CN109234354A - 一种高产PUFAs微藻的筛选及胁迫培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明申请属于藻类培养技术领域，具体公开了一种高产PUFAs微藻的筛选及胁迫培养方法，具体包括以下步骤,(1)藻种分离；(2)初筛：(3)对备选藻株进行油脂提取及脂肪酸组分分析，以油脂含量和PUFAs在总脂肪酸中的百分含量为标准，筛选出富含PUFAs的藻株；(4)选取氮、磷、铁三个营养因子对富含PUFAs的藻株进行胁迫培养，测定藻细胞生长环境极其营养成分的改变，对微藻脂肪酸组分进行分析；通过油脂分离，分别测定不同脂类脂肪酸组分的变化，对藻株在营养胁迫条件下油脂代谢的改变进行分析。本方法能够筛选出具有高PUFAs产率的微藻，并且通过对微藻生长进行胁迫，使微藻细胞为抵御胁迫而启动自身防卫***，从而产生更高的PUFAs积累。

Description

一种高产PUFAs微藻的筛选及胁迫培养方法
技术领域
本发明属于藻类培养技术领域，具体公开了一种高产PUFAs微藻的筛选及胁迫培养方法。
背景技术
脂肪酸是长的脂肪族碳氢链，不同种类的脂肪酸在长度、饱和度以及结构等方面都有所差异。相比饱和脂肪酸与单不饱和脂肪酸，含有两个及两个以上不饱和键的多不饱和脂肪酸(PUFAs)对机体有更为重要的生理作用。
PUFAs主要分为ω-3系列脂肪酸和ω-6系列脂肪酸，其中，距离氢氧链羧基最远端的双键在倒数第3，4个碳原子之间的为ω-3系列脂肪酸，距离氢氧链羧基最远端的双键在倒数第6，7个碳原子之间的为ω-6系列脂肪酸。
微藻是PUFAs的优质来源，富含人体所需的多种必需氨基酸。事实上，人们早已开始利用微藻中丰富的PUFAs，例如水产养殖中，通过人工添加微藻来提高鱼类、贝类和软体动物中的PUFAs(尤其是ω-3系列PUFAs的含量)。尽管目前已有微藻PUFAs商业化的产品，但是目前只有少数几种藻被用于生产，而且只有少数企业具备成功生产经验以及关键技术。微藻生物质积累量较低、藻种PUFAs产率低以及加工技术不成熟是目前需要突破的关键问题。
目前真正实现大规模商业化培养的微藻只有少数几种，主要为螺旋藻、小球藻、杜氏盐藻、念珠藻和束丝藻，严格的安全性评估限制了微藻生物多样性的优势。另外，在当前微藻培养技术条件下，一些有价值的藻种还难以实现高产量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够产生更高的PUFAs积累高产PUFAs微藻的筛选及胁迫培养方法。
为了达到上述目的，本发明的基础方案为：
一种高产PUFAs微藻的筛选及胁迫培养方法，具体包括以下步骤,
(1)藻种分离：采集土样和水样，分别用BG-11培养基和f/2培养基进行藻种分离；
(2)初筛：尼罗红染色法对分离的藻株进行初筛，筛选出油脂相对含量高的藻株；
(3)对备选藻株进行油脂提取及脂肪酸组分分析，以油脂含量和PUFAs在总脂肪酸中的百分含量为标准，筛选出富含PUFAs的藻株；
(4)选取氮、磷、铁三个营养因子对富含PUFAs的藻株进行胁迫培养，测定藻细胞生长环境极其营养成分的改变，对微藻脂肪酸组分进行分析；通过油脂分离，分别测定不同脂类脂肪酸组分的变化，对藻株在营养胁迫条件下油脂代谢的改变进行分析。
本基础方案的工作原理和有益效果在于：
BG-11培养基广泛适用于淡水微藻的培养，f/2培养基广泛适用于海洋藻类的培养；尼罗红染色是一种应用广泛的亲脂性的恶嗪类荧光染色剂，它能与细胞内多种组分结合；本方法能够筛选出具有高PUFAs产率的微藻，并且通过对微藻生长过程进行胁迫，使微藻细胞为抵御胁迫而启动自身防卫***，从而使微藻细胞整个代谢网络重编程，产生更高的PUFAs积累。
进一步，采集的土样和水样需要进行除杂处理，土样需去除肉眼可见的石子和植物根茎叶，水样需经250目筛绢过滤，去除大型浮游生物以及悬浮颗粒，能够保证实验结果的准确性。
