CN109280090B - 一种具有温肾壮阳活性的九香虫类蝽科昆虫多糖提取方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有温肾壮阳活性的九香虫类蝽科昆虫多糖提取方法和应用，步骤是：A、将九香虫类昆虫虫体烘干，粉碎，用石油醚回流提取，过滤，液固分离；得去除油脂药渣；B、将药渣挥干，用蒸馏水回流提取，过滤，合并滤液，浓缩，得水总提取物；C、将水总提取物加蒸馏水稍稀释，用醇溶液沉淀多糖，边加边搅拌，静置，过滤，得昆虫多糖醇沉物；D、将多糖醇沉物加水稀释、溶解，用DEAE‑葡聚糖凝胶纤维素柱层析分离纯化，用蒸馏水、氯化钠溶液冲洗，得九香虫类昆虫多糖。还涉及多糖在制备治疗或预防阳虚、阳痿、***功能障碍药物中的应用，方法易行，操作简便，纯度高达95％的多糖类化合物，具有强大的温肾壮阳、抗疲劳、恢复机体免疫能力作用。

Description

一种具有温肾壮阳活性的九香虫类蝽科昆虫多糖提取方法和 应用

技术领域

本发明属于蝽科九香虫类昆虫多糖提取技术领域，更具体涉及一种具有温肾壮阳活性的九香虫类蝽科昆虫多糖提取方法，还涉及一种具有温肾壮阳活性的九香虫类蝽科昆虫多糖的用途。

背景技术

***功能障碍是男性最常见的性功能障碍之一，目前的研究认为年龄是***功能障碍相关危险因素中最强的独立因素。男性***是一个复杂的过程，涉及大脑、激素、情感、神经、肌肉、血管等多方面问题。

九香虫为半翅目蝽科九香虫亚科昆虫九香虫Aspongopus chinensis Dallas的干燥体，别名黑兜虫、瓜黑蝽、臭屁虫、屁巴虫等，为中国特有种。《中国药典》(2015年版)记载九香虫具有理气止痛，温中助阳的功效，用于胃寒胀痛，肝胃气痛，肾虚阳痿，腰膝酸痛。始载于《本草纲目》：“咸温无毒，用于膈脘滞气，脾肾亏损，壮者元阳”。《本草新编》中记载：“虫中之至佳者，亦兴阳之物，以扶衰弱最宜”。民间更是有：“有钱人吃鹿茸，没钱人吃屁巴虫”之说。虽然九香虫的壮阳功效屡有记载，但对其壮阳功效的实验研究未见报道。结合壮阳行为与机体的疲劳密切相关，本发明目的提供一种蝽科九香虫类昆虫多糖提取方法及应用，且该昆虫多糖毒性比市售***物药效高，副作用小。市面上的西药西地那非或酚妥拉明疗效期短，长期服用具有一定副作用，治标不治本，并产生患者依赖的影响。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种具有温肾壮阳、抗疲劳、恢复机体免疫功能活性的九香虫类蝽科昆虫多糖的提取方法，方法易行，操作简便，该提取物药食两用，可以制备预防和治疗阳虚、阳痿的九香虫类蝽科的昆虫多糖。并对生理、病理的大鼠、小鼠具有明显的壮阳作用，且药效优于市场上一般***药效，具有潜在的产业开发价值，对***物的研发具有重大意义。

本发明的另一个目的是在于提供了一种具有温肾壮阳、抗疲劳、恢复机体免疫功能活性的九香虫类蝽科昆虫多糖在制备治疗或预防阳虚、阳痿、***功能障碍药物中的应用。利用中药多靶点的作用特点，对应***功能复杂的机制，标本同治，疗效优越，治愈率高，药食同源，长期服用无明显毒副作用的治疗***功能障碍的中药提取物制备方法。

为了实现上述的目的，本发明通过以下述技术方案实现：

一种具有温肾壮阳活性的九香虫类蝽科昆虫多糖的提取方法，包含以下步骤：

A、将九香虫类昆虫虫体50℃-80℃烘干10h-14h，粉碎、过40目筛，用石油醚或***浸润粉末2h-4h，使干粉完全溶胀，进行回流提取，脱脂2－6次，每次0.5～2h，过滤，液固分离；得到去除油脂的药渣。

B、将步骤A得到的药渣挥干残留石油醚，用蒸馏水浸泡2-4h，使药渣完全浸透，回流提取2－6次，每次0.5～2h，过滤，液固分离，合并滤液，挥去溶剂，浓缩，得到水总提取物；

