CN115372520A - 一种大果木姜子油的入血成分以及成分分布测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大果木姜子油的入血成分以及成分分布测定方法,属于中药技术领域,一种大果木姜子油的入血成分,所述入血成分包括桉油精、对伞花烃、4‑萜烯醇、4‑异丙基环己‑2‑烯‑1‑酮、α‑松油醇、2‑(4‑甲基苯基)丙‑2醇;一种大果木姜子油的入血成分分布测定方法,用于测定所述的大果木姜子油的入血成分分布,包括以下步骤:S1、溶液配制、S2、药液配制、S3、组织样品的收集、S4、组织样品的处理、S5、获得标准曲线、S6、组织匀浆样品测定;它可以表明大果木姜子油的入血成分,以及在大鼠体内各组织分布情况,阐明大果木姜子油中成分在大鼠体内的动力学特征及组织暴露程度,为大果木姜子油的深层次开发利用提供药效物质基础。
Description
技术领域
本发明涉及中药技术领域,更具体地说,涉及一种大果木姜子油的入血成分以及成分分布测定方法。
背景技术
大果木姜子为樟科樟属植物米槁的干燥成熟果实,又名毛丹母、青吐木、八角带,主要产于我国贵州、广西和云南等地,最早记载于《本草纲目拾遗》:“樟梨,即樟树子也,……,大者为贵,小者次之,其大者即为本品”。大果木姜子油是通过水蒸汽蒸馏法从大果木姜子干果中获得的挥发油,是贵州少数民族常用药物,其性状是淡黄色澄清液体,有清香气味,味辛辣,略有麻感,具有温中散寒,理气止痛等功效,用于胃痛、腹痛、胸痛、风湿性关节炎、呕吐及胸闷等,外用驱除蚊蝇。现代研究表明,大果木姜子的主要药效成分是挥发油,能增加心肌供氧,降低心肌耗氧量,具有抗心肌缺血作用,并能松弛内脏平滑肌和血管平滑肌,还具有抗病毒、抗炎镇痛、抑菌等作用。目前,以大果木姜子油为主药上市的相关制剂,有理气活血滴丸、心胃止痛胶囊、米槁心乐滴丸、米槁精油滴丸等,在临床上主要用于冠心病、心绞痛等心血管疾病及胃肠道疾病的治疗。
目前,在中药挥发油的质量控制方面,主要采用GC-MS或GC技术对挥发油的化学成分进行定性和定量研究。在中药质量评价体系中,多采用指纹图谱技术来体现中药的整体性。指纹图谱结合化学模式识别可对指纹图谱数据进行更深层次的挖掘与探讨,已被广泛用于中药的鉴别和质量评价中。化学模式识别是化学计量学的重要组成部分,可分为无监督模式识别和有监督模式识别方法。无监督模式识别方法包括聚类分析(CA)、主成分分析(PCA)等;有监督的模式识别方法包括判别分析(DA)、偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)等,可对多指标数据进行综合、降维和分类,从而更全面、科学、客观地反映中药质量信息。中药指纹图谱结合多成分含量测定方法,具有整体性、特征性、稳定性等特点,可作为全面评价中药质量的有效控制手段之一,已成为一种综合评价中药内在质量的模式在国内外得到广泛接受,可作为中药挥发油质量控制的一种手段。
中药药代动力学是借助于动力学原理,研究中药成分在体内吸收(Absorption,A)、分布(Distribution,D)、代谢(Metabolism,M)、***(Excretion,E)的动态变化规律及其体内时量-时效关系,并用数学函数加以定量描述的一门学科。中药药代动力学的研究可为阐明其药效物质基础、中药作用机制及中药复方配伍的科学性,为中药给药方案的设计和优化提供依据。中药的组织分布是影响药物代谢和药物治疗效果的重要因素,适宜的蓄积部位和暴露量,可以较为准确地提供中药的安全性和有效性信息。大果木姜子油是理气活血滴丸、心胃止痛胶囊、米稿心乐滴丸等多个治疗心脑血管疾病、胃肠道疾病等的中药制剂的主药,因此研究大果木姜子油在生物体内的ADME过程特征,可为研究上述大果木姜子油制剂的药效物质基础提供可量化的依据。目前,有关于大果木姜子油的国内外文献报道主要集中于提取纯化、化学成分及药理活性方面,尚且未见其的药代动力学及组织分布的研究,这样就使得大果木姜子油的药理毒理研究进展缓慢,同时无法进行临床应用。
发明内容
1.要解决的技术问题
