CN114805592A - 一种三特异性抗体的设计、制备及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种三特异性抗体的设计及其制备方法和用途，本发明三特异性抗体包含(a)anti‑Her2单克隆抗体Herceptin，(b)anti‑CD16a(FcgRIIIa)单链抗体scFv，(c)SIRPa D1蛋白，(d)柔性连接子；抗体Herceptin重链C端通过连接子连接anti‑CD16a单链抗体，抗体Herceptin轻链C端通过连接子连接SIRPa D1；对抗体Fc段进行改造，以改变其与受体的结合能力，同时延长蛋白的半衰期；通过SIRPa D1和CD47配体结合可靶向表达CD47的肿瘤细胞；同时可以阻断“别吃我(don’t eat me)”信号而激活巨噬细胞吞噬肿瘤细胞；通过anti‑CD16a特异性结合NK(Nature Killing)细胞；因此通过SIRPa和anti‑CD16a招募肿瘤微环境的巨噬细胞和NK细胞杀伤肿瘤细胞；本发明保证了anti‑CD16a的特异性，不会引起由于结合中性粒细胞表面的CD16b而引起的副作用(中性粒细胞减少，Neutropenia)。

Description

一种三特异性抗体的设计、制备及用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种三特异性抗体的设计、制备及用途。
背景技术
随着肿瘤学与免疫学的不断发展与深入，肿瘤免疫治疗已成为抗肿瘤领域最前沿的治疗手段。现阶段，国内外肿瘤免疫治疗的主要研究方向是免疫检查点抑制剂。CD47一直被行业认为是继PD-1/PD-L1之后，肿瘤免疫领域最重要的靶点，目前全球各地已有无数以CD47为靶点的候选药物处于临床前及临床开发阶段，但目前仍无获批的抗CD47疗法。
CD47广泛表达于多种癌细胞表面，但在红细胞表面也广泛表达，以保护自身不被吞噬。这意味着靶向CD47药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也不可避免会误伤红细胞，从而造成红细胞和血小板数量下降导致严重的贫血反应。
本发明是针对Her2、CD47和CD16a的三特异性抗体。Herceptin已成为Her2阳性肿瘤如乳腺癌的标准疗法；CD47-SIRPa“Don’t eat me”通路已被充分证明是有显著临床疗效的靶标；CD16a在NK细胞表面表达。本发明的作用机制包括但不限于以下三个：(1)可以将Her2和CD47双阳性的肿瘤拉到和NK细胞一起，由NK细胞释放Perporin(穿孔素)损伤肿瘤细胞膜后形成通道使NK细胞大量的Gramzyme B(粒酶B)进入肿瘤细胞内直接杀灭肿瘤细胞；(2)同时因为肿瘤细胞的CD47已被三抗的SIRPa D1结合屏蔽，使肿瘤微环境的巨噬细胞不在接受“别吃我(Don’t eat me)”的抑制信号，从而激活巨噬细胞吞噬并杀死肿瘤细胞；(3)抗Her2端还可以直接抑制Her2阳性肿瘤细胞的繁殖。图2展示了本发明药物的作用机理。靶向Her2和CD47的双特异性抗体已有报道，但靶向Her2-CD47-CD16a三特异性抗体未有报道，属于First-In-Class。
由于人CD16蛋白有两种亚型，CD16a与CD16b，CD16a主要表达于NK细胞，也表达于单核细胞和巨噬细胞，属于激活型受体；CD16b表达于中性粒细胞，两种亚型高度同源，因此，抗CD16a的抗体通常也可结合CD16b，往往引起中性粒细胞减少症。此发明中的抗CD16a特异性结合CD16a受体，而不结合CD16b,因此不会引起中性粒细胞减少症。
发明内容
为解决上述问题，本发明公开了一种三特异性抗体的设计、制备和用途；本发明重点解决的关键技术问题是保证anti-CD16a特异性，不与中性粒细胞表面的CD16b结合从而不引起有些抗CD16a抗体所具有的中性粒细胞减少的副作用，同时维持Herceptin抗体和SIRPa D1蛋白的高特异性与高亲和力，最大程度减少由于非特异性结合带来的副作用。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明的一个目的是提供一种三特异性抗体，所述抗体包含(a)anti-Her2单克隆抗体Herceptin，(b)anti-CD16a单链抗体scFv，(c)SIRPa D1蛋白，(d)柔性连接子。
三特异性抗体，以Herceptin为三特异性抗体的基本结构，在Herceptin重链N端或C端通过柔性连接子连接anti-CD16a单链抗体scFv或SIRPa D1蛋白，在Herceptin轻链N端或C端通过柔性连接子连接SIRPa D1蛋白或anti-CD16a单链抗体scFv。
在某些实施例中，以Herceptin为三特异性抗体的基本结构，SIRPa D1蛋白通过柔性连接子连接至Herceptin轻链C端，anti-CD16a scFv通过柔性连接子连接至Herceptin重链C端。
在某些实施例中，以Herceptin为三特异性抗体的基本结构，SIRPa D1蛋白通过柔性连接子连接至Herceptin轻链N端，anti-CD16a scFv通过柔性连接子连接至Herceptin重链C端。
在某些实施例中，以Herceptin为三特异性抗体的基本结构，SIRPa D1蛋白通过柔性连接子连接至Herceptin轻链C端，anti-CD16a scFv通过柔性连接子连接至Herceptin重链N端。
