CN109280671A

CN109280671A - 一个小麦细胞壁相关受体蛋白激酶基因及其表达载体和应用

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Publication number: CN109280671A
Application number: CN201811045486.5A
Authority: CN
Inventors: 曹爱忠; 邢莉萍; 周渭皓; 刘佳倩; 曹姝琪; 袁璐; 王秀娥; 张瑞奇; 肖进; 王海燕; 张守忠
Original assignee: Nanjing Xin Mai Xiu Biological Technology Co Ltd; Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Xin Mai Xiu Biological Technology Co Ltd; Nanjing Agricultural University
Priority date: 2018-09-07
Filing date: 2018-09-07
Publication date: 2019-01-29
Anticipated expiration: 2038-09-07
Also published as: CN109280671B

Abstract

本发明属于基因工程领域，公开了小麦中一个细胞壁相关受体蛋白激酶基因TaWAK6及其表达载体和应用。TaWAK6的cDNA序列为SEQ ID NO.3及其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.4。该基因来自普通小麦(Triticum asetivum L.)南农9918。TaWAK6在抗白粉病小麦品种南农9918中受白粉菌诱导表达增强，且表达水平远高于在感病小麦突变体SM‑1中的表达水平。通过病毒介导基因沉默技术诱导TaWAK6在南农9918中沉默，可使白粉病抗性显著降低；瞬间表达将该基因转化感病小麦突变体SM‑1，可使吸器指数显著降低、白粉病抗性提高。因此，TaWAK6可用于基因工程育种，将其导入易感白粉病小麦品种中，有望提高小麦的白粉病抗性。

Description

一个小麦细胞壁相关受体蛋白激酶基因及其表达载体和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，公开了小麦中一个细胞壁相关蛋白激酶基因TaWAK6及其表达载体和应用。

背景技术

小麦(Triticum aestivum)是一种世界性粮食作物，其适应性强、分布范围广，全世界约有35％-40％的人口以小麦为主要粮食，为人类提供了约20％蛋白质和21％食物热量(李里特，2006)。中国是全球小麦种植和产量第一大国，常年产量约占全球总产量的17％；在国内小麦是第三大粮食作物，其总产量仅次于水稻和玉米(参考文献：何中虎,庄巧生,程顺和,等.中国小麦产业发展与科技进步[J].农学学报,2018(1):99-106.)。我国小麦生产不仅在保障国内粮食安全中发挥重要作用，而且会影响国际粮食安全。

小麦整个生育期受到多种病虫的危害，其中由小麦白粉病菌(Blurmeriagraminis f.sp.tritici，Bgt)引起的小麦白粉病是世界范围内影响小麦生产最为严重的真菌性病害之一，目前已成为危害我国小麦安全生产的主要病害(参考文献：詹海仙,畅志坚,杨足君,等.小麦抗白粉病基因来源及抗性评价的研究进展[J].中国农学通报,2010,26(10):42-46.)。在病害发生严重的地区依旧主要依靠化学药剂防治，损害食品和生态安全。培育抗病品种是防治小麦白粉病、保证小麦安全生产最为经济有效的方法。由于小麦白粉病菌生理小种多、毒力变异快，一旦产生新的毒性小种或小种种群发生变化，会导致小麦白粉病的大爆发，给农业生产带来灾难性后果。广谱持久抗病基因的发掘和利用对白粉病防治具有重要意义，是培育持久抗病品种的前提和保障(Kuraparthy et al.,2007)。

簇毛麦(Haynaldia villosa，2n＝2x＝14，VV)是小麦亲缘物种，携带多个抗病、抗逆基因，将簇毛麦抗病基因导入普通小麦可提高普通小麦遗传多样性。南京农业大学细胞遗传研究所利用四倍体圆锥小麦与二倍体簇毛麦杂交，再与普通小麦回交多代后，选育出了普通小麦-簇毛麦易位系T6VS·6AL(参考文献：Chen PD,Qi LL,Zhou B,Zhang SZ,LiuDJ(1995)Development and molecular cytogenetic analysis of wheat-Haynaldiavillosa 6VS/6AL translocation lines specifying resistance to powderymildew.Theor Appl Genet 91:1125–1128.)，将簇毛麦6VS上携带的广谱高抗白粉病基因Pm21导入普通小麦。T6VS·6AL自1994年进入国内育种利用以来，已经选育出30余个抗白粉病小麦新品种，成为我国白粉病抗病育种的重要种质资源，而Pm21也成为我国主要的白粉病抗源基因。Pm21基因虽然已被克隆(参考文献：Xing,P.Hu,J.Liu,K.Witek,S.Zhou,J.Xu,W.Zhou,L.Gao,Z.Huang,R.Zhang,X.Wang,P.Chen,H.Wang,J.D.G.Jones,M.Karafiátová,J.Vrána,J.J.Y.Tian,Y.Wu,A.Cao,Pm21from Haynaldia villosa encodesa CC-NBS-LRR protein conferring powdery mildew resistance in wheat,Mol.Plant(2018)doi:10.1016/j.molp.2018.02.013.)，但是其介导的抗性途径中有哪些基因参与目前还不清楚。分析Pm21介导的广谱抗性机理和克隆其抗病途径中的基因，对于利用基因工程手段培育具有白粉病广谱抗性的小麦品种具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一个细胞壁相关受体蛋白激酶基因TaWAK6的表达载体和应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

