CN109297954A - 一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法与检测方法 - Google Patents

一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法与检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于医学检测领域并公开了一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法与检测方法；该试剂盒包括：M试剂、R试剂、胰岛素校准品、反应增强剂和化学发光底物液，所述的M试剂包括浓度为2μg/mL包被INS‑生物素化抗体的磁微粒、浓度为0.2mol/L的Tris缓冲液；所述的R试剂包括浓度为1μg/mL的INS‑AP标记抗体、浓度为0.1mol/L的Tris缓冲液；所述的胰岛素校准品包括两种不同浓度的胰岛素样品及0.1mol/L浓度的Tris缓冲液；本发明试剂盒具有特异性强、稳定性好的有益效果，提高了检测的灵敏度和特异性、适于自动化操作；本发明制备方法简单、容易在工业化生产中实现，有利于提高制备效率；同时，本发明检测方法检测过程简单，大大简化了现有的检测步骤和程序。

Description

一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法与 检测方法
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法与检测方法。
背景技术
胰岛素是胰岛β细胞分泌的多肽激素，由51个氨基酸组成。胰岛素分泌人血后在体内的半衰期通常为3-5分钟，主要由肝脏摄取并降解，少量在近曲小管内重吸收和降解。葡萄糖是促进胰岛素分泌的最强刺激因子，在葡萄糖作用下健康人体中胰岛素呈双相脉冲式分泌。许多其他因素，如代谢性、内分泌性、神经性因素以及药物都可以影响胰岛素的合成和分泌。胰岛素在体内的合成代谢中具有重要作用，对体内几乎所有的组织都有直接或者间接的影响。在代谢中胰岛素与胰岛素受体结合产生胰岛素样作用，促进机体对糖、脂肪及蛋白质的合成和储存。增高：见于肝硬化、2型糖尿病、甲状腺功能亢进、肢端肥大症、营养不良型肌强直、胰腺增生导致的低血糖症；部分氨基酸、胰高血糖素、睾酮、生长激素及口服避孕药可使血中胰岛素增高。减低：见于1型糖尿病、部分2型糖尿病、垂体功能低下症、肾上腺皮质功能低下、继发性胰腺损伤和慢性胰腺炎；儿茶酚胺、β受体阻滞剂及利尿剂可使胰岛素水平减低。
目前，胰岛素的实验室检测方法主要有有放射免疫(RIA)、酶联免疫(ELISA)、化学发光免疫(CLIA)等。其中RIA和ELISA出现较早，但由于其存在污染性强、灵敏度低、检测时间长等缺点，已不再据主体地位。而化学发光免疫技术由于灵敏度高、动力学范围宽、适于自动化操作等优点，是目前公认的特异性和灵敏度较高的检测方法。但是现有技术中适用于化学发光法测定用于胰岛素检测的试剂盒成分比较复杂，稳定性不够好，且其检测的灵敏度和特异性有待进一步提高。鉴于此，如何提供一种特异性强、稳定性好、能提高了检测的灵敏度和特异性的胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法与检测方法是本领域技术人员需要解决的技术难题。
发明内容
针对现有技术中试剂盒成分比较复杂，稳定性不够好，且其检测的灵敏度和特异性有待进一步提高的不足之处，本发明提供了一种特异性强、稳定性好、能提高了检测的灵敏度和特异性的胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法与检测方法。
本发明为解决上述技术问题，采用以下技术方案来实现：
设计一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，该试剂盒包括：M试剂、R试剂、胰岛素校准品、反应增强剂和化学发光底物液，所述的M试剂包括浓度为2μg/mL包被INS-生物素化抗体的磁微粒、浓度为0.2mol/L的Tris缓冲液；所述的R试剂包括浓度为1μg/mL的INS-AP标记抗体、浓度为0.1mol/L的Tris缓冲液；所述的胰岛素校准品包括两种不同浓度的胰岛素样品及0.1mol/L浓度的Tris缓冲液。
优选的，所述的M试剂、R试剂以及胰岛素校准品中还均含有表面活性剂、稳定剂以及pH调节剂。
优选的，所述试剂盒中的各试剂混合后的pH值范围为7-9。