在某些实施例中，以Herceptin为三特异性抗体的基本结构，SIRPa D1蛋白通过柔性连接子连接至Herceptin轻链N端，anti-CD16a scFv通过柔性连接子连接至Herceptin重链N端。
在某些实施例中，以Herceptin为三特异性抗体的基本结构，SIRPa D1蛋白通过柔性连接子连接至Herceptin重链N端，anti-CD16a scFv通过柔性连接子连接至Herceptin轻链N端。
在某些实施例中，以Herceptin为三特异性抗体的基本结构，SIRPa D1蛋白通过柔性连接子连接至Herceptin重链C端，anti-CD16a scFv通过柔性连接子连接至Herceptin轻链C端。
在某些实施例中，以Herceptin为三特异性抗体的基本结构，SIRPa D1蛋白通过柔性连接子连接至Herceptin重链C端，anti-CD16a scFv通过柔性连接子连接至Herceptin轻链N端。
在某些实施例中，以Herceptin为三特异性抗体的基本结构，SIRPa D1蛋白通过柔性连接子连接至Herceptin重链C端，anti-CD16a scFv通过柔性连接子连接至Herceptin重链N端。
在某些实施例中，以Herceptin为三特异性抗体的基本结构，SIRPa D1蛋白通过柔性连接子接至Herceptin轻链N端，anti-CD16a scFv通过柔性连接子连接至Herceptin轻链C端。
在某些实施例中，以Herceptin为三特异性抗体的基本结构，SIRPa D1蛋白通过柔性连接子连接至Herceptin轻链C端，anti-CD16a scFv通过柔性连接子连接至Herceptin轻链N端。
在某些实施例中，以Herceptin为三特异性抗体的基本结构，SIRPa D1蛋白通过柔性连接子连接至Herceptin重链N端，anti-CD16a scFv通过柔性连接子连接至Herceptin重链C端。
在某些实施方案中，所述柔性连接子的氨基酸序列包括但不限于GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:14)或GSASAPTLKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:15)。
在某些实施方案中，所述Herceptin单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1)；
轻链可变区的氨基酸序列为：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:6)。
在某些实施方案中，所述Herceptin单克隆抗体的重链恒定区的氨基酸序列为：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPK(SEQ ID NO:2)
或为：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPK(SEQ ID NO:3)。
在某些实施方案中，所述Herceptin单克隆抗体的轻链恒定区的氨基酸序列为：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:7)。
在某些实施方案中，所述anti-CD16a单链抗体scFv由重链可变区VH和轻链可变区VL组成，VH和VL通过柔性肽接头连接在一起。
在某些实施方案中，所述anti-CD16a单链抗体scFv的氨基酸序列为：
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKRYSPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARINPAYFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDFDGDSFMNWYQQKPGQPPKLLIYTTSNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:11)
或为：
EVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGSASAPTLKLEEGEFSEARVQPVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:12)
或为：
EVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:13)
在某些实施方案中，所述SIRPa D1蛋白的氨基酸序列为：
EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAK(SEQ ID NO:9)
或为：
EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAK(SEQ ID NO:10)。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体Herceptin的Fc段引入L234A或L235A突变，同时在Fc段引入M252Y、S254T或T256E突变。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体Herceptin的Fc段为野生型，同时在Fc段引入M252Y、S254T或T256E突变。