细胞壁相关受体蛋白激酶基因TaWAK6来自普通小麦(Triticum asetivum L.)南农9918，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

该细胞壁相关受体蛋白激酶基因的蛋白质为TaWAK6，其氨基酸序列为SEQ IDNO.4。

含有所述的细胞壁相关受体蛋白激酶基因TaWAK6的重组表达载体pBI220:TaWAK6。

所述的细胞壁相关受体蛋白激酶基因TaWAK6的重组表达载体优选以pBI220为出发载体，将TaWAK6基因***pBI220的BamHI和KpnI酶切位点间所得。

所述的细胞壁相关受体蛋白激酶基因TaWAK6的表达载体在构建抗白粉病小麦品种中的应用。

有益效果：

本发明从小麦中克隆得到了一个细胞壁相关受体蛋白激酶基因TaWAK6及其所编码的蛋白质TaWAK6，将其***表达载体pBI220，得到的该基因的过量表达载体导入感病小麦品种中，可以提高感白粉病小麦品种对白粉病的抗性。TaWAK6的超量表达载体用于基因工程育种，将其导入易感白粉病小麦品种中，能够获得具备白粉病抗性的小麦种质。

附图说明

图1 BSMV:TaWAK6载体酶切验证图

M：DL2000Marker；1：BSMV:TaWAK6质粒；2：BSMV:TaWAK6质粒经NheI酶切；

图2 TaWAK6在南农9918中沉默可导致白粉病抗性显著下降

1、接种BSMV:γ的叶片中白粉菌发育受阻，南农9918的抗性未受影响；

2、3：接种BSMV:TaWAK6的叶片中白粉菌发育正常，南农9918的抗性显著下降；

图3 pBI220:TaWAK6超量表达载体图谱

TaWAK6***pBI220的BamHI和KpnI之间，置于35S启动子下游

图4利用瞬间表达研究TaWAK6基因对吸器形成的影响和抗白粉病效应

TaWAK6在感病材料中瞬间超量表达可显著抑制白粉菌吸器的形成和提高白粉病抗性

具体实施方案

实施例1南农9918中一个细胞壁相关受体蛋白激酶基因TaWAK6的克隆

南农9918是南京农业大学细胞遗传所育成的含有广谱抗白粉病基因Pm21的小麦品种(公知公用，参考文献：陈佩度，张守忠，王秀娥，王苏玲，周波，冯祎高，刘大钧.抗白粉病高产小麦新品种南农9918.南京农业大学学报,2002,25(4):1438-1444)，SM-1是南京农业大学用EMS处理南农9918后筛选获得的感白粉病突变体(公知公用，参考文献：Xing,P.Hu,J.Liu,K.Witek,S.Zhou,J.Xu,W.Zhou,L.Gao,Z.Huang,R.Zhang,X.Wang,P.Chen,H.Wang,J.D.G.Jones,M.Karafiátová,J.Vrána,J.J.Y.Tian,Y.Wu,A.Cao,Pm21from Haynaldia villosa encodes a CC-NBS-LRR protein conferring powderymildew resistance in wheat,Mol.Plant(2018)doi:10.1016/j.molp.2018.02.013.)。为了筛选南农9918受白粉菌诱导表达的基因，采用高通量测序的方法获得抗白粉病小麦南农9918与感白粉病突变体SM-1(公知公用，参考文献：Xing,P.Hu,J.Liu,K.Witek,S.Zhou,J.Xu,W.Zhou,L.Gao,Z.Huang,R.Zhang,X.Wang,P.Chen,H.Wang,J.D.G.Jones,M.Karafiátová,J.Vrána,J.J.Y.Tian,Y.Wu,A.Cao,Pm21from Haynaldia villosaencodes a CC-NBS-LRR protein conferring powdery mildew resistance in wheat,Mol.Plant(2018)doi:10.1016/j.molp.2018.02.013.)的数字基因表达谱，并在此基础上筛选抗感材料中的差异表达基因。具体流程如下：将抗白粉病小麦南农9918的种子和感白粉病小麦SM-1的种子播于培养皿中发芽，露白后移栽到盆钵，一叶期把从感白粉病小麦材料上搜集的白粉菌孢子接种到苗上进行诱导，并于接种前和接种后24小时取样，生物学重复三次。