CN109258460B - 微茎尖培养结合热处理获得增城蜜菊脱毒苗的培育方法 - Google Patents

微茎尖培养结合热处理获得增城蜜菊脱毒苗的培育方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种微茎尖培养结合热处理获得增城蜜菊脱毒苗的培育方法。本发明提供的微茎尖培养结合热处理获得增城蜜菊脱毒苗的培育方法，包括以下步骤：优良株系选育、组织培养无菌组培瓶苗建立、热处理培养预脱毒、微茎尖培养脱毒、脱毒茎尖组织培养无菌繁殖体系建立、脱毒茎尖组织培养苗病毒检测和脱毒苗组培工厂化育苗等。本发明提供的获得增城蜜菊脱毒苗的方法，采用组织培养微茎尖结合热处理脱毒，并配合改进的培养基，培育无病毒苗成活率高，繁殖速度快，并且能够大规模的组培工厂化繁殖育苗，经济效益高。

Description

微茎尖培养结合热处理获得增城蜜菊脱毒苗的培育方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种微茎尖培养结合热处理获得增城蜜菊脱毒苗的培育方法。
背景技术
菊花为菊科菊属植物的干燥头状花序。具有疏风散热、清肝明目、解疮毒的功效。现代药理试验证明菊花具有改善心血管功能、抗癌、抗菌、扩血管、抗氧化等作用。2010版《中国药典-I部》将菊花收录为药食同源植物，具有较高的经济价值。近年来，它又成为一种重要的林下经济植物，广泛在林间地、山坡地种植，带来巨大的经济效益和生态效益。“增城蜜菊”是广州田园牧歌农林有限公司引种徽州亳菊，并从中选育出的良种。《本草纲目》中有“菊之品九百种”的记载，其中杭菊、亳菊、滁菊、怀菊最为有名，有“四大名菊”之称。亳菊是菊花中的珍品，2014年被中国农业部登记为地理标志性农产品，亳菊疏风散热、解暑明目，多为春、夏两季用药，历年来为中医首选的菊花品种。
增城蜜菊属菊科，为多年生草本宿根植物。茎基部木质化，绿色或带紫绿色，株高50～150cm。叶互生，椭圆状披针形，具浅裂及深裂。头状花序顶生或腋生，每花由300～600朵无柄的小花组成花序，直径2～7cm，芳香。果实为瘦果，柱状，无冠毛，通常不育。
增城蜜菊传统的繁殖方法主要是利用扦插、分株等繁殖方法，但是这些繁殖方法一方面需要大量母株，并且需要花费大量人力、物力、财力、时间等，且繁殖速度慢，对于大规模的菊花生产而言，传统的繁殖方法以远远不能满足生产上的需要；另一方面，由于长期采用分株、扦插等无性繁殖方法，使得病毒逐代传递积累，植株感染病毒日趋严重。目前侵袭菊花的病毒不下10余种，如菊花矮缩类病毒，菊花番茄***病毒，烟草花叶病毒，菊花花叶病毒等。而且病情会随种植时间的延长而逐渐恶化，植株生长势弱，产量降低，品质变差，甚至有点优良品种因此丢失。所以，如何获得增城蜜菊的脱毒育苗，并且生产可进行大规模扦插繁殖的脱毒育苗，成为目前的研究热点。
中国专利CN103340152B公开了一种菊花筛选脱毒快繁方法，所述方法包括以下步骤：采集菊花无菌健壮母本苗切成带芽茎段，消毒；将带芽茎段接种于培养基A上生长；一周后，待新的腋芽萌发至时，转接于新的培养基A上生长，生长两周后获得生根无菌健壮母本苗；将步骤S3中得到的无菌健壮母本苗切成的带芽茎段，接种于培养基上同时进行继代和生根培养，所述的培养基仍为培养基A，一周后，带芽茎段长成完整植株。该方法培育的菊花脱毒苗虽然进行了脱毒培养过程，但是脱毒效果不理想，脱毒后的育苗仍检测出较多的病毒，并且繁殖系数不高，繁殖速度较慢，无法进行大规模的工厂化育苗。
中国专利申请CN108207634A公开一种银香菊组织培养快繁体系建立的方法，包括以下几个步骤：(1)外植体的选取与灭菌；(2)愈伤组织的诱导；(3)丛生芽的分化与增殖；(4)生根培养；(5)银香菊再生植株炼苗与移栽。本方法采用银香菊茎段为外植体，通过调节MS培养基中特定激素的种类与浓度，成功建立了银香菊组织培养快繁体系。该方法获得外植体容易，组培操作简单，培养周期短，但是没有进行脱毒处理，无法得到病毒感染率较低的育苗，而且在组织培养中褐化现象严重，使得外植体逐渐变褐而死亡，大大降低了脱毒苗的成活率。
目前，对于菊科类植物的脱毒培养技术还存在脱毒率低，组织培养中褐化现象严重，大大降低了脱毒苗的成活率，使得繁殖速度慢，繁殖系数较低，无法进行大规模的产业化种植。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种微茎尖培养结合热处理获得增城蜜菊脱毒苗的培育方法。采用本发明的方法培育的脱毒苗脱毒率高，并且有效的减少了体外组织培养过程的褐化现象。脱毒苗的成活率大大提高，繁殖系数与繁殖速度均有明显的提高，并且本发明的脱毒苗的培育方法能够实现扦插快速繁殖及规模化的有机栽培种植，可在生产中推广应用。
