CN107586794A

CN107586794A - 异源代谢途径生产酪醇及羟基酪醇的方法

Info

Publication number: CN107586794A
Application number: CN201711054680.5A
Authority: CN
Inventors: 孙新晓; 袁其朋; 李向来; 陈振娅
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2017-11-01
Filing date: 2017-11-01
Publication date: 2018-01-16
Anticipated expiration: 2037-11-01
Also published as: CN107586794B

Abstract

本发明公开了异源代谢途径生产酪醇及羟基酪醇的方法。所述产羟基酪醇的宿主中导入了羟基酪醇生产的代谢途径。更确切的说，是在宿主中高效表达了氨基转移酶(Aminotransferase)，酮酸脱羧酶(Ketoacid decarboxylase)，醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase)来生产酪醇，再引入4‑羟基苯乙酸羟化酶(4‑Hydroxyphenylacetate hydroxylase)来生产羟基酪醇。这些酶所编码的基因构建在表达质粒上或者整合到基因组上。将酶所编码的基因导入宿主中，结果得到了可以利用葡萄糖，甘油，酪氨酸等生产羟基酪醇的生产宿主，同时本发明还公开了一种双相培养的方法，使得羟基酪醇的生产更为高效。

Description

异源代谢途径生产酪醇及羟基酪醇的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更确切的说，本发明涉及异源生物合成酪醇，羟基酪醇的代谢途径及双相培养的方法，通过增强上游莽草酸途径酶的表达，选择来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造的外源酶，选用原始或改造过的细菌，真菌，植物细胞或动物细胞作为宿主细胞，最终提高了酪醇，羟基酪醇的产量。

背景技术

酪醇是红景天属植物中主要活性化合物之一，具有抗缺氧、抗疲劳、抗辐射、抗癌、延缓衰老、调节机体免疫等方面具有显著作用，其主要用作医药、香料合成的中间体，例如合成心血管药美多心安，倍它素洛尔等。羟基酪醇(HT)是主要在橄榄中存在的天然酚类化合物，它具有强大的抗氧化活性，许多研究已经证明了羟基酪醇的疾病预防潜力，它可以保护脂质免受氧化损伤，抑制血小板聚集，具有清除自由基的作用，还有着抗肿瘤、抗炎、抗微生物等活性。此外，羟基酪醇具有良好的生物利用度和没有已知的毒性。因此，它在食品添加剂，功能食品甚至药品中的有着巨大的应用前景。然而，由于缺乏有效的生产方法，羟基酪醇还无法进行大规模生产。目前，羟基酪醇主要来源于橄榄叶提取物，或从橄榄油或橄榄油厂废水萃取，但是这些过程回收率低，持续时间长，环境污染大，产品纯度低，且难以分离。而其他报道用化学转化或生物转化来合成羟基酪醇的方法，也都存在产量低，路径复杂，周期漫长等缺点。本发明主要目的在于实现羟基酪醇的生物学方法的高效合成。筛选了催化效率较高的酶来实现羟基酪醇的生产，同样人工设计了新的代谢途径实现了羟基酪醇的从头合成，另外本发明还公开了一种双相培养的发酵方法来提高羟基酪醇的产量。实验结果表明，在优化条件下，酪醇从酪氨酸或从简单的碳源利用代谢工程菌能分别达到1469±56mg/L和550±26mg/L的产量，羟基酪醇从酪氨酸或从简单的碳源利用代谢工程菌能分别达到1243±165mg/L和647±35mg/L的最终产量。

发明内容

本发明的目的是提供了高产酪醇的宿主，通过向原始或改造过的细菌，真菌，植物细胞或动物细胞中导入中一条高效生产酪醇的途径，选择来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造的氨基转移酶(AT)、酮酸脱羧酶(KDC)，醇脱氢酶(ADH)，通过这些酶在宿主中的高效表达，实现酪醇从葡萄糖，甘油，酪氨酸的合成。

本发明的目的是提供了高产羟基酪醇的宿主，通过向原始或改造过的细菌，真菌，植物细胞或动物细胞中导入一条高效生产羟基酪醇的途径，选择来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造的氨基转移酶(AT)，酮酸脱羧酶(KDC)，醇脱氢酶(ADH)，4-羟基苯乙酸3-单加氧酶(HpaBC)，通过这些酶在宿主中的高效表达，实现羟基酪醇从葡萄糖，甘油，酪氨酸的合成。