使用Trizol试剂分别提取RNA(Invitrogen，USA)，形成测序样本：R24(南农9918诱导24小时的三个生物学重复样品)、R0(南农9918非诱导的三个生物学重复样品)、S24(SM-1诱导24小时的三个生物学重复样品)、S0(SM-1非诱导的三个生物学重复样品)。四个RNA送交北京六合华大基因科技股份有限公司进行数字基因表达谱的测序。样品间数据的比较，包括R24vs R0，S24vs S0，R24vs S24，以测序条数的比值大于2为标准，筛选在南农9918中诱导上调表达的基因。其中一个差异表达基因为Ta#S58887995，该基因是一个细胞壁相关受体蛋白激酶基因，该基因在R24与R0比较时显示为差异表达基因，即在抗病南农9918中该基因受白粉菌诱导表达；在S24与S0比较时显示为非差异表达基因，即在感病SM-1中该基因不受白粉菌诱导表达基因；在R24与S24比较时显示为差异表达基因，即在抗病南农9918与感病SM-1白粉菌诱导24小时该基因的表达存在差异。基于数字基因表达谱的分析，初步判断Ta#S58887995与白粉病抗性具有密切相关性。

以南农9918经白粉菌诱导24小时的叶片提取出的RNA反转录成cDNA为模板、以根据数字基因表达谱筛选的基因Ta#S58887995设计的引物P1(ATGTCACAAGCAAAGCTCAT,SEQID NO.1)和P2(TCATCTAGGAATTTCAGATG,SEQ ID NO.2)为引物进行RT-PCR，获得了Ta#S58887995基因的cDNA全长片段。PCR流程如下：5μl cDNA模板(100ng/ul)、2μl的P1引物(10μM)、2μl的P2引物、25μl Phanta Max buffer(2×)、2μl dNTP Mix(10mM)、1μl Phanta MaxSuper-Fidelity DNA polymerase(1U/μl)(Vazyme，China)，加水至50μl。PCR反应条件：95℃预变性3分钟；95℃15秒，60℃40秒，72℃2分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。PCR产物经1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带的特异性和大小，回收特异扩增条带(AP-GX-50，Axygen)并连接到TOPO克隆载体(Vazyme,Nanjing,China)。

对***TOPO克隆载体中的基因片段进行测序和比对，发现该基因为细胞壁相关受体蛋白激酶基因，与Ta#S58887995序列一致，命名为TaWAK6。对TaWAK6进行生物信息学分析，发现ORF(开放阅读框)2265bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码754个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。在NCBI中用BLASTP进行保守区域分析，发现该基因的氨基酸序列包含GUB WAK,EGF-like和kinase结构域，属于典型的细胞壁相关受体蛋白激酶基因。

实施例2利用BMSV-VIGS***研究TaWAK6的抗白粉病功能

病毒诱导的基因沉默(Virus Induced Gene Silencing，VIGS)是指携带目标基因片段的病毒侵染植物后，可诱导植物内源基因沉默、引起表型变化，进而根据表型变异研究目标基因的功能。与传统的基因功能分析方法相比，VIGS可以快速对目标基因进行沉默和功能鉴定克服功能重复。大麦条花叶病毒BSMV(Barley Stripe Mosaic Virus,BSMV)已经被改造，用于小麦中基因沉默和功能验证(参考文献：Zhou H,Li S,Deng Z,Wang X,ChenT,Zhang J,Chen S,Ling H,Zhang A,Wang D,Zhang X(2007)Molecular analysis ofthree new receptor-like kinase genes from hexaploid wheat and evidence fortheir participation in the wheat hypersensitive response to stripe rustfungus infection.Plant J 52:420–434)。

