CN115684371A - 一种酸枣仁水提物中皂苷的快速液质联用定量方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供的一种酸枣仁水提物中皂苷的快速液质联用定量方法，主要包括以下步骤：(1)酸枣仁水提物及皂苷含量测定供试品溶液的制备；(2)三重四极杆液质联用仪检测分析：以BEH C18色谱柱为固定相，使用乙腈和0.1％甲酸‑水梯度洗脱，定量样品中的酸枣仁皂苷A、B的含量；本发明方法的检出限为0.007μg/L，定量限为0.02μg/L，两种化合物在2μg/L～2mg/L范围内具有良好的线性，加标回收率在90.0％～95.0％之间，相对标准偏差均小于3.0％，且方法具有良好的准确性和重复性,分析时间短，样品前处理步骤少,满足对酸枣仁水提物中皂苷类成分定量的快速检测需要。

Description

一种酸枣仁水提物中皂苷的快速液质联用定量方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，特别涉及一种酸枣仁水提物中皂苷的快速液质联用定量方法。

背景技术

酸枣仁为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa(Bunge)Hu exH.F.Chou的干燥成熟种子，具有养心补肝，宁心安神等功效，是我国最著名的安神类中药材之一，也是***颁布的第一批药食同源中药材，被广泛应用于“枣仁安神颗粒”、“百乐眠胶囊”和“太太静心口服液”等中成药或保健品。

酸枣仁的主要活性成分为以斯皮诺素为代表的黄酮类和以酸枣仁皂苷A和B为代表的皂苷类等，具有镇静催眠、神经元保护等作用，可抗焦虑、抗抑郁、改善记忆和治疗老年痴呆等。随着现代社会工作节奏的加快，生活压力的增加，患有睡眠障碍问题的人群越来越多，酸枣仁水提物作为一种有效的助眠原料也正被日益广泛地应用到各类助眠产品的开发中，获得了极大的关注。然而，当前市场上酸枣仁提取物缺少统一标准，市场产品良莠不齐，存在理枣仁掺假、辅料稀释增重或采用醇提等不合规生产工艺提高成分含量等系列问题，导致企业在应用酸枣仁提取物开发功能性食品时，难以评估供应商原料的真假优劣，面临较大的质量风险。为此，亟需建立一种准确、全面的分析方法对酸枣仁提取物进行质量评价。

目前，针对酸枣仁提取物含量测定的文献报道较少，且多针对醇提物中酸枣仁皂苷A和B的测定，或者是采用树脂富集后进行总皂苷测定。2020版《中国药典》对酸枣仁皂苷A的含量测定使用了蒸发光散射检测器(ELSD)检测，但由于酸枣仁皂苷本身含量较低(饮片要求含量不低于0.03％)，水提过程中皂苷转移率低，且在生产过程中往往添加辅料辅助干燥或进行稀释，针对药材或醇提工艺开发的HPLC-ELSD含量测定方法灵敏度不足以适用于提取物的检测。为此，亟需建立一种灵敏度高，快速的酸枣仁水提物中皂苷A、B含量测定方法，为酸枣仁提取物的内控质量标准建设提供更多依据。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明主要针对酸枣仁水提物中皂苷成分含量低的问题，采用超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱(UPLC-QqQ-MS/MS)法实现酸枣仁皂苷A、B的快速准确含量测定，为酸枣仁提取物的内控质量标准建设提供更多依据。

本发明提供的一种酸枣仁水提物中皂苷的快速液质联用定量方法主要包括以下步骤：

步骤S1，酸枣仁水提物及皂苷含量测定供试品溶液的制备：

称取酸枣仁饮片至圆底烧瓶，加水浸泡30min，进行提取、滤过，滤液转移至容量瓶中，冷却至室温后定容、摇匀得到酸枣仁水提液，再进行浓缩、冷冻干燥，得到自制酸枣仁水提物粉末；

精确称量酸枣仁水提物冻干粉末，加入浓度为0-100％乙腈和/或醇溶剂进行提取，冷却至室温后，过0.22μm有机滤膜，用浓度0-100％乙腈定容，即为酸枣仁皂苷供试品溶液；

步骤S2，三重四极杆液质联用仪检测分析；该步骤中：

色谱条件：色谱柱为采用1.7μm BEH C18填料装填的50mm×2.1mm超高效液相色谱柱，流动相为乙腈(A)-0.1％甲酸/水(B)，流动相流速为0.3mL/min，柱温20-50℃，进样量0.1-10μL；梯度见表1；

质谱条件：ESI离子源；正离子模式；碰撞气，氩气；雾化气，氮气；加热气，氮气；毛细管电压3.00kV；源温度120-550℃，多反应监测模式(MRM)模式监测；

通过总离子流图和相应的质谱图结果确定酸枣仁皂苷A、B的母离子和子离子，并根据响应情况优化碰撞能和锥孔电压。

进一步的，S1中所述的提取方法为加热回流或超声提取，所用酸枣仁水提物冻干粉末与乙腈或醇溶剂的溶剂比为5-30倍量，提取温度为90℃-120℃，提取次数为1-3次，每次提取时间10-120分钟。

