CN110651717A - 一种菊花苗组培脱毒与快速繁殖的方法 - Google Patents

一种菊花苗组培脱毒与快速繁殖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种菊花苗组培脱毒与快速繁殖的方法，旨在提供一种菊花苗组培脱毒与快速繁殖的方法，通过本发明繁殖的菊花苗，生长健壮，抗性强，花芽分化早，花大色鲜，开花数多花期长。所述菊花苗组培脱毒与快速繁殖的方法，包括以下步骤：茎尖分生组织脱毒培养、初代培养、继代培养、生根与移栽；所述初代培养采用液体纸桥培养。

Description

一种菊花苗组培脱毒与快速繁殖的方法
技术领域
本发明涉及植物组培脱毒培养技术领域，尤其是一种菊花苗组培脱毒与快速繁殖的方法。
背景技术
菊花是中国十大名花之三，花中四君子(梅兰竹菊)之一，也是世界四大切花(菊花、月季、康乃馨、唐菖蒲)之一，产量居首。菊花具有清寒傲雪的品格，重阳节赏菊和饮菊花酒一直是中国民间长期流传的习惯，远从古代的京都帝王宫廷、官宦门第和庶民百姓，近至当今中国各城市的人民群众，每年都在秋天举行菊花会、菊展和菊式等各种形式的赏菊活动。
菊花除了可供人们观赏外，还具有药用和食用价值。从黄色菊花中提取的叶黄素，是一种重要的抗氧化剂，对视网膜中的黄斑有重要保护作用，缓解视疲劳症状降低白内障的发生率，叶黄素有助于降低、延缓眼睛的老化、退化、病变，减少眼疾的发生率，延缓动脉硬化作用，叶黄素对多种癌症有抑制作用，如乳腺癌、***癌、直肠癌、皮肤癌等。随着提取工艺和食品工业化水平完善的提高，叶黄素在保健食品等领域的前景将越来越广阔。
菊花不仅好看还可食用，可用于鲜食、干食、生食、熟食，还可制作成菊花茶、菊花酥饼、菊花糕、菊花酒等。菊花含叶黄素，除了可作为医药成分外，还是重要的天然色素类和天然保健品，是绿色的健康食品原料，极具商业开发价值。
在长期的无性繁殖和栽培过程，不可避免的使菊花感染病毒病，一年比一年严重，导致优育性状发生了变异和退化，花期延迟、花小数量少，花色暗淡，产量和价值大幅度降低。随着菊花观赏、药用、食用价值的开发，市场对优质菊花种苗的需求量很大。
发明内容
本发明旨在提供一种菊花苗组培脱毒与快速繁殖的方法，通过本发明繁殖的菊花苗，生长健壮，抗性强，花芽分化早，花大色鲜，开花数多花期长。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种菊花苗组培脱毒与快速繁殖的方法，包括以下步骤：茎尖分生组织脱毒培养、初代培养、继代培养、生根与移栽；所述初代培养采用液体纸桥培养。
所述初代培养的培养温度为22-25℃、培养时间为4-5周、光照强度为1000-3000lx、光照时间为12-14h/d。
所述初代培养的培养基为：基本培养基+6-BA 2-3㎎/L+NAA 0.1-0.5㎎/L+葡萄糖3％。
所述基本培养基为：硝酸氨720㎎/L+硝酸钾950㎎/L+二水氯化钙166㎎/L+七水硫酸镁185㎎/L+磷酸二氢钾68㎎/L+七水硫酸亚铁28㎎/L+乙二胺四乙酸钠37㎎/L+四水硫酸猛25㎎/L+七水硫酸锌10㎎/L+六水氯化钴0.025㎎/L+三氧化钼0.25㎎/L+碘化钾10㎎/L+肌醇100㎎/L。
所述继代培养的培养基为：基本培养基+NAA0.1㎎/L+葡萄糖3％+琼脂5％。
所述初代培养的容器为试管，液体培养基按每支试管3-4mL分装，将淲纸剪成条状，淲纸两端沿试管内壁***培养基中，上面高出培养基呈平形或马蹄形。继代培养殖的容器为500mL常规培养瓶，每瓶装培养基75mL。所有培养基和用具用品均要经高压消毒。
所述茎尖分生组织脱毒培养包括外植体选取与消毒、茎尖剥离与接种。
所述外植体选取与消毒具体为：切取菊花带顶芽的主茎3cm，剪掉展开的叶，保留护芽的嫩叶，用自来水冲洗干净后，用0.1％升汞表面消素5-7分钟，再用无菌水漂洗4-5次。