C、将步骤B得到的水总提取物加蒸馏水稍稀释，用醇溶液沉淀多糖，边加边搅拌至溶液内醇浓度至50～80％，避光，静置12h-24h，过滤，得到昆虫多糖醇沉物。

D、将步骤C得到的多糖醇沉物加水稍稀释、溶解，用DEAE-葡聚糖凝胶纤维素柱层析分离纯化，用蒸馏水、氯化钠(NaCl)溶液冲洗，收集洗脱液，过滤，挥干溶剂，得到一种具有温肾壮阳、抗疲劳、恢复机体免疫能力活性的九香虫类蝽科昆虫多糖。

所述的步骤A中的九香虫类昆虫为九香虫、黑兜虫、小皱蝽、无刺蝽任一种。

所述的步骤C中的醇溶液在甲醇溶液或乙醇溶液任一种；

所述的步骤B中的加热回流的条件为65～85℃进行。

所述的乙醇溶液的浓度为体积百分比为50～80％；

所述的甲醇溶液的浓度为体积百分比为50～80％；

所述的洗脱液洗脱体积为10-20倍柱体积；

所述的洗脱液氯化钠(NaCl)溶液洗脱浓度为0.1-0.9mol/L。

该发明提供了一种九香虫类中药提取物的提取纯化方法，通过醇沉的方法将九香虫药材中的粗多糖提取出来，去除其中脂肪油等成分，富集活性部位昆虫多糖，通过DEAE-葡聚糖凝胶纤维素洗脱粗多糖，得到纯度达到95％以上的九香虫多糖，改提取方法健康环保无污染，尽可能去除无用成分，有效成分纯度高。该中药提取物具有温肾壮阳、抗疲劳、恢复机体免疫功能活性，九香虫类蝽科昆虫多糖在制备治疗或预防阳虚、阳痿、***功能障碍药物中的应用。该发明针对于市面上西药西地那非或酚妥拉明疗效期短，长期服用具有一定副作用，治标不治本，并产生患者依赖的影响，本发明利用中药多靶点的作用特点，对应***功能复杂的机制，标本同治，疗效优越，治愈率高，药食同源，长期服用无明显毒副作用的治疗***功能障碍的中药提取物制备方法。

一种具有温肾壮阳、抗疲劳、恢复机体免疫能力活性的九香虫类蝽科昆虫多糖在制备治疗或预防阳虚、阳痿、***功能障碍药物中的应用，其步骤是：

1、血乳酸含量的影响；

2、血尿素氮的影响；

3、对力竭游泳时间的影响；

4、正常小鼠交配能力的影响；

5、阳虚小鼠交配能力的影响；

6、阳虚大鼠交配能力的影响。

通过上述实验，本发明治疗组效果显著，对阳虚模型及正常动物皆有效果。具有明显补肾壮阳抗疲劳，提高机体免疫力功能作用。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

(1)蝽科昆虫种类繁多，具有广阔的市场前景。

(2)以常规的提取石油醚-乙酸乙酯-正丁醇方法相比，本发明通过石油醚-水提-醇沉的方法得到的多糖提取物，制备方法简单、得到的提取物去除其他无用成分，提取过程环保，成本较低。

(3)该昆虫多糖提取物去除大部分其他成分，经过分离纯化操作，得到纯度高达95％的多糖类化合物，其多糖主要有甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖等单糖组成。

(4)本发明获得的醇沉物昆虫多糖具有强大的温肾壮阳、抗疲劳、恢复机体免疫能力作用。

(5)该昆虫多糖提取物药效高，毒性低，副作用小，可作为温肾壮阳、抗疲劳、恢复机体免疫能力备选药物。

(6)该昆虫多糖提取物取出昆虫油脂，保留温肾壮阳、抗疲劳、恢复机体免疫活性更高的昆虫多糖提取物，避免肥胖等其他副作用。

具体实施方式

实施例1：

实验材料

氢化可的松，成都艾科达化学试剂有限公司(纯度98％)；大株红景天胶囊，江苏康缘药业股份有限公司；金匮肾气丸，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂；补佳乐(戊酸***)，拜耳医药保健有限公司；生理盐水，武汉滨湖双鹤药业有限责任公司；乳酸测试盒、尿素氮试剂盒，南京建成生物工程研究所。雌、雄昆明小鼠，体重18-22g，购于湖北省实验动物研究中心；雌、雄SD大鼠，体重180-220g，购于湖北省实验动物研究中心；超纯水：Water purifier实验室专用超纯水机。电子分析天平：Precisa,型号：XB220A；冷冻离心机：德国Eppendorf，型号：Centrifuge 5804 R；酶标仪：美国Bio-Tek，型号：Synergy 2。

