CN109265423A - 一种色酮类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种色酮类化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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高雪梅
朱鸿
王闪闪
张再
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    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
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Abstract

本发明公开了一种色酮类化合物及其制备方法和应用，所述色酮类化合物是从豆科决明属乔木中分离得到，其分子式为C12H12O5，命名为(2′S)‑2‑(propan‑2′‑ol)‑5,7‑dihydroxy‑benzopyran‑4‑one，具有下述结构式：所述色酮类化合物的制备方法，是以干燥豆科乔木枝条、叶为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤而得到。该色酮类化合物经试验证明，具备很好的抗烟草花叶病毒活性，本发明化合物结构简单，活性好，可作为抗烟草花叶病毒药物的先导性化合物。

Description

一种色酮类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于植物有效成分提取技术领域，具体涉及一种色酮类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
植物病毒病有“植物癌症”之称, 是农业生产上重要病害之一。由于植物病毒属绝对内寄生生物, 自身无能量代谢***, 对寄主植物细胞具有高度依赖性, 因而植物病毒病的防治一直是植物病害防治中的一大难题。据估计，我国每年仅烟草花叶病毒一项就造成约5亿多元的经济损失! 因此，寻找安全有效的抗植物病毒药物受到了各国生物科学家的重视。以天然植物活性物质为有效成分的植物源抗病毒剂具有环境兼容性好、安全、开发成本低等优点,符合未来农药发展的趋势与要求, 有较好的开发和应用前景。近年来, 植物源抗病毒剂的研究已日益受到人们重视。为此, 本实验以烟草花叶病毒( tobaccomosaic virus, T MV ) 为对象, 对铁刀木的抗病毒活性进行了研究, 以期为我国传统药用植物资源的充分利用和新型植物源生物农药的研究与开发积累数据。
豆科决明属(Cassia L.)植物全球约 600 种，分布于全世界热带和亚热带地区，少数分布至温带地区，我国产20余种，广布于南北各省区。豆科决明属植物大多数都具有一定的药用价值，是我国传统中医药中十分重要的一部分。决明属植物还是天然色酮(chromone)类成分的主要资源之一，具有广谱强效的抗肿瘤活性，是近年来抗肿瘤天然产物的研究热点之一。除色酮(chromone)类外，黄酮类(flavonoid)、蒽醌类(anthraquinones)、三萜类(triterpenes)和生物碱类(alkaloids)等化合物也是本科植物的特征性成分，也具有多种生物活性。为了更有效地利用我国豆科植物资源，从中寻找具有开发前景的活性成分，我们选择对豆科苏木亚科植物开展较***的活性成分研究工作。
本发明从豆科植物中分离得到一个新的色酮化合物，该化合物具有显著的抗烟草花叶病毒活性。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种色酮类化合物；第二目的在于提供所述色酮类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述色酮类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述色酮类化合物是从干燥豆科乔木枝条、叶中分离得到，其分子式为 C12H12O5，命名为 (2′S)-2-(propan-2′-ol)-5,7-dihydroxy-benzopyran-4-one，具有下述结构式：
该化合物为淡棕色固体。本发明的第二目的是这样实现的，所述的色酮类化合物的制备方法，是以干燥豆科乔木枝条、叶为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高效液相色谱分离获得，具体为：
A、浸膏提取：将豆科乔木枝条、叶粗粉碎到 20~40 目，用有机溶剂超声提取 2~4 次，每次 30~60 min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩提取液至 1/4 ~ 1/2 体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏 a ；
B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比 1~2 倍量的水，用与水等体积的有机溶剂萃取3~5 次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏 b；
C、硅胶柱层析：将浸膏 b 用重量比 1.5~3 倍量的有机溶剂溶解，然后用浸膏重 0.8~1.2 倍的 100~200 目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为 200~300 目，用量为浸膏b 重量 6~8 倍量；用体积比为 1:0~0:1 的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；