本发明的另一个目的是提供一种制备上述三特异性抗体的方法，包括以下步骤：
(1)本发明结构如图1所示，为对称结构。在抗体Herceptin重链N端或C端通过柔性连接子连接anti-CD16a单链抗体scFv或SIRPa D1蛋白。scFv由重链可变区VH和轻链可变区VL组成，其中VH和VL通过柔性肽接头连接在一起。在scFv中，结构域的顺序可以是VH-接头-VL或VL-接头-VH。在Herceptin抗体轻链N端或C端通过柔性连接子连接SIRPaD1或anti-CD16a单链抗体scFv，。在抗体Herceptin Fc段引入L234A/L235A突变，以降低与受体FcgRIII和FcgRIIa的结合能力，同时在Fc段引入M252Y/S254T/T256E突变，以延长蛋白的半衰期；
(2)通过常规的分子生物学手段将步骤(1)中得到的DNA片段克隆至pcDNA系列载体或其它用于哺乳动物细胞表达***的载体，将步骤(1)中得到的DNA片段克隆至另一pcDNA系列载体或其它用于包括但不限于哺乳动物细胞表达***的载体，表达***的载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列；
(3)将步骤(2)中获得的重组载体转染至哺乳动物细胞以进行融合蛋白的表达与纯化，得到三特异性抗体。转染方式可以是化学试剂转染或者电穿孔转染，哺乳动物细胞可以是HEK293细胞或者CHO(中国仓鼠卵巢，Chinese Hamster Ovary)细胞或上述细胞的衍生细胞或其他表达***(如E.coli和酵母)。所得抗体命名为TriAB01/TriAB02/TriAB03/TriAB-C。
在某些实施方案中，所述步骤(1)中，具体包括以下步骤：
(a)将Herceptin抗体的重链、轻链和anti-CD16a单链抗体scFv的DNA序列合成；
(b)设计引物，以(a)中质粒为模板分别将Herceptin抗体的重链和anti-CD16a单链抗体scFv扩增；
(c)以(b)中DNA片段为模板，用扩增Herceptin抗体的重链DNA序列的上游引物和扩增anti-CD16a单链抗体scFv DNA序列的下游引物进行Overlap PCR，得到DNA序列；
(d)以突变点为界限设计突变引物，以(c)中片段为模板，用扩增Herceptin抗体的重链DNA序列的上游引物和下游突变引物扩增突变点前的片段，用上游突变引物和扩增anti-CD16a单链抗体scFv的下游引物扩增突变点后的片段；
(e)以(d)中得到两个片段为模板，用扩增Herceptin抗体的重链DNA序列的上游引物和扩增anti-CD16a单链抗体scFv的下游引物扩增得到突变后的片段；
(f)以同样的方式获得另一条DNA片段；
(g)将(e)和(f)中制备的片段连接至pcDNA系列载体或其它用于包括但不限于哺乳动物细胞表达***的载体，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5a或其他感受态细胞，挑取单克隆后制备质粒；
(h)将(g)中制备的质粒转染至HEK293细胞，在37℃、8％CO2 125rpm摇床中培养，瞬时表达7天后上清通过protein A亲和层析，纯化获得重组抗体，并通过UV280结合理论消光系数确定抗体浓度。
在某些实施方案中，抗体Herceptin序列包括但不限于：
重链序列1:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPK(SEQ ID NO:4)
重链序列2：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPK(SEQ ID NO:5)
轻链序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:8)
在某些实施方案中，SIRPa D1蛋白序列包括但不限于：
序列1：
EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAK(SEQ ID NO:9)
序列2：
EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAK(SEQ ID NO:10)
在某些实施方案中，Anti-CD16a scFv序列包括但不限于
序列1：
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKRYSPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARINPAYFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDFDGDSFMNWYQQKPGQPPKLLIYTTSNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:11)
序列2：
EVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGSASAPTLKLEEGEFSEARVQPVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:12)