优选的，所述化学发光底物液的浓度范围为：5-20g/L，且其成分主要由浓缩清洗液、激发清洗液和预激发清洗液组成。
优选的，所述化学发光底物液中浓缩清洗液、激发清洗液和预激发清洗液的组成比例为1：1-2：1-5。
优选的，所述包被INS-生物素化抗体的磁微粒为抗人胰岛素单克隆抗体的顺磁性微粒。
优选的，所述的反应增强剂为PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG10000和PEG20000中的一种或多种。
优选的，所述反应增强剂的浓度范围为：10-30g/L。
本发明的一种胰岛素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：制备M试剂：先配制Tris缓冲液，再将INS-生物素化抗体与链霉亲和素磁珠充分混匀加入适量Tris缓冲液于室温下充分混匀、定容后反应，得到M试剂；
步骤二：制备R试剂先配制Tris缓冲液，再将INS-AP抗体加入Tris缓冲液中，充分混匀，定容后得到R试剂；
步骤三：配制胰岛素校准品：配制Tris缓冲液，将两种不同浓度的胰岛素样品加入Tris缓冲液中，充分混匀，定容后得到胰岛素校准品；
步骤四：分别向步骤一、步骤二、步骤三制备的M试剂、R试剂、胰岛素校准品中加入反应增强剂和化学发光底物液，再混合均匀。
本发明的一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
步骤一：在反应管中加入待检测样本，并依次加入M试剂、R试剂、反应增强剂混匀，20-40℃下温育30min，得到双抗原夹心复合物，并将双抗原夹心复合物固定在磁性微球上；
步骤二：加清洗液，震荡，使磁性微球在磁场中沉降，除上清液，清除掉没有通过待测抗体形成双抗原夹心复合物的连接标记示踪物的抗原，重复步骤3-5次；
步骤三：在反应管中加入化学发光底物液，充分混匀，通过发光测定仪检测发光值，计算得到抗胰岛素抗体的含量。
本发明提出的一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法与检测方法，有益效果在于：
(1)本发明胰岛素检测试剂盒用于体外定量测定人体血清中胰岛素的含量，且本发明的试剂盒中磁微粒包被的是人胰岛素单克隆抗体，较现有化学发光免疫法相比，具有特异性强、稳定性好的有益效果，大大提高了检测的灵敏度和特异性；
(2)本发明胰岛素检测试剂盒在主要原材料配比及表面活性剂的选择上进行了很多尝试，最终得到适合于此体系的磁微粒酶标抗体的组合，从而在测定快速灵敏、特异性高的前提下，整个体系稳定性好盒操作简便，非常适合于临床全自动化学发光测定仪配套使用；
(3)本发明胰岛素检测试剂盒采用化学发光免疫夹心法测定血清中胰岛素水平；首先，将样本添加到含有包被着抗人胰岛素单克隆抗体的顺磁性微粒、缓冲溶液和INS-AP标记抗体的反应管中。INS-AP标记抗体和人胰岛素分子上不同的抗原位点反应。人胰岛素与固定在顺磁性微粒上的单克隆抗人胰岛素结合，从而形成夹心复合物；在反应管内温育完成后，结合在固相上的物质置于磁场内被吸附，而未结合的物质被冲洗除去，然后将化学发光底物添加到反应管内，然后由全自动发光测定仪对反应中所产生的光进行测量；所产生光的量与样本中的人INS的浓度成正比，具有特异性强、稳定性好的优点，提高了检测的灵敏度和特异性；可广泛应用于体外定量测定人体血清中胰岛素的含量；
(4)本发明胰岛素检测试剂盒采用化学发光免疫技术，其具有灵敏度高、稳定性好、特异性强、动力学范围宽、适于自动化操作等优点；
(5)本发明的制备方法简单、容易在工业化生产中实现，有利于提高制备效率；同时，本发明的检测方法检测过程简单，大大简化了现有的检测步骤和程序。
附图说明
下面结合附图中的实施例对本发明作进一步的详细说明，但并不构成对本发明的任何限制。
图1为本发明实施例二所示产品实验验证时利用零浓度校准品作为样本进行检测的最低检出限结果图；
图2为发明实施例二所示产品实验验证时利用国家标准浓度的准确样品进行第一次检测结果示意图；
图3为发明实施例二所示产品实验验证时利用国家标准浓度的准确样品进行第二次检测结果示意图；
图4为发明实施例二所示产品实验验证时利用国家标准浓度的准确样品进行第一次检测结果示意图；
图5为发明实施例二所示产品第一次实验验证时的线性范围内相关性测试结果图；
图6为发明实施例二所示产品第二次实验验证时的线性范围内相关性测试结果图；
图7为发明实施例二所示产品第三次实验验证时的线性范围内相关性测试结果图；
