模板质量，防止因模板量不足或抑制剂过强引起的假阴性结果，也能监测因模板量过高可能造成的假阳性，同时在突变检测反应液中均添加了内参引物探针，通过内参的扩增能有效避免假阴性出现，最终确保试剂盒检测结果准确无误。
具体实施方式
下面申请人结合具体实施例对本发明技术方案做进一步详细说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为本发明请求保护范围的限定。
实施例1：
本发明提出了一组用于检测膀胱癌的特异性引物和探针，包括β-GRS基因扩增引物和探针、NAG基因扩增引物和探针、HOXA13基因扩增引物和探针、UBE2C基因扩增引物和探针、内参基因引物对和TaqMan探针；β-GRS基因扩增引物序列如SEQ ID NO：1-2所示，β-GRS基因探针如SEQ ID NO：3所示；NAG基因扩增引物序列如SEQ ID NO：4-5所示，NAG基因探针如SEQ ID NO：6所示；HOXA13基因扩增引物序列如SEQ ID NO：7-8所示，HOXA13基因探针如SEQ ID NO：9所示；UBE2C基因扩增引物序列如SEQ ID NO：10-11所示，UBE2C基因探针如SEQID NO：12所示；内参基因引物序列如SEQ ID NO：13-14所示，内参基因探针序列如SEQ IDNO：15所示。其中检测探针均为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有非荧光淬灭基团，本实施例中的检测探针如下：
①β-GRS检测探针SEQ ID NO:3
5`-FAM-aggagataaatggaaacaa-MGB-3`
②NAG检测探针SEQ ID NO:6
5`-FAM-caggctgagttttggtc-MGB-3`
③HOXA13检测探针SEQ ID NO:9
5`-FAM-taaaggtaacaacaaaggtatatt-MGB-3`
④UBE2C检测探针SEQ ID NO:12
5`-FAM-atctacttggagcctgcaccattggag-BHQ1-3`
⑤内参基因检测探针SEQ ID NO15：
5`-FAM-tacccattctctgcttgacagtcctgc-BHQ1-3`
本发明还提出一种检测膀胱癌的试剂盒，该试剂盒包括上述的一组用于检测膀胱癌的特异性引物和探针，同时还包括外控基因引物和探针、PCR MIX反应液和去离子水，其中外控基因引物序列如SEQ ID NO:16-17所示，外控基因检测探针序列如SEQ ID NO:18，其中检测探针经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有非荧光淬灭基团，本实施例中的检测探针如下：
SEQ ID NO:18 5`-FAM-agacttaatagtccgcgtgggcgacg-BHQ1-3`
实施例2：以尿液为检测样本，膀胱癌检测方法的建立
使用实施例1中的试剂盒对15例膀胱癌患者尿液中膀胱脱落细胞和2名正常受试者尿液中膀胱脱落细胞进行检测，该检测已经获得被测者的知情和同意。这15名患者经过临床膀胱镜(金标准)方法进行诊断，其中非浸润性膀胱癌患者7例(FJ-01～FJ-7)，浸润性膀胱癌患者8例(J-01～J-8)。正常受试者编号为E-01～E-02，具体检测方法如下：
1.配制反应液
配制反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ、反应液Ⅳ、反应液Ⅴ，其中反应液Ⅰ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO:1-2、探针SEQ ID NO:3、内参混合物SEQ ID NO:13-15；反应液Ⅱ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO:4-6、探针SEQ ID NO:6、内参混合物SEQ ID NO:13-15；反应液Ⅲ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ IDNO:7-8、探针SEQ ID NO:9、内参混合物SEQ ID NO:13-15；反应液Ⅳ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO:10-11、探针SEQ ID NO:12、内参混合物SEQ ID NO:13-15；反应液Ⅴ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、外控混合物SEQ ID NO:16-18。阴性质控品为18兆以上无核酸酶水。
其中第一种反应中PCR缓冲液的体系包括：5μL 5×Buffer(TrispH8.0，KCl)、0.25μLMgCl2(250mM)、2μL dNTP Mix(10mM)、12.55μL去离子水；每一种反应液中添中的引物、探针混合液(10μM)为3μL，上、下游引物和探针各1μL，化学修饰热启动Taq酶(5U/μl)0.2μL。
本实施例中为15个待测样本，因此需配制15组反应溶液(每组反应液均包含反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ、反应液Ⅳ、反应液Ⅴ)
2.提取纯化待测样本DNA，并对提取的DNA进行浓度及纯度测定
(1)尿液样本采集及离心：采集每一位患者晨尿中的中段尿50mL，平均到两个50mL的离心管，立即以2000g离心20分钟，去掉上清液。