D、反相柱层析：将以 40:1 配比的有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液上反相柱层析，反相柱是用反相材料 C-18、C-8 或 ODS 装柱；用体积含量为40~100% 的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；
E、高效液相色谱分离：将以体积含量 40~60% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液经高效液相色谱分离纯化，即得所述的色酮类化合物。
以上述方法制备的色酮类化合物的结构是通过以下方法测定出来的：
本发明化合物为淡棕色固体；紫外光谱 (溶剂为甲醇)，λ max (logε: 223 (4.24), 252(3.78), 296 (3.55) nm；红外光谱 (溴化钾压片)ν max 3425, 2910, 2860, 1656, 1627,1460, 1370, 1130, 941, 831 cm-1；旋光：[α]22.3 D = +53.42 (c = 0.15, MeOH)。HRESIMS显示本发明化合物准分子离子峰m/z 235.2128 [M-H]- (计算值为235.2123)，结合13C 和1H NMR谱(图-1和图-2,数据归属见表-1) 给出其分子式C12H12O5，不饱和度为7。
该化合物的13C-NMR谱显示其含有12个碳信号：1个羰基碳(δ C184.1)、6个芳香碳、2个烯碳(δ C 110.2, 169.9)和一个2-羟丙基（δ C 44.7, 66.5, 23.7)；1H-NMR显示δ H 6.17(1H, d, J= 2.0 Hz, H-6)和6.31 (1H, d, J= 2.0 Hz, H-8)为一对间位取代的苯环质子信号, δ H 6.09 (1H, s)为一个烯氢信号，δ H2.66 (1H, dd, J = 14.4, 8.0 Hz, H-1′a)、2.74 (1H, dd, J = 14.4, 4.8 Hz, H-1′b)、4.18 (1H, m, H-2′)、1.27 (3H, d, J =6.2 Hz, H-3′)为2-羟丙基中的质子信号。13C NMR说明该化合物为2-羟丙基取代的色酮结构。以上数据与文献报道的(2′S)-2-(propan-2′-ol)-5-hydroxy-benzopyran-4-one基本一致，表明所述化合物与其具有相同的骨架结构，唯一区别在于所述化合物的色原酮母核中取代有两个间位羟基，含有两个间位取代的苯环质子信号，而化合物(2′S)-2-(propan-2′-ol)-5-hydroxy-benzopyran-4-one的母核中只取代有一个羟基，其苯环中则具有三个相邻的氢质子信号。在HMBC谱中（图3），2-羟丙基的氢 δ H 2.66 (1H, dd, J = 14.4, 8.0Hz, H-1′a), δ H2.74 (1H, dd, J = 14.4, 4.8 Hz, H-1′b)与C-2 (169.9)、C-3 (110.2)有相关，δ H 4.18 (1H, m, H-2′)与C-2 (169.9)有相关，说明2-羟丙基连在色原酮母核的C-2位，另外，δ H 6.17 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6)与C-8 (95.1)、C-10 (105.5)有远程相关，δ H 6.31 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8)与C-6 (100.2)、C-10 (105.5)有远程相关，δ H 6.09(1H, s, H-3)与C-1′ (44.7)、C-10 (105.5)有远程相关。此外，所述化合物与(2′S)-2-(propan-2′-ol)-5-hydroxy-benzopyran-4-one具有相同的旋光性，表明化合物1与其具有相同的构型，因此，鉴定化合物结构为(2′S)-2-(propan-2′-ol)-5,7-dihydroxy-benzopyran-4-one。
表1 化合物的 1H 和 13C NMR 数据 (400/100 MHz,CD3OD)
本发明的第三目的是这样实现的，即将所述色酮类化合物应用于制备抗烟草花叶病毒药物。
本发明色酮类化合物是首次被分离出来的，通过核磁共振和质谱测定方法确定了为色酮类化合物，并表征了其具体结构。以本发明化合物为原料，经对抗烟草花叶病毒的实验，其抑制率达到21.6 ± 2.7%，具有很好的抗烟草花叶病毒活性，接近阳性对照品南宁霉素的抑制率(26.5%)。以上结果揭示了本发明的化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中有良好的应用前景。
本发明化合物结构简单活性好，可作为抗烟草花叶病毒药物的先导性化合物。
附图说明
图1为化合物的核磁共振碳谱（13C NMR）；
图2为化合物的核磁共振氢谱（1H NMR）；
图3为化合物的主要HMBC相关。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
本发明所述的色酮类化合物是从干燥豆科乔木枝条、叶中分离得到，其分子式为C12H12O5，命名为 (2′S)-2-(propan-2′-ol)-5,7-dihydroxy-benzopyran-4-one，具有下述结构式：
本发明所述色酮类化合物的制备方法，是以干燥豆科乔木枝条、叶为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高效液相色谱分离获得，具体为：