本发明的技术方案是：
一种微茎尖培养结合热处理获得增城蜜菊脱毒苗的培育方法，包括以下步骤：
(1)优良株系选育
种植增城蜜菊原种，经观察，筛选出9株性状优良的单株，组织培养后获得幼苗，用获得的幼苗进行栽培种植试验，再从中筛选出6株性状优良的单株，同样经组织培养后进行栽培种植试验，最终筛选出3株性状优良的单株；
(2)组织培养无菌组培瓶苗建立
取步骤(1)获得的3株性状优良的单株中的嫩枝作为外植体，并进行消毒处理，然后将外植体接种到培养基JHr进行不定芽诱导培养20～25天后；切取经不定芽诱导的芽作材料进行增殖继代接种培养，接种到培养基JH中，每瓶培养基接种8节；切取经继代增殖培养的不定芽作材料进行生根诱导接种，接种后，用保鲜膜封好瓶口，放到塑料大棚进行生根炼苗，20～25天即得无菌组培瓶苗；
(3)热处理培养预脱毒
将步骤(2)所得的无菌组培瓶苗放入光照培养箱进行热处理培养，在温度为40℃、光照强度为2000Lux的光照培养箱中每天光照10h，连续培养72h，得预脱毒的培育苗；
(4)微茎尖培养脱毒
在无菌条件下于超净工作台解剖镜下切取步骤(3)所得预脱毒的培育苗的茎尖1.9～2.1cm，接种到脱毒尖不定芽诱导培养基JH7，在光照强度为2500～3500Lux、光照时间为7.0～8.0h、温度为23-27℃的条件下，培养25-30天，得脱毒不定芽；
(5)脱毒茎尖组织培养无菌繁殖体系建立
将步骤(4)所得的脱毒不定芽进行增殖继代培养，接种到不定芽初代培养基JH4中，在光照强度为2500～3500Lux，光照时间为7.0～8.0h，培养温度为23～27℃的条件下，培养20～25天，得脱毒茎尖组织培养苗；
(6)脱毒茎尖组织培养苗病毒检测
将步骤(5)所得脱毒茎尖组织培养苗用分子生物学鉴定法进行RNA病毒检测，筛选出不带病毒的脱毒茎尖组织培养苗；
(7)脱毒苗组培工厂化育苗
将步骤(6)中筛选出的不带病毒的脱毒茎尖组织培养苗接种到培养基JHr中诱导生根，培养20～25天后，得组培瓶脱毒苗；将所得组培瓶脱毒苗转移到塑7料大棚进行生根炼苗，培养20～25天，得增城蜜菊脱毒苗。
进一步地，所述步骤(2)和步骤(7)中的培养基JHr包括：ZL培养基+0.2mg/Lα-萘乙酸+1.5％蔗糖+0.55％复合卡拉胶，pH5.8。
进一步地，所述步骤(2)和步骤(5)中的不定芽初代培养基JH4包括:ZL培养基+1.5mg/L 6-苄氨基嘌呤+0.01mg/Lα-萘乙酸+3.0％蔗糖+0.55％复合卡拉胶，pH5.8。
进一步地，所述步骤(4)脱毒茎尖不定芽诱导培养基JH7包括：
ZL培养基+0.2mg/L 6-苄氨基嘌呤+0.01mg/Lα-萘乙酸+0.5mg/L赤霉素+100ml/L新鲜椰子汁+10mg/L海藻糖+3.0％蔗糖+0.55％复合卡拉胶，pH5.8。
进一步地，所述复合卡拉胶由以下组分及重量百分数组成：10％海藻酸钙，50％I-型卡拉胶和40％去离子水。
进一步地，所述复合卡拉胶的制备方法为：将I-型卡拉胶加入到去离子水中，升温至60-80℃至完全溶解后，加入海藻酸钙搅拌均匀，冷却至室温，即得。
进一步地，一种用于增城蜜菊脱毒苗培育的脱毒茎尖不定芽诱导培养基JH7，由以下组分组成：ZL培养基+0.2mg/L 6-苄氨基嘌呤+0.01mg/Lα-萘乙酸+0.5mg/L赤霉素+100ml/L新鲜椰子汁+10mg/L海藻糖+3.0％蔗糖+0.55％复合卡拉胶，所述培养基的pH为5.8。
进一步地，一种用于增城蜜菊脱毒苗培育的脱毒茎尖不定芽诱导培养基JH7中，所述的复合卡拉胶由以下组分及重量百分数组成：10％海藻酸钙，50％I-型卡拉胶和40％去离子水。
进一步地，所述用于增城蜜菊脱毒苗培育的脱毒茎尖不定芽诱导培养基JH7，所述复合卡拉胶的制备方法为：将I-型卡拉胶加入到去离子水中，升温至60-80℃至完全溶解后，加入海藻酸钙搅拌均匀，冷却至室温，即得。
本发明组织培养培养基的成分中，由I-型卡拉胶和海藻酸钙为主要成分制得的复合卡拉胶，取代了传统培养基中的琼脂。I-型卡拉胶是由半乳糖及脱水半乳糖所组成的多糖类硫酸酯的钙、钾、钠、铵盐，可以为植物生长提供所必需的盐类物质，调节培养基的渗透压，为植物的生长提供有利的渗透压环境。而且配合作为增稠剂的海藻酸钙一起使用，可以使制得的培养基形成稳定、柔软、富有弹性的半固态培养基。本发明中使用含有复合卡拉胶制备的培养基培养的脱毒苗长势更优，生长速度更快，成活率更高。
