CN109295113A

CN109295113A - 一种生产羟基酪醇的方法

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Publication number: CN109295113A
Application number: CN201811234787.2A
Authority: CN
Inventors: 蔡宇杰; 刘金彬; 李朝智; 丁彦蕊; 白亚军; 郑晓晖
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-10-23
Filing date: 2018-10-23
Publication date: 2019-02-01

Abstract

本发明公开了一种基因工程菌，属于生物工程技术领域。本发明的基因工程菌导入了L‑α‑氨基酸转氨酶、L‑谷氨酸基因、α‑酮酸脱羧酶基因、醇脱氢酶基因的酶基因，可应用于生物合成羟基酪醇。本发明还公开了重组大肠杆菌基因工程菌的构建方法和应用，进一步地，通过敲除或强化表达大肠杆菌基因组上的相将关基因促进底物的转运及减少产物的分解，提高了重组菌的生产效率。利用本发明的重组菌转化生产羟基酪醇的方法，具有操作简单，成本低，产物合成效率高的特点，具有良好的产业化前景。

Description

一种生产羟基酪醇的方法

技术领域

本发明涉及一种生产羟基酪醇的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

羟基酪醇(3,4-二羟基苯乙醇，Hydroxytyrosol，3,4-Dihydroxyphenylethanol，2-(3,4-Dihydroxyphenyl)ethanol)，是一种天然的多酚类化合物，具有很强的抗氧化活性，主要以酯类的形式存在于橄榄的果实和枝叶中。羟基酪醇苯环上连接有两个羟基，是其主要的抗氧化活性基团，因其固有的抗氧化活性可预防多种疾病的发生。除此之外，羟基酪醇还可消除体内自由基，恢复人体脏腑器官的健康状态，防止脑衰，延缓衰老。

近几年的研究表明，羟基酪醇对多种疾病有明显的作用，羟基酪醇在糖脂代谢调节、防治肿瘤、抗血栓、缓解动脉硬化、抑制病原微生物、防治视网膜黄斑变性、保护软骨和防治骨质疏松等方面都具有良好的生物活性。随着人们对羟基酪醇生物学活性及体内代谢特征的不断研究，越来越多的生物活性被开发出来，这些研究也受到国内外研究者的广泛关注。

目前羟基酪醇的工业化生产还不成熟，且大都处于实验室阶段。其小量制备主要有以下两种方式：1)通过酸解或酶解橄榄厂的废水、橄榄叶、原生橄榄油中的橄榄苦苷，再进一步获得羟基酪醇；2)利用化学合成的方法制备羟基酪醇。利用生产橄榄油产生的废水制备羟基酪醇，既能进行废物利用，又能减少对环境的污染。但是此方法需要大量的溶剂，并且羟基酪醇的回收率不高。通过化学合成的方法虽然能成功合成羟基酪醇(CN201110357075.1、CN201210342015.7)，但由于原料和试剂成本昂贵，反应过程中产生许多副产物，并且合成步骤较长，反应剧烈不易控制等缺点，使得化学合成方法不适合工业化生产。除此之外，由于羟基酪醇是重要的食品、药物、保健品的原材料，因此通过化学方法得到的产品不受人们欢迎。目前市场上的这一类物质主要从植物中提到得到，例如，中国发明专利CN201610883391.5公开了一种橄榄叶羟基酪醇的提取工艺；中国发明专利CN201710195462.7从橄榄叶中提取羟基酪醇的方法。由于植物资源及其含量的限制，并且提取过程繁琐、复杂，使得这些产品价格昂贵，因此通过微生物法生产受到了广泛的关注。

2012年，Yasuharu Satoh等人提出以酪氨酸为底物，在酪氨酸羟化酶的作用下生成L-多巴，L-多巴在L-多巴脱羧酶作用下生成多巴胺，接着在酪胺氧化酶作用下生成3,4-二羟基苯乙醛，再在醇脱氢酶作用下生成羟基酪醇，(Engineering of l-tyrosineoxidation in Escherichia coli and microbial production of hydroxytyrosol,Metab.Eng.14(6)603-610(2012))。通过构建含有不同基因的大肠宿主得到一株菌，分别以1mM酪氨酸为底物生成0.19±0.0056mM羟基酪醇，以1mM L-多巴生成0.74±0.088mM羟基酪醇。国际发明专利WO2017US39329(HOST CELLS AND METHODS FOR PRODUCINGHYDROXYTYROSOL)也公开了两株宿主细胞共同培养发酵酪氨酸产羟基酪醇的方法，首先在第一个宿主细胞的作用下产生L-多巴，进一步在产生羟基酪醇。这一种制备羟基酪醇的方法大多采用来源于人或小鼠的基因，致使基因在大肠宿主或其他异源宿主中的表达不兼容。

中国发明专利CN201510242626.8公开了一种大肠杆菌中过表达来源于大肠杆菌的单加氧酶基因簇HpaBC，以葡萄糖为底物从头开始合成羟基酪醇；该方案的不足之处在于羟基酪醇对菌体有毒性，还有就是外源蛋白HpaBC表达量较低；因此生产羟基酪醇的效率较难提高。中国发明专利CN201610158902.7公开了一种大肠杆菌宿主表达基因ARO10、HpaBC和UGT生产羟基酪醇的方法，该方法不仅生成羟基酪醇，还能够生成羟基酪醇-3-O-β-D-葡萄糖苷和羟基酪醇-4-O-β-D-葡萄糖苷，致使羟基酪醇的产量降低，而且使后期分离纯化步骤变得繁琐。Chung等人通过在大肠杆菌过表达来源于植物的芳香醛合成酶(aromaticaldehyde synthases)，将L-酪氨酸一步变成对羟基苯乙醛，再由大肠杆菌内部的还原***生成酪醇，另外在HpaBC的作用下产生羟基酪醇，由于植物基因的在大肠杆菌内的表达不兼容，因此影响了全细胞转化效率(Production of Three Phenylethanoids,Tyrosol,Hydroxytyrosol,and Salidroside,Using Plant Genes Expressing in EscherichiaColi.Scientific Reports,2017,7(2578))。