A、浸膏提取：将豆科乔木枝条、叶粗粉碎到 20~40 目，用有机溶剂超声提取 2~4 次，每次 30~60 min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩提取液至 1/4 ~ 1/2 体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏 a ；
B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比 1~2 倍量的水，用与水等体积的有机溶剂萃取3~5 次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏 b；
C、硅胶柱层析：将浸膏 b 用重量比 1.5~3 倍量的有机溶剂溶解，然后用浸膏重 0.8~1.2 倍的 100~200 目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为 200~300 目，用量为浸膏b 重量 6~8 倍量；用体积比为 1:0~0:1 的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；
D、反相柱层析：将以 40:1 配比的有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液上反相柱层析，反相柱是用反相材料 C-18、C-8 或 ODS 装柱；用体积含量为40~100% 的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；
E、高效液相色谱分离：将以体积含量 40~60% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液经高效液相色谱分离纯化，即得所述的色酮类化合物。
A步骤所述的有机溶剂为丙酮、乙醇或甲醇的任意一种。
A步骤所述的有机溶剂浓度为70~99％。
B步骤所述的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、***、石油醚或苯。
C步骤所述的混合有机溶剂为二氯甲烷-甲醇、石油醚-丙酮、二氯甲烷-乙酸乙酯或石油醚-乙酸乙酯。
C步骤所述的混合有机溶剂的体积配比为1:0、40:1、30:1、20:1、9:1、4:1、7:3、3:2、1:1、1:2、0:1。
E步骤所述的高效液相色谱分离纯化是以 40~70% 的甲醇为流动相，流速 3ml/min，22×250 mm，5μm 的反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为 254 nm，每次进样10~50μL，收集 10~50min 的色谱峰，多次累加后蒸干。本发明所述色酮类化合物的应用是在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。
本发明所述的豆科植物不受地区和品种限制，均可以实现本发明。
实施例1
取干燥的豆科乔木枝条、叶 5.5 kg，粗粉碎至 40 目，用 90% 的乙醇超声提取 4 次，每次 30min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的 1/4；静置，滤除沉淀物，浓缩成300g 浸膏a；在浸膏 a 中加入 300g 水，用与水等体积的乙酸乙酯萃取 5 次，合并萃取相，减压浓缩成 170g 浸膏 b；用 200-300 目硅胶 2000g 装柱，在浸膏 b 中加入 200g的甲醇溶解，然后加入 100-200 目硅胶 170g 拌样，拌样后上柱；用体积比分别为 1:0,40:1, 30:1, 20:1, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4 的二氯甲烷-甲醇混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分，得到 8 个部分，体积比 40:1 的二氯甲烷-甲醇混合有机溶剂的洗脱液 c 为 16g；用反相材料 C-18 装柱，洗脱液 c 上反相柱，以体积含量为 20~100% 的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量 40~60% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以 52%的甲醇为流动相，流速 3ml/min，22×250 mm mm，5μ m 的 Agilent C18 反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为 254 nm，每次进样 50 μL，收集 12 min 的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的色酮类化合物 (2′S)-2-(propan-2′-ol)-5,7-dihydroxy-benzopyran-4-one。
实施例2
