CN102250776B - 一株应用于污泥和畜禽粪污生物沥浸处理的耐酸性异养菌z3 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株应用于污泥和畜禽粪污生物沥浸处理的耐酸性异养菌Z3，属于环境工程技术领域。单细胞呈圆筒形，节孢子大小为6-12μm×3-6μm，菌落呈平面扩散，生长快，扁平，中心突起，白色，短绒状，液体培养浑浊，沉淀物疏松，繁殖方式为裂殖，形成的节孢子单个或连接成链。能在pH＝2.5的极端酸性环境下正常生长，最适pH为2.5-6，经形态、生理生化特性以及分子生物学鉴定，该菌株属于地霉属(Galactomyces geotrichum)，保藏编号为CGMCC No.4298。该菌株在猪粪粪污和城市污泥生物沥浸环境中可快速利用水溶性小分子有机物或简单有机酸作碳源和能源，从而促进了生物沥浸效率，使猪粪粪污和城市污泥重金属脱出率达到90％以上，脱水性分别提高48％和80％。
Description
一、技术领域
本发明涉及一株应用于污泥和畜禽粪污生物沥浸处理的耐酸性异养菌Z3，是一项利用异养菌与自养菌互作进行生物沥浸处理的技术，属于环境工程技术领域。
二、技术背景
目前我国每年产生约700多万吨(干物质计)各类城市污泥，以及数量更多的工业污泥和畜禽粪污等有机固体废物。这些固体有机废物都存在浓度不等种类不同的重金属，因为城市污水处理厂往往会接纳部分工业废水，而养殖场则在饲料中会添加一些金属盐作为添加剂，使得粪污中重金属也明显提高。此外，这些污泥或粪污还存在难于脱水的难题。例如，我国城市污泥采用加絮凝剂PAM再行机械脱水，其脱水后污泥含水率仍高达85％左右，这些污泥很难处置。因此，实现污泥深度脱水和从污泥中去除有害重金属，是实现污泥合理处置和资源化利用的重要前提，也是化解污泥处置难题的重要技术措施。
近年来，研究发现利用生物沥浸技术(Bioleaching)预处理液态污泥或畜禽粪污具有促进其脱水和溶出重金属的功效。本课题组通过10多年的研究和摸索，于2010年8月24日在江苏无锡市建立了国际上第一个城市污泥生物沥浸处理工厂，规模为日处理5万吨污水所产生的污泥。处理后污泥在不加任何絮凝剂的条件下直接通过机械脱水，可使污泥含水率达到55％左右，而且该技术还可使重金属脱出率达到80％以上，恶臭消除，病原物也被杀灭，展现出良好的产业化前景。
本课题组曾公开了两种高效作用于污泥的自养型生物沥浸微生物的专利(ZL02112924.X，ZL02137921.1)，即嗜酸性氧化亚铁硫杆菌LX5和氧化硫硫杆菌TS6。但在实际运行中，必须配合耐酸性异养菌，才能保持长久的活性。这是因为这两种硫杆菌都是专性化能自养菌，对污泥水溶性有机物有一定的敏感性，而污泥中水溶性有机物含量往往超过了它的致毒水平，需要异养菌分解这些对硫杆菌有毒的物质。本课题组于2004年5月31日发明了一种耐酸性红酵母菌及其用于污泥中重金属的生物脱除的方法的专利(ZL200410044843.8)，通过在污泥中同时接种以水溶性有机物为能量来源和碳源的红酵母菌R30，以大幅度降低这些有毒的小分子在污泥中的浓度，大大提高了硫杆菌在污泥生物沥浸中的活性，使污泥生物沥浸处理效率和稳定性得到进一步提高。这说明在污泥生物沥浸***中，耐酸性异养菌的加入是非常有益的。试验证明，在污泥生物沥浸***中，微生物多样性越丰富，生物沥浸效果越好。继R30菌之后，我们又发现了一种新的耐酸性异养菌D13(专利申请号：201010225268.7)，它们都能在酸性环境下正常生长。鉴于上述两株异养菌均为酵母属的真菌，为寻找更高效不同种类的异养菌，使污泥生物沥浸***的微生物多样性更丰富，我们从生物沥浸的畜禽粪污中分离到一株新的异养菌，并发现它能在污泥和畜禽粪污生物沥浸中挥发很好的作用。
三、发明内容
技术问题本发明的目的在于提供一种耐酸性异养菌以消除污泥生物沥浸处理中对硫杆菌生长有影响的小分子有机物，从而提高生物沥浸效率和长期运行的稳定性。
技术方案下面为本发明的主要内容：
本发明提供的一株在污泥和畜禽粪污生物沥浸中耐酸性的异养菌菌株Z3，分离自生物沥浸酸化的畜禽粪污，经过鉴定确认为地霉属(Galactomyces geotrichum)Z3。该菌株于2010年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国科学院微生物研究所，中国北京)，其保藏编号为CGMCC No.4298。菌株经PCR扩增后，18S rRNA部分基因、ITS1区域、5.8S rRNA、ITS2、28S rRNA部分基因序列在核酸数据库GenBank(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)登录号为HM566199。
上述菌株Z3经鉴定，具有如下生物学特征：