进一步的，S1中所述浓度为0-100％乙腈和/或醇溶剂，其中醇溶剂为甲醇、乙醇、正丁醇中的一种。

进一步的，处理样品时，每批实验***一个空白样，用乙腈代替样品，进行与样品完全相同的处理步骤，并进行上机测定，确保实验过程环境中无待测组分的干扰；

本发明的有益效果在于：建立了UPLC-QqQ-MS/MS法来测定酸枣仁水提物中皂苷A、B含量，分析时间短、样品前处理步骤少、准确度及灵敏度高，满足对酸枣仁水提物中皂苷类成分定量的快速检测需要，方法具有良好的准确性和重复性。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的1000ppb混合对照品中酸枣仁皂苷A、B的总离子流图；

图2为本发明实施例1提供的1000ppb混合对照品中酸枣仁皂苷A的定量离子对提取离子流图，酸枣仁皂苷A，离子对：1207.64＞455.41；

图3为本发明实施例1提供的1000ppb混合对照品中酸枣仁皂苷B的定量离子对提取离子流图，酸枣仁皂苷B，离子对：1045.58＞455.41；

图4为本发明实施例1提供的酸枣仁水提物样品1中酸枣仁皂苷A的定量离子对提取离子流图，酸枣仁皂苷A，离子对：1207.64＞455.41；

图5为本发明实施例1提供的酸枣仁水提物样品1中酸枣仁皂苷B的定量离子对提取离子流图，酸枣仁皂苷B，离子对：1045.58＞455.41。

具体实施方式

下面结合实例对本发明做进一步阐述，但仅限于说明本发明，而不是对本发明的任何限制。

实施例

本实施例是对酸枣仁水提物样品中酸枣仁皂苷A、B的快速液质联用定量，其具体步骤如下：

1.酸枣仁水提物及皂苷含量测定供试品溶液的制备：

称取40g酸枣仁饮片至圆底烧瓶，加水400mL，浸泡30min，回流提取1h，滤过，滤液转移至1000mL容量瓶中，滤渣加400mL水二次回流提取1h，滤过，滤液转移至先前容量瓶中，冷却至室温后定容，摇匀，取500mL酸枣仁水提液，浓缩至100mL，冷冻干燥，得到自制酸枣仁水提物。

取酸枣仁提取物，精密称取约0.1g，置100mL容量瓶，加50％乙腈约50mL，振荡，超声20min使全部溶解或溶散，冷却至室温后过0.22μm滤膜，用50％乙腈定容即得；平行制备两份。

2.三重四极杆液质联用仪检测分析；仪器具体条件如下：

色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITYUPLC BEH C18(50×2.1mm,1.7μm)；仪器型号：Waters I-Class/Xevo TQ-S三重四极杆液质联用仪；流动相：乙腈(A)-0.1％甲酸/水(B)；流速：0.3mL/min；柱温：30℃；进样量：2μL；梯度见表1；

表1流动相洗脱梯度表

时间/min	A％	B％
			0.0	19.0	81.0
2.0	23.0	77.0
			4.0	95.0	5.0

质谱条件：离子源：ESI离子源；正离子模式；碰撞气，氩气；雾化气，氮气；加热气，氮气；毛细管电压3.00kV；源温度150℃，MRM模式监测。通过总离子流图和相应的质谱图结果确定酸枣仁皂苷A、B的母离子和子离子，并根据响应情况优化碰撞能(CE)和锥孔电压(CV)。化合物分析离子及碰撞能见表2；

表2化合物保留时间、检测离子及碰撞能(*定量离子对)

3.酸枣仁皂苷A对照品、酸枣仁皂苷B对照品的制备与标准曲线的绘制：

精密称定酸枣仁皂苷A对照品、酸枣仁皂苷B对照品各10mg，分别置10mL容量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别作为酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B对照品储备液。精密量取酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B对照品储备液稀释，配制浓度为5、10、50、100、500、1000、2000μg/L的混合目标物标准曲线。线性方程及相关系数见表3；1000μg/L的混合对照品总离子流图见图1；1000μg/L的混合对照品提取离子流图见图2、图3，从图1、图2、图3的横坐标可见，该测定时间短，在4min以内。

表3酸枣仁皂苷A、B标准曲线线性方程及相关系数

化合物	线性方程	相关系数R<sup>2</sup>	线性范围(μg/L)
				酸枣仁皂苷A	Y＝167.702X+88.2103	0.9995	4.61～1845.00
酸枣仁皂苷B	Y＝316.106X+272.036	0.9992	4.48～1791.09

4.酸枣仁水提物的测定：采用上述方法分析，以外标法计算可得到化合物浓度及含量，数据精密度及重复性均较好，平行样RAD均小于2.0％，10批酸枣仁水提物样品含量计算数据见表4、表5；酸枣仁水提物样品分析提取离子流图见图4、图5；本发明方法操作过程简单，且具有较高的数据准确度，能够对酸枣仁水提物中的皂苷类成分进行快速准确的定量。