针对现有技术中存在的问题,本发明的目的在于提供一种大果木姜子油的入血成分以及成分分布测定方法,它可以表明大果木姜子油的入血成分,以及在大鼠体内各组织分布情况,阐明大果木姜子油中成分在大鼠体内的动力学特征及组织暴露程度,为大果木姜子油的深层次开发利用提供药效物质基础。
2.技术方案
为解决上述问题,本发明采用如下的技术方案。
一种大果木姜子油的入血成分,所述入血成分包括桉油精、对伞花烃、4-萜烯醇、4-异丙基环己-2-烯-1-酮、α-松油醇、2-(4-甲基苯基)丙-2醇。
一种大果木姜子油的入血成分分布测定方法,用于测定所述的大果木姜子油的入血成分分布,包括以下步骤:
S1、溶液配制
1)标准品溶液的配制:精密称取桉油精、对伞花烃、4-萜烯醇、4-异丙基环己-2-烯-1-酮、α-松油醇、2-(4-甲基苯基)丙-2醇对照品适量,置于容量瓶中,加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度,制成含桉油精、对伞花烃、4-萜烯醇、4-异丙基环己-2-烯-1-酮、α-松油醇、2-(4-甲基苯基)丙-2醇的混合对照品溶液,保存备用;
2)内标溶液的配制:精密称取环己酮对照品,置于容量瓶中,加入少量乙酸乙酯超声溶解并定容,获得环己酮的内标储备液;取环己酮内标储备液适量,逐步稀释配制成内标溶液,保存备用;
S2、药液配制:称取大果木姜子油适量,置于烧杯中,加入0.4-0.6%吐温-80生理盐水溶液,超声8-12min溶解,即得药液,且现配现用;
S3、组织样品的收集:
1)选取SD雄性大鼠若干只,并平均分组,给药前12h禁食,自由饮水,大鼠口服步骤S2中的药液后,分别于给药后进行股动脉放血,之后迅速取出心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肠、皮肤、肌肉;
2)用冰生理盐水将组织表面的血迹以及内容物洗去,并用滤纸将其沾干,装入自封袋中形成组织样品,保存备用;
S4、组织样品的处理:将步骤S3中的组织样品用生理盐水以1:2(g:mL)的比例匀浆,然后7000-9000r·min-1离心8-15min,取大鼠研磨组织上清液100μL,置1.5mL离心管中,依次加入步骤S1-2中的内标溶液100μL,涡混2-5min,再加入乙酸乙酯200μL,涡混2-5min,4-6℃、10000-13000r·min-1离心10-15min,得到组织匀浆样品,保存备用;
S5、获得标准曲线:取100μL大鼠空白肝组织匀浆液,加入含有6种成分的步骤S1-1中的混合对照品溶液100μL,配制成相当于大鼠的组织匀浆样品的药物浓度;按步骤S4项下组织样品的处理方法操作,以待测成分与环己酮内标峰面积之比(A/Ai)为纵坐标Y,各成分的浓度(C)为横坐标X进行线性回归,计算的直线方程,即为标准曲线;
S6、组织匀浆样品测定:将步骤S4中的组织匀浆样品通过GC-MS SIM法进样测定,记录所有样品的指标成分和环己酮内标的峰面积,将其带入到随行步骤S5中的标准曲线中计算出各待测成分的浓度。
进一步的,步骤S1-1中的对照品置于10mL的容量瓶中,且混合对照品溶液在-15-25℃下保存备用,步骤S1-2的容量瓶同样为10mL,且保存温度同样为-15-25℃。
进一步的,步骤S1-2中的内标溶液浓度为200-250ng·mL-1。
进一步的,步骤S3-1中股动脉放血时间点为四个,分别是给药后0.167h、0.5h、1h和1.5h。
进一步的,步骤S3-2中组织样品的保存温度为-15-25℃。
进一步的,步骤S3-1中的给药剂量为0.365-0.385g/d。
进一步的,步骤S4的组织匀浆样品保存于盛有内插管的进样瓶内,且保存温度为-15-25℃。
进一步的,步骤S6中GC-MS SIM法的色谱条件为不分流进样。
进一步的,步骤S6中GC-MS SIM法中质谱条件的检测电压为0.25-0.3KV。
3.有益效果
相比于现有技术,本发明的优点在于:
本方案以质谱法探索了大果木姜子油的化学物质组成,定性结合定量的质量控制研究,为大果木姜子油的质量标准提高与完善提供了实验依据,初步明确了大果木姜子油在生物体内的桉油精、对伞花烃、4-萜烯醇、4-异丙基环己-2-烯-1-酮、α-松油醇、2-(4-甲基苯基)丙-2醇6种成分的药动学过程及组织分布特征,为大果木姜子油的深度开发和利用提供了研究基础。