构建BSMV:TaWAK6载体的TaWAK6***片段的扩增：以TaWAK6为模板设计引物携带NheI酶切点的引物P3(GCTGCTAGCTGAAGATGCTGAGGTGGTTG，SEQ ID NO.5)和P4(GCTGCTAGCGGAATTTCGGATGATTGGAT，SEQ ID NO.6)，P3和P4的5’端均引入限制性内切酶NheI的酶切位点以及保护性碱基(引物5’端下划线序列中GCTAGC为NheI的酶切位点，GCT为保护碱基)，以便扩增出的片段利用NheI酶切***BSMV的γ载体。具体扩增如下：以P3和P4为引物，以含有TaWAK6的TOPO质粒为模板进行PCR，扩增TaWAK6中249bp片段。PCR程序：2μl质粒模板(100ng/ul)、2μl的P3引物(10μM)、2μl的P4引物、25μl Phanta Max buffer(2×)、2μl dNTP Mix(10mM)、1μl Phanta Max Super-Fidelity DNA polymerase(1U/μl)(Vazyme，China)，加水至50μl。PCR反应条件：95℃预变性3分钟；95℃15秒，60℃15秒，72℃30秒，35个循环；72℃延伸5分钟。PCR产物经1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带的特异性和大小(附图2)，回收特异扩增条带(AP-GX-50，Axygen)。

BSMV:TaWAK6载体的构建：TaWAK6扩增产物回收后，用限制性内切酶NheI完全酶切，同时利用限制性内切酶NheI完全酶切BSMV:PDS载体，切下一个200bp左右的***片段(为PDS基因序列)以及一个大于2kb的载体片段；将TaWAK6酶切后的回收片段与BSMV:PDS酶切后的载体片段利用T4连接酶连接(NEB，USA)，连接产物转化感受态大肠杆菌，涂氨苄抗性的平板，挑选单克隆。单克隆摇菌培养后，利用菌液作为模板进行PCR筛选有反向***子的阳性克隆。具体步骤如下：先用P3和P4为左右引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳，筛选出***了目的基因片段的阳性单克隆；以阳性单克隆的菌液为模板，以载体上的γ-strain-p引物P5为左引物(5′-CAACTGCCAATCGTGAGTAGG-3′，SEQ ID NO.7，引物距离NheⅠ酶切位点约230bp)、以TaWAK6的正向引物P3为右引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳，如果能扩增出比目标条带大230bp的片段，则表明单克隆中TaWAK6基因反向***在BSMV：γ载体的NheⅠ酶切位点之间。进一步将重组载体利用NheI进行酶切(图1)，验证正确的载体用于下一步体外转录和诱导基因沉默。

体外转录过程：按照质粒中提试剂盒说明书(天根公司)分别抽提BSMV病毒载体α、β、γ、γ-PDS和携带有目标基因外源***片段的重组γ-TaWAK6质粒，再利用RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems-T7试剂盒和Ribo m7G Cap Analog试剂盒对线性化的载体进行体外转录(Promega，USA)。体外转录后取α链转录物、β链转录物与γ链转录物等体积混合，再用三倍体积的DEPC水进行稀释，然后加入2×GKP Buffer(50mM glycine,30mM K2HPO4,pH 9.2,1％bentonite,1％celite)，混合液存于-80℃冰箱备用。

BSMV:TaWAK6接种和白粉病抗性鉴定：对二叶期南农9918小麦进行病毒接种诱导基因沉默。接种时先戴上乳胶手套，取8ul病毒混合物滴加在食指上，然后大拇指和食指互相轻触将病毒混合液在两指之间轻轻涂开，再用两指力度适中地摩擦叶片，直至液体全部消失。全部接种完毕后将盆铂放到周转箱内，用喷壶在周转箱内壁喷上少量DEPC水，盖上周转箱盖子后放置到23℃左右的黑暗生长室内，24小时植株转为正常培养条件生长，生长温度控制在20～28℃。接种后15天针对小麦第四张叶片进行取样和白粉病鉴定，取接种BAMV:γ(接种α链+β链+γ链)的对照叶片和接种BAMV:TaWAK6的TaWAK6沉默叶片(接种α链+β链+γ:TaWAK6)置于6BA保鲜培养基上，用抖落法接种新鲜的白粉菌孢子，接种6-8天后观察叶片发病情况。结果表明：接种BAMV:TaWAK6植株的接种白粉菌6天后，与接种BSMV:γ的对照相比，南农9918对白粉菌的抗性部分丧失，说明TaWAK6在南农9918发挥抗性中起着重要作用(附图2)。

