CN109239339A - 一种纤维蛋白（原）降解产物（fdp）检测试剂盒 - Google Patents

一种纤维蛋白（原）降解产物（fdp）检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测纤维蛋白（原）降解产物的试剂盒，包括平均粒径为280nm和160nm按照体积比3:7混合的双粒径聚苯乙烯乳胶颗粒。本发明通过抗体与较大粒径的乳胶颗粒的结合，增大其与溶液的接触面积，增加反应位点，使反应更快，更加灵敏；同时，该试剂盒的线性检测范围比目前市面上的检测试剂盒要广，可以用于检测1.5‑80.0µg/mL范围内的纤维蛋白（原）降解产物（FDP）的含量，可提高检测较低FDP浓度样本的准确性。

Description

一种纤维蛋白（原）降解产物（FDP）检测试剂盒
技术领域
本发明属于医学检验领域，具体涉及一种采用免疫比浊法定量检测人血浆中纤维蛋白（原）降解产物（FDP）含量的试剂盒。
背景技术
纤维蛋白（原）降解产物（FDP）测定试剂盒（免疫比浊法）用于体外定量检测人血浆中纤维蛋白/纤维蛋白原降解产物（FDP）的含量。
FDP（Fibrin/ Fibrinogen Degradation Products纤维蛋白/纤维蛋白原降解产物）是在纤溶亢进时产生的纤溶酶的作用下，纤维蛋白或纤维蛋白原被分解后产生的降解产物的总称。血液中的FDP浓度上升可证明有纤溶亢进，在恶性肿瘤、产科疾病、血管病变、弥散性血管内综合症（DIC）等各种疾病时显示高值。尤其在凝固及纤溶亢进显著时会引发DIC。因此，FDP检测是DIC诊断及观察治疗过程中的重要指标之一，反应机体纤溶活性的总水平。
近几年来，FDP含量的检测在临床诊断、筛查上应用广泛，如恶性肿瘤、弥散性血管内凝血、深静脉血栓形成、肺栓塞、严重细菌感染、慢性肝病、器官移植的排斥反应、妊娠高血压综合症等疾病所致的继发性及原发性纤溶亢进，FDP含量均出现升高。在溶栓药物的治疗过程中，大量纤溶酶的生成，会加速血栓的溶解，血液中FDP升高，对血清或血浆FDP浓度的检测，可以监控溶栓药物的治疗效果。由于血管内凝血，纤溶异常，大量FDP经肾脏排出或由于肾炎导致纤维蛋白在肾小管沉积同时继发激活纤维蛋白降解***生成FDP从尿中排出，因此尿液中出现FDP也意味着体内或肾脏有血管内凝血和纤溶现象。动态地观察尿FDP的变化，对肾脏移植后排斥反应的诊断有重要意义。因此，检测样本包括血清、血浆、尿液中FDP的含量对纤溶***疾病的早期、快速、准确诊断及对溶栓药物治疗的疗程监测和疗效考核具有重要的应用价值。
目前常用纤维蛋白（原）降解产物的检测方法如下：
1）胶乳凝集法：经典胶乳凝集法是将被检血浆中FDP与包被在乳胶颗粒上的单克隆抗体相作用，产生絮状沉淀反应进行定性或半定量测定。该方法具有简便、快速、费用不高等优点，但其灵敏度低，通过肉眼观察，仅能检出5µg/ml水平的FDP，常用于定性或半定量测定作为筛查，适用于床边检测（POCT）。
2）酶联免疫吸附法( ELISA）：ELISA法检测原理是包被抗人FDP抗体与待测标本中抗原结合，加入酶标抗体后形成复合物，再加入底物呈显色反应，测得的吸光度值与标本中抗原量成正比。该法具有灵敏度高、定量准确等特点，但经典ELISA法操作步骤复杂、费时，不适合急诊使用。
3）免疫胶体金法：该法是将单克隆抗体吸附在多孔薄膜并粘放在有多层吸收垫的塑料盘上，被检标本加入后即与该抗体结合，然后加入胶体金标记的抗体，在薄膜上即产生红色强度，红色强度与血浆中抗原成比例，在几分钟内即可完成。该法易受白细胞、血小板、类风湿因子、肝素及血脂等物质的干扰，特异性不强。
4）乙醇胶试验、鱼精蛋白副凝试验：乙醇胶试验、鱼精蛋白副凝试验是只能通过与FDP产物中X，Y片段产生凝块，仅能对FDP进行定性检测。
5）胶乳免疫比浊法：胶乳免疫比浊法是样本中抗原与包被在胶乳颗粒上的单克隆抗体发生抗原-抗体反应，在一定的缓冲体系中产生凝集而导致浊度增大，浊度的变化率与抗原浓度成正比。目前，已有多种全自动血凝仪用于免疫比浊法FDP的检测，该法有操作简便、快速、定量准确、敏感度高等优点，可满足POCT等需要，在临床研究中应用越来越广泛。但目前市场上用免疫比浊法检测人血浆中纤维蛋白（原）降解产物（FDP）含量的试剂盒在样本中FDP含量较低时存在检测不准确，而且线性检测范围较窄的缺点。
发明内容
针对试剂盒在样本中FDP含量较低时存在检测不准确，而且线性检测范围较窄的问题，本发明提供一种含双粒径乳胶的采用免疫比浊法检测FDP含量的试剂盒，该试剂盒线性范围宽，在低含量下检测误差小、检测准确度高。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种检测纤维蛋白（原）降解产物（FDP）的试剂盒，包括抗人FDP抗体，还包括双粒径聚苯乙烯乳胶颗粒。所述双粒径聚苯乙烯乳胶颗粒为平均粒径为280nm和160nm按照体积比3:7混合。
进一步的，上述试剂盒包括R1试剂：0.05-0.15 mol/L缓冲液1、0.3-0.6 mol/L稳定剂1、0.01-0.05% wt防腐剂；
R2试剂：1-5%wt抗人FDP抗体、0.05-0.20 mol/L缓冲液2、0.3-0.6 mol/L稳定剂2、双粒径聚苯乙烯乳胶颗粒和0.01-0.05%wt防腐剂。
所述试剂盒还包括参考血浆和质控血浆。
所述参考血浆或质控血浆可以为冻干品或溶液；优选为溶液。
所述参考血浆所包括：90-98%FDP、1-5%牛血清白蛋白、5-15mg/mL甘露醇和0.01-0.05%防腐剂。所述质控血浆包括：90-98%FDP、1%-5%牛血清白蛋白、5-15mg/mL甘露醇和0.01-0.05%防腐剂。
所述缓冲液1或2优选自MOPSO缓冲液、DIPSO缓冲液、Tris缓冲液或MES缓冲液。所述缓冲液1的pH优选为7.3-7.7。所述缓冲液2的pH优选为7.2-7.6。
