CN105131063B

CN105131063B - 从全缘叶绿绒蒿花中同时分离纯化多种黄酮类成分的方法

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Publication number: CN105131063B
Application number: CN201510543021.2A
Authority: CN
Inventors: 刘圆; 黄艳菲; 韩亚涛; 李伯超
Original assignee: Southwest Minzu University
Current assignee: Southwest Minzu University
Priority date: 2015-08-29
Filing date: 2015-08-29
Publication date: 2018-04-03
Anticipated expiration: 2035-08-29
Also published as: CN105131063A

Abstract

本发明提供了从全缘叶绿绒蒿花中同时分离纯化4种黄酮类成分的方法。本发明还提供了同时分离纯化2种已知黄酮类成分的方法。本发明通过HSCCC法，从全缘叶绿绒蒿中成功分离纯化出了4种黄酮类化合物，分离速度较快，为全缘叶绿绒蒿物质基础的研究奠定了基础。经研究发现，上述分离的已知化合物或新化合物均具有良好的清除自由基活性，可将其作为抗氧化的药物或保健品。

Description

从全缘叶绿绒蒿花中同时分离纯化多种黄酮类成分的方法

技术领域

本发明涉及从全缘叶绿绒蒿花中同时分离纯化多种黄酮类成分的方法。

背景技术

全缘叶绿绒蒿Meconopsis integrifolia(Maxim.)Franch.为罂粟科(Papaveraceae)绿绒蒿属(Meconopsis)植物，为传统藏药材，在我国主要分布于西藏、四川、云南、青海、甘肃等省区。《晶珠本草》记载全缘叶绿绒蒿以花入药，用于治疗肝炎、肺炎和水肿^[1-2]。现代化学成分研究对全缘叶绿绒蒿的地上部分的化学成分进行了较***的研究，采用传统分离方法分离得到了生物碱和黄酮等化合物^[3-5]。而藏医药书籍记载全缘叶绿绒蒿以花入药，未发现有文献报道对全缘叶绿绒蒿花的化学成分进行研究。并且，绿绒蒿属植物的化学成分多采用硅胶柱色谱、中压柱层析、制备液相、Sephadex LH-20等传统分离方法进行分离^[3-7]，因此，简单、快速、重复性好的分离制备纯化合物的方法在该属植物中将会受到越来越多的关注。

高速逆流色谱(High-speed counter-current chromatography,HSCCC)技术依据化合物在互不相溶的两相溶剂中的分配系数的差异而实现分离。不需要固体载体，可避免样品在分离过程中的不可逆吸附和分解，溶剂***的极性可根据化合物的性质选择，选择范围广，适合各种极性的化合物，并且分析时间较短，回收率和产品纯度高，适宜放大，便于工业化生产，可有效用于分离制备天然产物^[8-10]。

Zhou等^[11]报道，全缘叶绿绒蒿地上部分70％乙醇提取物有较好的肝保护作用。目前还未见通过HSCCC法对全缘叶绿绒蒿花中黄酮类成分的分离纯化研究。

发明内容

本发明的目的在于提供从全缘叶绿绒蒿中同时分离纯化不同黄酮类成分的方法。

本发明提供了从全缘叶绿绒蒿花中同时分离纯化4种黄酮类成分的方法，它包括如下操作步骤：

(1)取罂粟科绿绒蒿属植物全缘叶绿绒蒿M.integrifolia(Maxim.)Franch.的花，粉碎，以60～70％v/v乙醇为溶剂进行提取，收集醇提液，减压回收乙醇，依次用水-乙酸乙酯溶剂***和水-正丁醇溶剂***萃取，合并乙酸乙酯和正丁醇萃取液，除去溶剂后，所得残渣即为粗提物；

(2)取乙酸乙酯:正丁醇:水＝2:3:5v/v/v，充分振摇，静置分层，以上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满分离螺旋管，柱温30～35℃，主机正转,转速为890～920r/min，然后以2mL/min的流速泵入流动相，至两相溶剂在管柱中达到平衡状态；将步骤(1)制备的粗提物，以下相为溶剂溶解，制备样品溶液，将样品溶液进样，在254nm下监测，依次收集出峰时间为250～280min、300～320min、360～90min、420～450min的目标成分，即依次得到化合物1～4，各化合物结构式如下：