中国发明专利CN201711054680.5公开了异源代谢途径生产酪醇及羟基酪醇的方法。该方案在宿主中高效表达了氨基转移酶(Aminotransferase)，酮酸脱羧酶(Ketoaciddecarboxylase)，醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase)来生产酪醇，再在4-羟基苯乙酸羟化酶的作用下来生产羟基酪醇。该方案的缺点是需要外加许多昂贵的辅酶磷酸吡哆醛(PLP)和还原型辅酶Ⅰ(NADH)，而且在苯环上加羟基的效率明显降低，致使羟基酪醇的得率很低。

目前采用多酶串联表达构建的全细胞催化简单前体，生成相应的高副加值产物已经被广泛应用(Constructing Biocatalytic Cascades:In Vitro and in VivoApproaches to de Novo Multi-Enzyme Pathways,ACS Catal.,2017,7(1),710–724)，而且全细胞的获取更加简单方便，并实现对廉价底物的高效转化，有时比葡萄糖的从头合成更加经济有效。据文献(Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae for theProduction of 2-Phenylethanol Via Ehrlich Pathway,Biotechnology andBioengineering,2014,111(1),115-124.)报道，在以酿酒酵母为宿主构建的基因工程菌，以L-苯丙氨酸为原料，催化生成2-苯乙醇，产量达到6.1g/L，产率为82.5％。在以克雷酵母为宿主的研究中，以20g/L葡萄糖为原料，在不加L-苯丙氨酸的前提，下，获得苯乙醇的产量为1.3g/L，其得率远远小于以产物前体为原料，(Biosynthesis of2-phenylethanol fromglucose with genetically engineered Kluyveromyces marxianus,Enzyme andMicrobial Technology,2014,61–62,44–47)。

基于目前各种方法的缺陷，研究一种可工业化生产、同时利用廉价底物可以高效制备酪醇的方法非常有必要。

发明内容

基于目前各种方法的缺陷，本发明提供了一种羟基酪醇的生产方法，并构建了以大肠杆菌为宿主的共表达工程菌，实现了廉价底物L-多巴到羟基酪醇的高效生产。同时本发明要解决该菌株的构建和应用的技术问题。

本发明提供一种生产羟基酪醇的方法，所述方法是利用一种大肠杆菌重组菌以L-多巴为底物生产羟基酪醇；所述大肠杆菌重组菌同时表达4种酶，分别为L-α-氨基酸转氨酶、L-谷氨酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶，并在宿主大肠杆菌的基础上敲除了酚类化合物分解相关的基因。

在一种实施方式中，所述生产羟基酪醇化合物，是进行全细胞转化生产。

在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系中，包括新鲜细胞湿重为1-200g/L，左旋多巴1-200g/L，L-谷氨酸1-200g/L。

在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系中，pH 6.0-9.0。

在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系的温度为15-40℃。

在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系的反应时间为1-48小时。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌重组菌强化表达了谷氨酸转运基因、NAD合成基因、磷酸吡哆醛合成基因一种或者多种组合。

在一种实施方式中，所述酚类化合物分解相关的基因为hpaD、mhpB中的任意一种或者两种组合。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌重组菌采用pRSFDuet-1和pETDuet-1双质粒共表达编码这4个酶的基因；pRSFDuet-1装载L-α-氨基酸转氨酶和L-谷氨酸脱氢酶，pETDuet-1装载α-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌重组菌是将pRSFDuet-1和pETDuet-1质粒转化到宿主Escherichia coli B21感受态细胞中得到的。

在一种实施方式中，所述L-α-氨基酸转氨酶来自Escherichia coli BL21、Lactobacillus plantarum ATCC 14917、Lactobacillus paracasei ATCC 334。

在一种实施方式中，所述L-α-氨基酸转氨酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_000462687.1、WP_000486988.1、WP_003643296.1、YP_806114.1的序列。

在一种实施方式中，所述L-α-氨基酸转氨酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:COMPLEMENT(989603..990793)、NC_012892REGION:4174517..4175710、NZ_GL379768REGION:complement(121900..123087)、NC_008526REGION:complement(840419..841594)的序列。

在一种实施方式中，所述L-谷氨酸脱氢酶来自Escherichia coli BL21、Rhodobacter sphaeroides ATCC BAA-808、Clostridium symbiosum ATCC 14940、Bacillus subtilis 168。

在一种实施方式中，所述L-谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_000373021.1、WP_011338202.1、WP_003497202.1、WP_010886557.1序列。

在一种实施方式中，所述L-谷氨酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO为：NC_012892 REGION:1786741..1788084、NC_007493 REGION:complement(2129131..2130558)、NZ_KE992901 REGION:complement(17603..18955)、NC_000964REGION:complement(2402067..2403350)的序列。

在一种实施方式中，所述α-酮酸脱羧酶，来自Proteus mirabilis ATCC 29906或Lactococcus lactis ATCC 19435。

在一种实施方式中，所述α-酮酸脱羧酶，其氨基酸序列是NCBI上accession NO.为WP_004247067.1、WP_025016816.1的序列。

在一种实施方式中，所述α-酮酸脱羧酶，其核苷酸序列是NCBI上accession NO.为NZ_GG668593 REGION:50463..52112、NZ_LKLC01000008 REGION:208327..209973的序列。