本发明的又一目的是提供一种双相培养的方法，通过在发酵开始后的0h-36h中采取1-4次等量添加有机溶剂正辛醇，正壬醇，正癸醇，正己烷或乙酸已酯的方法来实现酪醇与羟基酪醇的高效萃取，以减少生物毒性来实现酪醇与羟基酪醇的高效生产。

本发明的另一个目的是提供所述产酪醇、羟基酪醇的不同宿主的发酵生产方法。

为了实现上述目的，本发明提供了能够产酪醇，羟基酪醇的宿主，向原始或改造过的细菌，真菌，植物细胞或动物细胞中导入含有这两种化合物生物合成路径相关基因，制备所述的酪醇，羟基酪醇的不同宿主。

一种异源生产酪醇的方法，其特征在于：其中，路径包括酪氨酸到酪醇的生物合成中所涉及的酶，包括氨基转移酶AT，酮酸脱羧酶KDC，醇脱氢酶ADH；催化反应包括AT催化酪氨酸生成对羟基苯丙酮酸，KDC催化对羟基苯丙酮酸生成对羟基苯乙醛，ADH催化对羟基苯乙醛生成酪醇。

能够完成酪氨酸到酪醇的生物合成路径的宿主的基因表达元件为下述1)，2)和3)中的一种:

1)表达下游途径，选择来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造，编码氨基转移酶AT的基因，酮酸脱羧酶KDC的基因，醇脱氢酶ADH的基因；

2)过表达上游途径，选择来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造，编码莽草酸途径TyrA^fbr,PpsA,TktA和AroG^fbr的基因tyrA^fbr,ppsA,tktA和aroG^fbr；

3)同时表达1)和2)。

一种异源生产羟基酪醇的方法，其特征在于：其中，路径包括酪氨酸到羟基酪醇的生物合成中所涉及的酶，包括氨基转移酶AT，酮酸脱羧酶KDC，醇脱氢酶ADH，4-羟基苯乙酸3-单加氧酶HpaBC；催化反应包括AT催化酪氨酸生成对羟基苯丙酮酸，KDC催化对羟基苯丙酮酸生成对羟基苯乙醛，ADH催化对羟基苯乙醛生成酪醇，HpaBC催化酪醇生成羟基酪醇。

能够完成酪氨酸到羟基酪醇的生物合成路径的宿主的基因表达元件为如下1)，2)和3)中的一种:

1)表达下游途径，选择来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造，编码氨基转移酶AT的基因，酮酸脱羧酶KDC的基因，醇脱氢酶ADH的基因，4-羟基苯乙酸3-单加氧酶HpaBC的基因；

3)同时表达1)和2)。

酪醇，羟基酪醇生产途径的宿主包括细菌，真菌，植物细胞或动物细胞，也包括改造过的细菌，真菌，植物细胞或动物细胞。

宿主引入了双相培养的方法来减少产物对细胞毒性，其中,双相培养中有机相溶剂包括正辛醇，正壬醇，正癸醇，正己烷，乙酸已酯；水相与有机相体积比为0.5-4；有机相添加方式为1-4次等量添加，添加时间为发酵开始后0h-36h。

选用细菌，真菌，植物细胞或动物细胞作为宿主进行发酵实验，实验条件的优化：在含有葡萄糖、甘油、酪氨酸的培养基中培养产酪醇，羟基酪醇的宿主，选用相当于发酵液体积1％-4％的接种量，加入的诱导剂浓度为0.25mM-1mM，选用37℃的诱导温度。

本发明还提供了微生物产酪醇，羟基酪醇的方法：第一种是体外添加酪氨酸，向原始或改造过的细菌，真菌，植物细胞或动物细胞中导入氨基转移酶(AT)，酮酸脱羧酶(KDC)，醇脱氢酶(ADH)，4-羟基苯乙酸3-单加氧酶(HpaBC)的基因，并在37℃下进行发酵。从发酵液中取样，利用高效液相色谱对产物的浓度进行了分析；第二种是酪醇，羟基酪醇的从头合成，分别将产酪醇，羟基酪醇的两个宿主，过夜培养之后，转接M9培养基中，在37℃培养48h。添加诱导剂后每隔12h取样测OD，并用高效液相色谱测定酪醇，羟基酪醇的浓度。