附图说明
图1为本发明的桉油精在大鼠体内的分布情况;
图2为本发明的对伞花烃在大鼠体内的分布情况;
图3为本发明的4-萜烯醇在大鼠体内的分布情况;
图4为本发明的4-异丙基环己-2-烯-1-酮在大鼠体内的分布情况;
图5为本发明的α-松油醇在大鼠体内的分布情况;
图6为本发明的2-(4-甲基苯基)丙-2醇在大鼠体内的分布情况。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述;显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例,基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例:
一种大果木姜子油的入血成分,所述入血成分包括桉油精、对伞花烃、4-萜烯醇、4-异丙基环己-2-烯-1-酮、α-松油醇、2-(4-甲基苯基)丙-2醇。
一种大果木姜子油的入血成分分布测定方法,用于测定上述桉油精、对伞花烃、4-萜烯醇、4-异丙基环己-2-烯-1-酮、α-松油醇、2-(4-甲基苯基)丙-2醇的入血成分分布,包括以下步骤:
1.2.1溶液配制
1.2.1.1标准品溶液的配制
精密称取桉油精、对伞花烃、4-萜烯醇、4-异丙基环己-2-烯-1-酮、α-松油醇、2-(4-甲基苯基)丙-2醇对照品适量,置于10mL量瓶中,加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度,制成含桉油精(1.378mg·mL-1)、对伞花烃(1.110mg·mL-1)、4-萜烯醇(1.660mg·mL-1)、4-异丙基环己-2-烯-1-酮(1.538mg·mL-1)、α-松油醇(1.690mg·mL-1)、2-(4-甲基苯基)丙-2醇(1.694mg·mL-1)的混合对照品溶液,-20℃保存备用。
1.2.1.2内标溶液的配制
精密称取环己酮对照品,置于10mL容量瓶中,加入少量乙酸乙酯超声溶解并定容,获得环己酮(1.072mg·mL-1)的内标储备液。取环己酮内标储备液适量,逐步稀释配制成200ng·mL-1的内标溶液,-20℃保存备用。
1.2.2给药剂量
参考2012版的国家食品药品监督管理局标准(理气活血滴丸):理气活血滴丸每日30丸(丸重25mg)用量,即每日0.75g,共使用大果木姜子药材4500g,大果木姜子油提取率11.30%(参考第一章“(一)”下的“2.5”项),换算得共使用了508g挥发油;经计算:508/1000*0.75=0.381g/d,每日服用大果木姜子油量为0.381g/d,该剂量在现行2019版《贵州省中药材、民族药材质量标准》规定的内服大果木姜子油0.05~0.45g/d范围内;即60kg患者每日剂量6.35mg·kg-1,按照大鼠等效剂量6.3倍计算,大鼠口服剂量为40.05mg·kg-1。本实施例将大鼠等效剂量40.05mg·kg-1定为低剂量、80.10mg·kg-1为中剂量、160.20mg·kg-1为高剂量。
1.2.3药液配制
药液配制:称取大果木姜子油适量,置于烧杯中,加入0.5%吐温-80生理盐水溶液,超声10min溶解,现配现用。
1.2.4 GC-MS条件
色谱条件:不分流进样;程序升温详见下表。
柱温箱温度程序
质谱条件:检测电压:0.25KV,6种指标成分及内标的检测离子信息详见下表。
指标成分及内标的质谱条件
1.2.5组织样品的收集
SD雄性大鼠24只,体重为220±20g,分为四组,每组6只,给药前12h禁食,自由饮水,大鼠口服大果木姜子油(80.10mg·kg-1)后,分别于给药后0.167h、0.5h、1h和1.5h四个时间点股动脉放血后,迅速取出心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肠、皮肤、肌肉。用冰生理盐水将组织表面的血迹以及内容物洗去,并用滤纸将其沾干,装入自封袋中,-20℃保存备用。
1.2.6组织样品的处理
将组织用生理盐水以1:2(g:mL)的比例匀浆,然后8000r·min-1离心10min,取大鼠研磨组织上清液100μL,置1.5mL离心管中,依次加入内标溶液100μL,涡混2min,再加入乙酸乙酯200μL,涡混2min,4℃、12000r·min-1离心10min,获得组织匀浆样品于盛有内插管的进样瓶内,-20℃保存备用。