取干燥的豆科乔木枝条、叶 3.2kg，粗粉碎至 40 目，用 含水10%的乙醇超声提取 3次，每次 20min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的 1/3；静置，滤除沉淀物，浓缩成 360g 浸膏 a；在浸膏 a 中加入 360g 的水，用与水等体积的乙酸乙酯萃取 3 次，合并萃取相，减压浓缩成 120g 浸膏 b；用 200-300 目硅胶 1200g 装柱，在浸膏 b 中加入240g 的甲醇溶解，然后加入 100-200 目硅胶 120g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为30:1、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、0:1 的二氯甲烷-乙酸乙酯混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；体积比 8:2 的二氯甲烷-乙酸乙酯混合有机溶剂的洗脱液 c 为46g；用反相材料 C-18 装柱，洗脱液 c 上反相柱，以体积含量为20~100% 的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；取以体积含量 40~60% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以 40%的甲醇为流动相，流速 3ml/min，22×250 mm mm，5μm 的 Agilent C18 反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为 254 nm，每次进样 30 μL，收集 46 min 的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的色酮类化合物 (2′S)-2-(propan-2′-ol)-5,7-dihydroxy-benzopyran-4-one。
实施例3
取干燥的豆科乔木枝条、叶 6.5kg，粗粉碎至 30 目，用 含水20%的甲醇超声提取 3次，每次 20min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的 1/2；静置，滤除沉淀物，浓缩成 675g 浸膏 a；在浸膏 a 中加入 700g 的水，用与水等体积的氯仿萃取 4 次，合并萃取相，减压浓缩成 342g 浸膏 b；用 200-300 目硅胶 3400g 装柱，在浸膏 b 中加入 900g的甲醇溶解，然后加入 100-200 目硅胶 360g 拌样，拌样后上柱；用体积比分别为 30:1、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、0:1 的二氯甲烷-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；体积比 6:4 的二氯甲烷-丙酮混合有机溶剂的洗脱液 c 为 45g；用反相材料 ODS 装柱，洗脱液 c 上反相柱，以体积含量为 20~100% 的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；取以体积含量 40~60% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以 50%的甲醇为流动相，流速 3ml/min，22×250 mm mm，5μm 的 Agilent C18 反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为 254nm，每次进样 40 μL，收集 26 min 的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的色酮类化合物(2′S)-2-(propan-2′-ol)-5,7-dihydroxy-benzopyran-4-one。
实施例4
取干燥的豆科乔木枝条、叶和/或果实 7.9kg，粗粉碎至 40 目，用 90%的乙醇提取 3次，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的 1/4；静置，滤除沉淀物，浓缩成 860g 浸膏 a；在浸膏 a 中加入 900g 的水，用与水等体积的石油醚萃取 4 次，合并萃取相，减压浓缩成 480g 浸膏 b；用 200-300 目硅胶 5000g 装柱，在浸膏 b 中加入 500g 的甲醇溶解，然后加入 100-200 目硅胶 500g 拌样，拌样后上柱；用体积比分别为 30:1、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、0:1 的丙酮-乙酸乙酯混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；体积比 9:1 的丙酮-乙酸乙酯混合有机溶剂的洗脱液 c为 53g；用反相材料 C-8 装柱，洗脱液 c 上反相柱，以体积含量为 20~100% 的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；取以体积含量40~60% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以 45%的甲醇为流动相，流速 3ml/min，22×250mm mm，5μm 的 Agilent C18 反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为 254 nm，每次进样 30 μL，收集 36 min 的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的色酮类化合物 (2′S)-2-(propan-2′-ol)-5,7-dihydroxy-benzopyran-4-one。
实施例 5