本发明还提供了微生物高产酪醇，羟基酪醇的方法，具体有以下几种：第一是过表达了增强上游通量的酶TPTA(tyrA^fbr,ppsA,tktA和aroG^fbr)。第二是优化了发酵的温度。第三是减去了培养基中存在的NH₄Cl。第四是添加了抗坏血酸(VC)。最终酪醇体外添加产量达到1469±56mg/L和从头合成产量达到550±26mg/L，羟基酪醇体外添加产量达到1243±165mg/L和从头合成产量达到647±35mg/L。

本发明还提供了高产羟基酪醇的双相培养的方法，通过选择无生物毒性的有机溶剂，包括正辛醇，正壬醇，正癸醇，正己烷，乙酸已酯，并优化了有机溶剂添加的时间和比例，最终羟基酪醇体外添加达到了1243±165mg/L和从头合成达到了647±35mg/L的最终产量。

如上文所述，本发明涉及酪醇，羟基酪醇的有效生产方法，所述方法的特征在于：通过筛选活性高及高效表达的酶，设计双相培养的方法，并且优化发酵过程中的培养基及培养条件，从而实现酪醇，羟基酪醇的高效从头合成。

附图说明

图1从头合成与添加实验产酪醇，羟基酪醇的路径；

图2导入氨基转移酶(AT)，酮酸脱羧酶(KDC)，醇脱氢酶(ADH)基因的原始或改造过的细菌，真菌，植物细胞或动物细胞在不同温度下转化酪氨酸到酪醇的发酵结果；

图3导入氨基转移酶(AT)，酮酸脱羧酶(KDC)，醇脱氢酶(ADH)，4-羟基苯乙酸3-单加氧酶(HpaBC)基因的原始或改造过的细菌，真菌，植物细胞或动物细胞在去掉NH₄Cl，添加抗坏血酸(VC)，添加有机溶剂进行双相培养的条件下分别转化酪氨酸到羟基酪醇的发酵结果；

图4导入氨基转移酶(AT)，酮酸脱羧酶(KDC)，醇脱氢酶(ADH)，莽草酸途径TyrA^fbr,PpsA,TktA和AroG^fbr酶基因的原始或改造过的细菌，真菌，植物细胞或动物细胞，从葡萄糖，甘油出发头合成酪醇的发酵结果；

图5导入氨基转移酶(AT)，酮酸脱羧酶(KDC)，醇脱氢酶(ADH)，4-羟基苯乙酸3-单加氧酶(HpaBC)，莽草酸途径TyrA^fbr,PpsA,TktA和AroG^fbr酶基因的原始或改造过的细菌，真菌，植物细胞或动物细胞，在去掉NH₄Cl，添加抗坏血酸(VC)，添加有机溶剂进行双相培养的条件下分别从葡糖糖，甘油出发从头合成羟基酪醇的发酵结果。

具体实施方式

具体实施例1

体外添加酪氨酸产酪醇和羟基酪醇

发酵过程中在培养基直接添加的酪氨酸，经过筛选来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造的氨基转移酶(AT)，酮酸脱羧酶(KDC)，醇脱氢酶(ADH)催化生成酪醇，而在此基础上再引入4-羟基苯乙酸3-单加氧酶(HpaBC)催化生成羟基酪醇。PCR获得氨基转移酶(AT)，酮酸脱羧酶(KDC)，醇脱氢酶(ADH),4-羟基苯乙酸3-单加氧酶(HpaBC)的基因片段，接着用限制性核酸内切酶对基因片段和质粒载体进行酶切，将酶切后的片段进行胶回收或柱回收，之后将氨基转移酶(AT)，酮酸脱羧酶(KDC)，醇脱氢酶(ADH)目的基因***到质粒pZE12-luc(高拷贝)上，获得pZE-ARO10-ADH6重组质粒；将4-羟基苯乙酸3-单加氧酶(HpaBC)目的基因***到质粒pCS27(中拷贝)上，获得pCS-HpaBC重组质粒(表1)。

