CN109306017B

CN109306017B - 一种基于SIRP-αD1突变体制备的重组蛋白及应用

Info

Publication number: CN109306017B
Application number: CN201811187563.0A
Authority: CN
Inventors: 王雷; 黄苏萍; 尹建河; 张楠; 董丽莎; 赵永浩; 汤春; 彭继荣; 张晓东
Original assignee: Beierda Pharmacy Suzhou Co ltd
Current assignee: Beierda Pharmacy Suzhou Co ltd
Priority date: 2018-10-12
Filing date: 2018-10-12
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2038-10-12
Also published as: CN109306017A

Abstract

本发明公开了一种基于SIRPαD1突变体制备的重组蛋白及应用，基于对SIRPα膜外端IgV区(SIRPαD1)进行接触表面氨基酸多点突变获得突变体I，在突变体I的基础上对第80位氨基酸天冬酰胺(N)采取去糖基化突变获得突变体II，偶联人IgG1‑Fc区域进行融合表达获得重组蛋白CD001/CD002。与野生型或去糖基化单点突变体相比，这些突变体与重组蛋白CD47及多种癌细胞系具有更高的亲和力，在蛋白水平及细胞水平上对CD47和SIRPa结合有着更好的阻断效果；对白血球(红细胞)无凝血；在功能上，能够更有效的激活巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬。CD001/CD002具有更好的靶点结合活性、更优的靶点阻断效果及更强的免疫激活功能，而对红细胞无副作用。

Description

一种基于SIRP-αD1突变体制备的重组蛋白及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基于SIRP-αD1突变体制备的重组蛋白及应用。

背景技术

CD47也被称为整合素相关蛋白(integrinassociatedprotein，IAP)，广泛的表达于细胞的表面，可与信号调节蛋白α(Signalregulatoryproteinα,SIRPα)、血小板反应蛋白(thrombospondin-1,TSP1)以及整合素(integrins)相互作用，介导细胞凋亡、增殖、免疫等一系列的反应。CD47是一个5次跨膜蛋白，分子量在50kDa左右，属于免疫球蛋白超家族，胞外N端为IgV结构域。CD47在19世纪80年代首次被确认为人类卵巢癌的肿瘤抗原，继而CD47被发现在多种类型的人类肿瘤中表达，包括急性髓细胞白血病(AML)、慢性髓细胞白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍金性淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌(BC)和其他实体肿瘤。

CD47是一个"自我"标记，代表"别吃我"信号。人体需要20-30万亿的红细胞，以此保持氧气有效的运输到全身各处。红细胞的生命周期较短,仅有120天，每小时有100亿的红细胞生成，也有无数衰老的红细胞被巨噬细胞吞噬清除。然而巨噬细胞是如何区分年轻和衰老的红细胞，只进攻衰老红细胞的机理却不为人知。直到2000年，Oldenborg等人证实CD47是细胞表面一个重要的"self"标记，是调节巨噬细胞吞噬作用的一个重要信号。CD47可以与巨噬细胞表面SIRPα结合，磷酸化其ITIM，随后招募SHP-1蛋白，产生一系列的级联反应抑制巨噬细胞的吞噬作用。年轻的红细胞表达较高的CD47向巨噬细胞释放"自己人，别吃我"的信号，而衰老的红细胞CD47下调，最终被巨噬细胞清除。

肿瘤细胞有一系列躲避人体免疫***追杀的方案，包括分泌免疫抑制因子、下调MHCI表达，以及上调PD-L1抑制CD8+T细胞活性。聪明的肿瘤细胞当然不会放过CD47这个完美的掩体，它们通过高表达CD47来躲避吞噬。不同的研究表明，几乎所有的肿瘤细胞和组织都高表达CD47，是对应正常细胞和组织的3倍。通过CD47这个"self"信号，肿瘤细胞有效的躲避了巨噬细胞的吞噬作用。

多个研究表明在细胞水平上，通过阻断SIRPα-CD47之间的相关作用可有效激活巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用，在体内通过CD47抗体阻断SIRPα-CD47之间的相关作用可有效的抑制肿瘤在小鼠体内的生长。另外，通过结构学及单点突变(图1C)研究表明I33、H56、S66能够影响到SIRPαD1与CD47的结合，在C’Dloop环中，K53、E54可能对与CD47结合后结构的稳定性有一定影响；在SIRPαD1中，存在潜在的N80糖基化，对与CD47的结合可能存在一定的影响。

Fc受体存在于多种免疫细胞表面，这些细胞包括B淋巴细胞，自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、中性粒细胞等具有免疫保护功能的细胞，Fc与Fc受体结合后可刺激巨噬细胞吞噬病原体或靶细胞以及刺激细胞毒淋巴T细胞，从而介导巨噬细胞或抗体依赖的细胞毒性来杀伤病原体、癌细胞等。

针对阻断SIRPα-CD47信号通路已有多种抑制剂的研究报道，包括FortySevern公司的抗CD47单抗Hu5F9-G4、TRILLIUMTHERAPEUTICS,INC.公司的双功能融合蛋白TTI-621以及国内宜名昂科生物医药技术(上海)有限公司的HY03M，但这些抑制剂存在着与红细胞结合的副作用(溶血)或与癌细胞靶向亲和力低等不足。

专利申请号为201510203619的发明专利公开一种基因重组融合蛋白，可以通过两种机制达到消灭肿瘤的目的，一是通过阻断肿瘤细胞诱导的巨噬细胞的抑制性信号，一是通过直接激活巨噬细胞的吞噬作用。该蛋白由人信号调节蛋白(Signal-regulatoryproteins)alpha(SIRPα)的膜外端第一个Ig样区(SIRPαD1)与人IgG1的Fc片段连接而成(SIRPαD1-Fc)。该发明提供一种编码重组双功能融合蛋白的核苷酸分子以及表达该蛋白的表达载体，一种制备所述蛋白的方法以及一种治疗过度表达CD47相关疾病的方法。该蛋白属于同源二聚体，分子量为90kDa。但是该专利并未提高与癌细胞的靶向亲和力，在功能上也并未提高巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于SIRPαD1突变体制备的重组蛋白，本发明通过对SIRPαD1进行表面氨基酸点突变及联合去糖基化点突变来改变SIRPαD1与癌细胞、红细胞的亲和力，从而提高肿瘤抑制并降低红细胞溶血的副作用。本发明涉及2个重组融合蛋白，包含SIRPαD1接触表面氨基酸突变组合偶联人IgG1-Fc(CD001)，以及上述重组蛋白CD001进行N80去糖基化获得CD002。CD001及CD002可以通过两种机制杀伤肿瘤细胞，一是阻断SIRPα-CD47信号达到激活巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，另一种是Fc与巨噬细胞的Fc受体结合激活巨噬细胞的免疫作用。本发明发现CD001、CD002具有更好的靶点结合活性、更优的靶点阻断效果及更强的免疫激活功能，而对红细胞无副作用，与对照(IgG1-Fc或PBS)相当。在蛋白水平上CD001、CD002与靶点CD47亲和力有着120倍的提高，在细胞水平上与多个癌细胞的结合能力也有显著的提高，在靶点阻断效果方面有着150～300倍的提高，激活巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用(ADCP)有着显著的提高，而在白血球(红细胞)溶血方面，达到无毒副作用的效果。

本发明公开了一种重组蛋白，包括对信号调节蛋白SIRPα膜外端接触表面氨基酸进行多点突变获得突变体I以及与突变体I连接的免疫球蛋白Fc区域，和/或者在突变体I的基础上结合对个别氨基酸突变获得突变体II以及与突变体II连接的免疫球蛋白Fc区域，然后偶联免疫球蛋白Fc区域进行融合表达获得重组蛋白CD001/CD002。