取干燥的豆科乔木枝条、叶 3.6 kg，粗粉碎至 20 目，用 80%的甲醇超声提取 3 次，每次 30min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的 1/2；静置，滤除沉淀物，浓缩成230g 浸膏 a；在浸膏 a 中加入 400g 的水，用与水等体积的丙酮萃取 4 次，合并萃取相，减压浓缩成 140g 浸膏 b；用 200-300 目硅胶 1600g 装柱，在浸膏 b 中加入 200g 的乙酸乙酯溶解，然后加入 100-200 目硅胶 140g 拌样，拌样后上柱；用体积比分别为 30:1、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、0:1 的石油醚-乙酸乙酯混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；体积比 1:1 的石油醚-乙酸乙酯混合有机溶剂的洗脱液 c 为 16g；用反相材料 ODS 装柱，洗脱液 c 上反相柱，以体积含量为 20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；取以体积含量 40~60% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以 55%的甲醇为流动相，流速 3ml/min，22×250 mm mm，5μ m 的 Agilent C18 反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样 20 μL，收集 9 min 的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的色酮类化合物 (2′S)-2-(propan-2′-ol)-5,7-dihydroxy-benzopyran-4-one。
实施例6
取实施例1制备的化合物，为淡棕色固体；
测定方法为：用核磁共振，结合其它波谱技术鉴定结构。
1) 紫外光谱 (溶剂为甲醇)，λ max (logε): 223 (4.24), 252 (3.78), 296(3.55) nm；
2) 红外光谱 (溴化钾压片) νmax 3425, 2910, 2860, 1656, 1627, 1460, 1370,1130, 941, 831 cm-1；
3) 旋光：[α]22.3 D = +53.42 (c = 0.15, MeOH)；
4) HRESIMS显示本发明化合物准分子离子峰m/z 235.2128 [M-H]- (计算值为235.2123)，结合13C 和1H NMR谱(图-1和图-2,数据归属见表-1) 给出其分子式C12H12O5，不饱和度为7。
该化合物的13C-NMR谱显示其含有12个碳信号：1个羰基碳(δ C184.1)、6个芳香碳、2个烯碳(δ C 110.2, 169.9)和一个2-羟丙基（δ C 44.7, 66.5, 23.7)；1H-NMR显示δ H 6.17(1H, d, J= 2.0 Hz, H-6)和6.31 (1H, d, J= 2.0 Hz, H-8)为一对间位取代的苯环质子信号, δ H 6.09 (1H, s)为一个烯氢信号，δ H2.66 (1H, dd, J = 14.4, 8.0 Hz, H-1′a)、2.74 (1H, dd, J = 14.4, 4.8 Hz, H-1′b)、4.18 (1H, m, H-2′)、1.27 (3H, d, J =6.2 Hz, H-3′)为2-羟丙基中的质子信号。13C NMR说明该化合物为2-羟丙基取代的色酮结构。以上数据与文献报道的(2′S)-2-(propan-2′-ol)-5-hydroxy-benzopyran-4-one基本一致，表明所述化合物与其具有相同的骨架结构，唯一区别在于所述化合物的色原酮母核中取代有两个间位羟基，含有两个间位取代的苯环质子信号，而化合物(2′S)-2-(propan-2′-ol)-5-hydroxy-benzopyran-4-one的母核中只取代有一个羟基，其苯环中则具有三个相邻的氢质子信号。在HMBC谱中（图3），2-羟丙基的氢 δ H 2.66 (1H, dd, J = 14.4, 8.0Hz, H-1′a), δ H2.74 (1H, dd, J = 14.4, 4.8 Hz, H-1′b)与C-2 (169.9)、C-3 (110.2)有相关，δ H 4.18 (1H, m, H-2′)与C-2 (169.9)有相关，说明2-羟丙基连在色原酮母核的C-2位，另外，δ H 6.17 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6)与C-8 (95.1)、C-10 (105.5)有远程相关，δ H 6.31 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8)与C-6 (100.2)、C-10 (105.5)有远程相关，δ H 6.09(1H, s, H-3)与C-1′ (44.7)、C-10 (105.5)有远程相关。此外，所述化合物与(2′S)-2-(propan-2′-ol)-5-hydroxy-benzopyran-4-one具有相同的旋光性，表明所述化合物与其具有相同的构型，因此，鉴定化合物结构为(2′S)-2-(propan-2′-ol)-5,7-dihydroxy-benzopyran-4-one。
实施例7
取实施例2~5制备的化合物，为淡棕色固体。测定方法与实施例6相同，确认实施例2~5制备的化合物为所述的色酮类化合物。
实施例8
取实施例1~5制备的异橙酮类化合物进行抗烟草花叶病毒活性试验，试验情况如下：
供试寄主: TMV 枯斑寄主心叶烟Nicotiana glutinosa L. , TMV ***侵染寄主普通烟Nicotiana tabacum L. K326 , 防虫温室内培育。