本发明中脱毒茎尖不定芽诱导中所用的JH7培养基中，还添加了赤霉素与海藻糖。赤霉素作为高效植物生长调节剂，对细胞的***具有促进作用，能够加速细胞的伸长。而海藻糖是一种非还原性糖类可以在脱毒苗体内细胞表面形成独特的保护膜，对其体内多种生物活性物质起到非特异性保护作用，一定程度上抵御培养过程中不利因素(包括不利渗透压、弱光、高湿等)对脱毒苗的伤害。本发明中意外的发现，赤霉素联合海藻糖一起使用，能够抑制多酚氧化酶的活性从而减少组织培养过程中产生的褐化现象，使褐化现象对外植体的不利影响降到最低，提高了愈伤组织的诱导率，大大提高了脱毒苗的成活率。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
(1)本发明提供的一种微茎尖培养结合热处理获得增城蜜菊脱毒苗的培育方法，将微茎尖脱毒与热处理脱毒相结合，以培养愈伤分化植株获得无菌苗的方式，经热处理后再以此无菌苗进行微茎尖脱毒，保证了100％的脱毒效率，获得的增城蜜菊脱毒苗与传统脱毒方式获得脱毒苗相比脱毒率高，繁殖速度快，同时还具有污染率低，成本低，无需损伤取材母株等特点。
(2)本发明的组织培养中，对传统的培养基进行了改进，添加的复合卡拉胶能在为植物提供生长必需的盐类物质的同时，形成稳定、柔软、富有弹性的半固态的培养基；添加的赤霉素与海藻糖协同作用，抑制了多酚氧化酶的活性，从而减少了组织培养过程中褐化现象的产生。
(3)本发明的组织培养所用的培养基中还添加了6-苄氨基嘌呤，可以促进植物细胞的***，促进细胞的延伸；添加的α-萘乙酸，作为植物生长调节剂，能促进促进植物的新陈代谢和光合作用，诱导根的生成。
(4)使用本发明的方法进行增城蜜菊脱毒苗的培育可在短时间内获得大量脱毒效率高生长健壮的无毒苗，可以在病毒防控塑料大棚内，人工控制的环境条件下，进行大规模扦插繁殖，生产无病毒苗供规模化有机栽培种植用，在生产中推广应用，取得了突破性的研究成果。
附图说明
图1为“增城蜜菊”母株的病毒检测电泳图；
图2为切取1.9mm～2.1mm的茎尖诱导成苗的CVB RT-PCR检测电泳图；
图3为切取1.9mm～2.1mm的茎尖诱导成苗的TAV RT-PCR检测电泳图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的保护范围之内。
实施例1一种微茎尖培养结合热处理获得增城蜜菊脱毒苗的培育方法
所述微茎尖培养结合热处理获得增城蜜菊脱毒苗的培育方法，包括以下步骤：
(1)优良株系选育
①第一次组织培养育苗
对选育出的良种“增城蜜菊”优良株系9个进行组织培养育苗，每个株系培育种苗2500株，共22500株。
②第一次栽培种植试验
对9个优良株系组织培苗进行第一次栽培种植试验，每个株系种植1亩，每亩种植2500株，共种植9亩。
③第二次优良单株筛选
通过对菊体生长量(包括长势、株高、冠幅)、花朵数量、干花品质等进行观察对比、检测等综合评价和分析，历经1年，第二次筛选出优良株系6个。
④第二次组织培养育苗
对第二次选育出的良种“增城蜜菊”优良株系6个进行组织培养育苗，每个株系培育种苗2500株，共15000株。
⑤第二次栽培种植试验
对6个优良株系组培苗进行第二次栽培种植试验，每个株系种植1亩，每亩种植2500株，共种植6亩。
⑥第三次优良单株筛选
通过对菊体生长量(包括长势、株高、冠幅)、花朵数量、干花品质等进行观察对比、检测等综合评价和分析，历经1年，第三次筛选出形状优良株系3个。
(2)外植体预处理
取步骤(1)获得的3株性状优良的单株中的嫩枝作为外植体，用作外植体的材料于取材前2个月放入塑料大棚内并于取材10天前开始停止淋水而改用1000倍的70％甲基托布津可湿性粉剂水溶液每隔3天整株连盆土一起淋湿，连续3次。取材时，选取正常健壮的植株，去除叶片，切成3.0cm的茎段或顶芽作为下一步外植体消毒用。
(3)外植体的消毒接种
经过步骤(2)外植体预处理后，采其顶芽为外植体，用二次消毒法在超净工作台上进行外植体消毒：第一次，用0.1％的HgCl2溶液表面消毒4min，无菌水冲洗2次；第二次，用0.1％的HgCl2溶液表面消毒3min，无菌水冲洗5次。
(4)组织培养无菌组培瓶苗建立
将消毒后外植体切成约1.5cm长的小段，带1个腋芽，接种到培养基JHr，在光照强度2500Lux，培养温度23℃，每天光照时间7h的条件下培养20天后。切取经不定芽诱导的芽作材料进行增殖继代接种，单节切割，每节带1片叶子(1个叶芽)，每瓶培养基(JHr培养基)接种8节。接种材料在培养室中培养20天。培养条件：光照强度2500lux,培养温度23℃，每天光照时间7.0h。切取经继代增殖培养的不定芽作材料进行生根诱导接种。单节切割，每节带1片叶子(1个叶芽)，每瓶培养基(JHr培养基)接种8节。接种后，用保鲜膜封好瓶口，放到塑料大棚进行生根炼苗。生根炼苗20天即形成完整植株。