进一步，所述油脂提取方法为：称取藻粉于离心管中，在氯仿、甲醇和水体系中进行藻细胞破碎与涡旋振荡，使体系分为两层，离心后收集下层氧仿相。在上层体系中加入1ml氯仿，重复旋涡振荡和离心操作，将提取液合并，氮气吹干，剩余在离心管中的组分即为油脂。能够较为简单快速的将藻粉内的油脂提取出来。
进一步，采用分段培养的方法进行胁迫培养，O-7天为正常生长阶段，7-14天为胁迫培养阶段，采用本方法胁迫后的微藻，PUFAs的含量提高效果较佳。
进一步，脂肪酸组分测定包括对总脂、中性脂、糖脂、磷脂进行测定，能够较为全面的对各种脂肪酸组分进行测定，保证了数据结果的准确性。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
实施例
一种高产PUFAs微藻的筛选及胁迫培养方法，具体包括以下步骤，
(1)采集土样2g，水样5ml(采集的土样和水样需要进行除杂处理，土样需去除肉眼可见的石子和植物根茎叶，水样需经250目筛绢过滤，去除大型浮游生物以及悬浮颗粒)。
每种样品分别用BG-11和f/2培养基两种培养基进行培养，培养基添加量为20ml，接种于50ml锥形瓶中，置于光照培养性中培养，培养条件为28℃，光照周期24:0，光强2000-3000lux，每天摇动锥形瓶两次，每个两天对样品培养液进行镜检观察。
取1ml培养液，先用500目筛绢过滤，之后取一滴澄清培养液于载玻片上，盖上盖玻片，置于物镜下观察藻细胞的种类和数量，直到视野中藻细胞数量较多时，富集结束，样品培养液开始进行微藻的分离和筛选。
(2)初筛：尼罗红染色法对分离的藻株进行快速初筛，筛选出油脂相对含量高的藻株。具体方法如下:①从固体平板上挑选单藻接种于BG-11培养基中培养一周左右后，时藻液OD680处于0.1-0.4之间；②向透明96孔板中加200ul藻液，放入荧光酶标仪中检测OD680；③向黑色不透明96孔板中加入198ul藻液，使用多功能酶标仪进行荧光测定，激发波长488nm，发射波长590nm，测得荧光值。④在③中的96孔板中加入2ul的0.1mg·ml-1尼罗红染液，混匀，于37℃混匀，于37℃摇床中避光温育10min,转速为120rmp。之后于多功能酶标仪中再次进行测定，得到荧光值。尼罗红染料用丙酮溶解，分装在1.5ml离心管中，于20℃中保存；⑤根据测定结果最终选出相对油脂含量最高的10株藻进行第二次筛选。⑥备选藻株扩大培养：对尼罗红染色法筛选出的10株藻进行1L体系的扩大培养，对数期接种，接种比例为1:50，培养温度为28℃，光照强度为2000-3000lux，光暗周期24:0，通入2％C02的无菌空气，培养7天后，通过离心收集藻细胞，-80℃预冻后，在冷冻干燥机中处理48h，制成干藻粉。
油脂提取主要操作如下:称取0.59藻粉于50mL离心管中，加入9ml氯仿/甲醇/水体系(V氯仿：V甲醇：V水＝1:2:0.8)，利用超声细胞破碎仪进行藻细胞破碎，之后在体系中加入5ml氯仿和5ml水，使体系中V氯仿：V甲醇：V水＝1:1:0.9，涡旋振荡1min，此时可观察到体系明显分为两层。于离心机中离心并收集下层氧仿相。在上层体系中加入1ml氯仿，重复旋涡振荡和离心操作，将提取液合并，氮气吹干，剩余在离心管中的组分即为油脂。
(3)脂肪酸组分测定①脂肪酸甲酯化：采用三氟化硼法对脂肪酸进行甲酯化处理。②气质联用(GC-MS)检测脂肪酸组分。
(4)选取氮、磷、铁三个营养因子对藻株进行胁迫培养，通过油脂分离，分别测定不同脂类脂肪酸组分的变化，对藻株在营养胁迫条件下油脂代谢的改变进行分析。
本次实验采用分段培养的方法进行胁迫培养。O-7天为正常生长阶段，使用标准f/2培养基对藻株进行培养，以扩大藻细胞密度。培养体系为IL，光照强度2000-3000lux，温度28℃，通入2％CO2的无菌空气，每组设置三组平行。7-14天为胁迫培养阶段，根据选择的营养胁迫因子的不同改变培养基成分。本专利选取N、P和Fe作为营养胁迫因子，具体方案如表1。