所述茎尖剥离与接种具体为：将消毒后的外植体放到辅有灭菌淲纸的培养皿中，在进行双筒解剖镜下剥离叶原基，露出半圆形分生组织时，切下0.2-0.3mm的生长点，接种到装有初代培养基的试管中，放置于淲纸桥上；优选地，上述操作步骤在超交净工作台上进行。
所述初代培养具体为：接种完毕，将试管放在培养架上，调控温度22-25℃、光照强度1000-3000lx、光照时间12-14小时/天进行培养。培养4-5周，每个茎尖分生组织产生愈伤组织，并分化出5个以上的小苗或从生芽。
所述继代培养具体为：将初代培养分化的试管苗嫩梢剪成一节带一叶的茎段，***继代培养基中，调控温度25-28℃、光照强度2000-5000lx、光照时间保持在每天13-15小时；培养3-4周后长成5-7cm的小苗，照上述方法切割茎段，重复8-10次，增殖率均在10-12倍以上。
所述生根与移栽具体为：将继代培养所得无根苗剪成3-5cm茎段插植到移栽基质中，加盖拱棚覆膜，保持棚内空气湿度85-90％，10天生根率达98-100％。
所述移栽基质为用NAA30㎎/L+IBA20㎎/L+80％克菌丹600倍混合成水溶浸透液珍珠岩。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1、基本培养基中无机盐含量中等，适合花药和生长点的培养，用于菊花外植体的初代和继代培养效果好，分化早，产生愈伤组织和不定芽多。
2、菊花茎尖剥离严格控制在0.2-03mm以内，脱毒干净效果好。
3、初代采用液体纸桥培养，基本无污染，成功率高，试验表明，外植体比在常规固体培养基中的愈伤组织和从生芽分化早、数量多。
3、利用菊花嫩茎易生根的特点，免去了试管生根培养这道工序，省工省时，操作容易，生根早、根系粗壮，幼苗质量好。
4、脱毒后繁育出来的菊花苗，生长健壮，抗性强，花芽分化早，花大色鲜，开花数多花期长。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的权利要求书做进一步的详细说明，但不构成任何对本发明的限制。
实施例1：品种为波斯菊
一、培养基配方
1、初代培养基为液体：基本培养基+6-BA2㎎/L+NAA0.2㎎/L+葡萄糖3％。
2、继代培养基为固体：基本培养基+NAA0.1㎎/L+葡萄糖3％+琼脂5％。
二、茎尖分生组织脱毒培养
1、外植体选取与消毒
切取波斯菊顶芽3-5cm，去掉展开的叶，只保留护芽的嫩叶—自来水冲洗干净—0.1％升汞表面消素5-7分钟—无菌水漂洗4-5次。
2、茎尖剥离与接种
在超交净工作台上放置双筒解剖镜，将消毒后的外植体放到辅有灭菌淲纸的培养皿中，左手拿鑷子固定住茎尖，右手握解剖针，置于镜下剥离叶原基，露出半圆形分生组织时，切下0.2-03mm的生长点，接种到装有液体培养基的试管中，放置于淲纸桥上。
三、初代培养
接种完毕，将试管放在培养架上进行培养，调控温度22-25℃、光照强度1000-3000lx、光照时间保持在每天12-14小时。
四、继代培养
初代培养20天，每个茎尖外植体产生愈伤组织，并分化出5个以上的小苗或从生芽。将试管苗隔梢剪成一节带一叶的茎段，***继代培养基中，调控温度25-28℃、光照强度2000-5000lx、光照时间保持在每天13-15小时。25天后，即长成5-7cm的小苗，再照上述方法切割茎段，重复培养，增殖率达10倍以上。
五、生根与移栽
移栽基质选用珍珠岩，用NAA30㎎/L+IBA20㎎/L+80％克菌丹600倍混合成水溶浸透液珍珠岩，将无根苗剪成3-5cm茎段直接插植到基质中，加盖拱棚覆膜，保持棚内空气湿度85-90％，10天生根率达100％。
实施例2：品种为紫菊
一、培养基配方
1、初代培养基为液体：基本培养基+6-BA3㎎/L+NAA0.2㎎/L+葡萄糖3％。
2、继代培养基为固体：基本培养基+NAA0.1㎎/L+葡萄糖3％+琼脂5％。
二、茎尖分生组织脱毒培养
1、外植体选取与消毒