所述稳定剂1优选为无机盐。所述稳定剂2包括无关蛋白、无机盐和助悬剂。作为优选，所述无机盐优选自氯化钠、氯化钾、硫酸钠和硫酸钾中的至少一种。所述无关蛋白优选为牛血清白蛋白。所述助悬剂选自甘油、糖浆、山梨醇中的至少一种。
作为优选，所述防腐剂选自ProClin 300、苯甲酸钠、硫柳汞、山梨酸钠和亚硝酸钠中的至少一种。
作为优选，所述抗人FDP抗体选自鼠抗人FDP抗体、兔抗人FDP抗体或羊抗人FDP抗体。
本发明的试剂盒检测原理为免疫比浊法：将抗体结合到乳胶颗粒上，样本中的被测抗原在缓冲液中与乳胶颗粒表面的抗体相结合，使乳胶颗粒彼此交联，导致溶液浊度增加。在一定范围内，反应液浊度与被测抗原的量呈线性相关。
本发明具有以下优点：
本发明的试剂盒采用的乳胶颗粒为双粒径，通过抗体与较大粒径的乳胶颗粒的结合，增大其与溶液的接触面积，增加反应位点，使反应更快，更加灵敏；同时，该试剂盒的线性检测范围比目前市面上的检测试剂盒要广，可以用于检测1.5-80.0 µg/mL范围内的纤维蛋白（原）降解产物（FDP）的含量，可提高检测较低FDP浓度样本的准确性。
附图说明
图1为实施例2中利用实施例1制备的试剂盒检测纤维蛋白（原）降解产物（FDP）的线性回归曲线；
图2为实施例2中利用对比例1制备的试剂盒检测纤维蛋白（原）降解产物（FDP）的线性回归曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 试剂盒的制备
1. R1试剂：
（1）称取所需纯化水1L（生产体积总量）：以1L为例，其他组分根据生产需要进行等比例称量；
（2）称取9.732 g 3-双（2-羟乙基）氨基-2-羟基丙磺酸（DIPSO）缓冲液（0.04M DIPSO，pH：7.5±0.2），23.376g氯化钠（0.4M），0.3gProClin 300（0.03%）按顺序投原料，确保每种原料完全溶解后再加下一种。
2. R2试剂：
2.1 磷酸盐缓冲液配制
（1）量取所需纯化水2L；
（2）分别称取磷酸二氢钾（0.1M）27.218g和氯化钠（0.4M）46.752g，加入2L纯化水中，室温下充分溶解。
2.2 聚苯乙烯乳胶微球的活化
（1）将平均粒径为280nm和160nm的聚苯乙烯乳胶颗粒按照体积比3:7混合（280nm聚苯乙烯乳胶颗粒30mL，160nm的聚苯乙烯乳胶颗粒70mL），移取50mL配制好的聚苯乙烯乳胶微球至烧杯中，用100mL磷酸盐缓冲液稀释乳胶微球；
（2）加入NHS 30mg充分溶解，再加入EDC 50mg充分溶解，室温反应30分钟，不断搅拌；
（3）12000rpm离心30分钟，弃上清，收集离心沉淀；每次用100mL磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤两次，离心沉淀后，弃上清；
（4）用100mL磷酸盐缓冲液重新悬浮乳胶微球，超声30分钟使其分散。
2.3 抗体的包被及封闭
（1）称取50mg（以1L生产体积总量为例）抗人FDP抗体溶于磷酸盐缓冲液中，加入活化好的聚苯乙烯乳胶溶液，包被2h；
（2）在包被好的抗体乳胶中，加入5mL乙醇胺，搅拌10分钟；
（3）12000rpm离心30分钟，弃上清。每次用100mL磷酸盐缓冲液洗涤两次，离心沉淀后，弃上清。用100mL磷酸盐缓冲液重新悬浮乳胶微球，超声20分钟；
（4）加入30g BSA（3%）和0.3g ProClin 300（0.03%），充分溶解后，加入900mL的磷酸盐缓冲液，即得R2试剂。
2.4 FDP参考血浆的配制
（1）量取所需人血浆100ml（生产体积总量）：以100ml为例，其他组分根据生产需要进行等比例称量；
（2）称量，按顺序投原料，确保每种原料完全溶解后再加下一种；
每100ml人血浆中，甘露醇1.2g（12mg/mL），牛血清白蛋白3g（3%牛血清白蛋白），适量的FDP，ProClin 300 0.03g（0.03% ProClin 300）。
2.5 FDP质控血浆的配制
（1）量取所需人血浆100ml（生产体积总量）：以100ml为例，其他组分根据生产需要进行等比例称量；
（2）称量，按顺序投原料，确保每种原料完全溶解后再加下一种。每100ml人血浆中，甘露醇1.2g（12mg/mL），牛血清白蛋白3g（3%牛血清白蛋白），适量的FDP，ProClin 300 0.03g（0.03% ProClin 300）。
对比例1
R1的制备方法如实施例1所述。R2的制备方法如实施例1所述，不同在于聚苯乙烯乳胶微球的粒径为180nm。得到单粒径聚苯乙烯乳胶的试剂盒。
实施例2 线性范围
采用希森美康全自动凝血分析仪CA-1500检测实施例1与对比例1中试剂盒检测FDP的线性范围。
1. 仪器具体参数设置
表1 全自动凝血分析仪参数设置
。
2. 线性范围测定方法
将接近线性范围上限的FDP高浓度样本（80.67µg/mL），用FDP稀释液将其按照1、3/4、1/2、1/4、1/8、1/16、1/24、1/50的比例进行稀释，共配制成8个不同浓度的溶液，用实施例2中所述方法进行测定，每个浓度重复测定3次，并求出平均浓度及其与理论浓度的相对偏差、绝对偏差，并进行线性回归分析，利用实施例1（双粒径）制备的试剂盒检测纤维蛋白（原）降解产物（FDP）的线性回归方程为y=78.047x-0.8035，相关系数r为0.9978，利用对比例1（单粒径）制备的试剂盒检测纤维蛋白（原）降解产物（FDP）的线性回归方程为y=77.293x-1.1198，相关系数r为0.9946，这说明利用实施例1（双粒径）制备的试剂盒在1.5-80.0µg/mL线性范围内的线性相关性比用对比例1制备的试剂盒好。
双粒径与单粒径聚苯乙烯乳胶试剂盒的测定结果如表2和表3所示；根据表2和表3中数据，以稀释比例为横坐标，以检测结果为纵坐标作图1和图2，并计算回归方程与r（相关系数）。由表2、表3数据可知，含双粒径聚苯乙烯乳胶试剂盒，测定的线性范围更宽，而且线性相关系数增大。
表2 实施例1制备的试剂盒的测定结果
。
表3 对比例1制备的试剂盒的测定结果
。