供试毒源: 烟草花叶病毒( TMV，U1 strain)，由云南省烟草研究院烟草化学重点实验室保存于普通烟K326上。
病毒提纯:参照Gooding 等的方法, 略加修改。典型症状病叶经差速离心、PEG 沉淀及10%～40% 蔗糖不连续密度梯度离心后提纯病毒。提纯的病毒经紫外扫描确定质量浓度为20 mg/mL [virus concentration = (A260 × dilution ratio) /]。提纯的病毒保存于-20℃，使用前用0.01 M PBS稀释至32 μg/mL。
抑制侵染作用测定: 采用局部枯斑法。将供试化合物溶解于DMSO并用蒸馏水稀释至所需浓度，宁南霉素用作阳性对照。选择健康、生长旺盛的5～6叶期心叶烟, 左半叶接种化合物与病毒等体积混合液, 右半叶接种蒸馏水( 含少量DMSO ) 与病毒等体积混合液作阴性对照。接种后用水冲洗。每处理接种4～5 个叶片, 重复3 次, 3 -4天后统计枯斑数目，计算抑制率。
抑制率 = (对照枯斑数- 处理枯斑数)/对照枯斑数×100%
试验结果
经对抗烟草花叶病毒的实验，其抑制率达到21.6 ± 2.7%，具有很好的抗烟草花叶病毒活性，接近阳性对照品南宁霉素的抑制率(26.5%)。以上结果揭示了本发明的化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中有良好的应用前景。本发明化合物结构简单活性好，可作为抗烟草花叶病毒药物的先导性化合物。

Claims (9)

1.一种色酮类化合物，其特征在于所述色酮类化合物是从干燥豆科乔木枝条、叶中分离得到，其分子式为 C12H12O5，命名为 (2′S)-2-(propan-2′-ol)-5,7-dihydroxy-benzopyran-4-one，具有下述结构式：
。
2.一种权利要求 1 所述的色酮类化合物的制备方法，其特征在于以干燥豆科乔木枝条、叶为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高效液相色谱分离获得，具体为：
A、浸膏提取：将豆科乔木枝条、叶粗粉碎到 20~40 目，用有机溶剂超声提取 2~4 次，每次 30~60 min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩提取液至 1/4 ~ 1/2 体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏 a ；
B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比 1~2 倍量的水，用与水等体积的有机溶剂萃取3~5 次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏 b；
C、硅胶柱层析：将浸膏 b 用重量比 1.5~3 倍量的有机溶剂溶解，然后用浸膏重 0.8~1.2 倍的 100~200 目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为 200~300 目，用量为浸膏b 重量 6~8 倍量；用体积比为 1:0~0:1 的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；
D、反相柱层析：将以 40:1 配比的有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液上反相柱层析，反相柱是用反相材料 C-18、C-8 或 ODS 装柱；用体积含量为40~100% 的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；
E、高效液相色谱分离：将以体积含量 40~60% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液经高效液相色谱分离纯化，即得所述的色酮类化合物。
3.根据权利要求 2 所述的色酮类化合物的制备方法，其特征在于A步骤所述的有机溶剂为丙酮、乙醇或甲醇的任意一种。
4.根据权利要求2所述的色酮类化合物的制备方法，其特征在于A步骤所述的有机溶剂浓度为70~99％。
5.根据权利要求 2 所述的色酮类化合物的制备方法，其特征在于B步骤所述的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、***、石油醚或苯。
6.根据权利要求 2 所述的色酮类化合物的制备方法，其特征在于C步骤所述的混合有机溶剂为二氯甲烷-甲醇、石油醚-丙酮、二氯甲烷-乙酸乙酯或石油醚-乙酸乙酯。
7.根据权利要求 2 所述的色酮类化合物的制备方法，其特征在于C步骤所述的混合有机溶剂的体积配比为1:0、40:1、30:1、20:1、9:1、4:1、7:3、3:2、1:1、1:2、0:1。
8.根据权利要求 2 所述的色酮类化合物的制备方法，其特征在于E步骤所述的高效液相色谱分离纯化是以 40~70% 的甲醇为流动相，流速 3ml/min，22×250 mm，5μm 的反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为 254 nm，每次进样 10~50μL，收集 10~50min 的色谱峰，多次累加后蒸干。
9.一种权利要求1所述的色酮类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。
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