切取波斯菊顶芽4cm，去掉展开的叶，只保留护芽的嫩叶—自来水冲洗干净—0.1％升汞表面消素5-7分钟—无菌水漂洗4-5次。
2、茎尖剥离与接种
在超交净工作台上放置双筒解剖镜，将消毒后的外植体放到辅有灭菌淲纸的培养皿中，左手拿鑷子固定住茎尖，右手握解剖针，置于镜下剥离叶原基，露出半圆形分生组织时，切下0.2-03mm的生长点，接种到装有液体培养基的试管中，放置于淲纸桥上。
三、初代培养
接种完毕，将试管放在培养架上进行培养，调控温度22-25℃、光照强度1000-3000lx、光照时间保持在每天12-14小时。
四、继代培养
初代培养4-5周，每个茎尖外植体产生愈伤组织，并分化出5个以上的小苗或从生芽。将试管苗隔梢剪成一节带一叶的茎段，***继代培养基中，调控温度25-28℃、光照强度2000-5000lx、光照时间保持在每天13-15小时。22天后，即长成4-5cm的小苗，再照上述方法切割茎段，重复培养，增殖率达10倍以上。
五、生根与移栽
移栽基质选用珍珠岩，用NAA30㎎/L+IBA20㎎/L+80％克菌丹600倍混合成水溶浸透液珍珠岩，将无根苗剪成3-5cm茎段直接插植到基质中，加盖拱棚覆膜，保持棚内空气湿度85-90％，10天生根率达100％。
实施例3：品种为墨菊
一、培养基配方
1、初代培养基为液体：基本培养基+6-BA2㎎/L+NAA0.5㎎/L+葡萄糖3％。
2、继代培养基为固体：基本培养基+NAA0.1㎎/L+葡萄糖3％+琼脂5％。
二、茎尖分生组织脱毒培养
1、外植体选取与消毒
切取波斯菊顶芽3cm，去掉展开的叶，只保留护芽的嫩叶—自来水冲洗干净—0.1％升汞表面消素5-7分钟—无菌水漂洗4-5次。
2、茎尖剥离与接种
在超交净工作台上放置双筒解剖镜，将消毒后的外植体放到辅有灭菌淲纸的培养皿中，左手拿鑷子固定住茎尖，右手握解剖针，置于镜下剥离叶原基，露出半圆形分生组织时，切下0.25mm的生长点，接种到装有液体培养基的试管中，放置于淲纸桥上。
三、初代培养
接种完毕，将试管放在培养架上进行培养，调控温度22-25℃、光照强度1000-3000lx、光照时间保持在每天12-14小时。
四、继代培养
初代培养4-5周，每个茎尖外植体产生愈伤组织，并分化出5个以上的小苗或从生芽。将试管苗隔梢剪成一节带一叶的茎段，***继代培养基中，调控温度25-28℃、光照强度2000-5000lx、光照时间保持在每天13-15小时。20天后，即长成5-7cm的小苗，再照上述方法切割茎段，重复培养，增殖率达10倍以上。
五、生根与移栽
移栽基质选用珍珠岩，用NAA30㎎/L+IBA20㎎/L+80％克菌丹600倍混合成水溶浸透液珍珠岩，将无根苗剪成3-5cm茎段直接插植到基质中，加盖拱棚覆膜，保持棚内空气湿度85-90％，10天生根率达100％。
实施例4：品种为万寿菊
一、培养基配方
1、初代培养基为液体：基本培养基+6-BA2㎎/L+NAA0.3㎎/L+葡萄糖3％。
2、继代培养基为固体：基本培养基+NAA0.1㎎/L+葡萄糖3％+琼脂5％。
二、茎尖分生组织脱毒培养
1、外植体选取与消毒
切取波斯菊顶芽3-5cm，去掉展开的叶，只保留护芽的嫩叶—自来水冲洗干净—0.1％升汞表面消素5-7分钟—无菌水漂洗4-5次。
2、茎尖剥离与接种
在超交净工作台上放置双筒解剖镜，将消毒后的外植体放到辅有灭菌淲纸的培养皿中，左手拿鑷子固定住茎尖，右手握解剖针，置于镜下剥离叶原基，露出半圆形分生组织时，切下0.3mm的生长点，接种到装有液体培养基的试管中，放置于淲纸桥上。
三、初代培养
接种完毕，将试管放在培养架上进行培养，调控温度22-25℃、光照强度1000-3000lx、光照时间保持在每天12-14小时。
四、继代培养
初代培养4-5周，每个茎尖外植体产生愈伤组织，并分化出5个以上的小苗或从生芽。将试管苗隔梢剪成一节带一叶的茎段，***继代培养基中，调控温度25-28℃、光照强度2000-5000lx、光照时间保持在每天13-15小时。18天后，即长成5-7cm的小苗，再照上述方法切割茎段，重复培养，增殖率达12倍以上。