在一种实施方式中，所述醇脱氢酶来自E.coli BL21(DE3)。

在一种实施方式中，所述醇脱氢酶，其氨基酸序列是NCBI上accession NO.为WP_001318460.1、WP_000692754.1的序列。

在一种实施方式中，所述醇脱氢酶，其核苷酸序列是NCBI上accessionNO.为NC_012892 REGION:4406777..4407796、NC_012892 REGION:312506..313555的序列。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌重组菌，是采用pRSFDuet-1和pETDuet-1双质粒共表达编码这4个酶的基因；pRSFDuet-1装载L-α-氨基酸转氨酶基因和L-谷氨酸脱氢酶，pETDuet-1装载α-酮酸脱羧酶基因和醇脱氢酶基因，然后将两个重组质粒转化到相应菌株，得到重组工程菌。

在一种实施方式中，所述酚类化合物分解相关的基因的核苷酸序列是NCBI上,NCBI上accession NO为：NC_012892 REGION:complement(4505585..4506436)和NC_012892REGION:339806..340750。

在一种实施方式中，所述强化表达是通过将Escherichia coli BL21(DE3)基因组上所要强化表达的基因前增加组成型启动子。

在一种实施方式中，所述强化表达的基因为gltS(谷氨酸转运基因)、nadA(NAD合成基因)、pdxJ(磷酸吡哆醛合成)中的任意一种或多种。

在一种实施方式中，所述gltS在NCBI上accession NO为：NC_012892 REGION:complement(3694931..3696136)；nadA为NC_012892 REGION:740487..741530；pdxJ为NC_012892 REGION:complement(2567591..2568322)。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种生产羟基酪醇的方法，利用一种大肠杆菌重组菌以L-多巴为底物生产羟基酪醇。该大肠杆菌重组菌同时表达4种酶，分别为L-α-氨基酸转氨酶、L-谷氨酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶，并在宿主大肠杆菌的基础上敲除了酚类化合物分解相关的基因。本发明选择的L-α-氨基酸转氨酶、L-谷氨酸脱氢酶均具有底物专一性差，光学专一性强的特点，因此在此工程菌的作用下可以催化L-多巴产生羟基酪醇。进一步地，通过敲除或强化表达大肠杆菌基因组上的相将关基因促进底物的转运及减少产物的分解，提高了重组菌的生产效率。利用本发明的重组菌转化生产羟基酪醇的方法，过程简单且原料易得价格低廉，具有良好的工业化应用前景。

具体实施方案

本发明的重组菌的功能核心在于可以同时表达4种酶，分别为L-α-氨基酸转氨酶、L-谷氨酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶。其原理为：在工程菌全细胞内，L-谷氨酸脱氢酶以菌体内的NAD为辅酶将L-谷氨酸脱氢生成α-酮戊二酸和NADH；L-α-氨基酸转氨酶将左旋多巴转生成3,4-二羟基苯丙酮酸，并实现了L-谷氨酸的再生，从而维持转化体系中L-谷氨酸浓度的恒定；随后经由α-酮酸脱羧酶作用生成3,4-二羟基苯乙醛；醇脱氢酶利用谷氨酸脱氢过程生成的NADH将3,4-二羟基苯乙醛还成羟基酪醇，同时实现了辅酶NAD的再生。同时敲除或强化表达大肠杆菌基因组上的相将关基因促进底物的转运及减少产物的分解。实现了全细胞四酶串联一步法将L-多巴转化为羟基酪醇。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

1、本发明所涉及的菌株及质粒

购自美国菌种保藏中心ATCC的Lactobacillus plantarum ATCC 14917、Lactobacillus paracasei ATCC 334、Rhodobacter sphaeroides ATCC BAA-808、Clostridium symbiosum ATCC 14940、Proteus mirabilis ATCC 29906、Lactococcuslactis ATCC 19435。购自Novagen公司的pRSFDuet-1质粒、pETDuet-1质粒、Escherichiacoli BL21(DE3)、Escherichia coli BL21DH5α。

2、大肠杆菌中相关基因的敲除及组成型强化表达

(1)大肠杆菌酚类化合物分解相关的基因的敲除

本发明中的酚类物质都极易被大肠杆菌中的酶分解，根据文献(Biodegradationof Aromatic Compounds by Escherichia coli，Microbiol Mol Biol Rev.2001,65(4):523–569.)，将相关基因敲除，避免产物和底物的分解。选择的基因是hpaD和mhpB,NCBI上accession NO为：NC_012892 REGION:complement(4505585..4506436)和NC_012892REGION:339806..340750。

(2)大肠杆菌谷氨酸转运基因的组成型强化表达

在全细胞转化过程中，需把底物转运至细胞内才能进行，增强谷氨酸转运蛋白有助于快速并长时间维持胞内底物的高浓度，有利于反应的进行。选择谷氨酸转运相关的基因是gltS，NCBI上accession NO为：NC_012892 REGION:complement(3694931..3696136)。多巴与芳香族氨基酸类似，细胞培养过程中需要吸收氨基酸等，因此菌体本身会表达大量的氨基酸转运蛋白，无须再强化表达。

(3)大肠杆菌辅酶合成相关重要基因的组成型强化表达

在醇还原酶还原过程中需要以NADH为辅酶，强化表达大肠杆菌NAD合成途径的关键酶，可以提高菌体内的NAD水平，从而有利于酪醇的生成。选择的基因有nadA。NCBI上accession NO为：NC_012892 REGION:740487..741530。

磷酸吡多醛(胺)是L-α-氨基酸转氨酶的辅酶，过表达该辅酶途径中的核心基因pdxJ,有利于左旋多巴的分解。NCBI上accession NO为：NC_012892 REGION:complement(2567591..2568322)。