溶剂体系的选择是高速逆流色谱分离(HSCCC)中至关重要的环节，需根据待分离物质的理化性质，选择合适的溶剂体系。分配系数是HSCCC分离的一个重要参数，是筛选溶剂体系的参考依据之一，理想的分配系数为0.5～2，K值太大使谱带增宽，K值太小则峰无法分离^[12-13]。本发明采用UPLC法测定溶剂体系的K值，结果见表1。

表1 化合物1～4在不同溶剂***中的K值

从表1可以看出，氯仿/甲醇/水体系(4:3:2)中目标化合物的K值太大，不适合分离，故尝试选择乙酸乙酯/正丁醇/水体系。结果表明，不同体积溶剂配比中，乙酸乙酯/正丁醇/甲醇/水体系(4:1:0.5:5，v/v/v/v)尽管K值(1.K＝0.58；2.K＝0.82；3.K＝1.38；4.K＝1.26)合适，但实际分离中目标峰的分离效果并不好，峰未分开，四个峰被一起冲出。故考虑通过增大K值的方式使出峰时间延缓，试验是否能使峰达到分离的目的。减少乙酸乙酯的体积，增大正丁醇的体积，当采用溶剂体系为乙酸乙酯/正丁醇/水体系(3:2:5，v/v/v)时，K值较大，峰3和4的K值已大于2，分离效果有所改善，但峰仍不能达到分离。继续减少乙酸乙酯，增大正丁醇的量，采用乙酸乙酯/正丁醇/水体系(2:3:5，v/v/v)，尽管K值已经很大(1.K＝1.85；2.K＝2.46；3.K＝4.45；4.K＝4.56)，远大于2，但仍能得到较好的分离效果。由此可认为，分离本发明各化合物选择溶剂体系时，除了参考K值外，实际的分离试验也很有必要，采用K值较大的溶剂体系，延缓出峰时间，有利于峰的分离。

HSCCC分离的其他条件如转速、柱温、流速对分离也有较大的影响，需进行试验选择合适的条件。乙酸乙酯/正丁醇/水体系属于界面张力较高的溶剂***，较高的转速可以促进分配和减少质点的传递阻力^[14]，故选择转速为900r/min。仪器柱温对固定相的保留有不可忽视的作用，对亲水性强的正丁醇溶剂体系的固定相保留率有较大影响，升高柱温有助于提高该体系的固定相保留率^[15]，试验发现，当柱温35℃时，乙酸乙酯/正丁醇/水(2:3:5，v/v/v)体系的保留率为46％，达到分离要求。由于所选溶剂体系保留率较低，高流速不利于固定相保留，故选择流速为2.0mL/min。

进一步地，步骤(1)中，乙醇浓度为70％v/v。

本发明还提供了从全缘叶绿绒蒿花中同时分离2种黄酮类成分的方法，它包括如下操作步骤：

(1)取罂粟科绿绒蒿属植物全缘叶绿绒蒿M.integrifolia(Maxim.)Franch.的花，粉碎，以60～70％v/v乙醇为溶剂进行提取，收集醇提液，减压回收乙醇，依次用水——乙酸乙酯溶剂***和水——正丁醇溶剂***萃取，合并乙酸乙酯和正丁醇萃取液，除去溶剂后，所得残渣即为粗提物；

(2)取乙酸乙酯:正丁醇:水＝2:3:5v/v/v，充分振摇，静置分层，以上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满分离螺旋管，柱温30～35℃，主机正转,转速为890～920r/min，然后以2mL/min的流速泵入流动相，至两相溶剂在管柱中达到平衡状态；将步骤(1)制备的粗提物，以下相为溶剂溶解，制备样品溶液，将样品溶液进样，在254nm下监测，依次收集出峰时间为250～280min、300～320min的目标成分，即依次得到化合物1～2，各化合物结构式如下：

其中，步骤(1)中，乙醇浓度为70％v/v。

其中，步骤(2)中，柱温为35℃。

其中，步骤(2)中，转速为900r/min。

本发明还提供了化合物1或2在制备抗氧化的药物或保健品种的用途。

进一步地，所述药品或保健品是清除自由基的药品或保健品。

其中，所述自由基为DPPH自由基。

本发明通过HSCCC法，从全缘叶绿绒蒿中成功分离纯化出了4种黄酮类化合物，分离速度较快，为全缘叶绿绒蒿物质基础的研究奠定了基础。

经研究发现，上述分离的已知化合物或新化合物均具有良好的清除自由基活性，可将其作为抗氧化的药物或保健品。

附图说明

图1全缘叶绿绒蒿花粗提物的HSCCC色谱图

图2不同摩尔浓度化合物、Vc和BHT清除DPPH活性图

图中标记的数字“1”、“2”、“3”、“4”，依次表示化合物“1”、“2”、“3”、“4”。

具体实施方式

实施例1 4种黄酮类成分的制备

(1)粗提物制备

称取全缘叶绿绒蒿花10g，打粉机粉碎，粉末不大于0.3mm(基本全部通过3号筛)，加70％乙醇(v/v)200mL，超声(45kHz，300w)提取3次，每次45min，合并3次滤液，减压回收乙醇，得浓缩液，将浓缩液置于-80℃冰箱过夜后，冷冻干燥，得干浸膏3.11g，干浸膏得率为31.1％。