实施例3TaWAK6基因瞬间表达载体的构建

以经白粉菌诱导的南农9918中克隆的TaWAK6基因cDNA为模板，使用引物对TaWAK6-BamHI-F(AGTCCGGAGCTAGCTCTAGAATGTCACAAGCAAAGCTCATC，SEQ ID NO.8)和TaWAK6-KpnI-R(CCCTTGCTCACCATGGATCCTCTAGGAATTTCAGATGATTGG，SEQ ID NO.9)进行PCR扩增，回收扩增片段。PCR程序：2μl质粒模板(100ng/ul)、2μl的P3引物(10μM)、2μl的P4引物、25μl Phanta Max buffer(2×)、2μl dNTP Mix(10mM)、1μl Phanta Max Super-Fidelity DNA polymerase(1U/μl)(Vazyme，China)，加水至50μl。PCR反应条件：95℃预变性3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃30秒，35个循环；72℃延伸5分钟。PCR产物经1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带的特异性和大小，回收特异扩增条带(AP-GX-50，Axygen)。利用BamHI和KpnI双酶切对pBI220(Jefferson RA,Kavanagh TA,Bevan MW.GUS fusions:beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higherplants.EMBO J.1987,6:3901-3907.)进行双酶切并回收载体骨架，利用同源重组试剂盒(ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit，Vazyme)将回收的TaWAK6产物***到酶切回收的载体骨架，将TaWAK6置于35S启动子后面的多克隆位点处。由此将目标基因TaWAK6克隆到强启动子35S的下游，获得表达载体pBI220:TaWAK6(附图3)。经测序验证，表明载体构建成功。

实施例4利用瞬间表达方法将TaWAK6基因转入小麦叶片

瞬间表达方法是一种可靠且快速鉴定基因功能的方法(Schweizer,Pokorny etal.A Transient Assay System for the Functional Assessment of Defense-RelatedGenes in Wheat Molecular Plant-Microbe Interactions.1999,12:647-654.)。本研究利用瞬间表达方法，将质粒DNA包裹到金属微粒外层，借助基因枪将金属微粒和基因轰击到小麦叶片的表皮细胞，然后在SM-1叶片中统计轰击TaWAK6细胞的白粉菌吸器指数与未轰击TaWAK6细胞的白粉菌吸器指数，明确目标基因是否具有白粉病抗病功能。

载体DNA与金属微粒包裹的程序如下：

制备钨粉：称取30mg的钨粉于1.5ml eppendorf管中，加入1ml 70％酒精，涡旋3-5min后静置15min，使钨粉完全沉淀。12000rpm离心1min后弃上清。加入1ml ddH₂O水，涡旋混匀后，离心弃上清(重复三次)。最后加入500μl 50％甘油涡旋混匀，以备用。

包裹子弹：吸取5μl涡旋均匀的钨粉于1.5ml的eppendorf管中，加入5μl质粒DNA(总量应为1μg)。边涡旋边向eppendorf管内滴加50μl 2.5M CaCl₂，然后加入20μl 0.1M亚精氨(现配先用)，涡旋3min。静置1min后离心2s，弃上清。加入140μl 70％酒精，充分涡旋，离心2s，弃上清。然后加入140μl 100％酒精，充分涡旋，离心2s，弃上清。最后加入15μl100％酒精，充分涡旋，以备使用。

实施GUS基因单转化时，将含有GUS基因表达载体pAHC25(Christensen AH,QuailP H.Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectableand/or screenable marker genes in monocotyledonous plants.TransgenicResearch,1996,5:213-218.)的质粒DNA与钨粉包裹；当实施TaWAK6与GUS基因共转化时，将含有TaWAK6基因表达载体pBI220:TaWAK6的质粒DNA与含有GUS基因表达载体pAHC25的质粒DNA按摩尔浓度1:1的比例混合，包裹钨粉。当GUS基因与TaWAK6基因进行共转化时，Marker基因GUS转入的细胞也是TaWAK6转入的细胞。因GUS基因表达的细胞经染色整个细胞呈现蓝色，所以本研究以蓝色细胞作为TaWAK6的表达细胞。

基因枪轰击程序如下：剪下长约6cm的小麦幼苗叶片端部，平行贴在载玻片上，每张玻片贴6片叶片左右。基因枪使用PDS1000/He***，采用1350psi的可裂膜片，真空度为28inHg。轰击后将叶片置于垫有润湿滤纸的瓷盘内，罩以打有小孔的保鲜膜，保湿并透气，18-20℃恢复培养4h后，高密度接种白粉菌分生孢子。接种48h后用GUS染液(配方为：0.1mol/L Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液(pH7.0)，含10mmol/L EDTA，5mmol/L铁***和亚铁***，0.1mg/ml X-Gluc，0.1％Triton X-100，20％甲醇，)真空渗透10min,37℃染色12h，然后用70％酒精脱色2天直至叶片变成白色为止，最后利用浓度为0.6％的考马斯亮蓝对白粉菌孢子染色。