3、酶的选择

(1)L-α-氨基酸转氨酶的选择

L-α-氨基酸转氨酶广泛存在于细菌、真菌、哺乳动物细胞中。通常活力最高的是以α-酮戊二酸或草酰乙酸为受氨体的转氨酶(Genetic Characterization of the MajorLactococcal Aromatic Aminotransferase and Its Involvement in Conversion ofAmino Acids to Aroma Compounds,Appl.Environ.Microbiol.,1999 65(11)4873-4880)。从Lactobacillus plantarum ATCC 14917、Lactobacillus paracasei ATCC 334中分别克隆得到L-α-氨基酸转氨酶基因lparo、lcaro，其氨基酸序列是NCBI上accession NO.为WP_003643296.1、YP_806114.1的序列。从Escherichia coli BL1(DE3)中克隆得到两个L-α-氨基酸转氨酶基因ecaro1、ecaro2，其氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_000462687.1、WP_000486988.1。

(2)α-酮酸脱羧酶的选择

根据文献报道选择细菌来源于的，对芳香族酮酸具有明显活性的α-酮酸脱羧酶，较其它专利中酵母或植物来源的相比具有更好地在大肠杆菌中表达的特性(Characterisation of a thiamine diphosphate-dependent alpha-keto aciddecarboxylase from Proteus mirabilis JN458,Food Chem.,2017,232,19-24)。本发明分别从Proteus mirabilis ATCC 29906和Lactococcus lactis ATCC 19435中分别克隆得到α-酮酸脱羧酶基因pmkdc和llkdc，其氨基酸序列是NCBI上accession NO.为WP_004247067.1、WP_025016816.1的序列，其核苷酸序列是NCBI上accession NO.为NZ_GG668593 REGION:50463..52112、NZ_LKLC01000008 REGION:208327..209973的序列。

(3)醇脱氢酶的选择

醇脱氢酶广泛存在于各类细菌中，根据文献报道大肠杆菌本身也含有多种底物广泛的醇脱氢酶(Production of aromatic compounds by metabolically engineeredEscherichia coli with an expanded shikimate pathway,Appl.Environ.Microbiol.2012,78(17),6203-6216)，因此直接从Escherichia coli BL21(DE3)克隆得到两个醇脱氢酶基因ecadh1和ecadh2，所述醇脱氢酶，其氨基酸序列是NCBI上accession NO.为WP_001318460.1、WP_000692754.1的序列，其核苷酸序列是NCBI上accession NO.为NC_012892 REGION:4406777..4407796、NC_012892 REGION:312506..313555的序列，从而更有利于醇脱氢酶在大肠杆菌中的过表达。

(4)L-谷氨酸脱氢酶的选择

L-谷氨酸脱氢酶是几乎所有生物中连接碳源和氮源代谢的关键酶。其中的L-谷氨酸是最为廉价的一种氨基酸，脱氢后生成的α-酮戊二酸可作为左旋多巴转氨脱氨的受氨体。L-谷氨酸脱氢酶以L-谷氨酸为底物将L-谷氨酸上生成的氢传递给辅酶NAD或NADP，从而生成NADH或NADPH。NADH或者NADPH可以作为前述的醇脱氢酶的供氢体(Structural basisfor the catalytic mechanism andα-ketoglutarate cooperativity of glutamatedehydrogenase,J Biol Chem,2018,293(17),6241-6258)。本发明从Escherichia coliBL21、Rhodobacter sphaeroides ATCC BAA-808、Clostridium symbiosum ATCC 14940、Bacillus subtilis 168中分别得到L-谷氨酸基因ecgdh(氨基酸序列是WP_000373021.1)、rsgdh(氨基酸序列是WP_011338202.1)、csgdh(氨基酸序列是WP_003497202.1)、bsgdh(氨基酸序列是WP_010886557.1)。

4、四酶共表达体系的构建及细胞的培养

将以上选择的L-α-氨基酸转氨酶、L-谷氨酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶酶中每类任选一个酶，进行四酶组合共表达。目前大肠杆菌多基因共表达的有多种方法(大肠杆菌多基因共表达策略，中国生物工程杂志，2012，32(4):117-122)，本发明采用刘向磊(合成生物学技术改造大肠杆菌生产莽草酸及白藜芦醇，2016，上海医药工业研究院，博士论文)所述方法构建，每个基因前均包含T7启动子和RBS结合点，理论上来讲因为每个基因前都有T7和RBS，因此基因的表达强度受排列次序的影响不大。本发明采用pRSFDuet-1和pETDuet-1双质粒共表达四基因，pRSFDuet-1装载L-α-氨基酸转氨酶基因和L-谷氨酸脱氢酶基因，pETDuet-1装载α-酮脱羧酶基因和醇脱氢酶基因。得到共表达重组质粒后，将两种重组质粒同时转入大肠杆菌Escherichia coli B21感受态细胞中，利用含有氨苄青霉素(Ampicillin)和卡那霉素(kanamycin)平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。

细胞的培养：根据经典的重组大肠杆菌培养及诱导表达方案，将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到LB发酵培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)中，当细胞OD₆₀₀达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。

5、全细胞转化羟基酪醇化合物

全细胞转化体系为：左旋多巴浓度为1-200g/L，L-谷氨酸浓度为1-200g/L，调节pH在6.0-9.0之间,新鲜湿菌体量为1-200g/L。然后于15-40℃，转化1-48小时。转化结束后液相色谱测定羟基酪醇的产量。左旋多巴溶解度较低，高浓度情况下是含有不溶物的混悬液。

6、样品的检测分析

羟基酪醇定量分析：转化液采用PerkinElmer Series 200高效液相色谱仪检测分析，色谱条件为：流动相是甲醇-0.1％甲酸水(40:60)、采用汉邦Megres C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速1ml/min、柱温30℃、进样量20μl、检测波长210nm。