优选的是，基于对SIRPα膜外端IgV区(SIRPαD1)接触表面氨基酸进行多点突变获得突变体I。对信号调节蛋白SIRPα膜外端IgV区接触表面氨基酸进行多点突变。

上述任一方案优选的是，在突变体I的基础上对第80位氨基酸天冬酰胺突变获得突变体II。

上述任一方案优选的是，CD001进行N80去糖基化获得CD002。

上述任一方案优选的是，所述的信号调节蛋白SIRPα为成熟的野生型人信号调节蛋白。

上述任一方案优选的是，所述的免疫球蛋白Fc区域为人IgG1-Fc。

本发明还提供一种氨基酸，其编码上述任一项所述的重组蛋白。

本发明还提供一种多聚核苷酸，其编码上述的氨基酸。

本发明还提供一种表达载体，其包含上述所述的多聚核苷酸。

本发明还提供一种宿主细胞，其包含上述所述的表达载体。

本发明还提供一种上述所述的重组蛋白在制备***疾患CD47过度表达药物中的应用。

优选的是，肿瘤疾患包括血液瘤、实体瘤疾患中的至少一种，血液瘤为急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、成人T-细胞白血病、多发性骨髓瘤、混合白血病、非霍奇金淋巴瘤中的至少一种；实体瘤为肺癌、膀胱癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌、***癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌中的至少一种。

本发明还提供一种上述所述的重组蛋白在阻断CD47与SIRPα的相互作用、激活巨噬细胞等免疫细胞的免疫作用药物中的应用。

有益效果

本发明公开了一种基于SIRPαD1突变体制备的重组蛋白，基于对SIRPα膜外端IgV区(SIRPαD1)进行接触表面氨基酸多点突变获得突变体I，在突变体I的基础上对第80位氨基酸天冬酰胺(N)采取去糖基化突变获得突变体II，偶联人IgG1-Fc区域进行融合表达获得重组蛋白CD001、CD002。与野生型或去糖基化单点突变体相比，所述突变体与重组蛋白CD47及多种癌细胞系具有更高的亲和力，在蛋白水平及细胞水平上对CD47和SIRPa结合有着更好的阻断效果；对白血球(红细胞)无凝血；在功能上，能够更有效的激活巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬。本发明提供了重组蛋白CD001及CD002的氨基酸及核苷酸序列、突变体表达载体的构建、融合蛋白的制备方法。本发明发现CD001、CD002具有更好的靶点结合活性、更优的靶点阻断效果及更强的免疫激活功能，而对红细胞无副作用，与对照(IgG1-Fc或PBS)相当。CD001、CD002与靶点CD47亲和力有着120倍的提高，与多个癌细胞的结合能力也有显著的提高，在靶点阻断效果方面有着150～300倍的提高，激活巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用(ADCP)有着显著的提高，而在白血球(红细胞)溶血方面，达到无毒副作用的效果。

本发明涉及2个重组蛋白，包含SIRPαD1接触表面氨基酸点突变组合偶联人IgG1-Fc(CD001)，以及对CD001进行去糖基化点突变(N80A)获得CD002，上述重组蛋白可以通过两种机制杀伤肿瘤细胞，一是阻断SIRPα-CD47信号达到激活巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，另一种是Fc与巨噬细胞的Fc受体结合激活巨噬细胞的免疫作用。本发明利用人胚肾细胞(293F)表达所述重组蛋白并纯化制备，发现所述突变体具有更好的靶点结合活性及巨噬细胞ADCP激活功能，而对红细胞的溶血程度更低。

本发明通过对SIRPαD1与CD47结合区域的部分表面氨基酸进行点突变获得重组蛋白CD001(I31/K53/E54/H56/S66)，或将上述突变体CD001的第80位氨基酸突变去糖基化，获得CD002(I31/K53/E54/H56/S66/N80)。

本发明在蛋白水平上研究了所述突变体与SIRPα配体CD47的亲和力，与野生型SIRPαD1-Fc(IgG1)相比亲和力有120倍的提高，与去糖基化单点突变体SIRPαD1-Fc(N80A)相比，亲和力有30倍的提高；同时在靶点阻断效果方面CD001、CD002有更强的阻断作用，同SIRPαD1-Fc(IgG1)及SIRPαD1-Fc(N80A)相比，阻断作用有150～300倍的提高；在细胞水平上研究了与表达CD47的CHO-K1稳定细胞系的亲和力，与野生型SIRPαD1-Fc(IgG1)及去糖基化单点突变体SIRPαD1-Fc(N80A)相比均具有显著的提高，与多个癌细胞(Jurkat、HL-60、PC-3、CCRF-CEM、Raji)结合能力方面亦具有显著的提高；此外，本发明研究了这些突变体对人体巨噬细胞的免疫激活能力，能够更有效的激活人源巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用(ADCP)；在体外本发明进行了红细胞凝血副作用方面的研究，CD001与CD002对红细胞不产生溶血，而H5F9-G4、SIRPα-Fc在浓度达到0.78μg/ml则产生溶血，本发明在浓度达到200μg/ml时依然无溶血副作用。

附图说明

图1是SIRPα-CD47分子作用示意图及表面接触重要氨基酸，其中图1A是CD47及SIRPα分子示意图，图1B是肿瘤细胞通过SIRPα-CD47免疫逃逸示意图，图1C是影响SIRPα-CD47相互作用的重要表面接触氨基酸；

图2是本发明CD001/CD002设计示意图；

图3是七种融合蛋白SDS-PAGE图；

图4是靶点结合活性(ELISA)；

图5是七种细胞靶点结合活性(FACS)；

图6是靶点抑制活性(ELISA)；

图7是靶点抑制活性(FACS)；

图8是FcrR结合活性(ELISA)；

图9A是人MDM分离活化后鉴定结果；图9B是几种融合蛋白对MDM的ADCP激活活性分析；

图10是几种融合蛋白对红细胞的凝血作用分析。

具体实施方式

下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。

如图1和图2所示，本发明通过对SIRPαD1与CD47结合区域的部分表面氨基酸进行组合突变获得CD001(I31/K53/E54/H56/S66)，或将上述突变体CD001的第80位氨基酸突变去糖基化获得CD002(I31/K53/E54/H56/S6/N80)。有研究推测一段短肽序列“SCAWSGVAG”可能会对SIRPαD1的活性提高有帮助，因此本发明在野生型SIRPαD1的N端加入短肽序列制备成CD003(SCAWSGVAG)作为参考研究。在氨基酸突变的选择上，本发明采取了同类氨基酸突变或氨基酸结构相近原则，如K/R、E/Q、T/S、V/I等，去糖基化突变则是将N突变为A。利用人胚肾细胞(293F)表达上述重组蛋白并纯化制备，在蛋白水平上研究了这些突变体与SIRPα的配体CD47的亲和力，与野生型SIRPαD1-Fc(IgG1)及去糖基化单点突变体SIRPαD1-Fc(N80A)进行对比具有显著的提高(最高达到120倍)，与表达CD47的CHO-K1稳定细胞系的结合能力具有显著的提高，与多个癌细胞(Jurkat、HL-60、PC-3、CCRF-CEM、Raji)结合能力具有显著的提高，同时能够更有效的激活人源巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用；在副作用方面，对红细胞的溶血可以忽略，而H5F9-G4、SIRPα-Fc在浓度达到0.78μg/ml则产生溶血，本发明在浓度达到200μg/ml时依然无凝血副作用。