电转法制备感受态的细胞，并分装100μL于1.5mL的EP管用于转化。将构建好的质粒pZE-ARO10-ADH6 2μL，和pZE-ARO10-ADH62μL与pCS-HpaBC 2μL的混合质粒分别加入到含有100μL感受态细胞的1.5mL离心管中，混合均匀。接着利用电转仪将质粒电转进入感受态细胞中。电转完成后，加入700μL LB培养基，并将混合物转移到1.5mL离心管中，在37℃下复苏30min。之后取100μL菌液涂到含有氨苄霉素，卡那霉素抗生素的平板上，37℃过夜培养。制备成生产酪醇的菌株ΔBW(pZE-ARO10-ADH6)，与生产羟基酪醇的菌株ΔBW(pZE-ARO10-ADH6、pCS-HpaBC)。

产酪醇和羟基酪醇微生物的发酵

在生产酪醇的菌株ΔBW(pZE-ARO10-ADH6)，与生产羟基酪醇的菌株ΔBW(pZE-ARO10-ADH6、pCS-HpaBC)平板上分别挑取单菌落，接到4mL的带有氨苄霉素，卡那霉素抗性的液体LB中，37℃下培养12h，之后分别将1mL(体积比2％)的菌液接种到50mL的带有氨苄霉素，卡那霉素抗性的发酵培养基(培养基成分包括7g/L Na₂HPO₄，3g/LKH₂PO₄，0.5g/L NaCl，1g/L NH₄Cl，2.5g/L Glucose，5g/L酵母粉，2g/L MOPS)中，直接加入IPTG进行诱导，其浓度为1mM，并在0h，12h，24h时分别添加100g/L酪氨酸1mL(最终浓度为6g/L)。之后分别在12小时，24小时，36小时和48小时的时候取样，并用高效液相色谱测定酪醇，羟基酪醇的浓度。其中，对生产酪醇的菌株ΔBW(pZE-ARO10-ADH6)进行了温度的优化，分别在30℃和37℃下对其进行了发酵，最终37℃下酪醇产量比在30℃下提高800mg；而对生产羟基酪醇的菌株ΔBW(pZE-ARO10-ADH6、pCS-HpaBC)则分别采用了去掉培养基中NH₄Cl，添加抗坏血酸(VC)，添加有机溶剂正癸醇进行双相培养的发酵方法。最终在去掉培养基中NH₄Cl后，羟基酪醇产量比对照组(培养基正常含有NH₄Cl)增加100mg；去掉培养基中NH₄Cl并加入最终浓度1.5g/L的抗坏血酸后羟基酪醇产量比对照组(培养基正常含有NH₄Cl)增加300mg；去掉培养基中NH₄Cl，再加入终浓度1.5g/L抗坏血酸，并在12h后一次性的在50mL水相中添加25mL有机溶剂正癸醇(水相与有机相体积比为2)进行双相培养后，羟基酪醇产量比对照组(培养基正常含有NH₄Cl)增加600mg。添加实验生产酪醇的最终产量如图2所示，添加实验生产羟基酪醇最终产量如图3所示。

具体实施例2

微生物异源合成酪醇与羟基酪醇代谢途径的构建

从葡萄糖、甘油出发，经过莽草酸途径从而合成酪氨酸，酪氨酸再经过筛选来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造的氨基转移酶(AT)，酮酸脱羧酶(KDC)，醇脱氢酶(ADH)从而催化生成酪醇，而在酪醇的基础上再引入4-羟基苯乙酸3-单加氧酶(HpaBC)，可催化酪醇到羟基酪醇的反应。用PCR获得氨基转移酶(AT)，酮酸脱羧酶(KDC)，醇脱氢酶(ADH),4-羟基苯乙酸3-单加氧酶(HpaBC)和增强莽草酸途径的TyrA^fbr,PpsA,TktA和AroG^fbr酶的基因片段，接着用限制性核酸内切酶对基因片段和质粒载体进行酶切，将酶切后的片段进行胶回收或柱回收，之后将目的基因***到质粒pZE12-luc(高拷贝)和pCS27(中拷贝)上，获得pZE-ARO10-ADH6，pCS-TPTA与pCS-TPTA-HpaBC(表1)。

取构建好的质粒pZE-ARO10-ADH6 2μL与pCS-TPTA 2μL混合，取pZE-ARO10-ADH6 2μL与pCS-TPTA-HpaBC 2μL混合，分别电转到已经被制成感受态的100μL大肠杆菌中，电转完成后，加入700μLLB培养基，并将混合物转移到1.5mL离心管中，在37℃下复苏30min。之后取100μL菌液涂到含有氨苄霉素，卡那霉素抗生素的平板上，37℃过夜培养。分别形成从头合成酪醇与羟基酪醇的菌株ΔBW(pZE-ARO10-ADH6、pCS-TPTA)，ΔBW(pZE-ARO10-ADH6、pCS-TPTA-HpaBC)。