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

基因的克隆

(1)引物设计

设计用于PCR扩增的引物。

(2)PCR扩增

按照Takara公司Genomic DNA Purification Kit试剂盒的使用说明书，抽提处于对数生长期的野生菌株的基因组DNA，用表1中的引物，以各对应菌株抽提的基因组为模板进行PCR扩增。扩增体系为：Prime STARHS DNA Polymerase(2.55U/μL)0.5μL、10×PrimeSTAR Buffer 10μL、dNTP Mixture(2.5mM each)4μL、模板DNA 1μL、Up引物(20μM)1μL、Down引物(20μM)1μL、ddH₂O补足到50μL。扩增程序为：94℃，10min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，2min，共30个循环；72℃，10min。PCR产物送华大基因测序。

后从Lactobacillus plantarum ATCC 14917、Lactobacillus paracasei ATCC334分别克隆得到L-α-氨基酸转氨酶基因lparo、lcaro，从Escherichia coli BL21(DE3)中克隆得到两个L-α-氨基酸转氨酶基因ecaro1、ecaro2；从Escherichia coli BL21、Rhodobacter sphaeroides ATCC BAA-808、Clostridium symbiosum ATCC 14940、Bacillus subtilis 168中分别得到L-谷氨酸脱氢酶基因ecgdh、rsgdh、csgdh、bsgdh；从Proteus mirabilis ATCC 29906、Lactococcus lactis ATCC 19435分别得到α-酮酸脱羧酶基因pmkdc、llkdc；从Escherichia coli strain BL21得到乙醇脱氢酶基因ecadh1、ecadh2。

(3)pRSFDuet-1单基因质粒的构建

将pRSFDuet-1载体质粒和步骤(2)中lparo、lcaro、ecaro1、ecaro2的PCR产物于37℃水浴下双酶切1h。酶切体系为：10×cut buffer 5μL,DNA 10μL，限制性内切酶SacⅠ和限制性内切酶HindⅢ各1μL，无菌水33μL。将pRSFDuet-1载体质粒和步骤(2)中ecgdh、rsgdh、csgdh、bsgdh的PCR产物于37℃水浴下双酶切1h。酶切体系为：10×cut buffer 5μL,DNA 10μL，限制性内切酶Nde Ⅰ和限制性内切酶Xho Ⅰ各1μL，无菌水33μL。

然后分别回收酶切产物，并于16℃水浴下连接12h-16h，pRSFDuet-1分别与lparo、lcaro、ecaro1、ecaro2进行连接，pRSFDuet-1分别与ecgdh、rsgdh、csgdh、bsgdh进行连接。连接体系为：10×DNA ligase buffer 2.5μL，DNA片段8μL，载体DNA 2μL，T4DNA ligase 1μL，无菌水11.5μL共25μL。

随后将25μL连接液转入100μL DH5α感受态细胞，冰浴30min。放入预热的42℃水浴中，放置90s进行热休克处理。立即冰浴2min。加入1mL不含抗生素的LB培养液，37℃培养1h使菌体复苏。最后将含pRSFDuet-1重组质粒的细胞均匀涂布在含卡那霉素的LB平板上，挑单菌落培养12h，然后提取质粒，双酶切验证其正确性，同时进行DNA测序以保证其准确性，最后保存正确转化子，得到如下质粒：含有L-α-氨基酸转氨酶基因的重组质粒pRSFDuet-lparo、pRSFDuet-lcaro、pRSFDuet-ecaro1、pRSFDuet-ecaro2；含有L-谷氨酸脱氢酶的基因的重组质粒pRSFDuet-ecgdh、pRSFDuet-rsgdh、pRSFDuet-csgdh、pRSFDuet-bsgdh。然后将重组质粒转入100μLBL21感受态细胞中，冰浴30min。放入预热的42℃水浴中，放置90s进行热休克处理。立即冰浴2min。加入1mL不含抗生素的LB培养液，37℃培养1h使菌体复苏。最后将含pRSFDuet-1重组质粒的细胞均匀涂布在含卡那霉素的LB平板上，待单菌落长出后进行菌落pcr验证，挑取有条带的单菌落培养12h，保存备用。

表1：PCR扩增所使用引物

引物名称	引物5'-3'	序列编号
			lparo F	atgacactatttagagacga	SEQ ID NO:27
lparo R	ttagttgatacagttagc	SEQ ID NO:28
			lcaro F	atgaagttgcaaccattaaat	SEQ ID NO:29
lcaroR	ctaggcggctttatgcgcagc	SEQ ID NO:30
			ecaro1F	atgtttgagaacattaccgccg	SEQ ID NO:31
ecaro1R	cagcactgccacaatcgcttc	SEQ ID NO:32
			ecaro2F	gtgtttcaaaaagttgacgcc	SEQ ID NO:33
ecaro2R	catcaccgcagcaaacgcc	SEQ ID NO:34
			pmkdcF	atgacaaacacagttattaag	SEQ ID NO:35
pmkdcR	gaatgaatataatgaactttttg	SEQ ID NO:36
			llkdcF	atgtatacagtaggagattac	SEQ ID NO:37
llkdcR	tgatttattttgttcagcaaatag	SEQ ID NO:38
			ecadh1F	atgtcgatgataaaaagctatg	SEQ ID NO:39
ecadh1R	ataatcggctttcaacaccacgcgg	SEQ ID NO:40
			ecadh2F	atgaagatcaaagctgttg	SEQ ID NO:41
ecadh2R	gtctgttagtgtgcgattatc	SEQ ID NO:42
			ecgdhF	atggatcagacatattctctgga	SEQ ID NO:43
ecgdhR	aatcacaccctgcgccagcatcg	SEQ ID NO:44
			rsgdhF	atgcaagccgcagaacccag	SEQ ID NO:45
rsgdhR	gagccccttcgagcggtagg	SEQ ID NO:46
			csgdhF	atgagcaagtatgttgacagag	SEQ ID NO:47
csgdhR	ccaagcaatgccctgagccatc	SEQ ID NO:48
			bsgdhF	atggcagccgatcgaaac	SEQ ID NO:49
bsgdhR	tatccagcctctaaaacgcga	SE QID NO:50