(2)尿液沉淀提取DNA：按照DNeasy Blood&Tissue Kit(厂家：Qiagen，货号：69504)试剂盒说明书提取尿液沉淀DNA，Qubit定量检测DNA浓度。DNA浓度需大于等于2.5ng/μL，结果如下：
表1
| 样本号 | 浓度(ng/μl) | 260/280 |
| FJ-01 | 84.5 | 1.96 |
| FJ-02 | 75.0 | 1.82 |
| FJ-03 | 42.6 | 1.72 |
| FJ-04 | 92.2 | 1.80 |
| FJ-05 | 55.4 | 1.75 |
| FJ-06 | 82.5 | 1.87 |
| FJ-07 | 75.0 | 1.82 |
| J-01 | 40.6 | 1.65 |
| J-02 | 92.2 | 1.80 |
| J-03 | 65.4 | 1.73 |
| J-04 | 87.5 | 1.85 |
| J-05 | 63.0 | 1.74 |
| J-06 | 42.6 | 1.72 |
| J-07 | 91.2 | 1.68 |
| J-08 | 68.4 | 1.75 |
| E-01 | 63.2 | 1.85 |
| E-02 | 92.7 | 1.72 |
3.将已知浓度的DNA样本用TE稀释成2～20ng/μL
4.分别向反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ、反应液Ⅳ、反应液Ⅴ中各加入2μL已稀释备用的样本DNA作为模板进行PCR扩增。
5.设置PCR程序，实时荧光PCR检测
荧光检测通道选择FAM，VIC/HEX检测通道，其中突变和外控通道选择FAM通道，内参选择VIC通道。
PCR程序为：52℃30min，(95℃15s，60℃40s)×45cycles，60℃同时收集2种荧光信号。
6.检测结果分析
(1)判定标准
①阴性质控品：FAM通道、VIC通道无扩增曲线，或者扩增曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长期，Ct值≥51。
②外控反应液：FAM通道Ct值36≤Ct≤45，样本DNA加入量适中；FAM通道Ct值＞45，样本基因组DNA提取质量较差，只有突变DNA含量较高的样本可以检测出突变，突变DNA含量较低的样本建议重新提取样本，增加基因组DNA加入量；FAM通道Ct值＜36，样本加入量过高，建议稀释后重新检测。
③样本突变类型判定标准
表2
(2)扩增结果显示：
阴性质控品FAM、VIC通道均没有扩增曲线，外控反应液FAM通道Ct值均在36≤Ct≤45之间，说明样本质控合格，可根据判定标准对样本检测结果进行判定，17个样品中，E-01-02均无扩增曲线，表明该样本不存在与膀胱癌相关的标记物；FJ-01-07、J-01-08的4个标记物检测样品均有扩增曲线，具体检测结果如下表所示：
表3
| 样本号 | β-GRS | NAG | HOXA13 | UBE2C |
| FJ-01 | 37.9 | 45.2 | 46.3 | 38.9 |
| FJ-02 | 38.6 | 41.3 | 45.2 | 39.7 |
| FJ-03 | 37.6 | 45.6 | 44.9 | 39.6 |
| FJ-04 | 36.9 | 45.2 | 48.6 | 41.3 |
| FJ-05 | 45.6 | 44.3 | 48.6 | 44.6 |
| FJ-06 | 44.9 | 48.9 | 45.2 | 44.5 |
| FJ-07 | 49.5 | 44.8 | 44.3 | 41.9 |
| J-01 | 50.1 | 45.6 | 48.5 | 45.6 |
| J-02 | 48.6 | 44.1 | 45.6 | 44.3 |
| J-03 | 44.6 | 41.3 | 44.9 | 39.5 |
| J-04 | 41.3 | 40.2 | 48.7 | 38.7 |
| J-05 | 42.6 | 40.9 | 45.6 | 41.2 |
| J-06 | 44.2 | 50.2 | 45.0 | 40.9 |
| J-07 | 38.9 | 41.6 | 44.6 | 42.3 |
| J-08 | 39.7 | 48.9 | 48.7 | 50.2 |
从上表中的数据可以看出，15例膀胱癌患者尿液中膀胱脱落细胞中4种标记物均存在，与真实结果一致。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 爱尔生基因医学科技有限公司
<120> 一种检测膀胱癌的特异性引物和试剂盒及其检测方法
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<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
agacttaata gtccgcgtgg gcgacg 26
Claims (10)