(5)人工气候箱热处理培养预脱毒
将步骤(4)所得的无菌组培瓶苗置于温度为40℃光照强度为2000Lux的光照培养箱中热处理培养72h，接着进行栽培种植试验，得预脱毒的培育苗。
(6)超净工作台组培苗微茎尖无菌切取
在无菌条件下于超净工作台解剖镜下切取步骤(5)所述预脱毒培育苗的茎尖1.9cm，接种到脱毒茎尖不定芽诱导培养基JH7，在光照强度为2500Lux、光照时间为7.0h、温度为23℃的条件下，培养25天，得脱毒不定芽。
(7)脱毒茎尖组织培养无菌繁殖体系建立
将步骤(6)所得的脱毒不定芽作为材料进行增殖继代接种到培养基JHr中，单节切割，每节带1片叶子，在光照强度为2500Lux，光照时间为7.0h，培养温度为23℃的条件下，培养20天，得脱毒茎尖组织培养苗。
(8)脱毒茎尖组织培养苗病毒检测
将步骤(7)所得脱毒茎尖组织培养苗用分子生物学鉴定法进行RNA病毒检测，筛选出不带病毒的脱毒茎尖组织培养苗。
(9)脱毒苗组培工厂化育苗
将步骤(8)中筛选出的不带病毒的脱毒茎尖组织培养苗进行增殖继代培养，接种到生培养基JHr中，在培养室中培养20天。培养条件为光照强度2500Lux,培养温度23℃，每天光照时间7.0h得组培瓶脱毒苗；将所得组培瓶脱毒苗转移到塑料大棚进行生根炼苗，培养20天，得增城蜜菊脱毒苗。
所述移栽基质选用泥炭土、蛭石混合，移栽前，基质用35％的甲醛溶液50倍水淋透15天后使用，移栽时，将已生根且炼苗过的合格试管苗取出，用自来水冲洗干净基部的培养基，然后种植在装好基质的育苗筛上并盖上塑料盖保湿，3天后逐渐打开塑料盖，7天后把塑料盖完全打开。
种植后第1～2天喷急救回生丹一次，以后每周喷多菌灵或甲基托布津或急救回生丹和1/2MS无机成分溶液或“花多多”一次，每天根据天气及基质干湿情况进行喷水，注意基质不能过湿，特别是冬季和早春，否则容易引起烂根而死亡，影响移栽成活率，30天后可出圃种植。
所述培养基JHr包括：ZL培养基+0.2mg/Lα-萘乙酸+1.5％蔗糖+0.55％复合卡拉胶，pH5.8。
所述不定芽初代培养基JH4包括：ZL培养基+1.5mg/L 6-苄氨基嘌呤+0.01mg/Lα-萘乙酸+3.0％蔗糖+0.55％复合卡拉胶，pH5.8。
所述脱毒茎尖不定芽诱导培养基JH7包括：
ZL培养基+0.2mg/L 6-苄氨基嘌呤+0.01mg/Lα-萘乙酸+0.5mg/L赤霉素+100ml/L新鲜椰子汁+10mg/L海藻糖+3.0％蔗糖+0.55％复合卡拉胶，pH5.8。
所述ZL培养基的组成如下表所示：
表1ZL培养基成分组成
化学名称 化学式 用量mg/L
硝酸氨 NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub> 360
硝酸钾 KNO<sub>3</sub> 1800
磷酸二氢钾 KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 370
氯化钙 CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O 440
硝酸钙 Ca(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub> 1200
硫酸镁 MgSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O 170
硫酸亚铁 FeSO<sub>4</sub>﹒7H<sub>2</sub>O 27.8
乙二胺四乙二钠盐 Na<sub>2</sub>-EDTA 37.3
钼酸钠 Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>﹒2H<sub>2</sub>O 0.25
硫酸锰 MnSO<sub>4</sub>﹒4H<sub>2</sub>O 22.3
硫酸锌 ZnSO<sub>4</sub>﹒7H<sub>2</sub>O 8.6
硫酸铜 CuSO<sub>4</sub>﹒5H<sub>2</sub>O 0.025
氯化钴 CoCl<sub>2</sub>﹒6H<sub>2</sub>O 0.025
碘化钾 KI 0.83
硼酸 H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub> 6.2
甘氨酸 C<sub>2</sub>H<sub>5</sub>NO<sub>2</sub> 4.0