实施例2

L-α-氨基酸转氨酶的筛选，从实施例1中获得多种含L-α-氨基酸转氨酶基因的重组工程菌，并在Escherichia coli BL21(DE3)中得到表达。诱导表达方法：将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到LB发酵培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)中，当细胞OD₆₀₀达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。收集细胞、破胞测定粗酶液活性，以α-酮戊二酸为受体时比较各种酶的活性，根据文献(转氨酶催化不对称合成芳香族L-氨基酸.生物工程学报，2012，28(11):1346-1358.)所述的方法测定L-α-氨基酸转氨酶的活性，结果如表2所示。因此选择来源于Lactobacillus paracasei ATCC 334的L-α-氨基酸转氨酶lcaro用于左旋多巴的转氨脱氨是最佳的。

表2不同L-α-氨基酸转氨酶的活性比较

重组菌	活性U/ml
		E.coli BL21/pRSFDuet-ecaro1	2.6
E.coli BL21/pRSFDuet-ecaro2	1.5
		E.coli BL21/pRSFDuet-lparo	2.1
E.coli BL21/pRSFDuet-lcaro	3.3

实施例3

L-谷氨酸脱氢酶的筛选，从实施例1中获得多种含L-谷氨酸脱氢酶的基因的重组工程菌，根据实施例2中的诱导表达方法，并在E.coli BL21(DE3)中得到表达。根据文献(纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶活性测定.上海交通大学学报·农业科学版，2010，1:82-86.)破胞测定粗酶液活性，所述的方法测定L-谷氨酸脱氢酶以NAD为辅酶的活性，结果如表3所示。因此选择来源于枯草芽孢杆菌的L-谷氨酸脱氢酶bsgdh用于羟基酪醇的生产为最佳。

表3不同L-谷氨酸脱氢酶的活性比较

重组菌	活性U/ml
		E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-ecgdh	0.6
E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-rsgdh	1.7
		E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-csgdh	2.5
E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-bsgdh	2.9

实施例4

根据文献Characterisation of a thiamine diphosphate-dependent alpha-keto acid decarboxylase from Proteus mirabilis JN458.Food Chemistry,2017,232,19–24.在谷氨酸生长α-酮戊二酸的过程中，α-酮酸脱羧酶不能将α-酮戊二酸的羧基脱去。而且大肠杆菌中的乙醇脱氢酶也不具备还原α-酮戊二酸的能力。

实施例5

根据文献Large scale validation of an efficient CRISPR/Cas-based multigene editing protocol in Escherichia coli.Microbial Cell Factories,2017,16(1):68所述的方法将Escherichia coli BL21(DE3)上的hpaD和mhpB进行单或双敲除。其中，本发明所用基因敲除的质粒为pCasRed与pCRISPR-gDNA(hpaD sgRNA)与同源臂(hpaDdonor)一起导入Escherichia coli BL21(DE3)上，Cas9/sgRNA诱发宿主在hpaD基因位点发生双链断裂，重组酶Red将hpaD donor整合到hpaD基因上，实现基因的敲除，并测序验证。hpaD sgRNA、hpaD donor、mhpB sgRNA、mhpB donor分别如序列表SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示。mhpB以同样的方式敲除。

配置pH为7的溶液，左旋多巴或羟基酪醇4g/L，湿菌体量200g/L，35℃放置10小时后测定浓度，表4中显示了反应体系中左旋多巴和羟基酪醇的剩余量。

表4不同菌株对底物和产物分解后的剩余浓度

	左旋多巴g/L	羟基酪醇g/L
			E.coli BL21(DE3)	1.6	1.2
E.coli BL21(ΔhpaDΔmhpB,DE3)	3.7	3.5
			E.coli BL21(ΔhpaD,DE3)	2.2	2.8
E.coli BL21(ΔmhpB,DE3)	1.9	1.6

E.coli BL21(ΔhpaDΔmhpB,DE3)效果最好，将之命名为E.coli HM。

实施例6

重组大肠杆菌构建：首先将编码L-α-氨基酸转氨酶、L-谷氨酸脱氢酶，α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶，分别连接到pRSFDuet-1、pETDuet-1质粒上。得到两个基因共表达重组质粒，将双质粒转化大肠杆菌E.coli HM，利用抗生素平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。

将重组大肠杆菌诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，细胞湿重为40g/L，左旋多巴浓度为40g/L，L-谷氨酸浓度为30g/L，pH 8.0，于35℃反应，时间12小时。转化结束后液相色谱测定羟基酪醇，结果如表5所示。

表5各种重组菌的比较

实施例7

采用文献Large scale validation of an efficient CRISPR/Cas-based multigene editing protocol in Escherichia coli.Microbial Cell Factories,2017,16(1):68所述的方法，将Escherichia coli HM基因组上对应基因前增加大肠杆菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpdA)前的中等表达强度组成型启动子(PG)，序列如SEQ ID NO:8所示。

强化基因gltS表达时，以E.coli HM基因组为模板，以引物gltS-FF/gltS-FR、gltS-gpdA-F/gltS-gpdA-R、gltS-RF/gltS-RR,扩增出上游、启动子、下游序列，并以gltS-FF和gltS-RR为引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含gltS sgRNA)一起转入Escherichia coli HM后，Cas9/sgRNA诱发宿主在gltS基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到gltS基因之前，并测序验证。