取浸膏约150mg，用50mL水溶解，转移至分液漏斗中，依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取，合并乙酸乙酯和正丁醇萃取液，45℃减压回收溶剂，所得粗提物备用。

(2)分离纯化

在分液漏斗中按乙酸乙酯/正丁醇/水(2:3:5，v/v/v)配置两相溶剂***共2L，充分振摇，静置分层。以上相为固定相，下相为流动相，将制备好的样品浸膏溶于20mL下相中，备用。

以20mL/min的流速将溶剂***上相泵入主机充满分离螺旋管，循环水浴温度35℃，UV检测波长254nm，转速900r/min，正转。转速稳定后，以流速2.0mL/min泵入下相，待下相从管柱出口流出并且基线稳定后，将样品溶液由进样圈注入，根据色谱图手动收集各色谱峰组分(见图1)，即可分别得到化合物1～4。

其中，收集出峰时间为250～280min的部位，减压除去溶剂后，所剩固形物即为化合物1(60mg)；

收集出峰时间为300～320min的部位，减压除去溶剂后，所剩固形物即为化合物2(40mg)；

收集出峰时间为360～390min的部位，减压除去溶剂后，所剩固形物即为化合物3(16mg)；

收集出峰时间为420～450min的部位，减压除去溶剂后，所剩固形物即为化合物4(11mg)。

本发明出峰时间从泵入上相的时间算起。本发明对各成分的分离速度较快，整个分离过程，从泵入溶剂上相到峰分离结束所花时间仅为480min。

结构鉴定

化合物1：黄色粉末，ESI-MS(负离子模式)：m/z 625.16。化合物1¹H-NMR和¹³C-NMR数据见表2和表3。化合物1的数据与文献[16]中quercetin-3-O-β-D-glucopyrannosy-(1→6)-β-D-glucopyranoside的数据基本一致。

化合物2：黄色粉末，ESI-MS(负离子模式)：m/z 667.22，MS/MS产生的二级碎片离子有m/z 625.13、607.13、301.01。化合物2¹H-NMR和¹³C-NMR数据见表2和表3。化合物2的数据与文献[17]中quercetin 3-O-[2”'-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside]的数据基本一致。

化合物4：黄色粉末，ESI-MS(负离子模式)：m/z 667.23。化合物4的分子量与化合物2的分子量一致。MS/MS产生的二级碎片离子有m/z 625.13、607.13、301.01，与化合物2一致，丢失了碎片CH₃COO、C₂H₅O₃、C₁₄H₂₃O₁₂，并且二者¹H-NMR和¹³C-NMR数据相似，可见二者为同分异构体，苷元为槲皮素。不同之处为乙酰基与槲皮素苷的联接位置。在HMBC图谱中，乙酰基的C＝O(δ_C 169.7)与δ_H4.66相关，δ_H4.66与C-2”'(δ_C 71.2)和C-4”'(δ_C67.6)相关，HSQC图谱中，δ_H4.66与C-3”'(δ_C 77.8)相关，因此，可确定乙酰基与C-3”'相连，化合物4为quercetin3-O-[3”'-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside]。

化合物3：黄色粉末，ESI-MS(负离子模式)：m/z 667.24。MS/MS产生的二级碎片离子有m/z 625.16、607.16、301.01，与化合物2和化合物4一致，丢失了碎片CH₃COO、C₂H₅O₃、C₁₄H₂₃O₁₂，并且核磁数据也与化合物2和化合物4相似。不同之处为乙酰基与槲皮素苷的联接位置。在HMBC图谱中，乙酰基中C＝O(δ_C170.3)与δ_H3.93和4.10相关，说明乙酰基可能与一个亚甲基相连。在HSQC图谱中，δ_H3.93和4.10和δ_C 63.5(C-6”')相关，由此可知，乙酰基与C-6”'相连，化合物3为quercetin 3-O-[6”'-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside]。