表4 10批酸枣仁水提物样品酸枣仁皂苷A的含量计算表

表5 10批酸枣仁水提物样品酸枣仁皂苷B的含量计算表

5.酸枣仁皂苷A、B的快速液质联用定量方法学验证；

1)2种化合物的方法检出限、方法定量限、线性及范围：

根据步骤3中方法配制对照品混标进样分析，2种化合物的方法检出限、方法定量限见表6，线性及范围见表3；

表6 2种化合物的方法检出限、方法定量限

化合物	方法检出限(μg/L)	方法定量限(μg/L)
			酸枣仁皂苷A	0.007	0.02
酸枣仁皂苷B	0.007	0.02

2)稳定性

取酸枣仁水提物样品1，按照步骤1中样品处理方法制备，在制备后的0,6,12,18,24h分别按照步骤2中液质条件进行测定，记录酸枣仁皂苷A和B峰面积，计算酸枣仁皂苷A和B峰面积RSD分别为1.23％和1.89％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。酸枣仁水提物1供试品的24h稳定性验证见表7。

表7酸枣仁水提物样品1供试品的24h稳定性验证

3)重复性

取酸枣仁水提物样品1平行6份，按照步骤1中样品处理方法制备，按照步骤2中液质条件进行测定，记录酸枣仁皂苷A和B的峰面积，计算6份平行样中酸枣仁皂苷A和B含量RSD分别为2.35％和1.88％，表明本方法重复性较好。酸枣仁水提物样品1供试品的重复性验证见表8。

表8酸枣仁水提物样品1供试品的重复性验证

4)加样回收率

取酸枣仁水提物样品1平行6份，每份0.05g，精密称定，置100mL容量瓶中，加入酸枣仁皂苷A 0.04mg，酸枣仁皂苷B 0.02mg，加50％乙腈约50mL，振荡，超声20min，冷却至室温后用50％乙腈定容，过0.22μm滤膜，即得。按照步骤2中液质条件进行测定，结果显示，酸枣仁皂苷A和B的回收率分别为94.14％和91.41％，RSD分别为1.50％和0.45％；表明本方法具有良好的准确性。酸枣仁水提物样品1供试品的加样回收率验证见表9、表10。

表9酸枣仁水提物样品1供试品酸枣仁皂苷A的加样回收率验证

表10酸枣仁水提物样品1供试品酸枣仁皂苷B的加样回收率验证

方法空白：处理样品时，每批实验***一个空白样，用50％乙腈代替样品，进行与样品完全相同的处理步骤，并进行上机测定，确保实验过程环境中无待测组分的干扰；

结论：

1.本发明方法的检出限为0.007μg/L，定量限为0.02μg/L，两种化合物在2μg/L～2mg/L范围内具有良好的线性，可见有良好的灵敏性；加标回收率在90.0％～95.0％之间，相对标准偏差均小于3.0％，可见方法具有良好的准确性和重复性；

2.本发明所建立的方法操作简单，测定时间较短，如图1、图2、图3所示均在4min内可以完成成分含量的测定分析；

3.本发明所建立的方法稳定性好。

以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims (3)

1.一种酸枣仁水提物中皂苷的快速液质联用定量方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤S1，酸枣仁水提物及皂苷含量测定供试品溶液的制备：

称取酸枣仁饮片至圆底烧瓶，加水浸泡30min，进行提取、滤过，滤液转移至容量瓶中，冷却至室温后定容、摇匀得到酸枣仁水提液，再进行浓缩、冷冻干燥，得到自制酸枣仁水提物粉末；

精确称量酸枣仁水提物冻干粉末，加入浓度为0-100%乙腈和/或醇溶剂进行提取，冷却至室温后，过0.22μm有机滤膜，用浓度0-100%乙腈定容，即为酸枣仁皂苷供试品溶液；

步骤S2，三重四极杆液质联用仪检测分析；该步骤中：

色谱条件：色谱柱为采用1.7μm BEH C18填料装填的50mm×2.1mm超高效液相色谱柱，流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸/水（B），流动相流速为0.3mL/min，柱温20-50℃，进样量0.1-10μL；梯度洗脱：0-2min，19%-23%A；2-4min，23%-95%A；质谱条件：ESI 离子源；正离子模式；碰撞气，氩气；雾化气，氮气；加热气，氮气；毛细管电压3.00 kV；源温度120-550°C，多反应监测模式(MRM)模式监测；通过总离子流图和相应的质谱图结果确定酸枣仁皂苷A、B的母离子和子离子，并根据响应情况优化碰撞能和锥孔电压。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，S1中所述的提取方法为加热回流或超声提取，所用酸枣仁水提物冻干粉末与乙腈或醇溶剂的溶剂比为5-30倍量，提取温度为90℃-120℃，提取次数为1-3次，每次提取时间10-120分钟。

3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，S1中所述浓度为0-100%乙腈和/或醇溶剂，其中醇溶剂为甲醇、乙醇、正丁醇中的一种。

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