下表为引物名称与序列表序号的对应索引。

表6引物名称与序列表序号对照

名称	序列表中编号
		gltS sgRNA	SEQ ID NO:20
gltS-FF	SEQ ID NO:21
		gltS-FR	SEQ ID NO:22
gltS-gpdA-F	SEQ ID NO:23
		gltS-gpdA-R	SEQ ID NO:24
gltS-RF	SEQ ID NO:25
		gltS-RR	SEQ ID NO:26

根据实施例2所述的方法诱导表达，收集各类细胞进行转化分析，结果如表7所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重5g/L，L-谷氨酸1g/L，左旋多巴20g/L，pH 8.0，温度为40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间12小时。

表7转化结果比较

将效果最好的E.coli HM(PG-gltS)命名为E.coli HMG。

实施例8

根据实例7的方法将E.coli HMG中nadA、pdxJ基因前增加大肠杆菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpdA)前的中等表达强度组成型启动子(PG)，序列如SEQ ID NO:8所示。然后再将质粒导入。

强化基因nadA表达时，以E.coli HMG基因组为模板，以引物nadA-FF/nadA-FR、nadA-gpdA-F/nadA-gpdA-R、nadA-RF/nadA-RR,扩增出上游、启动子、下游序列，并以nadA-FF和nadA-RR为引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含nadA sgRNA)一起转入E.coli HMG后，Cas9/sgRNA诱发宿主在nadA基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到nadA基因之前，并测序验证。

强化基因pdxJ表达时，以E.coli HMG基因组为模板，以引物pdxJ-FF/pdxJ-FR、pdxJ-gpdA-F/pdxJ-gpdA-R、pdxJ-RF/pdxJ-RR,扩增出上游、启动子、下游序列，并以pdxJ-FF和pdxJ-RR为引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含pdxJ sgRNA)一起转入Escherichia coli HMG后，Cas9/sgRNA诱发宿主在pdxJ基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到pdxJ基因之前，并测序验证。

下表8为引物名称与序列表序号的对应索引。

表8引物名称与序列表序号对照

名称	序列表中编号
		pdxJ sgRNA	SEQ ID NO:13
nadA sgRNA	SEQ ID NO:1
		pdxJ-FF	SEQ ID NO:14
pdxJ-FR	SEQ ID NO:15
		pdxJ-gpdA-F	SEQ ID NO:16
pdxJ-gpdA-R	SEQ ID NO:17
		pdxJ-RF	SEQ ID NO:18
pdxJ-RR	SEQ ID NO:19
		nadA-FF	SEQ ID NO:2
nadA-FR	SEQ ID NO:3
		nadA-gpdA-F	SEQ ID NO:4
nadA-gpdA-R	SEQ ID NO:5
		nadA-RF	SEQ ID NO:6
nadA-RR	SEQ ID NO:7

基因改造完成后，将共表达质粒导入。根据实施例2所述的方法诱导表达，收集各类细胞进行转化分析，结果如表9所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重为20g/L，L-谷氨酸200g/L，左旋多巴120g/L，pH 9.0，温度为30℃，摇床转速250转/分钟；转化时间24小时。

表9转化结果比较

将最好的E.coli HMG(PG-nadA,PG-pdxJ)命名为E.coli HNP。

实施例9

根据实施例2所述诱导表达方法，将E.coli HNP/(pRSFDuet-lcaro-bsgdh,pETDuet-pmkdc-ecadh2)诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重1g/L，L-谷氨酸1g/L，左旋多巴1g/L，pH 6.0，温度为15℃，摇床转速250转/分钟；转化时间1小时。测定结果，羟基酪醇浓度为86mg/L。

实施例10

根据实施例2所述诱导表达方法，将表9中菌株诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重200g/L，L-谷氨酸20g/L，左旋多巴200g/L，pH 8.5，温度为40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间48小时。将沉淀全部稀释溶解后测定结果，测定结果如表10所示。

表10测定结果比较

以上所述的L-α-氨基酸转氨酶、L-谷氨酸基因、α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶及其共表达基因工程菌的构建、菌体的培养基组成及培养方法和全细胞生物转化仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则和精神之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均就包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种生产羟基酪醇的方法

<160> 50

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttaacggcgt cggcttcggg 20

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcgaatcctg cacgacccac cacta 25

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcggccactc atcaacatga ttcatcgaca ttagcgtaat attcgctgtt 50

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aacagcgaat attacgctaa tgtcgatgaa tcatgttgat gagtggccga 50

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgtctggatc aaacattacg ctcatggttt tctcctgtca ggaacgttcg 50

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgaacgttcc tgacaggaga aaaccatgag cgtaatgttt gatccagaca 50

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

catccacgga caatgcgcgc agctg 25

<210> 8

<211> 1100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgaatcatg ttgatgagtg gccgatcgct acgtgggaag aaaccacgaa actccattgc 60