盐酸硫胺素 VB<sub>1</sub> 12
盐酸吡哆辛 VB<sub>6</sub> 1.2
抗坏血酸 Vc 2.0
泛酸钙 - 2.4
生物素 V<sub>H</sub> 0.24
烟酸 C<sub>6</sub>H<sub>5</sub>NO<sub>2</sub> 5.0
肌醇 C<sub>6</sub>H<sub>12</sub>O<sub>6</sub> 50
所述复合卡拉胶由以下组分及重量百分数组成：10％海藻酸钙，50％I-型卡拉胶和40％去离子水。
所述复合卡拉胶的制备方法，包括以下步骤：
将I-型卡拉胶加入到去离子水中，升温至60℃至完全溶解后，加入海藻酸钙搅拌均匀，冷却至室温，即得。
实施例2一种微茎尖培养结合热处理获得增城蜜菊脱毒苗的培育方法
所述微茎尖培养结合热处理获得增城蜜菊脱毒苗的培育方法，包括以下步骤：
(1)优良株系选育
方法同实施例1。
(2)外植体预处理
取步骤(1)获得的3株性状优良的单株中的嫩枝作为外植体，用作外植体的材料于取材前2个月放入塑料大棚内并于取材10天前开始停止淋水而改用1000倍的70％甲基托布津可湿性粉剂水溶液每隔3天整株连盆土一起淋湿，连续3次。取材时，选取正常健壮的植株，去除叶片，切成4.0cm的茎段或顶芽作为下一步外植体消毒用。
(3)外植体的消毒接种
经过步骤(2)外植体预处理后，采其顶芽为外植体，用二次消毒法在超净工作台上进行外植体消毒：第一次，用0.1％的HgCl2溶液表面消毒4min，无菌水冲洗2次；第二次，用0.1％的HgCl2溶液表面消毒3min，无菌水冲洗5次。
(4)组织培养无菌组培瓶苗建立
将消毒后外植体切成约1.8cm长的小段，带2个腋芽，接种到培养基JHr，在光照强度3000Lux，培养温度25℃，每天光照时间7.5h的条件下培养23天后，切取经不定芽诱导的芽作材料进行增殖继代接种，单节切割，每节带1片叶子(1个叶芽)，每瓶培养基(JHr培养基)接种8节。接种材料在培养室中培养20天。培养条件：光照强度3000Lux,培养温度25℃，每天光照时间7.5h。切取经继代增殖培养的不定芽作材料进行生根诱导接种。单节切割，每节带1片叶子(1个叶芽)，每瓶培养基(JHr培养基)接种8节。接种后，用保鲜膜封好瓶口，放到塑料大棚进行生根炼苗。生根炼苗23天即形成完整植株。
(5)人工气候箱热处理培养预脱毒
将步骤(4)所得的无菌组培瓶苗置于温度为40℃光照强度为2000Lux的光照培养箱中热处理培养72h，接着进行栽培种植试验，得预脱毒的培育苗。
(6)超净工作台组培苗微茎尖无菌切取
在无菌条件下于超净工作台解剖镜下切取步骤(5)所述预脱毒培育苗的茎尖2.0cm，接种到脱毒茎尖不定芽诱导培养基JH7，在光照强度为3000Lux、光照时间为7.5h、温度为23℃的条件下，培养28天，得脱毒不定芽。
(7)脱毒茎尖组织培养无菌繁殖体系建立
将步骤(6)所得的脱毒不定芽作为材料进行增殖继代接种到培养基JHr中，单节切割，每节带1片叶子，在光照强度为3000Lux，光照时间为7.5h，培养温度为25℃的条件下，培养23天，得脱毒茎尖组织培养苗。
(8)脱毒茎尖组织培养苗病毒检测
将步骤(7)所得脱毒茎尖组织培养苗用分子生物学鉴定法进行RNA病毒检测，筛选出不带病毒的脱毒茎尖组织培养苗。
(9)脱毒苗组培工厂化育苗
将步骤(8)中筛选出的不带病毒的脱毒茎尖组织培养苗进行增殖继代培养，接种到生培养基JHr中，在培养室中培养23天。培养条件为光照强度3000Lux,培养温度23℃，每天光照时间7.5h得组培瓶脱毒苗；将所得组培瓶脱毒苗转移到塑料大棚进行生根炼苗，培养23天，得增城蜜菊脱毒苗。
所述移栽基质选用泥炭土、蛭石混合，移栽前，基质用35％的甲醛溶液50倍水淋透15天后使用，移栽时，将已生根且炼苗过的合格试管苗取出，用自来水冲洗干净基部的培养基，然后种植在装好基质的育苗筛上并盖上塑料盖保湿，3天后逐渐打开塑料盖，7天后把塑料盖完全打开。
种植后第1～2天喷急救回生丹一次，以后每周喷多菌灵或甲基托布津或急救回生丹和1/2MS无机成分溶液或“花多多”一次，每天根据天气及基质干湿情况进行喷水，注意基质不能过湿，特别是冬季和早春，否则容易引起烂根而死亡，影响移栽成活率，30天后可出圃种植。
所述培养基JHr组分与实施例1相同。
所述不定芽初代培养基JH4组分与实施例1相同。
所述脱毒茎尖不定芽诱导培养基JH7组分与实施例1相同
所述ZL培养基组成成分与实施例1中相同。
所述复合卡拉胶由以下组分及重量百分数组成：10％海藻酸钙，50％I-型卡拉胶和40％去离子水。
所述复合卡拉胶的制备方法，包括以下步骤：