表1
胁迫培养期间采用细胞计数法对藻株S7-M11的以下生长情况进行测定。
①叶绿素荧光参数Fv/Fm的测定,叶绿素荧光参数时反映藻细胞生理状态的常用特征值，本次实验使用光合生物反应器FMT150进行该指标的测定。其内置的叶绿索荧光仪能够进行微澡叶绿索荧光的检侧。具体操作如下:每次测定前摇匀藻液，无菌条件下取样20ml将藻液进行暗适应15min。之后将藻液转移入生物反应器的培养池中，使藻液没过内部叶绿素荧光仪的出光孔，将遮光板放好。之后通过仪器操作可直接读出Fv/Fm的值。
②总糖含量测定—苯酚硫酸法采用传统的糖含量测定方法对微藻的糖含量进行检测，方法如下：称取20mg干藻粉于50mL离心管中，加入20ml水，超声5分钟(输出功率30％，工作1s，间歇3s)，使藻粉均匀分散在水中，将体系稀释四倍。取2mL稀释后体系加入到10ml比色管中，加入6％苯酚溶液1.0ml及浓硫酸5.0mL,摇匀冷却，恒温30℃水浴30min,测定49Onm吸光度，以2.0水按同样显色操作为空白。
③总蛋白含量测定，具体实验步骤如下，首先称取20mg藻粉于50ml离心；管中加入10ml0.5mol/L的NaOH溶液中，在80℃水浴中提取10min，搅拌。迅速冷却到室温，离心5000rpm，5min，将上清转移到25ml容量瓶中。重复一次提取。收集上清，定容。然后采用BCA试剂盒进行蛋白质浓度的测定。具体操作如下使用时将solutionA摇晃混匀，根据需要测定的样品数量，按50体积solutionA加1体积solutionB(50:1)配制一定量的BCA工作液，混合均匀。所配制得到的BCA工作液在室温下可保存24h,完全溶解蛋白标准品(5mg/ml，BSA)，取10ul用0.5mol/L的Na0H溶液稀释至100ul，浓度为0.5mol/L。将稀释后标准品0.5mg/ml按0，1，2，4，8，12,16,20ul分别依次加到96孔板中，并用标准品稀释液补充至20ul，同时再分别加入20ul的待测样品到对应的样品孔中。各孔加入200ulBCA工作液，用加样枪轻轻吹打混匀，60℃放置30min冷却到室温后，用酶标仪测定562nm下的吸光度。用读取到的标准品浓度值绘制标准曲线，并用吸光值通过标准曲线获得待测样品的蛋白浓度。
④油脂含量测定,具体方法如上所用油脂含量测定方法。
⑤油脂分离方法，提取出的藻油中加入3ml氯仿，吸取2ml进行油脂分离，使用固相萃取小柱对油脂进行分离，将样品加入固相萃取小柱中，先用1ml氯仿洗脱出中性脂,再用10ml丙酮洗脱出糖脂,最后用10ml甲醇洗脱出磷脂，氮气吹后，通过称重测定三种脂类的含量。
⑥脂肪酸组分测定，通过如上的试验方法对总脂，中性脂，糖脂，磷脂进行脂肪酸组分测定。
结论
(1)氮胁迫对藻株S7-M11脂代谢的影响
O-7天正常培养下，藻细胞密度达到了2.62×106个mL-1。第7天开始胁迫，胁迫处理前后均对细胞密度进行测定，三组均显示胁迫处理后藻细胞密度有了一定程度的下降，这是由于离心藻液，清洗藻泥的过程导致了少量藻细胞的损失。胁迫培养期间，与对照组相比，N+组生长更为旺盛，其最终细胞密度提高了7.21％，N+组Fv/Fm稳定保持在0.6-0.7之间，稍高于对照组，这说明藻细胞生理状态保持良好。N-组细胞密度在短暂升高之后呈现持续下降的趋势，相比对照组最终降低了69.33％，其Fv/Fm值相比对照组出现了明显的下降趋势，这表明藻细胞光合效率持续降低，其生长受到了外界胁迫，难以维持正常的生理状态。