gcaatacgct gcgataacca gtaaaaagac cagccagtga atgctgattt gtaaccttga 120

atatttattt tccataacat ttcctgcttt aacataattt tccgttaaca taacgggctt 180

ttctcaaaat ttcattaaat attgttcacc cgttttcagg taatgactcc aacttattga 240

tagtgtttta tgttcagata atgcccgatg actttgtcat gcagctccac cgattttgag 300

aacgacagcg acttccgtcc cagccgtgcc aggtgctgcc tcagattcag gttatgccgc 360

tcaattcgct gcgtatatcg cttgctgatt acgtgcagct ttcccttcag gcgggattca 420

tacagcggcc agccatccgt catccatatc accacgtcaa agggtgacag caggctcata 480

agacgcccca gcgtcgccat agtgcgttca ccgaatacgt gcgcaacaac cgtcttccgg 540

agcctgtcat acgcgtaaaa cagccagcgc tggcgcgatt tagccccgac atagccccac 600

tgttcgtcca tttccgcgca gacgatgacg tcactgcccg gctgtatgcg cgaggttacc 660

gactgcggcc tgagtttttt aagtgacgta aaatcgtgtt gaggccaacg cccataatgc 720

gggcagttgc ccggcatcca acgccattca tggccatatc aatgattttc tggtgcgtac 780

cgggttgaga agcggtgtaa gtgaactgca gttgccatgt tttacggcag tgagagcaga 840

gatagcgctg atgtccggcg gtgcttttgc cgttacgcac caccccgtca gtagctgaac 900

aggagggaca gctgatagaa acagaagcca ctggagcacc tcaaaaacac catcatacac 960

taaatcagta agttggcagc atcaccccgt tttcagtacg ttacgtttca ctgtgagaat 1020

ggagattgcc catcccgcca tcctggtcta agcctggaaa ggatcaattt tcatccgaac 1080

gttcctgaca ggagaaaacc 1100

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tatgcccgtc gatcgcgccc 20

<210> 10

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccaagatcac gcacgtaccg tcgatgtatc tctctgaact gccagggaaa aaccacggtt 60

agatcagcaa gcgttgccgg gaaatgggcg tcgataccat tatcgttttc gacacccact 120

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tcatcgagta cctcttgcgc 20

<210> 12

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tagcctgata tgcacgctta tcttcactgt ctttcccact cgccgctggt gggatatgtc 60

aatggcgtga ttgccagcgc ccgcgagcgt attgcggctt tctcccctga actggtggtg 120

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgtcgcggtc agtaatgtga 20

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gcagaagaag atggtcattg gcaac 25

<210> 15

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tcggccactc atcaacatga ttcattcgct taggcataaa ttgccggaac 50

<210> 16

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gttccggcaa tttatgccta agcgaatgaa tcatgttgat gagtggccga 50

<210> 17

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tgacgcctaa cagtaattca gccatggttt tctcctgtca ggaacgttcg 50

<210> 18

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cgaacgttcc tgacaggaga aaaccatggc tgaattactg ttaggcgtca 50

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tcacagcaaa acgcttcgcc agaaa 25

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ttatggcttc accaatgcga 20

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

taagggttac gttgacggtt aagca 25

<210> 22

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tcggccactc atcaacatga ttcattgctt aaccgtcaac gtaaccctta 50

<210> 23

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

taagggttac gttgacggtt aagcaatgaa tcatgttgat gagtggccga 50

<210> 24

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ttgctaaagt atcgagatga aacatggttt tctcctgtca ggaacgttcg 50

<210> 25

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

cgaacgttcc tgacaggaga aaaccatgtt tcatctcgat actttagcaa 50

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

agccagctcc cacagtttca gcccc 25

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

atgacactat ttagagacga 20

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ttagttgata cagttagc 18

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

atgaagttgc aaccattaaa t 21

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ctaggcggct ttatgcgcag c 21

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

atgtttgaga acattaccgc cg 22

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

cagcactgcc acaatcgctt c 21

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gtgtttcaaa aagttgacgc c 21

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

catcaccgca gcaaacgcc 19

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

atgacaaaca cagttattaa g 21

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

gaatgaatat aatgaacttt ttg 23

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

atgtatacag taggagatta c 21

<210> 38

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

tgatttattt tgttcagcaa atag 24

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

atgtcgatga taaaaagcta tg 22

<210> 40

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

ataatcggct ttcaacacca cgcgg 25

<210> 41

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

atgaagatca aagctgttg 19

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

gtctgttagt gtgcgattat c 21

<210> 43

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

atggatcaga catattctct gga 23

<210> 44

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

aatcacaccc tgcgccagca tcg 23

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

atgcaagccg cagaacccag 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

gagccccttc gagcggtagg 20

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

atgagcaagt atgttgacag ag 22

<210> 48

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

ccaagcaatg ccctgagcca tc 22

<210> 49

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

atggcagccg atcgaaac 18

<210> 50

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

tatccagcct ctaaaacgcg a 21

Claims

1.一种生产羟基酪醇的方法，其特征在于，所述方法是利用一种大肠杆菌重组菌以L-多巴为底物生产羟基酪醇；所述大肠杆菌重组菌同时表达4种酶，分别为L-α-氨基酸转氨酶、L-谷氨酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶，并在宿主大肠杆菌的基础上敲除了酚类化合物分解相关的基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生产羟基酪醇化合物，是进行全细胞转化生产。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述全细胞转化生产的体系中，包括新鲜细胞湿重为1-200g/L，左旋多巴1-200g/L，L-谷氨酸1-200g/L。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述全细胞转化生产的体系中，pH 6.0-9.0。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述全细胞转化生产的体系的温度为15-40℃。

6.根据权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于，所述全细胞转化生产的体系的反应时间为1-48小时。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌重组菌强化表达了谷氨酸转运基因、NAD合成基因、磷酸吡哆醛合成基因一种或者多种组合。

8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述酚类化合物分解相关的基因为hpaD、mhpB中的任意一种或者两种组合。

9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌重组菌采用pRSFDuet-1和pETDuet-1双质粒共表达编码这4个酶的基因；pRSFDuet-1装载L-α-氨基酸转氨酶和L-谷氨酸脱氢酶，pETDuet-1装载α-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶。

10.根据权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌重组菌是将pRSFDuet-1和pETDuet-1质粒转化到宿主Escherichia coli B21感受态细胞中得到的。