实施例5利用瞬间表达方法研究TaWAK6抗病功能

白粉菌侵入小麦叶片表皮细胞后，在表皮细胞中产生的指状物称为吸器。吸器不能正常产生是叶片细胞对白粉菌具有抗性的重要指标。在GUS表达的细胞中，吸器会被GUS染色液染成蓝色，在显微镜下容易辨认(附图3)。在GUS基因转化细胞后，通过统计与白粉菌互作的GUS表达细胞中，吸器形成的细胞所占的比例(％)，即为“吸器指数”(Schweizer,Pokorny et al.A Transient Assay System for the Functional Assessment ofDefense-Related Genes in Wheat Molecular Plant-Microbe Interactions.1999,12:647-654.)。吸器指数越小，表明抗病性越强。本研究利用“吸器指数”作为抗病强弱的衡量指标。

当单转化GUS基因时，观察了528个GUS表达细胞中，感病小麦SM-1的吸器指数为56.44％；当GUS基因与TaWAK6共转化后，统计了495个GUS表达细胞，感病小麦SM-1的吸器指数为39.20％(统计了495个细胞)(附图4)。该结果说明，TaWAK6能显著的降低吸器指数，对白粉菌具有抗病作用。

序列表

<110> 南京农业大学

南京新麦秀生物科技有限公司

<120> 一个小麦细胞壁相关受体蛋白激酶基因及其表达载体和应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtcacaag caaagctcat 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcatctagga atttcagatg 20

<210> 3

<211> 2265

<212> DNA

<213> 普通小麦(Triticum asetivum L.)