将I-型卡拉胶加入到去离子水中，升温至70℃至完全溶解后，加入海藻酸钙搅拌均匀，冷却至室温，即得。
实施例3一种微茎尖培养结合热处理获得增城蜜菊脱毒苗的培育方法
所述微茎尖培养结合热处理获得增城蜜菊脱毒苗的培育方法，包括以下步骤：
(1)优良株系选育
方法同实施例1。
(2)外植体预处理
取步骤(1)获得的3株性状优良的单株中的嫩枝作为外植体，用作外植体的材料于取材前2个月放入塑料大棚内并于取材10天前开始停止淋水而改用1000倍的70％甲基托布津可湿性粉剂水溶液每隔3天整株连盆土一起淋湿，连续3次。取材时，选取正常健壮的植株，去除叶片，切成4.0cm的茎段或顶芽作为下一步外植体消毒用。
(3)外植体的消毒接种
经过步骤(2)外植体预处理后，采其顶芽为外植体，用二次消毒法在超净工作台上进行外植体消毒：第一次，用0.1％的HgCl2溶液表面消毒4min，无菌水冲洗2次；第二次，用0.1％的HgCl2溶液表面消毒3min，无菌水冲洗5次。
(4)组织培养无菌组培瓶苗建立
将消毒后外植体切成约2.0cm长的小段，带3个腋芽，接种到培养基JHr，在光照强度3500Lux，培养温度27℃，每天光照时间8.0h的条件下培养25天后，切取经不定芽诱导的芽作材料进行增殖继代接种，单节切割，每节带1片叶子(1个叶芽)，每瓶培养基(JHr培养基)接种8节。接种材料在培养室中培养25天。培养条件：光照强度3500Lux,培养温度27℃，每天光照时间8.0h。切取经继代增殖培养的不定芽作材料进行生根诱导接种。单节切割，每节带1片叶子(1个叶芽)，每瓶培养基(JHr培养基)接种8节。接种后，用保鲜膜封好瓶口，放到塑料大棚进行生根炼苗。生根炼苗25天即形成完整植株。
(5)人工气候箱热处理培养预脱毒
将步骤(4)所得的无菌组培瓶苗置于温度为40℃光照强度为2000Lux的光照培养箱中热处理培养72h，接着进行栽培种植试验，得预脱毒的培育苗。
(6)超净工作台组培苗微茎尖无菌切取
在无菌条件下于超净工作台解剖镜下切取步骤(3)所述预脱毒培育苗的茎尖2.1cm，接种到脱毒茎尖不定芽诱导培养基JH7，在光照强度为3500Lux、光照时间为8.0h、温度为25℃的条件下，培养30天，得脱毒不定芽。
(7)脱毒茎尖组织培养无菌繁殖体系建立
将步骤(6)所得的脱毒不定芽作为材料进行增殖继代接种到培养基JHr中，单节切割，每节带1片叶子，在光照强度为3500Lux，光照时间为8.0h，培养温度为27℃的条件下，培养25天，得脱毒茎尖组织培养苗。
(8)脱毒茎尖组织培养苗病毒检测
将步骤(7)所得脱毒茎尖组织培养苗用分子生物学鉴定法进行RNA病毒检测，筛选出不带病毒的脱毒茎尖组织培养苗。
(9)脱毒苗组培工厂化育苗
将步骤(8)中筛选出的不带病毒的脱毒茎尖组织培养苗进行增殖继代培养，接种到培养基JHr中，在培养室中培养25天。培养条件为光照强度3500Lux，培养温度25℃，每天光照时间8.0h得组培瓶脱毒苗；将所得组培瓶脱毒苗转移到塑料大棚进行生根炼苗，培养25天，得增城蜜菊脱毒苗。
所述移栽基质选用泥炭土、蛭石混合，移栽前，基质用35％的甲醛溶液50倍水淋透15天后使用，移栽时，将已生根且炼苗过的合格试管苗取出，用自来水冲洗干净基部的培养基，然后种植在装好基质的育苗筛上并盖上塑料盖保湿，3天后逐渐打开塑料盖，7天后把塑料盖完全打开。
种植后第1～2天喷急救回生丹一次，以后每周喷多菌灵或甲基托布津或急救回生丹和1/2MS无机成分溶液或“花多多”一次，每天根据天气及基质干湿情况进行喷水，注意基质不能过湿，特别是冬季和早春，否则容易引起烂根而死亡，影响移栽成活率，30天后可出圃种植。
所述培养基JHr组分与实施例1相同。
所述不定芽初代培养基JH4组分与实施例1相同。
所述脱毒茎尖不定芽诱导培养基JH7组分与实施例1相同
所述ZL培养基组成成分与实施例1中相同。
所述复合卡拉胶由以下组分，重量百分数组成：10％海藻酸钙，50％I-型卡拉胶和40％去离子水。
所述复合卡拉胶的制备方法，包括以下步骤：
将I-型卡拉胶加入到去离子水中，升温至80℃至完全溶解后，加入海藻酸钙搅拌均匀，冷却至室温，即得。
对比例1传统热处理脱毒获得增城蜜菊脱毒苗的培育方法
1.实验步骤
(1)优良株系选育
方法与实施例1相同
(2)组织培养无菌组培瓶苗建立
取步骤(1)获得的3株性状优良的单株中的嫩枝作为外植体，并进行消毒处理，然后将外植体接种到不定芽诱导培养基JHr进行培养，培养30天后，即得愈伤组织，切取愈伤组织上2cm3的小块，接种到不定芽初代培养基JH4中，培养25天，获得不定芽；将所述不定芽转接到组培瓶内的生根诱导培养基JHr中培养40天，得无菌组培瓶苗；培养过程中在光照强度为3000Lux，时间为7.5h，温度为25℃的条件下；