本发明提供了编码上述突变体CD001、CD002、CD003的氨基酸序列、核苷酸序列、表达所述突变体的表达载体、重组蛋白的制备方式。

本发明进一步优化的技术方案是，基于SIRPαD1接触表面氨基酸点突变组合偶联IgG1-Fc获得重组蛋白CD001，对突变体CD001进行去糖基化获得重组蛋白CD002，利用293F细胞表达所述重组蛋白并纯化，与野生型SIRPαD1-Fc(IgG1)相比，这些突变体与靶点CD47具有更高的亲和力，与癌细胞系具有更高的亲和力，对红细胞溶血副作用。

本发明进一步优化的技术方案是，CD001、CD002，与野生型SIRPαD1-Fc(IgG1)相比，这些突变体对靶点CD47与SIRPα具有更强的阻断效果，阻断性能有150～300倍的提高。

本发明进一步优化的技术方案是，本发明的重组蛋白CD001(SEQ ID NO:16、SEQID NO:17)、CD002(SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19)具有更强的肿瘤杀伤活性，能够更有效的激活巨噬细胞的ADCP免疫功能，其作用机制包括两点，阻断SIRPα-CD47信号达到激活巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，另一种是Fc与巨噬细胞的Fc受体结合激活巨噬细胞的免疫作用。所述突变体可以应用于CD47过度表达的肿瘤治疗。

本发明进一步优化的技术方案是，本发明的重组蛋白CD001(SEQ ID NO:16、SEQID NO:17)、CD002(SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19)具有更低的副作用，对红细胞不产生溶血。其作用机制可能是引起红血球溶血的信号通路因表位亲和力降低而不能被激活。所述突变体具备更高的安全性。

本发明进一步优化的技术方案是，本发明的重组融合蛋白包括基于SIRPα膜外区IgV样区(SIRPαD1)接触表面氨基酸点突变组合偶联IgG1-Fc获得CD001，以及对CD001去糖基化点突变获得CD002，所述的SIRPαD1或其突变体能够与CD47结合，所述的IgG1-Fc可以与FcrR结合激活巨噬细胞的免疫作用。

本发明进一步优化的技术方案是，本发明重组蛋白中所述的信号调节蛋白SIRPα为成熟的野生型内源性人信号调节蛋白，所述的SIRPα膜外区IgV样区优选为人SIRPαD1，所述的IgG1-Fc片段优选为人IgG1-Fc片段。

本发明进一步优化的技术方案是，本发明的重组蛋白CD001与SEQ ID NO:10具有至少95％相似性的氨基酸序列；在一个实施例中，本发明的重组融合蛋白CD002与SEQ IDNO:10具有至少95％相似性的氨基酸序列；

本发明进一步优化的技术方案是，本发明提供了编码上述重组蛋白(CD001、CD002)的氨基酸序列、核苷酸序列、表达所述多个重组蛋白的表达载体、重组蛋白的制备方式。

本发明进一步优化的技术方案是，本发明提供了表达所述重组蛋白的宿主细胞。

本发明提供了重组蛋白在治疗CD47过度表达的肿瘤疾病的应用。

本发明应用于肿瘤疾患包括血液瘤及实体瘤疾患，其中血液瘤选自急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、成人T-细胞白血病、多发性骨髓瘤、混合白血病、非霍奇金淋巴瘤；实体瘤选自肺癌、膀胱癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌、***癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌。

具体实施例如下：

实施例1

本发明通过对SIRPαD1与CD47结合区域的部分表面氨基酸进行点突变获得CD001(I31/K53/E54/H56/S66)，或将上述突变体CD001的第80位氨基酸突变去糖基化获得CD002(I31/K53/E54/H56/S6/N80)。在野生型SIRPαD1的N端加入短肽序列“SCAWSGVAG”制备成CD003作为参考研究。

1.实验材料及方法

SIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc(IgG1)、SIRPαD1-Fc(IgG4)、SIRPαD1-Fc(N80A)、CD001、CD002、CD003表达载体的构建；人的SIRPα拥有两对野生型V1或V2，氨基酸序列27-504位组成成熟的V1(NP_542970.1NCBI)，V2与V1具有13个氨基酸的不同，30-504位氨基酸构成成熟的V2(CAA71403.1GeneBank)，本发明选择野生型2即V2，SIRPαD1的氨基酸序列31-148(SEQID NO:1)，突变体按照预设氨基酸进行突变，分别为CD001(I31/K53/E54/H56/S66)、CD002(I31/K53/E54/H56/S6/N80)、CD003设计为在SIRPαD1(IgG1)的N端加入SCAWSGVAG。Fc的选择上，选用人IgG1(SEQ ID NO:2)及人IgG4的Fc(S228P、SEQ ID NO:3)。所述重组蛋白氨基酸的N端加入优化信号肽进行分泌表达，将重组蛋白的氨基酸进行密码子优化，核苷酸的5’端加入Kozak序列GCCGCCACC，核苷酸两端加入pcDNA3.4的酶切位点EcoRI/HindIII，合成基因经酶切后连接到pcDNA3.4。

2.蛋白制备

将SIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc(IgG1)、SIRPαD1-Fc(IgG4)、SIRPαD1-Fc(N80A)、CD001、CD002、CD003以及阳性对照抗体H5F9-G4(SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5)表达载体经大肠杆菌扩增抽提并去内毒素，按照质粒：培养基＝1μg/ml转染Expi-293F细胞。所用转染试剂为ExpiFectamine293TransfectionKit(Theromfisher，Lot#：A14524)，转染时细胞密度为25*105cells/ml，转染后16-18h添加表达增强剂Enhancer1及Enhancer2，转染后5天收集细胞上清。

经ProteinA纯化，在4℃条件下以10000rpm/min，离心30min上清液去除细胞碎片，ProA柱子用平衡液(0.02MPB、0.15MNaCl、pH7.0)平衡10个柱体积后，以2ml/min的速度使上清液流过柱子，上样完成后使用平衡液对结合后的柱子清洗5个柱体积，加入洗脱液(0.02MPB、0.15MNaCl、pH3.0)洗脱，洗脱液滴入到加入中和液(1MTris，pH9.0)收集管中。收集到蛋白洗脱液，使用超滤管(MilliporeUFC903096)4000G超滤浓缩并置换buffer成PBS(HyCloneSH30256.01)，SDS-PAGE检测后放到-20℃保存。去内毒素，过滤除菌，SDS-PAGE纯度检测。

3.靶点结合活性(ELISA)

通过ELISA检测SIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc(IgG1)、SIRPαD1-Fc(IgG4)、SIRPαD1-Fc(N80A)、CD001、CD002、CD003、H5F9-G4与其靶点CD47的结合活性。

具体实施如下：

将hCD47-his(Cat#CD7-H5227,Lot#C56P1-737F1-FA)按照1μg/ml进行包被，包被缓冲液选择PBS(HyCloneLot:AC13298279)，100μl/孔，常温(25℃)包被16-18h，TBST洗板2次，PBS+3％BSA进行封闭，200μl/孔，常温(25℃)封闭16-18h，TBST洗板1次，扣干，37℃干燥2小时。