图8为发明实施例二所示产品实验验证时分析内精密度CV值测试结果图；
图9为发明实施例二所示产品实验验证时不同区域设置为高的批间精密度CV值测试结果图；
图10为发明实施例二所示产品实验验证时不同区域设低的批间精密度CV值测试结果图；
图11为本发明实施例二所示产品每批次测试结果的特异性结果图；
图12为发明实施例二所示产品对干扰物质(如胆红素、甘油三酯)的试验结果图。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例一
本发明的一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，该试剂盒包括：M试剂、R试剂、胰岛素校准品、反应增强剂和化学发光底物液，所述的M试剂包括浓度为2μg/mL包被INS-生物素化抗体的磁微粒、浓度为0.2mol/L的Tris缓冲液；所述的R试剂包括浓度为1μg/mL的INS-AP标记抗体、浓度为0.1mol/L的Tris缓冲液；所述的胰岛素校准品包括两种不同浓度的胰岛素样品及0.1mol/L浓度的Tris缓冲液；所述的M试剂、R试剂以及胰岛素校准品中还均含有表面活性剂、稳定剂以及pH调节剂，所述试剂盒中的各试剂混合后的pH值为7，所述化学发光底物液的浓度为：50g/L，且其成分主要由浓缩清洗液、激发清洗液和预激发清洗液组成，所述化学发光底物液中浓缩清洗液、激发清洗液和预激发清洗液的组成比例为1：1：1，所述包被INS-生物素化抗体的磁微粒为抗人胰岛素单克隆抗体的顺磁性微粒，所述的反应增强剂为PEG4000，所述反应增强剂的浓度为：10g/L。
实施例二
本发明的一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，该试剂盒包括：M试剂、R试剂、胰岛素校准品、反应增强剂和化学发光底物液，所述的M试剂包括浓度为2μg/mL包被INS-生物素化抗体的磁微粒、浓度为0.2mol/L的Tris缓冲液；所述的R试剂包括浓度为1μg/mL的INS-AP标记抗体、浓度为0.1mol/L的Tris缓冲液；所述的胰岛素校准品包括两种不同浓度的胰岛素样品及0.1mol/L浓度的Tris缓冲液；所述的M试剂、R试剂以及胰岛素校准品中还均含有表面活性剂、稳定剂以及pH调节剂，所述试剂盒中的各试剂混合后的pH值为8，所述化学发光底物液的浓度为：10g/L，且其成分主要由浓缩清洗液、激发清洗液和预激发清洗液组成，所述化学发光底物液中浓缩清洗液、激发清洗液和预激发清洗液的组成比例为1：2：3，所述包被INS-生物素化抗体的磁微粒为抗人胰岛素单克隆抗体的顺磁性微粒，所述的反应增强剂为PEG4000、PEG6000和PEG8000，所述反应增强剂的浓度为：20g/L。
实施例三
本发明的一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，该试剂盒包括：M试剂、R试剂、胰岛素校准品、反应增强剂和化学发光底物液，所述的M试剂包括浓度为2μg/mL包被INS-生物素化抗体的磁微粒、浓度为0.2mol/L的Tris缓冲液；所述的R试剂包括浓度为1μg/mL的INS-AP标记抗体、浓度为0.1mol/L的Tris缓冲液；所述的胰岛素校准品包括两种不同浓度的胰岛素样品及0.1mol/L浓度的Tris缓冲液；所述的M试剂、R试剂以及胰岛素校准品中还均含有表面活性剂、稳定剂以及pH调节剂，所述试剂盒中的各试剂混合后的pH值为9，所述化学发光底物液的浓度为：20g/L，且其成分主要由浓缩清洗液、激发清洗液和预激发清洗液组成，所述化学发光底物液中浓缩清洗液、激发清洗液和预激发清洗液的组成比例为1：2：5，所述包被INS-生物素化抗体的磁微粒为抗人胰岛素单克隆抗体的顺磁性微粒，所述的反应增强剂为PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG10000和PEG20000，所述反应增强剂的浓度为：30g/L。
实施例四
胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的成分与实施例二相同，本发明的胰岛素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：制备M试剂：先配制Tris缓冲液，再将INS-生物素化抗体与链霉亲和素磁珠充分混匀加入适量Tris缓冲液于室温下充分混匀、定容后反应，得到M试剂；