(3)热处理培养预脱毒
将步骤(2)所得的无菌组培瓶苗置于温度为40℃光照强度为2000Lux的光照培养箱中热处理培养72h，接着进行栽培种植试验，得增城蜜菊脱毒苗；
所述培养基JHr组分与实施例1相同。
所述不定芽初代培养基JH4组分与实施例1相同。
所述ZL培养基组成成分与实施例1中相同。
所述复合卡拉胶的组成以及制备方法与实施2相同。
对比例2、3、4一种微茎尖培养结合热处理获得增城蜜菊脱毒苗的培育方法
所述微茎尖培养结合热处理获得增城蜜菊脱毒苗的培育方法与实施例2相同，与实施例2的区别在于组织培养过程步骤(6)中脱毒茎尖不定芽诱导培养基JH7的组分不同，具体见表2。
表2脱毒茎尖不定芽诱导培养基的组分对比
Figure GDA0002317279330000131
Figure GDA0002317279330000141
试验例一、不同脱毒方法对增城蜜菊脱毒苗存活率的影响
1.试验材料：由实施例1、实施例2、实施例3、对比例1的培育方法获得的增城蜜菊脱毒苗。
2.试验步骤
各取200株实施例1、实施例2、实施例3、对比例1培育的增城蜜菊脱毒苗，移栽至塑料大棚内，培养20天，计算增城蜜菊脱毒苗的存活率。
3.试验结果
试验结果如表3所示。
表3不同脱毒方法对增城蜜菊脱毒苗存活率的影响
组别 实施例1 实施例2 实施例3 对比例1
存活植株数 185 196 190 51
存活率 92.5％ 98％ 95％ 25.5％
由表3可以得出，采用本发明的方法培育获得的增城蜜菊脱毒苗在移栽大棚培养20天后，增城蜜菊脱毒苗的存活率均达到90％以上，其中实施例2的存活率最高，达到98％，为本发明最佳实施例；同时，用本发明的培育方法获得的脱毒苗与对比例1的传统方法仅通过热处理脱毒而获得的脱毒苗相比，存活率大大提高，有益效果十分明显。
试验例二、不同成分脱毒茎尖不定芽诱导培养基对植株生根率、褐化率的影响
1.试验材料：由实施例2、对比例2、对比例3、对比例4的培育方法获得的脱毒不定芽。
2试验步骤
取实施例2、对比例2、对比例3、对比例4中200株步骤(4)中培育所得脱毒不定芽，观察其生根与褐化情况，并进行记录。
2.实验结果
实验结果如表4所示。
表4不同成分脱毒茎尖不定芽诱导培养基的茎尖不定芽诱导培养基对植株生根率、褐化率的影响
Figure GDA0002317279330000142
Figure GDA0002317279330000151
由表4可以看出，采用本发明的脱毒茎尖不定芽诱导培养基JH7进行的实验，褐化率仅为6.4％，明显低于其他对比例，而生根率高达93.3％，明显高于对比例2、3、4的生根率，说明本发明微茎尖不定芽诱导培养基中添加的海藻糖和赤霉素共同作用，协同效果明显，在促进植株根系生长的同时降低了植株的褐化率；同时，实施例2与对比例4的对比结果表明，本发明中使用的复合卡拉胶制得的培养基生根率明显好于传统琼脂制得的培养基。
试验例三、脱毒茎尖组织培养苗病毒检测
1.试验材料：增城蜜菊母株、实施例2获得的脱毒茎尖组织培养苗。
2.试验方法
(1)随机选取两株增城蜜菊的母株进行TAV和CVB病毒检测。
(2)取实施例2中切取1.9mm～2.1mm茎尖时获得的脱毒茎尖组织培养苗，分别对植株的TAV和CVB病毒进行RT-PCR检测。
3.试验结果
试验结果如图1、图2、图3所示。
图1为增城蜜菊母株的病毒检测，泳道1表示母株1的CVB病毒检测结果，泳道2表示母株1的TVA病毒检测结果，泳道3表示母株2的CVB病毒检测结果，泳道4表示母株2的TVA病毒检测结果。由图1可得，随机选取的2株母株里都带有TAV和CVB病毒。
图2为切取1.9mm～2.1mm的茎尖诱导成苗的CVB RT-PCR检测结果，泳道“-”为阴性对照，泳道“+”为阳性对照，泳道1-12为切取1.9mm～2.1mm茎尖时诱导出的脱毒茎尖组织培养苗的检测结果。
图3为切取1.9mm～2.1mm的茎尖诱导成苗的TAV RT-PCR检测结果，泳道“-”为阴性对照，泳道“+”为阳性对照，泳道1-12为切取1.9mm～2.1mm茎尖时诱导出的脱毒茎尖组织培养苗的检测结果。
由图1和图2的结果可以得出，对不同大小的微茎尖诱导成的苗，进行RT-PCR病毒检测，发现当茎尖大小为1.9mm～2.1mm时，所获得植株的TAV和CVB病毒检测都均为阴性，表明切取1.9mm～2.1mm茎尖时获得的脱毒茎尖组织培养苗均不带毒，说明本发明中要想获得稳定的“增城蜜菊”脱毒苗，切取1.9mm～2.1mm的茎尖诱导成苗的脱毒效果好，且稳定。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (4)