(1)菌株的形态特征：单细胞呈圆筒形，节孢子大小为6-12μm×3-6μm，菌落呈平面扩散，生长快，扁平，中心突起，白色，短绒状，液体培养浑浊，沉淀物疏松，繁殖方式为裂殖，形成的节孢子单个或连接成链。
(2)菌株的生理生化特征：该菌株在25～35℃条件下生长良好，易于常温下培养，其最适生长温度为28℃。在pH2～9均能生长，最适pH为2.5～6，当pH＞7时生长受到一定影响，当pH＜2.5时生长受较大抑制。试验发现在猪粪粪污生物沥浸的后期pH达到2.0时，仍能够检测到菌株Z3，说明它对酸性环境的耐受能力很强。菌株Z3能发酵葡萄糖、果糖、而不发酵乳糖，微弱发酵蔗糖，能同化KNO3和(NH4)2SO4，不能利用肌醇、异丙醇作为唯一碳源，不形成类淀粉化合物。
(3)菌株的分子生物鉴定结果：菌株Z3的18S rRNA部分基因、ITS1区域、5.8S rRNA、ITS2、28S rRNA部分基因共测出325个碱基对，在核酸数据库GenBank(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)登录号为HM566199。18S rRNA-ITS1-5.8S rRNA-ITS2-28S rRNA的序列如下：
gggcttgcat ttcagtattt gtgatttacc acagcaaaca aaaatcatac aatcaaaaca aaaataattaaaacttttaa caatggatct cttggttctc gtatcgatga agaacgcagc gaaacgcgat atttcttgtgaattgcagaa gtgaatcatc agtttttgaa cgcacattgc actttggggt atcccccaaa gtatacttgtttgagcgttg tttctctctt ggaattgctt tgctcttcta aaatttcgaa tcaaattcgt ttgaaaaacaacactattca acctcagatc aagtaggatt acccgctgaa cttaa
菌株Z3与Galactomyces geotrichum strain YF01f相似性最高，同源性达到99.69％，因此，鉴定为Galactomyces sp.Z3，结合生理生化特征将其归类为地霉属。
有益效果
该菌株与已有的同类菌株相比具有明显优点：
在猪粪粪污和污泥生物沥浸***中，能耐受pH2的酸性环境，在pH2.5时能很好生长，因此，在生物沥浸中能保持较长久的活力而不需要经常添加。
该菌能快速利用猪粪粪污和污泥生物沥浸***中溶解性有机物(DOM)，减少DOM对硫杆菌的毒害。
该菌在利用DOM或小分子有机酸时，会迅速产生较高浓度的溶解性CO2，大大促进以CO2为碳源的硫杆菌生长。
因此，在猪粪粪污和污泥生物沥浸中，接种Galactomyces sp.Z3可使猪粪粪污和污泥生物沥浸时间缩短，重金属溶出率提高，且处理后猪粪粪污和污泥脱水性能明显得到提高。
四、具体实施方式
下面叙述本发明的实施例。
1、菌株Z3的分离与扩大培养
配制PDA培养基，成分：马铃薯200g，蔗糖或葡萄糖20g，水1000mL，pH自然，121℃，30min灭菌。用于分离耐酸性异养菌的样品取自于先前完成的猪粪粪污生物沥浸处理后的酸化猪粪粪污(pH值为2.0左右)。用接种环取酸化猪粪粪污液一环，在PDA平板上划线分离，将上述接种有酸化猪粪粪污悬液的平板于28℃下倒置培养3～4d，至生长出菌落。在PDA平板上分离生长较好的有代表性的单菌落做涂布镜检，若有不纯，则进一步挑取此菌落反复划线，直至获得目的菌株的纯菌，并转移斜面保存备用。液体培养条件：从斜面上取Z3菌苔，接种于PDA液体培养基中，28-30℃，于180rpm往复式摇床培养2天，菌数达107个/mL。形态观察和显微镜检发现，该菌株单细胞呈圆筒形，节孢子大小为6-12μm×3-6μm。菌落呈平面扩散，生长快，扁平，中心突起，白色，短绒状，液体培养浑浊，沉淀物疏松，繁殖方式为裂殖，形成的节孢子单个或连接成链。菌株进一步经生理生化鉴定和分子生物学鉴定后确定为地霉属菌株，命名为Galactomyces sp.Z3。
2、Z3最适生长的pH测定
将一定体积的PDA液体培养基按照每瓶50mL分装于一系列150mL三角瓶中。用4N H2SO4将培养基pH值分别调节至1.5，2.0，2.5，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0和8.5的10个梯度，随后于121℃下灭菌15min。待冷却后分别取一环Galactomyces sp.Z3斜面菌苔接种于上述培养基中，置于转速为180r/min摇床中28℃恒温培养48h。其生长用培养液在600nm处的吸光值(OD)来表征，每个pH处理均设3个重复，结果见表1。
表1Galactomyces sp.Z3在不同pH培养基中生长状况