序列3：
EVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:13)
本发明还有一个目的是提供上述的三特异性抗体在制备抗肿瘤药物中的用途。此三特异性抗体可用于任何同时表达Her2和CD47的肿瘤的治疗，包括但不限于肺癌、乳腺癌、胃食管癌、胆道癌和卵巢癌等。用途还包括单一疗法***或和其他肿瘤治疗方法联用。
本发明还有一个目的是提供上述的方法制备的三特异性抗体在制备双特异性抗体、三特异性抗体或多特异性抗体药物中的用途。双特异性抗体、三特异性抗体或多特异性抗体可用于任何同时表达Her2和CD47的肿瘤的治疗，包括但不限于肺癌、乳腺癌、胃食管癌、胆道癌和卵巢癌等。用途还包括单一疗法***或和其他肿瘤治疗方法联用。
本发明的特点：
1.为解决靶向CD16a特异性不强的缺陷，本发明中的anti-CD16a scFv特异性结合CD16a，而不与CD16b结合，从而避免了中性粒细胞和抗体的结合而引起的中性粒细胞减少症。
2.通过SIRPa D1和CD47配体结合可连接上表达CD47的肿瘤细胞；同时可以阻断“别吃我(Don’t eat me)”信号而激活巨噬细胞来吞噬肿瘤细胞；
3.通过突变手段减低抗体Fc段与受体FcgRIIa的结合能力，从而避免了中性粒细胞和抗体的结合而引起的中性粒细胞减少症。
4.同时在Fc段引入M252Y/S254T/T256E突变，以延长蛋白的半衰期。
5.抗体结构与传统IgG相似，采用对称结构设计，无knob-into-hole突变，避免产生同源异构体。在纯化工艺开发和生产成本方面有显著优势。
6.Herceptin本身具有直接抑制肿瘤生长的功能。
附图说明
图1为本发明三特异性抗体的结构示意图；
图2为本发明三特异性抗体作用机理示意图；
图3为本发明三特异性抗体与Her2蛋白的结合能力检测图；
图4为本发明三特异性抗体与CD47蛋白的结合能力检测图；
图5为本发明三特异性抗体与CD16a蛋白的结合能力检测图；
图6为本发明三特异性抗体与CD16b蛋白的结合能力检测图；
图7为本发明三特异性抗体与细胞SK-BR-3结合能力检测图；
图8为本发明三特异性抗体与细胞SK-OV-3结合能力检测图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
ELISA检测三特异性抗体与Her2蛋白的结合
包被不同浓度(10000ng/ml、2500ng/ml、625ng/ml、156.25ng/ml、39.0625ng/ml、9.765625ng/ml、2.44140625ng/ml、0)的Her2蛋白(10004-H08H1，义翘神州)，100ul/孔4℃过夜；用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入1ug/ml三特异性抗体及其他对照样品各100ul，37℃孵育1h；然后加入山羊抗人IgG/HRP，37℃孵育1h，显色10min后，酶标仪上读取OD450。结果见图3。
实施例2
ELISA检测三特异性抗体与CD47蛋白的结合
包被不同浓度(10000ng/ml、2500ng/ml、625ng/ml、156.25ng/ml、39.0625ng/ml、9.765625ng/ml、2.44140625ng/ml、0)的CD47蛋白(12283-H08H，义翘神州)，100ul/孔4℃过夜；用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入1ug/ml三特异性抗体各100ul，37℃孵育1h；然后加入山羊抗人IgG/HRP，37℃孵育1h，显色10min后，酶标仪上读取OD450。结果见图4。
实施例3
ELISA检测三特异性抗体与CD16a蛋白的结合
包被不同浓度(10000ng/ml、2500ng/ml、625ng/ml、156.25ng/ml、39.0625ng/ml、9.765625ng/ml、2.44140625ng/ml、0)的CD16a蛋白(10389-H08C，义翘神州)，100ul/孔4℃过夜；用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入1ug/ml三特异性抗体各100ul，37℃孵育1h；然后加入山羊抗人IgG/HRP，37℃孵育1h，显色10min后，酶标仪上读取OD450。结果见图5。
实施例4
ELISA检测三特异性抗体与CD16b蛋白的结合
包被不同浓度(10000ng/ml、2500ng/ml、625ng/ml、156.25ng/ml、39.0625ng/ml、9.765625ng/ml、2.44140625ng/ml、0)的CD16a蛋白(11046-H08H，义翘神州)，100ul/孔4℃过夜；用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入1ug/ml三特异性抗体各100ul，37℃孵育1h；然后加入山羊抗人IgG/HRP，37℃孵育1h，显色10min后，酶标仪上读取OD450。结果见图6。
实施例5
FACS检测三特异性抗体与细胞SK-BR-3的结合能力