1.一组用于检测膀胱癌的特异性引物和探针，其特征在于，包括β-GRS基因扩增引物和探针、NAG基因扩增引物和探针、HOXA13基因扩增引物和探针、UBE2C基因扩增引物和探针；所述β-GRS基因扩增引物序列如SEQ ID NO：1-2所示，β-GRS基因探针如SEQ ID NO：3所示；所述NAG基因扩增引物序列如SEQ ID NO：4-5所示，NAG基因探针如SEQ ID NO：6所示；所述HOXA13基因扩增引物序列如SEQ ID NO：7-8所示，HOXA13基因探针如SEQ ID NO：9所示；所述UBE2C基因扩增引物序列如SEQ ID NO：10-11所示，UBE2C基因探针如SEQ ID NO：12所示。
2.根据权利要求1所述的一组用于检测膀胱癌的特异性引物和探针，其特征在于，还包括内参基因引物对和TaqMan探针，所述内参基因引物序列如SEQ ID NO：13-14所示，所述内参基因的TaqMan探针序列如SEQ ID NO：15所示。
3.一种检测膀胱癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测膀胱癌的特异性引物和探针，具体包括β-GRS基因扩增引物和探针、NAG基因扩增引物和探针、HOXA13基因扩增引物和探针、UBE2C基因扩增引物和探针；所述β-GRS基因扩增引物序列如SEQ ID NO：1-2所示，β-GRS基因探针如SEQ ID NO：3所示；所述NAG基因扩增引物序列如SEQ ID NO：4-5所示，NAG基因探针如SEQ ID NO：6所示；所述HOXA13基因扩增引物序列如SEQ ID NO：7-8所示，HOXA13基因探针如SEQ ID NO：9所示；所述UBE2C基因扩增引物序列如SEQ ID NO：10-11所示，UBE2C基因探针如SEQ ID NO：12所示。
4.根据权利要求3所述的一种检测膀胱癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内参基因引物对和TaqMan探针，所述内参基因引物序列如SEQ ID NO：13-14所示，所述内参基因的TaqMan探针序列如SEQ ID NO：15所示。
5.根据权利要求3所述的一种检测膀胱癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括外控基因引物和探针，所述外控基因引物序列如SEQ ID NO:16-17所示，所述外控基因序列如SEQ ID NO:18。
6.根据权利要求3所述的一种检测膀胱癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR MIX反应液和去离子水。
7.根据权利要求6所述的一种检测膀胱癌的试剂盒，其特征在于，所述PCR MIX反应液包括Taq DNA聚合酶、buffer、dNTPs和MgCl2；所述Taq DNA聚合酶的浓度为5U/μl；所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，它们的浓度均为2.5μM；所述MgCl2的浓度为250mM。
8.一种膀胱癌的检测方法，其特征在于，该方法利用权利要3-7中任一项所述的试剂盒检测组织或尿液中β-GRS、NAG、HOXA13、UBE2C至少一种标记物的表达量，包括如下步骤：
(1)配制反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ、反应液Ⅳ、反应液Ⅴ，所述反应液Ⅰ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO:1-2、探针SEQ ID NO:3、内参混合物SEQ ID NO:13-15；所述反应液Ⅱ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO:4-6、探针SEQ ID NO:6、内参混合物SEQ ID NO:13-15；所述反应液Ⅲ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQID NO:7-8、探针SEQ ID NO:9、内参混合物SEQ ID NO:13-15；所述反应液Ⅳ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO:10-11、探针SEQ ID NO:12、内参混合物SEQ ID NO:13-15；所述反应液Ⅴ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、外控混合物SEQ ID NO:16-18；
(2)提取纯化待测样本DNA，并对提取的DNA进行浓度及纯度测定；所述待测样本为尿液中膀胱脱落细胞；
(3)将步骤(2)中已知浓度的DNA样本用TE稀释成2～20ng/μl；
(4)分别向反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ、反应液Ⅳ、反应液Ⅴ中各加入2μl步骤(3)中已稀释备用的样本DNA作为模板；
(5)设置PCR程序，实时荧光PCR检测；
(6)检测结果分析。
9.根据权利要求8所述的一种膀胱癌的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中反应液中每一种引物的终浓度均为100-400nm，每一种探针的终浓度均为100-400nm。
10.根据权利要求8所述的一种膀胱癌的检测方法，其特征在于，所述步骤(5)中荧光检测通道选择FAM、VIC检测通道，其中突变和外控通道选择FAM通道，内参选择VIC通道。
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