<400> 3

atgtcacaag caaagctcat cgtcgcaacg gtgacggcac ttcagctcct catggcgaca 60

gccgtcgccg ccgtccaggt agccttacct gggtgcccgc aggcctgcgg caacgtcacc 120

gtcccctacc ctttcggctt ccggcgaggc tgctttcgca agggcttcaa cctcacctgc 180

gacgagacgc gccgtccgcc gaggctgctc ctgggcgacg gcgtggaggt ggacgccatc 240

tccctggcgg acggcacggt gcatgtgcag accaaggtcg tggcattccg accactttac 300

acaaacggtg ccgtcggcgc gaggagatct atcgaccaca actactcgtg gtacggcggc 360

ctgccggaag tgtacaagag cggcggcgcg cagctcgcgg tgtccaccga ccacaacgtc 420

tttgtggcca tcgggtgcaa cttcatcggc tacctcgtcg cagtcagcga cgggggtcgc 480

gagtatgtca gcacatgctc cacgctgtgc aacgggaaaa cccgggacgc cttgtgcacg 540

ggcgtcggct gctgctggac gaccatcgcg cagcgttacc ccgggtacca ggtgaagttc 600

aaggatttgg acgatacggc ggcagcgtac gcgggccaaa gccgtgcgtc ggtggccgcg 660

ttcatagtcg atcgcgagtg gttcgtaggc accatgcaga acactgtcag cttcaatgat 720

tttgtcaatg atgatttcgg taacggtccg tccagcatgc ccaccgtgct gcaatggtgg 780

ctagacgtag atagcgaccg tgacttggtc gtcaaggatc cacgttctgc atctcgttgg 840

agatgcataa gcttgaacag tttcgctgcc tacatcggcg acgcagtgaa caaagtaagg 900

tgcaactgct cggatggata cgaaggcaac tcttacatcg ttgacggatg tcaagatatc 960

ggtgagtgct tacggccaga tgtttatccc tgccatggaa catgcatcaa tatgccaggg 1020

acatacagat gctcagcaaa gaaaagaatc atcagcttag caggtctaat taccataata 1080

gcaatcgttg ctggttttgg actactattt tcactcctag gtgttgccca agtcacaaaa 1140

aaactcaaga aaggaagagc caagaagatc agacaaaaat tctttaagaa aaaccatgga 1200

ctgcttctac aacagttaat ctcttcgaac aaagatatag ccgaaaagat gaagattttc 1260

agcttagaag agctagaaca agcaaccaac aaatttgatc ataatcggat ccttggtggc 1320

ggtgggcatg gcacggtgta taaagccatc ttatctgatc aacgtgtcgt ggccatcaag 1380

aaggccaaaa ttgttgtgca aagggaaatc gaccagttca taaatgaggt tgccatactt 1440

tcacagataa accacaggaa tgtggtgaaa ctttttggtt gttgtctcga gacagaagtt 1500

cctctactag tttacgagtt catattgaat ggaactctct cttgtcatct ccatggcaaa 1560

agtgagaacc atttgtcatg gaaaactcga ttgaggattg ctttggaaac tgcaagggct 1620

attgcatctc tacactctgc agcttccata tcagtatacc atagagatat caaatgtgcc 1680

aatattctac ttactgatac tttaatagca aaagtatcag attttggtgc ttcaaggtca 1740

attgcaatag acgggacagg aatacttaca gttgtccaag gaacctatgg ttaccttgat 1800

cctgaatact actacacgag tcgattgacg aagaagagtg atgtttacag ttttggtgtc 1860

atcctagcag agctattgac aagtgtcaca ccagtttttt cttctcattc atcagaagga 1920

acaagcctag catcgcactt tgtatcacta atgagcggca atcgcttgtc agatattcta 1980

gatacacaaa ttattcatga aggaggagtt gaagatgctg aggtggttgc aagacttgca 2040

caagcatgct taagcttaaa aggggaagaa agacctacaa tgaggcaagt ggagacaaca 2100

cttgaagatg tgcataactc aaaggtcaag ctcagttctc agataacaag agtgaatcag 2160

agtgctatga aagatcagcc atggatgggg aacaaaggcg gtgaaggaac taggttatac 2220

agcttggaaa aggagattat ccaatcatct gaaattccta gatga 2265

<210> 4

<211> 754

<212> PRT

<213> 普通小麦(Triticum asetivum L.)

<400> 4

Met Ser Gln Ala Lys Leu Ile Val Ala Thr Val Thr Ala Leu Gln Leu

1 5 10 15

Leu Met Ala Thr Ala Val Ala Ala Val Gln Val Ala Leu Pro Gly Cys

20 25 30

Pro Gln Ala Cys Gly Asn Val Thr Val Pro Tyr Pro Phe Gly Phe Arg

35 40 45

Arg Gly Cys Phe Arg Lys Gly Phe Asn Leu Thr Cys Asp Glu Thr Arg

50 55 60

Arg Pro Pro Arg Leu Leu Leu Gly Asp Gly Val Glu Val Asp Ala Ile

65 70 75 80

Ser Leu Ala Asp Gly Thr Val His Val Gln Thr Lys Val Val Ala Phe

85 90 95

Arg Pro Leu Tyr Thr Asn Gly Ala Val Gly Ala Arg Arg Ser Ile Asp

100 105 110

His Asn Tyr Ser Trp Tyr Gly Gly Leu Pro Glu Val Tyr Lys Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Gln Leu Ala Val Ser Thr Asp His Asn Val Phe Val Ala Ile