96孔圆底板中加入50ul SK-BR-3细胞，细胞数为50000/孔，用FACS buffer(无菌PBS,0.2％BSA)梯度稀释抗体，按50ul/孔加入96孔圆底板中，4℃孵育1h。2000rpm离心3min后弃上清，用FACS buffer洗2此，加入100ul/孔荧光二抗(Southern Biotech，2040-09)，终浓度1ug/ml，4℃孵育1h，2000rpm离心3min后弃上清，用FACS buffer洗2次后用100ul/孔FACS buffer重悬，用流式细胞仪进行检测。结果见图7。
实施例6
FACS检测三特异性抗体与细胞SK-OV-3的结合能力
96孔圆底板中加入50ul SK-OV-3细胞，细胞数为50000/孔，用FACS buffer(无菌PBS,0.2％BSA)梯度稀释抗体，按50ul/孔加入96孔圆底板中，4℃孵育1h。2000rpm离心3min后弃上清，用FACS buffer洗2此，加入100ul/孔荧光二抗(Southern Biotech，2040-09)，终浓度1ug/ml，4℃孵育1h，2000rpm离心3min后弃上清，用FACS buffer洗2次后用100ul/孔FACS buffer重悬，用流式细胞仪进行检测。结果见图8。
需要说明的是，以上内容仅仅说明了本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
序列表
<110> 南京吉盛澳玛生物医药有限公司
<120> 一种三特异性抗体的设计、制备及用途
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Lys
325
<210> 3
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Lys
325
<210> 4
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile
245 250 255
Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Lys
<210> 5
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile
245 250 255
Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Lys
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 8
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 9
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Ala
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Lys
115
<210> 10
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Lys
115
<210> 11
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Asn Pro Ala Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu
130 135 140
Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln
145 150 155 160
Ser Val Asp Phe Asp Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys
<210> 12
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu
115 120 125
Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Gln Pro Val Leu
130 135 140
Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile
145 150 155 160
Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys
180 185 190
Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn
195 200 205
Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 13
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Pro Val Leu
130 135 140
Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile
145 150 155 160
Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys
180 185 190
Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn
195 200 205
Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 15
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser
1 5 10 15
Glu Ala Arg Val
20

Claims (27)

1.三特异性抗体，其特征在于，所述抗体包含(a)anti-Her2单克隆抗体Herceptin，(b)anti-CD16a单链抗体scFv，(c)SIRPa D1蛋白，(d)柔性连接子。
2.根据权利要求1所述的三特异性抗体，其特征在于，以Herceptin为三特异性抗体的基本结构，在Herceptin重链N端或C端通过柔性连接子连接anti-CD16a单链抗体scFv或SIRPa D1蛋白，在Herceptin轻链N端或C端通过柔性连接子连接SIRPa D1蛋白或anti-CD16a单链抗体scFv。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的三特异性抗体，其特征在于，所述柔性连接子的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS或GSASAPTLKLEEGEFSEARV。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的三特异性抗体，其特征在于，所述Herceptin抗体的重链可变区的氨基酸序列为：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS；轻链可变区的氨基酸序列为：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK。
5.根据权利要求1-2中任一项所述的三特异性抗体，其特征在于，所述anti-CD16a单链抗体scFv由重链可变区VH和轻链可变区VL组成，VH和VL通过柔性肽接头连接在一起。
6.根据权利要求5中任一项所述的三特异性抗体，其特征在于，所述anti-CD16a单链抗体scFv的重链可变区氨基酸序列为：
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKRYSPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARINPAYFAYWGQGTLVTVSS或为：
EVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSS；
轻链可变区氨基酸序列为：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDFDGDSFMNWYQQKPGQPPKLLIYTTSNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK
或为：
QPVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVL
7.根据权利要求1-2所述的三特异性抗体，其特征在于，所述SIRPa D1蛋白的氨基酸序列为：
EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGAITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAK
或为：
EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAK
8.根据权利要求1-2中任一项所述的三特异性抗体，其特征在于，所述Herceptin抗体的Fc段引入L234A或L235A突变，同时在Fc段引入M252Y、S254T或T256E突变。
9.根据权利要求1-2中任一项所述的三特异性抗体，其特征在于，所述Herceptin抗体的Fc段为野生型，同时在Fc段引入M252Y、S254T或T256E突变。
10.制备如权利要求1-9中任一项所述的三特异性抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将anti-CD16a单链抗体scFv通过柔性连接子连接于Herceptin抗体重链C端或N端；将SIRPa D1蛋白通过柔性连接子连接于Herceptin抗体轻链C端或N端；在Herceptin抗体Fc段引入突变；
(2)将步骤(1)得到的第一条DNA片段克隆至pcDNA系列载体或其它用于包括但不限于哺乳动物细胞表达***的载体；将步骤(1)得到的第二条DNA片段克隆至另一pcDNA系列载体或其它用于包括但不限于哺乳动物细胞表达***的载体，得到重组载体；
(3)将步骤(2)获得的重组载体转染至哺乳动物细胞或其他表达***，进行融合蛋白的表达与纯化后得到三特异性抗体。
11.根据权利要求10所述的制备三特异性抗体的方法，其特征在于，步骤(3)中哺乳动物细胞包括HEK293细胞、CHO细胞、上述细胞的衍生细胞。
12.根据权利要求10所述的制备三特异性抗体的方法，其特征在于，步骤(1)中Herceptin抗体的Fc段引入L234A或L235A突变，同时在Fc段引入M252Y、S254T或T256E突变。