表2

注：化合物1(溶剂为dmso)和化合物2(溶剂为methanol-d₄)由400MHz核磁共振仪测定；化合物3(溶剂为dmso)和化合物4(溶剂为dmso)由600MHz核磁共振仪测定；化合物1的化学位移归属参考文献，其他化合物的化学位移归属根据DEPT、¹H-¹H COSY、HSQC和HMBC数据。

表3 化合物1～4¹³C NMR数据

实施例2 2种已知黄酮类成分的制备

(1)粗提物制备

(2)分离纯化

其中，收集出峰时间为250～280min的部位，减压除去溶剂后，所剩固形物即为化合物1；

收集出峰时间为300～320min的部位，减压除去溶剂后，所剩固形物即为化合物2。

本发明出峰时间从泵入上相的时间算起。

实施例3 本发明化合物抗氧化活性研究

1 材料

普析TU-1950紫外分光光度计(北京普析公司)；METTLER AE240型电子天平(梅特勒--托利多(上海)有限公司)，KQ-250B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

DPPH(悌希爱(上海)化成工业发展有限公司)；抗坏血酸(广东光华科技股份有限公司)；BHT(成都科龙化工试剂厂)，其他试剂为分析纯，水为蒸馏水。实验样品：化合物1quercetin-3-O-β-D-glucopyrannosy-(1→6)-β-D-glucopyranoside，化合物2quercetin3-O-[2”'-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside，化合物3quercetin 3-O-[6”'-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside，化合物4quercetin 3-O-[3”'-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside。以上实验样品采用实施例1方法分离得到。

2 方法

DPPH溶液的配制：精密称取DPPH粉末7.30mg，加入无水乙醇定容至50mL容量瓶中，得DPPH储备液。将储备液再稀释5倍，得浓度为0.074mmol/L、吸光度约为0.7的DPPH工作液。

样品溶液的配制：精密称取样品粉末适量，加H₂O配制成0.32mmol/L储备液，测定时用H₂O稀释成0.16mmol/L、0.08mmol/L、0.04mmol/L、0.02mmol/L、0.005mmol/L。

3 清除DPPH能力测定

DPPH自由基清除能力测定方法参考Zhou G等[18]的方法。吸取样品溶液0.4mL不同浓度样品溶液和2.6mLDPPH工作液于比色管中，避光反应1h后，于517nm处测定吸光度值。以H₂O代替样品溶液作为空白，以无水乙醇代替样品和DPPH溶液作为空白对照，以相同浓度的Vc和BHT为阳性对照，清除率按下式计算。

式中A_s为空白，即70％乙醇加DPPH溶液的吸光度；A_i为不同浓度样品溶液和DPPH溶液的吸光度；A₀为空白对照的吸光度。

4 结果与讨论

不同物质浓度样品和阳性对照物Vc和BHT对DPPH的清除率见图2，IC₅₀值分别为化合物1(0.057mmol/L)，化合物2(0.051mmol/L)，化合物3(0.049mmol/L)，化合物4(0.067mmol/L)，Vc(0.159mmol/L)，而在该浓度梯度下，BHT的最大DPPH清除率未超过50％，故无法计算IC₅₀值。

从结果可以看出，从全缘叶绿绒蒿花中分离得到的化合物1～4清除DPPH自由基的能力要强于Vc和BHT，有很好的抗氧化活性。

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Claims

1.从全缘叶绿绒蒿花中同时分离纯化4种黄酮类成分的方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：

(1)取罂粟科绿绒蒿属植物全缘叶绿绒蒿M.integrifolia(Maxim.)Franch的花，粉碎，以60～70％v/v乙醇为溶剂进行提取，收集醇提液，减压回收乙醇，依次用水——乙酸乙酯溶剂***和水——正丁醇溶剂***萃取，合并乙酸乙酯和正丁醇萃取液，除去溶剂后，所得残渣即为粗提物；

(2)取乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶3∶5v/v/v，充分振摇，静置分层，以上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满分离螺旋管，柱温30～35℃，主机正转,转速为890～920r/min，然后以2mL/min的流速泵入流动相，至两相溶剂在管柱中达到平衡状态；将步骤(1)制备的粗提物，以下相为溶剂溶解，制备样品溶液，将样品溶液进样，在254nm下监测，依次收集出峰时间为250～280min、300～320min、360～390min、420～450min的目标成分，即依次得到化合物1～4，各化合物结构式如下：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，乙醇浓度为70％v/v。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，柱温为35℃。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，转速为900r/min。