130 135 140

Gly Cys Asn Phe Ile Gly Tyr Leu Val Ala Val Ser Asp Gly Gly Arg

145 150 155 160

Glu Tyr Val Ser Thr Cys Ser Thr Leu Cys Asn Gly Lys Thr Arg Asp

165 170 175

Ala Leu Cys Thr Gly Val Gly Cys Cys Trp Thr Thr Ile Ala Gln Arg

180 185 190

Tyr Pro Gly Tyr Gln Val Lys Phe Lys Asp Leu Asp Asp Thr Ala Ala

195 200 205

Ala Tyr Ala Gly Gln Ser Arg Ala Ser Val Ala Ala Phe Ile Val Asp

210 215 220

Arg Glu Trp Phe Val Gly Thr Met Gln Asn Thr Val Ser Phe Asn Asp

225 230 235 240

Phe Val Asn Asp Asp Phe Gly Asn Gly Pro Ser Ser Met Pro Thr Val

245 250 255

Leu Gln Trp Trp Leu Asp Val Asp Ser Asp Arg Asp Leu Val Val Lys

260 265 270

Asp Pro Arg Ser Ala Ser Arg Trp Arg Cys Ile Ser Leu Asn Ser Phe

275 280 285

Ala Ala Tyr Ile Gly Asp Ala Val Asn Lys Val Arg Cys Asn Cys Ser

290 295 300

Asp Gly Tyr Glu Gly Asn Ser Tyr Ile Val Asp Gly Cys Gln Asp Ile

305 310 315 320

Gly Glu Cys Leu Arg Pro Asp Val Tyr Pro Cys His Gly Thr Cys Ile

325 330 335

Asn Met Pro Gly Thr Tyr Arg Cys Ser Ala Lys Lys Arg Ile Ile Ser

340 345 350

Leu Ala Gly Leu Ile Thr Ile Ile Ala Ile Val Ala Gly Phe Gly Leu

355 360 365

Leu Phe Ser Leu Leu Gly Val Ala Gln Val Thr Lys Lys Leu Lys Lys

370 375 380

Gly Arg Ala Lys Lys Ile Arg Gln Lys Phe Phe Lys Lys Asn His Gly

385 390 395 400

Leu Leu Leu Gln Gln Leu Ile Ser Ser Asn Lys Asp Ile Ala Glu Lys

405 410 415

Met Lys Ile Phe Ser Leu Glu Glu Leu Glu Gln Ala Thr Asn Lys Phe

420 425 430

Asp His Asn Arg Ile Leu Gly Gly Gly Gly His Gly Thr Val Tyr Lys

435 440 445

Ala Ile Leu Ser Asp Gln Arg Val Val Ala Ile Lys Lys Ala Lys Ile

450 455 460

Val Val Gln Arg Glu Ile Asp Gln Phe Ile Asn Glu Val Ala Ile Leu

465 470 475 480

Ser Gln Ile Asn His Arg Asn Val Val Lys Leu Phe Gly Cys Cys Leu

485 490 495

Glu Thr Glu Val Pro Leu Leu Val Tyr Glu Phe Ile Leu Asn Gly Thr

500 505 510

Leu Ser Cys His Leu His Gly Lys Ser Glu Asn His Leu Ser Trp Lys

515 520 525

Thr Arg Leu Arg Ile Ala Leu Glu Thr Ala Arg Ala Ile Ala Ser Leu

530 535 540

His Ser Ala Ala Ser Ile Ser Val Tyr His Arg Asp Ile Lys Cys Ala

545 550 555 560

Asn Ile Leu Leu Thr Asp Thr Leu Ile Ala Lys Val Ser Asp Phe Gly

565 570 575

Ala Ser Arg Ser Ile Ala Ile Asp Gly Thr Gly Ile Leu Thr Val Val

580 585 590

Gln Gly Thr Tyr Gly Tyr Leu Asp Pro Glu Tyr Tyr Tyr Thr Ser Arg

595 600 605

Leu Thr Lys Lys Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Ile Leu Ala Glu

610 615 620

Leu Leu Thr Ser Val Thr Pro Val Phe Ser Ser His Ser Ser Glu Gly

625 630 635 640

Thr Ser Leu Ala Ser His Phe Val Ser Leu Met Ser Gly Asn Arg Leu

645 650 655

Ser Asp Ile Leu Asp Thr Gln Ile Ile His Glu Gly Gly Val Glu Asp

660 665 670

Ala Glu Val Val Ala Arg Leu Ala Gln Ala Cys Leu Ser Leu Lys Gly

675 680 685

Glu Glu Arg Pro Thr Met Arg Gln Val Glu Thr Thr Leu Glu Asp Val

690 695 700

His Asn Ser Lys Val Lys Leu Ser Ser Gln Ile Thr Arg Val Asn Gln

705 710 715 720

Ser Ala Met Lys Asp Gln Pro Trp Met Gly Asn Lys Gly Gly Glu Gly

725 730 735

Thr Arg Leu Tyr Ser Leu Glu Lys Glu Ile Ile Gln Ser Ser Glu Ile

740 745 750

Pro Arg

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctgctagct gaagatgctg aggtggttg 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctgctagcg gaatttcgga tgattggat 29

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caactgccaa tcgtgagtag g 21

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agtccggagc tagctctaga atgtcacaag caaagctcat c 41

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cccttgctca ccatggatcc tctaggaatt tcagatgatt gg 42

Claims

1.一个小麦细胞壁相关受体蛋白激酶基因TaWAK6，来自普通小麦(Triticum asetivumL.)南农9918，其ORF序列如SEQ ID NO.3所示。

2.权利要求1所述的基因TaWAK6编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO.4。

3.一个小麦细胞壁相关受体蛋白激酶基因TaWAK6的重组表达载体pBI220:TaWAK6。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于所述的一个小麦细胞壁相关受体蛋白激酶基因TaWAK6的表达载体pBI220:TaWAK6是以pBI220为出发载体，将TaWAK6基因***pBI220的BamHI和KpnI酶切位点间所得。

5.权利要求1所述的一个小麦细胞壁相关受体蛋白激酶基因TaWAK6在构建抗白粉病小麦品种中的应用。

6.权利要求3或4所述的一个小麦细胞壁相关受体蛋白激酶基因TaWAK6的表达载体pBI220:TaWAK6在构建抗白粉病小麦品种中的应用。