步骤二：制备R试剂：先配制Tris缓冲液，再将INS-AP抗体加入Tris缓冲液中，充分混匀，定容后得到R试剂；
步骤三：配制胰岛素校准品：配制Tris缓冲液，将两种不同浓度的胰岛素样品加入Tris缓冲液中，充分混匀，定容后得到胰岛素校准品；
步骤四：分别向步骤一、步骤二、步骤三制备的M试剂、R试剂、胰岛素校准品中加入反应增强剂和化学发光底物液，再混合均匀。
实施例五
素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的成分与实施例二相同，本发明的胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
步骤一：在反应管中加入待检测样本，并依次加入M试剂、R试剂、反应增强剂混匀，30℃下温育30min，得到双抗原夹心复合物，并将双抗原夹心复合物固定在磁性微球上；
步骤二：加清洗液，震荡，使磁性微球在磁场中沉降，除上清液，清除掉没有通过待测抗体形成双抗原夹心复合物的连接标记示踪物的抗原，重复步骤4次；
步骤三：在反应管中加入化学发光底物液，充分混匀，通过发光测定仪检测发光值，计算得到抗胰岛素抗体的含量。
性能检测试验
利用实施例二、实施例四和实施例五所示的产品、制备方法和检测方法分别进行如下测试项目，提高以验证本发明实施例所示产品的性能
一、最低检出限
重复测定零校准品10次。计算出化学发光(RLU)值的均值和标准差(SD)。得出根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度与化学发光(RLU)值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将所对应的RLU值带入方程式中，求出对应的浓度值，结果如附图1所示，由附图1可知，本发明胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒对最低检出限为0.01μmol/L。
二、准确性
用实施例二所示的试剂盒将国家标准品配制成与试剂盒内校准品相应的5个浓度点，每点平行测定3次，计算两条剂量-反应曲线的斜率和效价比，测试结果如附图2至附图4所示；由附图2至附图4可知，本发明胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒检测结果与国家标准浓度样品比较，其检测的准确度非常高，符合国家标准要求。
三、线性
线性区间用接近线性区间上限的高浓度样本按一定比例稀释为6个浓度，其中低值浓度的样本须接近线性区间的下限。按试剂盒说明书进行操作，将每一稀释浓度的样本重复测试3次，计算平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性回归的相关系数∣r∣，结果如附图5至附图7所示，结果表明每批次胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的测试结果在线性范围内均相关性良好。
四、分析内精密度
在剂量-反应曲线的不同区域设置高(伯乐生命医学产品有限公司质控品，靶值:177.46mIU/L)、低(伯乐生命医学产品有限公司质控品，靶值:64.32mIU/L)两个浓度的质控品测定，在同一次分析内，每个质控品重复测定10次，其测定结果的变异系数(CV)，结果如附图8所示，结果表明每批次胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂的分析内精密度，也就是变异系数(CV)符合规定要求。
五、批间精密度
在剂量-反应曲线的不同区域设置高(伯乐生命医学产品有限公司质控品，靶值:177.46mIU/L)、低(伯乐生命医学产品有限公司质控品，靶值:64.32mIU/L)两个浓度的质控品测定，用3个不同批次的产品进行独立分析，每批次重复测定10次，计算每个浓度样本30次测量结果的平均值(M)和标准差(SD)，结果如附图9-附图10所示，以上结果表明每批次胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒测试结果的批间精密度，也就是变异系数(CV)符合规定要求。
六、特异性
分别测定浓度为10ng/mL的人胰岛素原和浓度为500μIU/mL的人胰岛素样本，各1次，结果如附图11所示，结果表明每批次胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的特异性符合规定要求。
七、抗干扰性