从头合成酪醇，羟基酪醇微生物的发酵

在大肠杆菌基因工程菌株ΔBW(pZE-ARO10-ADH6、pCS-TPTA)与ΔBW(pZE-ARO10-ADH6、pCS-TPTA-HpaBC)的平板上挑取单菌落，接到4mL的带有氨苄霉素，卡那霉素抗性的液体LB中，37℃培养12h，之后分别将1mL(体积比2％)的菌液接种到50mL的带有氨苄霉素，卡那霉素抗性的发酵培养基(培养基成分包括7g/L Na₂HPO₄，3g/LKH₂PO₄，0.5g/L NaCl，1g/LNH₄Cl，2.5g/L Glucose，2g/L酵母粉，2g/L MOPS)中，直接加入IPTG进行诱导，其浓度为1mM。之后分别在12小时，24小时，36小时和48小时的时候取样，并用高效液相色谱测定酪醇，羟基酪醇的浓度。其中，对生产羟基酪醇的菌株ΔBW(pZE-ARO10-ADH6、pCS-TPTA-HpaBC)则分别采用了添加抗坏血酸(VC)，添加有机溶剂正癸醇进行双相培养的发酵方法，添加终浓度1g/L的抗坏血酸后羟基酪醇产量比对照组增加100mg；加入终浓度1g/L的抗坏血酸，并同时在12h后一次性的在50mL水相中添加25ml有机溶剂正癸醇(水相与有机相体积比为2)进行双相培养后，羟基酪醇产量比对照组增加150mg。从头合成酪醇的最终产量如图4所示，从头合成羟基酪醇的最终产量如图5所示。

表1宿主和质粒

Claims

1.一种异源生产酪醇的方法，其特征在于：其中，路径包括酪氨酸到酪醇的生物合成中所涉及的酶，包括氨基转移酶AT，酮酸脱羧酶KDC，醇脱氢酶ADH；催化反应包括AT催化酪氨酸生成对羟基苯丙酮酸，KDC催化对羟基苯丙酮酸生成对羟基苯乙醛，ADH催化对羟基苯乙醛生成酪醇。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：能够完成酪氨酸到酪醇的生物合成路径的宿主的基因表达元件为下述1)，2)和3)中的一种:

3)同时表达1)和2)。

3.一种异源生产羟基酪醇的方法，其特征在于：其中，路径包括酪氨酸到羟基酪醇的生物合成中所涉及的酶，包括氨基转移酶AT，酮酸脱羧酶KDC，醇脱氢酶ADH，4-羟基苯乙酸3-单加氧酶HpaBC；催化反应包括AT催化酪氨酸生成对羟基苯丙酮酸，KDC催化对羟基苯丙酮酸生成对羟基苯乙醛，ADH催化对羟基苯乙醛生成酪醇，HpaBC催化酪醇生成羟基酪醇。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：能够完成酪氨酸到羟基酪醇的生物合成路径的宿主的基因表达元件为如下1)，2)和3)中的一种:

3)同时表达1)和2)。

5.如权利要求1-4任意一项所述的方法，其特征在于：酪醇，羟基酪醇生产途径的宿主包括细菌，真菌，植物细胞或动物细胞，也包括改造过的细菌，真菌，植物细胞或动物细胞。

6.如权利要求1-5任意一项所述的方法，其特征在于：宿主引入了双相培养的方法来减少产物对细胞毒性，其中,双相培养中有机相溶剂包括正辛醇，正壬醇，正癸醇，正己烷，乙酸已酯；水相与有机相体积比为0.5-4；有机相添加方式为1-4次等量添加，添加时间为发酵开始后0h-36h。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：选用细菌，真菌，植物细胞或动物细胞作为宿主进行发酵实验，实验条件的优化：在含有葡萄糖、甘油、酪氨酸的培养基中培养产酪醇，羟基酪醇的宿主，选用相当于发酵液体积1％-4％的接种量，加入的诱导剂浓度为0.25mM-1mM，选用37℃的诱导温度。