1.一种微茎尖培养结合热处理获得增城蜜菊脱毒苗的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)优良株系选育
种植增城蜜菊原种，经观察，筛选出9株性状优良的单株，组织培养后获得幼苗，用获得的幼苗进行栽培种植试验，再从中筛选出6株性状优良的单株，同样经组织培养后进行栽培种植试验，最终筛选出3株性状优良的单株；
(2)组织培养无菌组培瓶苗建立
取步骤(1)获得的3株性状优良的单株中的嫩枝作为外植体，并进行消毒处理，然后将外植体接种到培养基JHr进行不定芽诱导培养20-25天；切取经不定芽诱导培养的芽作材料进行增殖继代培养，接种到培养基JH4中，每瓶培养基接种8节；切取经继代增殖培养的不定芽作材料进行生根诱导，接种后，用保鲜膜封好瓶口，放到塑料大棚进行生根炼苗，20～25天即得无菌组培瓶苗；
(3)热处理培养预脱毒
将步骤(2)所得的无菌组培瓶苗放入光照培养箱进行热处理培养，在温度为40℃、光照强度为2000Lux的光照培养箱中每天光照10h，连续培养72h，得预脱毒的培育苗；
(4)微茎尖培养脱毒
在无菌条件下于超净工作台解剖镜下切取步骤(3)所得预脱毒的培育苗的茎尖1.9～2.1cm，接种到脱毒茎尖不定芽诱导培养基JH7，在光照强度为2500～3500Lux、光照时间为7.0～8.0h、温度为23～27℃的条件下，培养25～30天，得脱毒不定芽；
(5)脱毒茎尖组织培养无菌繁殖体系建立
将步骤(4)所得的脱毒不定芽进行增殖继代培养，接种到不定芽初代培养基JH4中，在光照强度为2500～3500Lux，光照时间为7.0～8.0h，培养温度为23～27℃的条件下，培养20～25天，得脱毒茎尖组织培养苗；
(6)脱毒茎尖组织培养苗病毒检测
将步骤(5)所得脱毒茎尖组织培养苗用分子生物学鉴定法进行RNA病毒检测，筛选出不带病毒的脱毒茎尖组织培养苗；
(7)脱毒苗组培工厂化育苗
将步骤(6)中筛选出的不带病毒的脱毒茎尖组织培养苗接种到培养基JHr中诱导生根，培养20-25天后，得组培瓶脱毒苗；将所得组培瓶脱毒苗转移到塑料大棚进行生根炼苗，培养20-25天，得增城蜜菊脱毒苗；
所述步骤(4)中脱毒茎尖不定芽诱导培养基JH7，包括：ZL培养基+0.2mg/L 6-苄氨基嘌呤+0.01mg/Lα-萘乙酸+0.5mg/L赤霉素+100ml/L新鲜椰子汁+10mg/L海藻糖+3.0％蔗糖+0.55％复合卡拉胶，pH5.8；所述复合卡拉胶由以下组分及重量百分数组成：10％海藻酸钙，50％I-型卡拉胶和40％去离子水；
所述步骤(2)和步骤(7)中的培养基JHr包括：ZL培养基+0.2mg/Lα-萘乙酸+1.5％蔗糖+0.55％复合卡拉胶，pH5.8；所述复合卡拉胶由以下组分及重量百分数组成：10％海藻酸钙，50％I-型卡拉胶和40％去离子水；
所述步骤(2)和步骤(5)中的不定芽初代培养基JH4包括：ZL培养基+1.5mg/L 6-苄氨基嘌呤+0.01mg/Lα-萘乙酸+3.0％蔗糖+0.55％复合卡拉胶，pH5.8；所述复合卡拉胶由以下组分及重量百分数组成：10％海藻酸钙，50％I-型卡拉胶和40％去离子水；
所述ZL培养基由以下组分组成：
Figure FDA0002317279320000021
Figure FDA0002317279320000031
2.如权利要求1所述微茎尖培养结合热处理获得增城蜜菊脱毒苗的培育方法，其特征在于，所述复合卡拉胶的制备方法为：将I-型卡拉胶加入到去离子水中，升温至60-80℃至完全溶解后，加入海藻酸钙搅拌均匀，冷却至室温，即得。
3.一种用于增城蜜菊脱毒苗培育的脱毒茎尖不定芽诱导培养基JH7，其特征在于，由以下组分组成：ZL培养基+0.2mg/L 6-苄氨基嘌呤+0.01mg/Lα-萘乙酸+0.5mg/L赤霉素+100ml/L新鲜椰子汁+10mg/L海藻糖+3.0％蔗糖+0.55％复合卡拉胶，所述培养基的pH为5.8；所述的复合卡拉胶由以下组分及重量百分数组成：10％海藻酸钙，50％I-型卡拉胶和40％去离子水；所述ZL培养基由以下组分组成：
Figure FDA0002317279320000041
4.如权利要求3所述的用于增城蜜菊脱毒苗培育的脱毒茎尖不定芽诱导培养基JH7，其特征在于，所述复合卡拉胶的制备方法为：将I-型卡拉胶加入到去离子水中，升温至60-80℃至完全溶解后，加入海藻酸钙搅拌均匀，冷却至室温，即得。
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