CD47系列抑制剂稀释：

按照330μl 100μg/ml配置SIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc(IgG1)、SIRPαD1-Fc(IgG4)、SIRPαD1-Fc(N80A)、CD001、CD002、CD003、H5F9-G4，100μg/ml为第一个梯度，进行4倍梯度稀释，例如第二个梯度是将第一个梯度80μl加入240μl PBS，依次类推，共11个梯度浓度。37℃孵育1小时。自动洗板机PBST洗板3次后，每孔加入100μl 1：20000稀释的羊抗人HRP二抗(abcamLot#：ab98624)，37℃孵育45分钟。孵育结束后自动洗板机洗板3次，最后一次洗涤完成后拿酶标板到吸水纸上扣干净残留液体。每孔加入100μl TMB显色液。避光反应3-5分钟，每孔加入50μl1％H₂SO₄终止反应。设置MD(I3X)酶标仪读取吸光值为450nm和630nm，自动读取完数值后保存数据。

4.靶点结合活性(FACS)

利用流式细胞仪(BDFACSCelestaCellAnalyzer)测定SIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc(IgG1)、SIRPαD1-Fc(IgG4)、SIRPαD1-Fc(N80A)、CD001、CD002、CD003、H5F9-G4与表达人或食蟹猴CD47的CHO-K1稳定细胞株、Jurkat、HL-60、PC-3、CCRF-CEM、Raji等癌细胞系的结合活性。

具体实施如下：

本实施例共采用2种表达CD47的稳定细胞株(CHO-K1-Cyno-CD47/CHO-K1-Human-CD47)及5种癌细胞系，CHO-K1-Cyno-CD47/CHO-K1-Human-CD47源自南京金斯瑞生物技术有限公司，Jurkat(

TIB-152^TM)属于T淋巴细胞白血病细胞，HL-60(

CCL-240^TM)属于人早幼粒白血病细胞，PC-3(上海中国科学院细胞库)属于人***癌细胞，CCRF-CEM(上海中国科学院细胞库)属于人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞，Raji(上海中国科学院细胞库)属于人淋巴瘤细胞。

分别将所列细胞进行消化后(悬浮细胞无需消化)，室温进行离心处理，1000rpm，5mins，弃上清，经PBS洗涤后，PBS重悬于细胞流式管中，细胞浓度调整为1*10⁶cells/ml。每管PBS体积为250μL，重组蛋白或抗体的反应浓度为3个梯度，1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml，调整蛋白或抗体浓度后每管加入相应的蛋白250μL；室温孵育1h后，PBS洗涤3次(1500rpm，5mins)；每管样品加入100μL二抗GoatAnti-humanIgG/Alexa647(BiossLot:AE041526)，室温避光孵育30mins后，加入1mLPBS洗涤3次(1500rpm，5mins)；每管加入500μLPBS重悬细胞，上机检测。

5.靶点抑制活性(ELISA)

利用Biotin标记SIRPα-Fc(Cat#4546-SA-050，R&DSystem)，CD47(Acro,CD7-H5227-1mg,Histag)按照1μg/ml100μl/孔在PBS缓冲液条件下包被，分别与不同浓度的待测样品一起混合，加入到预包被CD47抗原的96孔板中，37℃孵育45分钟。孵育结束后自动洗板机洗板5次，最后一次洗涤完成后用酶标板到吸水纸上扣干净残留液体。每孔加入100μlStreptavidin-HRP，37℃孵育45分钟。孵育结束后自动洗板机洗板5次，最后一次洗涤完成后用酶标板到吸水纸上扣干净残留液体。每孔加入100μlTMB显色液。避光反应3-5分钟，每孔加入50μl 1％H₂SO₄终止反应。设置MD(I3X)酶标仪读取吸光值为450nm和630nm，自动读取完数值后保存数据。

其中待测样品包括SIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc(IgG1)、SIRPαD1-Fc(IgG4)、SIRPαD1-Fc(N80A)、CD001、CD002、CD003、H5F9-G4、B6H12(SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:7)、Human-IgG1，起始浓度10μg/ml，3倍梯度稀释，共12个浓度梯度。

6.靶点抑制活性(FACS)

将Jurkat细胞进行室温离心处理，1000rpm，5mins，弃上清，经PBS洗涤后，PBS重悬于细胞流式管中，细胞浓度调整为1*10⁷cells/ml。利用Biotin标记SIRPα-Fc(Cat#4546-SA-050，R&DSystem)，分别与不同浓度的待测样品一起混合加入到Jurkat细胞中(2.5×10⁵cells/reaction)。每个反应体系为250μL，重组蛋白或抗体的反应浓度为10个梯度，起始浓度300nM，3倍梯度稀释。

4℃孵育1h后，PBS洗涤3次(1500rpm，5mins)；每管样品加入100μL二抗Anti-SAiFlour647(genscript，3μg/mL)，4℃避光孵育30mins后，加入1mLPBS洗涤3次(1500rpm，5mins)；每管加入500μLPBS重悬细胞，上机检测。

其中待测样品包括SIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc(IgG1)、SIRPαD1-Fc(IgG4)、SIRPαD1-Fc(N80A)、CD001、CD002、CD003、H5F9-G4、Human-IgG1。

7.FcγR结合活性

用PBS分别包被FcrRI,FcrRIIa,FcrRIIb,FcrRIIIa(1μg/ml，100μl/孔)，Streptavidin-HRP标记待测样品，采用间接ELISA检测各待测物与FcrRI，FcrRIIa，FcrRIIb，FcrRIIIa的结合活性；

待测样品分别加入到预包被FcrRI，FcrRIIa，FcrRIIb，FcrRIIIa的96孔板中，37℃孵育45分钟。孵育结束后自动洗板机洗板5次，最后一次洗涤完成后用酶标板到吸水纸上扣干净残留液体。每孔加入100μlTMB显色液。避光反应3-5分钟，每孔加入50μl 1％H₂SO₄终止反应。设置MD(I3X)酶标仪读取吸光值为450nm和630nm，自动读取完数值后保存数据。

待测样品包括SIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc(IgG1)、SIRPαD1-Fc(IgG4)、SIRPαD1-Fc(N80A)、CD001、CD002、CD003、H5F9-G4、B6H12、Human-IgG1，起始浓度10μg/ml，3倍梯度稀释，共12个浓度梯度。

8.体外功能检测(激活巨噬细胞吞噬实验ADCP)

效应细胞MDM分离诱导：抽取20个人的静脉血液分离PBMC，分离单核细胞，加入M-CSF诱导分化MDM，2周后通过CD11b、CD14、CD45、CD163、CD206生物标志物进行鉴定分化的巨噬细胞MDM；

ADCP：从培养箱中取出靶细胞HL-60，将细胞收集到15ml离心管，离心，弃去上清，用PBS重悬细胞，计数，用PKH26(SIGMA-ALDRICH)染靶细胞，放置37℃&5％CO₂培养过夜；次日将靶细胞从培养基中取出，离心收集细胞，弃上清，使用完全培养基重悬，计数；取靶细胞，加入完全培养基，将细胞和待测样品加入到对应的96孔板中，10000cells/孔；室温孵育0.5h；从培养基中拿出效应细胞(MDM)，收集上清，加PBS清洗，加Accutase消化MDM，让其脱壁，加入相同体积的完全培养基终止消化，将细胞悬液转移到离心管中，将细胞上清和消化下来的细胞按照300g离心10min；取相应体积的MDM细胞，加入完全培养基，将MDM细胞加入到对应靶细胞的96孔板中。效应细胞：靶细胞＝5:1，37℃孵育1h；

加Accutase，显微镜下观察贴壁的细胞是否消化下来(约15min)，取出细胞，将细胞转移到另一块板中，待消化完全将移出的细胞悬液重新加入对应孔中；离心，加入检测抗体CD11b，4℃孵育15min；加PBS到每孔，离心，弃去上清，加PBS重悬；流式细胞仪检测；