五、生根培养
移栽基质选用珍珠岩，用NAA30㎎/L+IBA20㎎/L+80％克菌丹600倍混合成水溶浸透液珍珠岩，将无根苗剪成3-5cm茎段直接插植到基质中，加盖拱棚覆膜，保持棚内空气湿度85-90％，10天生根率达100％。
对比例1
为了比较本发明脱毒快繁与常规组培快繁育苗的效果，同时进行了试验对比，在与实施例1-4相同的培基配方，将波斯菊、紫菊、墨菊、万寿菊在初代培养时采用常规组培固体茎段直插培养，各自分别接种20瓶；培养条件和继代培养方式与实施例1-4相同，改变其生根培养方式，将其在试管中进行生根培养。
接种后随时观察检查记载两种方法培养的变化，60天后统计两种试验数据，结果详见表1。
表1菊花苗脱毒快繁与常规组培快繁试验统计
Figure BDA0002281247050000091
Figure BDA0002281247050000101
结果显示：采用茎尖脱毒液体纸桥培养芽分化时间比常规组培固体茎段直插培养，芽分化早6到12天，芽分化率高43-48％，增殖倍高8-4.5倍，根系粗壮。

Claims (10)

1.一种菊花苗组培脱毒与快速繁殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：茎尖分生组织脱毒培养、初代培养、继代培养、生根与移栽；所述初代培养采用液体纸桥培养。
2.根据权利要求1所述菊花苗组培脱毒与快速繁殖的方法，其特征在于，所述初代培养的培养温度为22-25℃、培养时间为4-5周、光照强度为1000-3000lx、光照时间为12-14h/d。
3.根据权利要求1所述菊花苗组培脱毒与快速繁殖的方法，其特征在于，所述初代培养的培养基为：基本培养基+6-BA 2-3㎎/L+NAA 0.1-0.5㎎/L+葡萄糖3％。
4.根据权利要求3所述菊花苗组培脱毒与快速繁殖的方法，其特征在于，所述基本培养基为：硝酸氨720㎎/L+硝酸钾950㎎/L+二水氯化钙166㎎/L+七水硫酸镁185㎎/L+磷酸二氢钾68㎎/L+七水硫酸亚铁28㎎/L+乙二胺四乙酸钠37㎎/L+四水硫酸猛25㎎/L+七水硫酸锌10㎎/L+六水氯化钴0.025㎎/L+三氧化钼0.25㎎/L+碘化钾10㎎/L+肌醇100㎎/L。
5.根据权利要求1或4所述菊花苗组培脱毒与快速繁殖的方法，其特征在于，所述继代培养的培养基为：基本培养基+NAA0.1㎎/L+葡萄糖3％+琼脂5％。
6.根据权利要求1所述菊花苗组培脱毒与快速繁殖的方法，其特征在于，所述茎尖分生组织脱毒培养包括外植体选取与消毒、茎尖剥离与接种。
7.根据权利要求6所述菊花苗组培脱毒与快速繁殖的方法，其特征在于，所述茎尖剥离与接种具体为：将消毒后的外植体放到辅有灭菌淲纸的培养皿中，在进行双筒解剖镜下剥离叶原基，露出半圆形分生组织时，切下0.2-0.3mm的生长点，接种到装有初代培养基的试管中，放置于淲纸桥上；优选地，上述操作步骤在超交净工作台上进行。
8.根据权利要求5所述菊花苗组培脱毒与快速繁殖的方法，其特征在于，所述继代培养具体为：将初代培养分化的试管苗嫩梢剪成一节带一叶的茎段，***继代培养基中，调控温度25-28℃、光照强度2000-5000lx、光照时间保持在每天13-15小时；培养3-4周后长成5-7cm的小苗，照上述方法切割茎段，重复8-10次。
9.根据权利要求1所述菊花苗组培脱毒与快速繁殖的方法，其特征在于，所述生根与移栽具体为：将继代培养所得无根苗剪成3-5cm茎段插植到移栽基质中，加盖拱棚覆膜，保持棚内空气湿度85-90％。
10.根据权利要求9所述菊花苗组培脱毒与快速繁殖的方法，其特征在于，所述移栽基质为用NAA30㎎/L+IBA20㎎/L+80％克菌丹600倍混合成水溶浸透液珍珠岩。
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