一种具有温肾壮阳、抗疲劳、恢复机体免疫能力活性的九香虫类蝽科昆虫多糖的提取方法，其步骤是：

A、将九香虫类昆虫干燥，粉碎、过40目筛，用液固比6：1体积的石油醚或***进行回流提取脱脂回流提取2或4或6次，每次0.5或1或1.5或2h，过滤；液固分离，得到去除油脂的药渣。

B、将步骤B得到的药渣挥干残留石油醚，用液固比8：1体积的蒸馏水回流提取2或4或6次，每次0.5或1或1.5或2h，过滤，液固分离，得到水总提取物；

C、将步骤C得到的水提取物用醇溶液沉淀多糖，边加边搅拌至溶液内醇浓度至50或60或70或80％，避光，静置12或18或22或24h，过滤，得到醇沉物九香虫类蝽科昆虫多糖。

D、将步骤C得到的多糖醇沉物加水稍稀释、溶解，用DEAE-葡聚糖凝胶纤维素柱层析分离纯化，用蒸馏水、氯化钠(NaCl)溶液冲洗，收集洗脱液，过滤，挥干溶剂，得到一种具有温肾壮阳、抗疲劳、恢复机体免疫能力活性的九香虫类蝽科昆虫多糖。

所述的步骤A中的加热回流的条件为65或70或75或80或85℃进行。

所述的步骤B中的九香虫类昆虫为九香虫、黑兜虫、小皱蝽、无刺蝽任何一种。

所述的步骤C中的醇溶液在甲醇溶液或乙醇溶液任何一种；

所述的步骤C乙醇溶液的浓度为体积百分比为50或60或70或80％；

所述的步骤C甲醇溶液的浓度为体积百分比为50或60或70或80％。

通过上述实例，获得了一种较为纯净的昆虫多糖，去除昆虫体内油脂等杂质，该提取方法方法易行，操作简便，环保健康。九香虫具有较好的温肾壮阳、抗疲劳、恢复机体免疫功能的效果，但其含有的油脂会导致肥胖等副作用，该方法通过简单的方法去除九香虫中油脂，得到药理活性更高的昆虫多糖。

实施例2：

一种具有温肾壮阳、抗疲劳、恢复机体免疫能力活性的九香虫类蝽科昆虫多糖在制备治疗或预防阳虚、阳痿、***功能障碍药物中的应用，其步骤是：

1、血乳酸含量的影响

雄性昆明小鼠，随机分成4组，每组动物10只，分别为空白对照组(生理盐水)、阳性对照组(大株红景天胶囊，590mg/kg)、各提取物低剂量组(1.4g/kg，按原药材计)、各提取物中剂量(7g/kg，按原药材计)各提取物高剂量(14g/kg，按原药材计).给药15天。末次给药30min后眼眶内眦采血20μL，不负重在30±1℃的水箱中游泳10min后，立即眼眶内眦采血20μL，休息10min后，眼眶内眦采血20μL。EDTA抗凝，2500rpm/min离心，取上清，按照乳酸测试试剂盒测试乳酸含量。

表1：多糖提取物对小鼠游泳前后血浆乳酸含量的影响(n＝10)

2、血尿素氮的影响

剂量、给药和分组同2.2.1。末次给药30min后，不负重在30±1℃的水箱中游泳90min，休息60min后眼眶内眦采血，约0.5ml。4℃冰箱防止3h，2500rpm/min离心，取上清，按尿素检测试剂盒检测尿素氮含量。

表2：多糖提取物对小鼠血浆尿素氮含量的影响(n＝10)

3、对力竭游泳时间的影响

剂量、给药和分组同2.2.1。末次给药30min后，按小鼠体重5％负重铁丝，在30±1℃的水箱中游泳，开始计时，直至小鼠沉入水底8s不在浮起，记录游泳时间。

表3：多糖提取物对小鼠力竭游泳时间的影响(n＝10)

4、正常小鼠交配能力的影响

雄性昆明小鼠，随机分成5组，每组动物10只，分别为空白对照组(生理盐水)、阳性对照组(左旋多巴，150mg/kg)、各提取物低剂量组(1.4g/kg，按原药材计)、各提取物中剂量(7g/kg，按原药材计)、各提取物高剂量(14g/kg，按原药材计).给药30天。雌鼠与交配前48h、