Claims (8)

1.一种检测纤维蛋白（原）降解产物的试剂盒，包括抗人FDP抗体，其特征在于，还包括双粒径聚苯乙烯乳胶颗粒。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述双粒径聚苯乙烯乳胶颗粒为平均粒径为280nm和160nm按照体积比3:7混合。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒包括：
R1试剂：0.05-0.15 mol/L缓冲液1、0.3-0.6 mol/L稳定剂1、0.01-0.05% wt防腐剂；
R2试剂：1-5%wt抗人FDP抗体、0.05-0.20 mol/L缓冲液2、0.3-0.6 mol/L稳定剂2、双粒径聚苯乙烯乳胶颗粒和0.01-0.05%wt防腐剂。
4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，还包括参考血浆和质控血浆。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，参考血浆或质控血浆选自冻干品或溶液。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，缓冲液1或2选自MOPSO缓冲液、DIPSO缓冲液、Tris缓冲液或MES缓冲液；所述缓冲液1的pH优选为7.3-7.7；所述缓冲液2的pH优选为7.2-7.6。
7.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述稳定剂1为无机盐；所述稳定剂2包括无关蛋白、无机盐和助悬剂。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗人FDP抗体选自鼠抗人FDP抗体、兔抗人FDP抗体或羊抗人FDP抗体。
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