结果表明，Galactomyces sp.Z3能耐受pH2.0的极端酸性环境，在该环境下仍有少量的生长。当pH达到2.5时，该菌就能很好生长，但到pH大于7.0时，生长受影响。
3、Galactomyces sp.Z3对猪粪粪污DOM的利用
取150mL猪粪粪污和城市污泥DOM溶液(预先调节pH为5)分别放于不同三角瓶中，高温湿热灭菌后，冷却，每个三角瓶分别接种Galactomyces sp.Z3菌苔一环，于28℃下培养48h。并各自设置不接种Galactomyces sp.Z3的对照处理，其他条件完全相同。用TOC仪测定培养前后DOM浓度变化，结果见表2。
表2Galactomyces sp.Z3对猪粪粪污和污泥DOM的利用率
结果表明，Z3在48h内对猪粪中DOM的利用率达到59％，而对照处理仅仅为0.3％，对污泥中DOM的利用率达到86％，而对照处理仅为3.2％。说明Z3可通过利用DOM而迅速将其分解，从而减少了DOM对硫杆菌的毒害。与此同时，Z3在利用DOM时可能产生大量的CO2，因此又可能促进了以CO2为碳源的硫杆菌的生长。
4、Z3在猪粪粪污和城市污泥生物沥浸中的作用效果
硫杆菌Thiobacillus sp.，主要为本实验室分离的菌株Thiobacillus thiooxidans TS6(CGMCC NO.0759)和Thiobacillus ferrooxidans LX5(CGMCC No.0727)。在本课题组发明的生物反应器(专利号ZL200520072316.8)中加入含水率为96％的猪粪粪污20L和4g/L的微生物复合营养剂(其配方见本课题组申请的专利：专利申请号201010221264.1)，并接种10％的复合硫杆菌菌液，于28℃下，进行驯化培养，至污泥pH约为3时正式开始进行试验。此时，采用连续进料，连续排料方式处理，即泵入新的猪粪粪污，并同时按一天处理猪粪粪污重量的5％一次性接种Z3液体发酵菌液(以后不再添加)，粪污停留时间(SRT)为2天，稳定运行1周后，采集排出的生物沥浸处理粪污，测定粪污中重金属(Cu，Zn)溶出率和它的脱水性能，同时做不加Z3的对照处理，粪污脱水性能采用测定比阻(γ)来衡量，比阻值越大越难脱水，测定结果见表3。采用上述同样的方法，将猪粪粪污换成城市污泥，在加与不加Z3的情况下，进行生物沥浸，测定结果见表4。
表3在接种与不接种Z3的情况下猪粪粪污生物沥浸处理效果
表4在接种与不接种Z3的情况下城市污泥生物沥浸处理效果
结果显示，在停留时间为2天的生物沥浸条件下，接种Z3处理效果要提高许多，主要表现在重金属溶出率比不接种处理高，重金属溶出率平均达到90％以上，比阻也有大幅度下降。与未加Z3的生物沥浸猪粪粪污和污泥相比，接种Z3菌株的生物沥浸猪粪粪污和污泥脱水性分别提高48％和80％。很明显，该菌具有有效提高生物沥浸的效果。
Claims (4)
1.一株应用于污泥和畜禽粪污生物沥浸处理的耐酸性异养菌Z3，命名地霉属Z3(Galactomyces geotrichum Z3)，2010年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4298。
2.根据权利要求1所述的应用于污泥和畜禽粪污生物沥浸处理的耐酸性异养菌Z3，其特征在于所述的地霉属Z3可在pH2.5的极端酸性环境中正常生长，最适pH为2.5-6。
3.根据权利要求1所述的应用于污泥和畜禽粪污生物沥浸处理的耐酸性异养菌Z3，其特征在于所述的地霉属Z3菌株经PCR扩增后，18S rRNA部分基因、ITS1区域、58S rRNA、ITS2、28S rRNA部分基因序列的GenBank登录号为HM566199，其序列为：
gggcttgcat ttcagtattt gtgatttacc acagcaaaca aaaatcatac aatcaaaaca aaaataatta
aaacttttaa caatggatct cttggttctc gtatcgatga agaacgcagc gaaacgcgat atttcttgtg
aattgcagaa gtgaatcatc agtttttgaa cgcacattgc actttggggt atcccccaaa gtatacttgt
ttgagcgttg tttctctctt ggaattgctt tgctcttcta aaatttcgaa tcaaattcgt ttgaaaaaca
acactattca acctcagatc aagtaggatt acccgctgaa cttaa 。
4.根据权利要求1所述的应用于污泥和畜禽粪污生物沥浸处理的耐酸性异养菌Z3，其特征在于所述的地霉属Z3接种在畜禽粪污和污泥生物沥浸***中反应2天可使它们的脱水性分别提高48％和80％，重金属溶出率提高到90％以上。
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