4h灌胃戊酸***(0.4mg/kg)，使之发情时间同步。灌胃1h后观察20min内小鼠交配能力(捕捉潜伏期、捕捉次数、交配潜伏期、交配次数)。

表4：多糖提取物对正常小鼠交配能力的影响(n＝10)

5、阳虚小鼠交配能力的影响

雄性昆明小鼠，随机分成6组，每组动物10只，分别为空白对照组(生理盐水)、模型组(生理盐水)阳性对照组(金匮肾气丸，7g/kg)、各提取物低剂量组(1.4g/kg，按原药材计)、各提取物中剂量(7g/kg，按原药材计)、各提取物高剂量(14g/kg，按原药材计).给药30天。从给药第四天开始，除正常组外，其余组皮下注射氢化可的松25mg/kg，每日1次，连续7天，造模同时给药。雌鼠与交配前48h、4h灌胃戊酸***(0.4mg/kg)，使之发情时间同步。灌胃1h后观察30min内小鼠交配能力(捕捉潜伏期、捕捉次数、交配潜伏期、交配次数)。

表5：多糖提取物对阳虚小鼠交配能力的影响(n＝10)

6、阳虚大鼠交配能力的影响

SD雄性大鼠，随机分成6组，每组动物10只。分别为空白对照组(生理盐水)、模型组(生理盐水)阳性对照组(金匮肾气丸，7g/kg)、各提取物低剂量组(1.4g/kg，按原药材计)、各提取物低剂量组(7g/kg，按原药材计)、各提取物高剂量(14g/kg，按原药材计).给药30天。从给药第四天开始，除正常组外，其余组皮下注射氢化可的松25mg/kg，每日1次，连续7天，造模同时给药。雌鼠于交配前14天手术切除卵巢，交配前48h皮下注射戊酸***(20μg/只)和4h皮下注射***(500μg/只)，使之发情时间同步。灌胃1h后观察30min内大鼠交配能力(捕捉潜伏期、捕捉次数、交配潜伏期、交配次数)。大鼠麻醉，腹主动脉取血，室温自然凝血，2500rpm/min离心，检测血清中IL-2、IL-6、TNF-α含量。

表6：多糖提取物对阳虚大鼠免疫功能的影响(n＝10)

表7：多糖提取物对阳虚大鼠交配能力的影响(n＝10)

2.4多糖和单糖检测：

通过苯酚-硫酸法检测经DEAE-纤维素层析柱纯化后多糖含量，检测多糖纯度为95.6％；多糖酸化水解，衍生化后经HPLC分析，主要由甘露糖、葡糖糖、鼠李糖、半乳糖等单糖组成。

Claims (1)

1.一种九香虫类蝽科昆虫多糖在制备治疗或预防阳虚、阳痿及***功能障碍药物中的应用，其特征在于，所述九香虫类蝽科昆虫多糖的提取方法如下：

A、将九香虫类昆虫虫体50-80℃烘干10h-14h，粉碎、过40目筛，用石油醚或***浸润粉末2h-4h，使干粉溶胀，进行回流提取，脱脂2－6次，每次0.5~2h，过滤，液固分离，得到去除油脂的药渣；

B、将步骤（A）的药渣挥干残留石油醚，用蒸馏水浸泡2-4h，使药渣浸透，回流提取2－6次，每次0.5~2h，过滤，液固分离，合并滤液，挥去溶剂，浓缩，得到水总提取物；

C、将步骤（B）的水总提取物加蒸馏水稀释，用醇溶液沉淀多糖，边加边搅拌至溶液内醇浓度至50~80%，避光，静置12h-24h，过滤，得到昆虫多糖醇沉物；

D、将步骤（C）的多糖醇沉物加水稀释、溶解，用DEAE-葡聚糖凝胶纤维素柱层析分离纯化，用蒸馏水、氯化钠溶液冲洗，收集洗脱液，过滤，挥干溶剂，得到所述九香虫类蝽科昆虫多糖；

所述的步骤（A）中的九香虫类昆虫为九香虫、黑兜虫、小皱蝽、无刺蝽任一种；

所述的步骤（B）中的加热回流的条件为65~85℃；

所述的步骤（C）中的醇溶液在甲醇溶液或乙醇溶液任一种；

所述的乙醇或甲醇溶液的浓度为体积百分比为50~80%；

所述的洗脱液洗脱体积为10-20倍柱体积；

所述的洗脱液氯化钠溶液洗脱浓度为0.1-0.9mol/L。