1.2.7获得标准曲线
取100μL大鼠空白肝组织匀浆样品,加入含有6种成分的系列对照品溶液100μL,配制成相当于大鼠的组织匀浆样品的药物浓度。按“1.2.6”项下组织样品处理方法操作。以待测成分与环己酮内标峰面积之比(A/Ai)为纵坐标Y,各成分的浓度(C)为横坐标X进行线性回归,计算的直线方程,即为标准曲线。
6种成分在相应的浓度范围内与峰面积呈良好线性关系。大鼠的组织匀浆样品标准曲线方程及最低定量限(LLOQ)详见下表。
各组织中6种成分的标准曲线
1.2.8组织匀浆样品测定
从(-20℃)冰箱中取出大鼠的组织匀浆样品,室温解冻后按“1.2.6”项下组织样品处理方法进行处理,通过GC-MS SIM法进样测定。记录所有样品的指标成分和环己酮内标的峰面积,将其带入到随行标准曲线中计算出各待测成分的浓度。
组织分布测定结果:
通过GC-MS SIM法研究了大鼠灌胃给予大果木姜子油(80.10mg·kg-1)后6种成分在大鼠组织中分布情况。6种成分在大鼠体内的各组织中的浓度见下表,其分布趋势和水平如说明书附图所示。
6种成分在大鼠体内的分布情况(x±s,n=6)
其中,6种成分在组织中立即被检测到,并在0.17或0.5h达到最高浓度,然后在大多数组织中在1h时迅速下降到低水平。该趋势和第三部分中药动参数t1/2和MRT的结果相符。除了胃肠道,这6种成分在富含血液的心脏、肝脏、肾脏、脾脏、脑中表现出高暴露量。值得注意的是,除了4-异丙基环己-2-烯-1-酮,其它5种成分的物理性质有助于渗透到血脑屏障中,这5种化合物均在脑中表现出明显的水平。
其中,6种成分的在大鼠的各组织中的含量趋势如下所述:桉油精在心、肝、脾、肺、脑、胃、小肠中均有含量;对伞花烃在肝、小肠中均有含量;4-萜烯醇在肝、脑、胃中均有含量;4-异丙基环己-2-烯-1-酮在肝、胃、小肠中均有含量;α-松油醇在心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、小肠、肌肉中均含量;2-(4-甲基苯基)丙-2醇在肝、肺、胃、小肠中均有含量;其各成分在以上组织中的含量在0.17h达到最高,在0.5~1.5h呈现出下降趋势,这与第三部分药时曲线图3-2中该成分在0.033~1.5h出现的趋势现象相吻合。桉油精在皮肤中也有含量;对伞花烃在心、脾、肺、肾、脑、胃、肌肉、皮肤中均有含量;4-萜烯醇在心、脾、肺、肾、小肠、肌肉、皮肤中均有含量;4-异丙基环己-2-烯-1-酮在脾、肾、皮肤中均有含量;α-松油醇在皮肤中也有含量;2-(4-甲基苯基)丙-2醇在心、脾、肾、脑、肌肉、皮肤中含量;其各成分在以上组织中的含量在0.17~0.5h时呈上升趋势,在0.5h时达峰,随后迅速下降。桉油精在肾、肌肉中在1h时含量达到峰值,在1.5h迅速下降。
综上所述,首先,本方案建立并验证了一种基于GC-MS SIM的简便、灵敏和高特异性的方法,用于测定大鼠的组织中的桉油精、α-松油醇、对伞花烃、4-异丙基环己-2-烯-1-酮、2-(4-甲基苯基)丙-2醇;方法学的各项指标符合生物样品分析要求。
其次,本方案首次展示了大鼠灌胃给予大果木姜子油后6种成分在的体内分布情况,结果表明6种成分物被快速吸收并转移到组织,然后迅速消除;其中胃肠道、肝脏内暴露最高,除了4-异丙基环己-2-烯-1-酮,其它5种成分在是肾脏、心脏、脾脏、脑、肺、肌肉、皮肤中均被检测到;而4-异丙基环己-2-烯-1-酮仅在胃、小肠、肾、脾、肝、皮肤被检测到;除了4-异丙基环己-2-烯-1-酮,其它5种成分具有促进吸收和血脑屏障通透性的特性。
最后,本方案探讨了大果木姜子油的主要成分的体内处置过程,有助于为大果木姜子油的药理毒理研究和临床应用提供参考。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式;但本发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种大果木姜子油的入血成分,其特征在于,所述入血成分包括桉油精、对伞花烃、4-萜烯醇、4-异丙基环己-2-烯-1-酮、α-松油醇、2-(4-甲基苯基)丙-2醇。