数据分析：％PhagocytosisbyMDMs＝{(PKH26+&CD11b+cells)/AllPKH26+cells}×100％。

待测样品包括SIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc(IgG1)、SIRPαD1-Fc(IgG4)、SIRPαD1-Fc(N80A)、CD001、CD002、CD003、H5F9-G4、B6H12、Human-IgG1、Human-IgG4、anti-SIRPaAb，起始浓度10μg/ml，5倍梯度稀释，共7个浓度梯度。每个浓度下的样品进行双孔重复。

9.红细胞凝集实验(Hemagglutinationactivity)

利用来自健康人的红细胞测定SIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc(IgG1)、SIRPαD1-Fc(IgG4)、SIRPαD1-Fc(N80A)、CD001、CD002、CD003、H5F9-G4对血球的凝集活性。

具体实施如下：

使用柠檬酸钠等抗凝血剂收集全血；将全血置于15ml离心管，PBS补足至15ml，室温离心，200×g，10mins，弃上清；用PBS将RBCs补足至15mL，混匀后，室温离心，1500rpm，5mins。洗涤3次；最后一次洗涤后，使用PBS调节RBCs浓度为2％(如在1ml的RBCs中加入49ml的PBS；将重组蛋白及阳性抗体按照200μg/ml进行2倍梯度稀释，共计15个浓度梯度；使用96孔圆底板，每孔加入50μl相应浓度的重组蛋白或单抗与50μl的RBCs，室温孵育2h后观察并记录反应结果。

实验结果：

1.表达载体的构建

按照选定设计的SIRPa、SIRPαD1、SIRPαD1突变体及Fc构成的重组蛋白将其优化后的核苷酸序列经EcoRI/HindIII酶切后构建至pcDNA3.4载体上，构建后的表达载体进行目的基因测序。

各融合蛋白的氨基酸及核苷酸构成如下：

SIRPα-Fc共有1722个核苷酸(SEQ ID NO.9)，编码574个氨基酸(SEQ ID NO.:8)；SIRPαD1-Fc(IgG1)共有1035个核苷酸(SEQ ID NO:11)，编码345个氨基酸(SEQ ID NO:10)；SIRPαD1-Fc(IgG4)共有1041个核苷酸(SEQ ID NO:13)，编码347个氨基酸(SEQ ID NO:12)；SIRPαD1-Fc(N80A)共有1122个核苷酸(SEQ ID NO:15)，编码374个氨基酸(SEQ ID NO:14)；CD001共有1035个核苷酸(SEQ ID NO:17)，编码345个氨基酸(SEQ ID NO:16)；CD002共有1035个核苷酸(SEQ ID NO:19)，编码345个氨基酸(SEQ ID NO:18)；CD003共有1062个核苷酸(SEQ ID NO:21)，编码354个氨基酸(SEQ ID NO:20)；

2.蛋白制备

所表达的重组蛋白理论分子量如下：

SIRPα-Fc～127.2Kd、SIRPαD1-Fc(IgG4)～76.7Kd、SIRPαD1-Fc(IgG4)～80.4Kd、SIRPαD1-Fc(N80A)～82.2Kd、CD001～76.7Kd、CD002～76.7Kd、CD003～78.3Kd。上述蛋白经293F细胞表达并纯化后经SDS-PAGE鉴定，如图3所示，总体上实际分子量接近理论分子量，同时本发明也同R&D及ACRO表达制备的SIRPa-Fc进行了比对，SDS检测分子量一致。同时本发明所涉及的突变体重组蛋白并没有因部分氨基酸的改变影响在宿主细胞中的表达。

3.靶点结合活性(ELISA)

通过ELISA分析所述突变体重组蛋白与其靶点CD47的结合活性，结果如图4所示。我们发现SIRPaD1-Fc的亲和力优于SIRPa-Fc，而SIRPaD1去糖基化突变体SIRPαD1-Fc(N80A)亲和力优于野生型SIRPaD1-Fc，即靶点结合活性SIRPαD1-Fc(N80A)>SIRPaD1-Fc>SIRPa-Fc，与专利CN201510203619.7所述一致。而对部分接触表面氨基酸突变体CD001或表面氨基酸结合去糖基化突变体CD002均能显著的提高同靶点CD47的结合活力。CD001/CD002与野生型相比亲和力有120倍的提高，且CD001/CD002与SIRPαD1-Fc(N80A)相比亲和力有10～30倍的提高，另外CD001/CD002与H5F9-G4靶点亲和力相比有5倍的提高。此外，在野生型N端加入“SCAWSGVAG”(CD003)也能够一定程度的提高靶点亲和力，与野生型相比靶点亲和力有15倍左右的提高。

总体而言CD47的靶点结合活性：

(CD001/CD002)>CD003>SIRPαD1-Fc(N80A)>SIRPaD1-Fc>SIRPa-Fc

4.靶点结合活性(FACS)

我们利用流式细胞仪测定了SIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc(IgG1)、SIRPαD1-Fc(IgG4)、SIRPαD1-Fc(N80A)、CD001、CD002、CD003、H5F9-G4与表达人或食蟹猴CD47的CHO-K1稳定细胞株、Jurkat、HL-60、PC-3、CCRF-CEM、Raji等癌细胞系的结合活性。结果如图5。

结果显示CD001/CD002与所测定的细胞株的亲和力均显著高于SIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc(IgG1)、SIRPαD1-Fc(IgG4)、SIRPαD1-Fc(N80A)与所测定的细胞株的亲和力，且与CD47抗体H5F9-G4相比，亲和力或提高或持平。而CD003与所测定的细胞株的亲和力同SIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc(IgG1)、SIRPαD1-Fc(IgG4)、SIRPαD1-Fc(N80A)相比没有明显的改变。

上述结果表明SIRPaD1接触表面氨基酸突变体CD001及在此基础上进一步去糖基化突变体CD002都能够显著的提高其同癌细胞结合活性的提高。而单纯的野生型去糖基化突变体SIRPαD1-Fc(N80A)不能有效的改善同靶细胞的结合活性；在野生型N端添加短肽序列“SCAWSGVAG”获得的突变体CD003亦不能改善同靶细胞的结合活性。

5.靶点抑制活性

本发明利用Biotin标记SIRPa-Fc(Cat#4546-SA-050，R&DSystem)，检测了包括SIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc(IgG1)、SIRPαD1-Fc(IgG4)、SIRPαD1-Fc(N80A)、CD001、CD002、CD003、H5F9-G4、B6H12等11个待测样品对SIRPa和CD47结合的阻断效果。结果如图6所示。

结果发现与SIRPαD1-Fc(IgG1)、SIRPαD1-Fc(N80A)相比CD001、CD002有着更强的靶点阻断作用，同SIRPαD1-Fc(IgG1)相比，阻断作用有150～300倍的提高。去糖基化单点突变体SIRPαD1-Fc(N80A)的靶点结合抑制活性与SIRPαD1-Fc(IgG1)相比略有提高，CD003的靶点结合抑制活性下降显著。

总体表明去糖基化突变体SIRPαD1-Fc(N80A)或者N端加上短肽序列CD003并不能改善蛋白水平的靶点抑制活性。而接触表面氨基酸突变体CD001能够有效的增强靶点结合抑制活性，在此基础上进行的N80A突变体CD002能够进一步增强靶点结合抑制活性。

6.靶点抑制活性(FACS)