13.根据权利要求10所述的制备三特异性抗体的方法，其特征在于，步骤(1)中Herceptin抗体的Fc段为野生型，同时在Fc段引入M252Y、S254T或T256E突变。
14.根据权利要求10所述的制备三特异性抗体的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，具体包括以下步骤：
(a)将Herceptin抗体的重链和anti-CD16a单链抗体scFv DNA序列合成；
(b)设计引物，以(a)中质粒为模板分别将Herceptin抗体的重链和anti-CD16a单链抗体scFv扩增；
(c)以(b)中DNA片段为模板，用扩增抗体Herceptin的重链DNA序列的上游引物和扩增anti-CD16a单链抗体scFv DNA序列的下游引物进行Overlap PCR，得到DNA序列；
(d)以突变点M252Y、S254T或T256E为界限设计突变引物，以(c)中片段为模板，用扩增Herceptin抗体的重链DNA序列的上游引物和下游突变引物扩增突变点前的片段，用上游突变引物和扩增anti-CD16a单链抗体scFv的下游引物扩增突变点后的片段；
(e)以(d)中得到两个片段为模板，用扩增Herceptin抗体的重链DNA序列的上游引物和扩增anti-CD16a单链抗体scFv的下游引物扩增得到突变后的DNA片段；
(f)以同样的方式获得第二条DNA片段；
(g)将(e)和(f)中制备的片段连接至pcDNA系列载体或其它用于包括但不限于哺乳动物细胞表达***的载体，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5a或其他感受态细胞，挑取单克隆后制备质粒；
(h)将(g)中制备的质粒转染至HEK293细胞，在37℃、8％CO2 125rpm摇床中培养，瞬时表达7天后上清通过protein A亲和层析，纯化获得重组抗体，并通过UV280结合理论消光系数确定抗体浓度。
15.权利要求1-9中任一项所述的三特异性抗体在抗肿瘤药物中的应用。
16.权利要求10-14中任一项所述的方法制备的三特异性抗体在抗肿瘤药物中的应用。
17.权利要求2中所述的三特异性抗体，其特征在于，以Herceptin为三特异性抗体的基本结构，SIRPa D1蛋白通过柔性连接子连接至Herceptin轻链C端，anti-CD16a scFv通过柔性连接子连接至Herceptin重链C端。
18.权利要求2中所述的三特异性抗体，其特征在于，以Herceptin为三特异性抗体的基本结构，SIRPa D1蛋白通过柔性连接子连接至Herceptin轻链N端，anti-CD16a scFv通过柔性连接子连接至Herceptin重链C端。
19.权利要求2中所述的三特异性抗体，其特征在于，以Herceptin为三特异性抗体的基本结构，SIRPa D1蛋白通过柔性连接子连接至Herceptin轻链C端，anti-CD16a scFv通过柔性连接子连接至Herceptin重链N端。
20.权利要求2中所述的三特异性抗体，其特征在于，以Herceptin为三特异性抗体的基本结构，SIRPa D1蛋白通过柔性连接子连接至Herceptin轻链N端，anti-CD16a scFv通过柔性连接子连接至Herceptin重链N端。
21.权利要求2中所述的三特异性抗体，其特征在于，以Herceptin为三特异性抗体的基本结构，SIRPa D1蛋白通过柔性连接子连接至Herceptin重链N端，anti-CD16a scFv通过柔性连接子连接至Herceptin轻链N端。
22.权利要求2中所述的三特异性抗体，其特征在于，以Herceptin为三特异性抗体的基本结构，SIRPa D1蛋白通过柔性连接子连接至Herceptin重链C端，anti-CD16a scFv通过柔性连接子连接至Herceptin轻链C端。
23.权利要求2中所述的三特异性抗体，其特征在于，以Herceptin为三特异性抗体的基本结构，SIRPa D1蛋白通过柔性连接子连接至Herceptin重链C端，anti-CD16a scFv通过柔性连接子连接至Herceptin轻链N端。
24.权利要求2中所述的三特异性抗体，其特征在于，以Herceptin为三特异性抗体的基本结构，SIRPa D1蛋白通过柔性连接子连接至Herceptin重链C端，anti-CD16a scFv通过柔性连接子连接至Herceptin重链N端。
25.权利要求2中所述的三特异性抗体，其特征在于，以Herceptin为三特异性抗体的基本结构，SIRPa D1蛋白通过柔性连接子接至Herceptin轻链N端，anti-CD16a scFv通过柔性连接子连接至Herceptin轻链C端。
26.权利要求2中所述的三特异性抗体，其特征在于，以Herceptin为三特异性抗体的基本结构，SIRPa D1蛋白通过柔性连接子连接至Herceptin轻链C端，anti-CD16a scFv通过柔性连接子连接至Herceptin轻链N端。
27.权利要求2中所述的三特异性抗体，其特征在于，以Herceptin为三特异性抗体的基本结构，SIRPa D1蛋白通过柔性连接子连接至Herceptin重链N端，anti-CD16a scFv通过柔性连接子连接至Herceptin重链C端。
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