2.一种大果木姜子油的入血成分分布测定方法,其特征在于,用于测定权利要求1所述的大果木姜子油的入血成分分布,包括以下步骤:
S1、溶液配制
1)标准品溶液的配制:精密称取桉油精、对伞花烃、4-萜烯醇、4-异丙基环己-2-烯-1-酮、α-松油醇、2-(4-甲基苯基)丙-2醇对照品适量,置于容量瓶中,加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度,制成含桉油精、对伞花烃、4-萜烯醇、4-异丙基环己-2-烯-1-酮、α-松油醇、2-(4-甲基苯基)丙-2醇的混合对照品溶液,保存备用;
2)内标溶液的配制:精密称取环己酮对照品,置于容量瓶中,加入少量乙酸乙酯超声溶解并定容,获得环己酮的内标储备液;取环己酮内标储备液适量,逐步稀释配制成内标溶液,保存备用;
S2、药液配制:称取大果木姜子油适量,置于烧杯中,加入0.4-0.6%吐温-80生理盐水溶液,超声8-12min溶解,即得药液,且现配现用;
S3、组织样品的收集:
1)选取SD雄性大鼠若干只,并平均分组,给药前12h禁食,自由饮水,大鼠口服步骤S2中的药液后,分别于给药后进行股动脉放血,之后迅速取出心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肠、皮肤、肌肉;
2)用冰生理盐水将组织表面的血迹以及内容物洗去,并用滤纸将其沾干,装入自封袋中形成组织样品,保存备用;
S4、组织样品的处理:将步骤S3中的组织样品用生理盐水以1:2(g:mL)的比例匀浆,然后7000-9000r·min-1离心8-15min,取大鼠研磨组织上清液100μL,置1.5mL离心管中,依次加入步骤S1-2中的内标溶液100μL,涡混2-5min,再加入乙酸乙酯200μL,涡混2-5min,4-6℃、10000-13000r·min-1离心10-15min,得到组织匀浆样品,保存备用;
S5、获得标准曲线:取100μL大鼠空白肝组织匀浆液,加入含有6种成分的步骤S1-1中的混合对照品溶液100μL,配制成相当于大鼠的组织匀浆样品的药物浓度;按步骤S4项下组织样品的处理方法操作,以待测成分与环己酮内标峰面积之比(A/Ai)为纵坐标Y,各成分的浓度(C)为横坐标X进行线性回归,计算的直线方程,即为标准曲线;
S6、组织匀浆样品测定:将步骤S4中的组织匀浆样品通过GC-MS SIM法进样测定,记录所有样品的指标成分和环己酮内标的峰面积,将其带入到随行步骤S5中的标准曲线中计算出各待测成分的浓度。
3.根据权利要求2所述的大果木姜子油的入血成分分布测定方法,其特征在于,步骤S1-1中的对照品置于10mL的容量瓶中,且混合对照品溶液在-15-25℃下保存备用,步骤S1-2的容量瓶同样为10mL,且保存温度同样为-15-25℃。
4.根据权利要求2所述的大果木姜子油的入血成分分布测定方法,其特征在于,步骤S1-2中的内标溶液浓度为200-250ng·mL-1。
5.根据权利要求2所述的大果木姜子油的入血成分分布测定方法,其特征在于,步骤S3-1中股动脉放血时间点为四个,分别是给药后0.167h、0.5h、1h和1.5h。
6.根据权利要求2所述的大果木姜子油的入血成分分布测定方法,其特征在于,步骤S3-2中组织样品的保存温度为-15-25℃。
7.根据权利要求2所述的大果木姜子油的入血成分分布测定方法,其特征在于,步骤S3-1中的给药剂量为0.365-0.385g/d。
8.根据权利要求2所述的大果木姜子油的入血成分分布测定方法,其特征在于,步骤S4的组织匀浆样品保存于盛有内插管的进样瓶内,且保存温度为-15-25℃。
9.根据权利要求2所述的大果木姜子油的入血成分分布测定方法,其特征在于,步骤S6中GC-MS SIM法的色谱条件为不分流进样。
10.根据权利要求2所述的大果木姜子油的入血成分分布测定方法,其特征在于,步骤S6中GC-MS SIM法中质谱条件的检测电压为0.25-0.3KV。
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