本发明利用Biotin标记SIRPa-Fc(Cat#4546-SA-050，R&DSystem)，检测了包括SIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc(IgG1)、SIRPαD1-Fc(IgG4)、SIRPαD1-Fc(N80A)、CD001、CD002、CD003、H5F9-G4等10个待测样品对SIRPa和Jurkat细胞结合的阻断效果。结果如图7。结果发现与SIRPαD1-Fc(IgG1)相比CD001、CD002有着更强的阻断作用，阻断作用有40～80倍的提升。而去糖基化单点突变体SIRPαD1-Fc(N80A)的细胞结合抑制活性略有下降，CD003的细胞结合抑制活性没有改变。

总体表明去糖基化突变体SIRPαD1-Fc(N80A)或者N端加上短肽序列CD003并不能改善细胞水平的靶点抑制活性。而接触表面氨基酸突变体CD001(重组蛋白)能够有效的增强细胞结合抑制活性，在此基础上进行的N80A突变体CD002(重组蛋白)能够进一步增强细胞结合抑制活性。

7.FcγR结合活性

本发明验证了所选用的Fc(IgG1)与Fc受体FcrRI，FcrRIIa，FcrRIIb，FcrRIIIa的结合活性，结果如图8。表明同SIRPαD1-Fc(IgG1)来源的Fc并无显著差异，推测对于通过Fc受体激活的ADCP及ADCC或CDC的作用不会产生显著差异。

8.体外功能检测

为分析CD001/CD002对激活巨噬细胞的ADCP活性，本发明从20个健康人的PBMC中分离并诱导扩增MDM，经多个生物标志物进行确认所分离诱导的MDM。

进一步，本发明对突变体融合蛋白的ADCP激活活性进行了实验分析，在此次实验中，本发明的阳性对照采用了多种CD47抑制剂，包括CD47的抗体B6H12、H5F9-G4，SIRPa相关的融合蛋白SIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc(IgG1)、SIRPαD1-Fc(IgG4)、SIRPαD1-Fc(N80A)，以及SIRPa的一株单抗，每个待测样品采用了7个梯度双份重复。

MDM生物标志物检测结果表明从人血中分离活化的MDM检测标志物阳性，符合实验要求，如图9A和图9B所示。

在ADCP的激活作用中(如图10所示)，CD001、CD002显著强于SIRPa-Fc、SIRPαD1-Fc(IgG1)、SIRPαD1-Fc(IgG4)以及去糖基化单点突变体SIRPαD1-Fc(N80A)，其中CD002最为显著，无论是与对照抗体或对照融合蛋白相比，对MDM的ADCP活性至少提高20％。另外，去糖基化单点突变体SIRPαD1-Fc(N80A)以及CD003相较于SIRPαD1-Fc(IgG1)，ADCP的激活活性没有提高，表明去糖基化单点突变体SIRPαD1-Fc(N80A)或者N端加上短肽序列CD003并不能改善ADCP激活活性。而接触表面氨基酸突变CD001能够有效的增强ADCP活性，在此基础上进行的N80A突变CD002能够进一步增强ADCP活性。同时SIRPαD1-Fc(IgG4)的ADCP活性低于其他的融合蛋白，表明SIRPαD1和Fc的受体活性共同作用能够最大化激活巨噬细胞ADCP的活性。

9.红细胞凝集实验(Hemagglutinationactivity)

本发明检测了SIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc(IgG1)、SIRPαD1-Fc(IgG4)、SIRPαD1-Fc(N80A)、CD001、CD002、CD003、H5F9-G4同健康人血的红细胞凝集。

结果显示SIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc(IgG4)、H5F9-G4都会产生不同程度的红细胞溶血(依据蛋白浓度不同溶血程度不同)，而CD001、CD002在浓度达到200μg/ml的时候结果同阴性对照一致未出现溶血，此外我们用三份健康人新鲜血重复的结果一致。表明CD001、CD002的安全性优于SIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc(IgG4)、H5F9-G4，同SIRPαD1-Fc(IgG1)相当。

结论分析：

1.结论：

本发明通过对SIRPαD1的接触表面氨基酸进行突变获得CD001，以及对CD001进行N80A突变获得CD002，以期提高其靶点结合活性并同时降低红细胞凝血造成的副作用。同时我们将抗体H5F9-G4、B6H12、重组融合蛋白SIRPαD1-Fc(IgG1)、SIRPαD1-Fc(IgG4)、SIRPαD1-Fc(N80A)作为研究参照。

研究发现CD001/CD002不论与CD47重组蛋白还是同多种细胞系(2株表达CD47稳定细胞株及5种癌细胞系)的结合活性均显著高于SIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc(IgG1)、SIRPαD1-Fc(IgG4)、SIRPαD1-Fc(N80A)同CD47重组蛋白或多种癌细胞系的结合活性，CD003同CD47重组蛋白亲和力有一定的提高，但是与靶细胞的结合没有很显著的改善；

在CD47与其配体SIRPa的结合抑制方面(IC50)，CD001/CD002具有更优的效果，与SIRPαD1-Fc(IgG1)相比有150～300倍的提高，去糖基化单点突变体SIRPαD1-Fc(N80A)与SIRPαD1-Fc(IgG1)相比在靶点结合抑制方面没有显著的改善；

在免疫功能激活方面，CD001/CD002能够更显著的激活人源巨噬细胞(MDM)对癌细胞的吞噬作用；其中CD002最为显著，无论是与对照抗体或对照融合蛋白相比，对MDM的ADCP活性至少提高20％。另外，去糖基化单点突变体SIRPαD1-Fc(N80A)以及CD003相较于SIRPαD1-Fc(IgG1)，ADCP的激活活性没有提高，表明去糖基化单点突变体SIRPαD1-Fc(N80A)或者N端加上短肽序列CD003并不能改善ADCP激活活性。而接触表面氨基酸突变CD001能够有效的增强ADCP活性，在此基础上进行的N80A突变CD002能够进一步增强ADCP活性。同时SIRPαD1-Fc(IgG4)的ADCP活性低于其他的融合蛋白，表明SIRPαD1和Fc的受体活性共同作用能够最大化激活巨噬细胞ADCP的活性。

在安全性方面，CD001/CD002/CD003与SIRPαD1-Fc(IgG1)在浓度达到200μg/ml时均没有造成红细胞溶血，而H5F9-G4、SIRPα-Fc在浓度达到0.78μg/ml则产生溶血；灵长类动物试验(LiuJ,WangL,ZhaoF,TsengS,NarayananC,ShuraL,etal.(2015))的研究发现血液中CD47抑制剂的有效浓度需要在50～150μg/ml，因此CD001/CD002/CD003及SIRPαD1-Fc(IgG1)作为CD47抑制剂具有更高的安全性。

本发明基于所述实施例能够进一步阐述本发明内容，但不限于实施例，且实施例不是限制本发明的保护范围。本领域技术人员可以基于本发明在权利要求范围内进行各种修改、替换及等同都被包括在本发明中。

序列表

<110> 倍而达药业（苏州）有限公司

<120> 一种基于SIRP-αD1突变体制备的重组蛋白及应用

<130> 20180704

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser

100 105 110

Val Arg Ala Lys Pro Ser

115

<210> 2

<211> 227

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 3

<211> 229

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 4

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 6

<211> 118

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asp Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Gly Phe Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 8