取2份健康人的血清样本，每份标本单独做一种干扰物质(如血红蛋白、胆红素)的试验，将每份标本再分作十份，分别添加不同浓度(如下表所示)的干扰成份，然后在试剂(盒)规定参数下对含有不同浓度梯度的常见干扰物质的标本进行测定，测定结果与未加干扰物质的标本比较，干扰率≤±5％则可判断被评价干扰物对被评价方法无干扰。反之则认为被评价干扰物对被评价方法有明显干扰作用。结果应符合试剂盒质量标准的要求。
干扰率(％)判断计算公式如下：
干扰值＝干扰样品测定值-基础样品测定值
干扰率(％)＝干扰值/基础值×100
测试结果如附图12所示，由附图12可得出：胰岛素检测试剂盒在胆红素≤90mg/dL、甘油三酯≤1800mg/dL时干扰率小于5％，不会对试验产生干扰。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：M试剂、R试剂、胰岛素校准品、反应增强剂和化学发光底物液，所述的M试剂包括浓度为2μg/mL包被INS-生物素化抗体的磁微粒、浓度为0.2mol/L的Tris缓冲液；所述的R试剂包括浓度为1μg/mL的INS-AP标记抗体、浓度为0.1mol/L的Tris缓冲液；所述的胰岛素校准品包括两种不同浓度的胰岛素样品及0.1mol/L浓度的Tris缓冲液。
2.根据权利要求1所述的一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述的M试剂、R试剂以及胰岛素校准品中还均含有表面活性剂、稳定剂以及pH调节剂。
3.根据权利要求1或2所述的一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的各试剂混合后的pH值范围为7-9。
4.根据权利要求1所述的一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液的浓度范围为：5-20g/L，且其成分主要由浓缩清洗液、激发清洗液和预激发清洗液组成。
5.根据权利要求4所述的一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液中浓缩清洗液、激发清洗液和预激发清洗液的组成比例为1：1-2：1-5。
6.根据权利要求1所述的一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述包被INS-生物素化抗体的磁微粒为抗人胰岛素单克隆抗体的顺磁性微粒。
7.根据权利要求1所述的一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述的反应增强剂为PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG10000和PEG20000中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述反应增强剂的浓度范围为：10-30g/L。
9.如权利要求1-8所述任意一种胰岛素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：制备M试剂：先配制Tris缓冲液，再将INS-生物素化抗体与链霉亲和素磁珠充分混匀加入适量Tris缓冲液于室温下充分混匀、定容后反应，得到M试剂；
步骤二：制备R试剂先配制Tris缓冲液，再将INS-AP抗体加入Tris缓冲液中，充分混匀，定容后得到R试剂；
步骤三：配制胰岛素校准品：配制Tris缓冲液，将两种不同浓度的胰岛素样品加入Tris缓冲液中，充分混匀，定容后得到胰岛素校准品；
步骤四：分别向步骤一、步骤二、步骤三制备的M试剂、R试剂、胰岛素校准品中加入反应增强剂和化学发光底物液，再混合均匀。
10.如权利要求1-8所述任意一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：在反应管中加入待检测样本，并依次加入M试剂、R试剂、反应增强剂混匀，20-40℃下温育30min，得到双抗原夹心复合物，并将双抗原夹心复合物固定在磁性微球上；
步骤二：加清洗液，震荡，使磁性微球在磁场中沉降，除上清液，清除掉没有通过待测抗体形成双抗原夹心复合物的连接标记示踪物的抗原，重复步骤3-5次；
步骤三：在反应管中加入化学发光底物液，充分混匀，通过发光测定仪检测发光值，计算得到抗胰岛素抗体的含量。
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