<211> 574

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser

100 105 110

Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg

115 120 125

Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe

130 135 140

Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu

145 150 155 160

Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr

165 170 175

Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His

180 185 190

Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro

195 200 205

Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr

210 215 220

Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val

225 230 235 240

Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp

245 250 255

Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr

260 265 270

Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn

275 280 285

Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His

290 295 300

Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala

305 310 315 320

His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser

325 330 335

Asn Glu Arg Asn Glu Phe Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

340 345 350

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

355 360 365

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

370 375 380

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

385 390 395 400

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

405 410 415

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

420 425 430

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

435 440 445

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

450 455 460

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

465 470 475 480

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

485 490 495

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

500 505 510

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

515 520 525

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

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Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

545 550 555 560

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

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<210> 9

<211> 1722

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

gaagaggagc tgcaggtcat ccagcccgac aagtctgtgt ccgtggcagc aggagaaagc 60

gctatcctgc attgcaccgt gaccagcctg attcccgtgg gaccaatcca gtggttcaga 120

ggagccggac cagccagaga gctgatctac aaccagaagg agggccactt ccccagagtg 180

acaacagtgt ccgagagcac caagcgggag aacatggact tcagcatcag catcagcaac 240

atcacaccag ccgacgccgg cacatactat tgcgtgaagt tccggaaggg cagcccagat 300

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agcgacttcc agaccaacgt ggacccagtg ggagagagcg tgtcctacag catccactcc 540

accgccaagg tggtgctgac aagagaggac gtgcacagcc aggtcatttg cgaggtggca 600

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aacgtgtcta gaaccgagac cgcctctacc gtgaccgaga acaaggacgg cacctacaat 840

tggatgtctt ggctgctggt gaacgtgtcc gcccataggg acgacgtgaa gctgacttgc 900

caggtggaac acgacggaca gcctgctgtg tctaagagcc acgacctgaa ggtgtccgcc 960

catcctaagg agcagggatc taataccgcc gccgagaaca ccggaagcaa cgagcggaac 1020

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ctgctgggag gccctagcgt gtttctgttc cctcccaagc ccaaggacac cctgatgatc 1140

agcaggaccc cagaagtgac ttgcgtggtg gtggacgtgt ctcacgagga tcccgaggtc 1200

aagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggag gtgcacaacg ctaagaccaa gcccagggag 1260

gagcagtaca acagcaccta ccgggtggtg tccgtgctga cagtgctgca ccaggattgg 1320

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aagaccatca gcaaggccaa gggccagcct agagagcctc aggtgtacac actgcctcct 1440

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acccctccag tgctggatag cgacggctct ttcttcctgt acagcaagct gaccgtggac 1620

aagagcaggt ggcagcaggg caacgtgttc tcttgcagcg tgatgcacga ggccctgcat 1680

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<210> 10

<211> 345

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu

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Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser

100 105 110

Val Arg Ala Lys Pro Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

115 120 125

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

130 135 140

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

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Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

165 170 175

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

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Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

195 200 205

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

210 215 220

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

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Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

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Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

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Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

275 280 285

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Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

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Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

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<210> 11

<211> 1035

<212> DNA

<213> Homo sapiens

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gaagaggagc tgcaggtcat ccagcccgac aagtctgtgt ccgtggcagc aggagaaagc 60

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<210> 12

<211> 347

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser

100 105 110

Val Arg Ala Lys Pro Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

115 120 125

Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

130 135 140

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

145 150 155 160

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

165 170 175

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

180 185 190

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

195 200 205

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

210 215 220

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

225 230 235 240

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

245 250 255

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

260 265 270

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

275 280 285

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

290 295 300

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

305 310 315 320

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

325 330 335

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

340 345

<210> 13

<211> 1041

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13

gaagaggagc tgcaggtcat ccagcccgac aagtctgtgt ccgtggcagc aggagaaagc 60

gctatcctgc attgcaccgt gaccagcctg attcccgtgg gaccaatcca gtggttcaga 120

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atcacaccag ccgacgccgg cacatactat tgcgtgaagt tccggaaggg cagcccagat 300

accgagttca agagcggagc cggaacagag ctgagcgtga gagccaagcc tagcgagagc 360

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tttctgtttc ctcccaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc agaagtgact 480

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tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcctagc agcatcgaga agaccatcag caaggccaag 720

ggccagccta gagagcctca ggtgtacacc ctgcctccta gccaggagga gatgaccaag 780

aaccaggtgt ccctgacttg cctcgtgaag ggattctacc ccagcgacat cgcagtcgag 840

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<210> 14

<211> 374

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile

1 5 10 15

Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu

20 25 30

His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe

35 40 45

Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly

50 55 60

His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn

65 70 75 80

Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Ala Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly

85 90 95

Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe

100 105 110

Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala

115 120 125

Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala Thr Pro Gln His Glu Pro

130 135 140

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

145 150 155 160

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

165 170 175

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

180 185 190

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

195 200 205

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

210 215 220

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

225 230 235 240

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

245 250 255

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

260 265 270

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

275 280 285

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

290 295 300

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

305 310 315 320

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

325 330 335

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

340 345 350

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

355 360 365

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370

<210> 15

<211> 1122

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 15

tcttgcgctt ggagcggagt ggcaggagaa gaagagctgc aggtcatcca gcccgacaaa 60

agcgtgagcg tggcagccgg agaaagcgct attctgcatt gcaccgtgac cagcctgatc 120

ccagtgggac caatccagtg gttcagagga gccggaccag ccagggagct gatctacaac 180

cagaaggagg gccacttccc cagagtgacc acagtgtccg agagcaccaa gcgggagaac 240

atggacttca gcatcagcat cagcgccatc accccagcag acgccggcac atactattgc 300

gtgaagttcc ggaagggcag cccagatacc gagtttaaga gcggcgccgg aacagagctg 360

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cagcacgagc ccaagtcttg cgacaagacc cacacttgcc ctccttgtcc agccccagaa 480

ctgctgggag gccctagcgt gtttctgttc cctcccaagc ccaaggacac cctgatgatc 540

agcaggaccc cagaagtgac ttgcgtggtg gtggacgtgt ctcacgagga tcccgaggtc 600

aagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggag gtgcacaacg ctaagaccaa gcccagggag 660

gagcagtaca acagcaccta ccgggtggtg tccgtgctga cagtgctgca ccaggattgg 720

ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtg tccaacaagg ccctgccagc ccctatcgag 780

aagaccatca gcaaggccaa gggccagcct agagagcctc aggtgtacac actgcctcct 840

agcagggacg agctgaccaa gaaccaggtg tccctgactt gcctcgtgaa gggcttctac 900

cccagcgata tcgccgtgga gtgggagtct aatggccagc ccgagaacaa ctacaagacc 960

acccctccag tgctggatag cgacggctct ttcttcctgt acagcaagct gaccgtggac 1020

aagagcaggt ggcagcaggg caacgtgttc tcttgcagcg tgatgcacga ggccctgcat 1080

aaccactaca cccagaagag cctgagcctg agcccaggca ag 1122

<210> 16

<211> 345

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Phe Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn

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85 90 95

Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser

100 105 110

Val Arg Ala Lys Pro Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

115 120 125

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

130 135 140

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

145 150 155 160

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

165 170 175

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

180 185 190

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

195 200 205

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

210 215 220

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

225 230 235 240

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

245 250 255

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

260 265 270

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

275 280 285

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

290 295 300

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

305 310 315 320

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

325 330 335

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

340 345

<210> 17

<211> 1035

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 17

gaagaggagc tgcaggtcat ccagcccgac aagtctgtgt ccgtggcagc aggagaaagc 60

gctatcctgc attgcaccgt gaccagcctg tttcccgtgg gaccaatcca gtggttcaga 120

ggagccggac cagccagaga gctgatctac aaccagaggc agggcccttt ccctagagtg 180

acaaccgtgt ccgagaccac caagagggag aacatggact tcagcatcag catcagcaac 240

atcacaccag ccgacgccgg cacatactat tgcgtgaagt tccggaaggg cagcccagat 300

accgagttca agagcggagc cggaacagag ctgagcgtga gagccaagcc tagcgacaag 360

acccacacct gtcctccttg tccagcccca gaactgctgg gaggaccaag cgtgttcctg 420

ttccctccca agcccaagga caccctgatg atcagcagga ccccagaagt gacttgcgtg 480

gtggtggacg tgtctcacga ggatcccgaa gtgaagttca attggtacgt ggacggcgtg 540

gaggtgcaca acgctaagac caagcccagg gaggagcagt acaacagcac ctaccgggtg 600

gtgtccgtgc tgacagtgct gcaccaggat tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 660

gtgtccaata aggccctgcc agcccctatc gagaagacca tcagcaaggc caagggccag 720

cctagagagc ctcaggtgta caccctgcct cctagcaggg acgagctgac caagaaccag 780

gtgtccctga cttgcctcgt gaagggcttc taccccagcg atattgccgt cgagtgggag 840

tctaacggcc agcccgagaa caactacaag accacacctc cagtgctgga tagcgacggc 900

agcttcttcc tgtacagcaa gctgaccgtg gacaaaagcc gctggcagca gggcaacgtg 960

ttttcttgca gcgtgatgca cgaagccctg cacaaccact acacccagaa gagcctgagc 1020

ctgtctccag gcaag 1035

<210> 18

<211> 345

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Phe Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Ala

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser

100 105 110

Val Arg Ala Lys Pro Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

115 120 125

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

130 135 140

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

145 150 155 160

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

165 170 175

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

180 185 190

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

195 200 205

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

210 215 220

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

225 230 235 240

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

245 250 255

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

260 265 270

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

275 280 285

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

290 295 300

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

305 310 315 320

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

325 330 335

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

340 345

<210> 19

<211> 1035

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 19

gaagaggagc tgcaggtcat ccagcccgac aagtctgtgt ccgtggcagc aggagaaagc 60

gctatcctgc attgcaccgt gaccagcctg tttcccgtgg gaccaatcca gtggttcaga 120

ggagccggac cagccagaga gctgatctac aaccagaggc agggcccttt ccctagagtg 180

acaaccgtgt ccgagaccac caagagggag aacatggact tcagcatcag catcagcgcc 240

atcacaccag ccgacgccgg cacatactat tgcgtgaagt tccggaaggg cagcccagat 300

accgagttca agagcggagc cggaacagag ctgagcgtga gagccaagcc tagcgacaag 360

acccacacct gtcctccttg tccagcccca gaactgctgg gaggaccaag cgtgttcctg 420

ttccctccca agcccaagga caccctgatg atcagcagga ccccagaagt gacttgcgtg 480

gtggtggacg tgtctcacga ggatcccgaa gtgaagttca attggtacgt ggacggcgtg 540

gaggtgcaca acgctaagac caagcccagg gaggagcagt acaacagcac ctaccgggtg 600

gtgtccgtgc tgacagtgct gcaccaggat tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 660

gtgtccaata aggccctgcc agcccctatc gagaagacca tcagcaaggc caagggccag 720

cctagagagc ctcaggtgta caccctgcct cctagcaggg acgagctgac caagaaccag 780

gtgtccctga cttgcctcgt gaagggcttc taccccagcg atattgccgt cgagtgggag 840

tctaacggcc agcccgagaa caactacaag accacacctc cagtgctgga tagcgacggc 900

agcttcttcc tgtacagcaa gctgaccgtg gacaaaagcc gctggcagca gggcaacgtg 960

ttttcttgca gcgtgatgca cgaagccctg cacaaccact acacccagaa gagcctgagc 1020

ctgtctccag gcaag 1035

<210> 20

<211> 354

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile

1 5 10 15

Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu

20 25 30

His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe

35 40 45

Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly

50 55 60

His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn

65 70 75 80

Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly

85 90 95

Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe

100 105 110

Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Asp

115 120 125

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

130 135 140

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

145 150 155 160

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

165 170 175

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

180 185 190

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

195 200 205

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

210 215 220

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

225 230 235 240

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

245 250 255

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

260 265 270

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

275 280 285

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

290 295 300

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

305 310 315 320

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

325 330 335

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

340 345 350

Gly Lys

<210> 21

<211> 1062

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 21

tcttgcgctt ggagcggagt ggcaggagaa gaagagctgc aggtcatcca gcccgacaaa 60

agcgtgagcg tggcagccgg agaaagcgct attctgcatt gcaccgtgac cagcctgatc 120

ccagtgggac caatccagtg gttcagagga gccggaccag ccagggagct gatctacaac 180

cagaaggagg gccacttccc cagagtgacc acagtgtccg agagcaccaa gcgggagaac 240

atggacttca gcatcagcat cagcaacatc accccagcag acgccggcac atactattgc 300

gtgaagttcc ggaagggcag cccagatacc gagtttaaga gcggcgccgg aaccgaactg 360

agcgtgagag ctaagcccag cgacaagacc cacacttgcc ctccttgtcc agccccagaa 420

ctgctgggag gccctagcgt gtttctgttc cctcccaagc ccaaggacac cctgatgatc 480

agcaggaccc cagaagtgac ttgcgtggtg gtggacgtgt ctcacgagga tcccgaggtc 540

aagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggag gtgcacaacg ctaagaccaa gcccagggag 600

gagcagtaca acagcaccta ccgggtggtg tccgtgctga cagtgctgca ccaggattgg 660

ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtg tccaacaagg ccctgccagc ccctatcgag 720

aagaccatca gcaaggccaa gggccagcct agagagcctc aggtgtacac actgcctcct 780

agcagggacg agctgaccaa gaaccaggtg tccctgactt gcctcgtgaa gggcttctac 840

cccagcgata tcgccgtgga gtgggagtct aatggccagc ccgagaacaa ctacaagacc 900

acccctccag tgctggatag cgacggctct ttcttcctgt acagcaagct gaccgtggac 960

aagagcaggt ggcagcaggg caacgtgttc tcttgcagcg tgatgcacga ggccctgcat 1020

aaccactaca cccagaagag cctgagcctg agcccaggca ag 1062

Claims

1.一种重组蛋白，包括对成熟的野生型人信号调节蛋白SIRPα膜外端IgV区接触表面氨基酸进行多点突变获得的突变体I以及与突变体I连接的免疫球蛋白Fc区域，然后偶联人IgG1-Fc进行融合表达获得重组蛋白CD001；或者在突变体I的基础上对第80位氨基酸天冬酰胺进行突变获得的突变体II以及与突变体II连接的免疫球蛋白Fc区域，然后偶联人IgG1-Fc进行融合表达获得重组蛋白CD002；编码CD001的基因的核苷酸序列如序列表中SEQID NO:17所示，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:16所示；编码CD002的基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:19所示，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:18所示。

2.根据权利要求1所述的重组蛋白在制备治疗CD47过度表达的肿瘤疾患的药物中的应用，所述肿瘤疾患选自血液瘤、实体瘤疾患中的至少一种，血液瘤为急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、成人T-细胞白血病、多发性骨髓瘤、混合白血病、非霍奇金淋巴瘤中的至少一种；实体瘤为肺癌、膀胱癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌、***癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌中的至少一种。