氮胁迫对藻株S7-M11胞内生化组分的影响，胁迫培养下，藻株三大能量代谢物含量发生了明显变化，与对照组相比，N-组碳水化合物含量与总脂含量分别提高到10.34％和31.62％，总蛋白含量下降到18.00％；相反，N+组碳水化合物与总脂含量均下降，而总蛋白含量上升到34.37％。三大能量物质的变化趋势与细胞生理状态相符。微藻在应对缺氮胁迫时，有些倾向于积累碳水化合物，而有些能够更多积累，.而对于藻株S7-M11，缺氮条件下，碳水化合物含量与油脂含量分别提高了17.22％和21.03％，这说明S7-M11自身代谢在响应无氮胁迫时，碳代谢流会更多的流向油脂积累。
氮胁迫对藻株S7-M11总脂脂肪酸组成的影响，氮胁迫培养条件下，S7-M11的总脂脂肪酸组分发生了明显改变。N+组中，以C14:0和C16:0，C18:0为主的SFA占总脂肪酸的40.13％与对照组相比降低6.80％，其中C16:O降低25.82％一组中SFA的含量则明显升高至61.11％(对照组42.8％)，上升了42.83％，且C14:0，C16:0和C18:0含量均显著升高。N+组以C16:1和C18:1为主的单不饱和脂肪酸总量变化不大，而N-组呈现明显的降低。PUFAs和C18:2和C18:3等短链PUFAs以及C20:3、C20:4、C20:5和C20:6等长链PUFAs为主。N+组PUFAs总百分比含量升高12.17％，主要表现为C18:2、C20:4等W-3系列PUFAs的升高，以及C18:3、C20:3、C20:5以及C22:6等W-3系列PUFAs的升高。N-组PUFAs百分比组成下降27.88％，其中C18:3、C20:3以及C20:4均由明显降低。
此次测定中C18:3为价亚麻酸，C20:4为花生四烯酸，C20:5为EPA，C22:6为DHA，这些PUFAS均在生物体重发挥着重要的功能，属于具有高附加值的营养物质。根据以上数据分析可知，氮充足条件下有利用S7-M11合成这些功能性PUFAs百分比含量略有降低，使其应用价值倾向于营养物质的开发利用。而缺氮处理能促进S7-M11合成短链的饱和脂肪酸，这些脂肪酸由于其饱和度高，性质稳定，易被用来生产生物柴油，因此，缺氮条件有利于藻株生物能源领域的开发利用。
(4)藻株S7-M11各类脂质脂肪酸组成的变化：本次实验通过油脂分离研究了油脂成分在胁迫过程中的变化。实验结果表明，N+组磷脂含量升高了36.10％，这表明氮充足时，细胞生长***旺盛，需要合成更多磷脂用于生命活动。N-组中性脂有明显的增加，相比对照组中性脂含量的21.13％，N-组中性脂含量高达31.45％提高了48.82％，中性脂SFA含量较多，此结果也可以解释实验结果中N-组SFA显著增多的现象。同时，N-组糖脂含量也有明显增加，推测这一现象出现的原因可能是细胞在无氮压下启动防御机制，此过程需要更多糖脂发挥作用。
脂分离后，分别对NL、GL和PL的脂肪酸组分进行测定，进一步探讨胁迫条件下不同脂质脂肪酸组成的变化特点。从总脂脂肪酸组分分析中得知，N+条件能够促进藻细胞积累PUFAs，尤其C18:3、C20:4、C22:6三种重要的PUFAs均有显著提高，从各类脂质脂肪酸组成来看C18:3百分含量的升高主要体现在GL中的C18:3增多，C20:4在三种脂质中百分含量均有增加，C22:6主要体现在PL中百分含量明显增多。尽管N+条件下总脂中C20:5的组成比例略低于对照组，但是在GL中出现明显提高。另外，对于某种脂肪酸组分在三类脂质中的分布进行分析，可以得出，C16:O、C16:O等藻细胞中含量丰富的SFA和MUFA主要存在于NL中，而C18:3、C20:4、C22:5为代表的PUFAs多存在于GL和PL等极性脂中。这一结果进一步印证了NL、GL、PL和在生物体内各自的生理功能一NL以能量储存为主，GL和PL则属于功能性脂类，参与多种生命活动。
(2)磷胁迫对藻株S7-M11脂代谢的影响
①磷胁迫对藻株S7-M11生长的影响，实验结果显示。P+条件下细胞密度始终高于对照组，并在胁迫末期与对照组趋同，这一结果与N+组相比，说明P+条件对细胞促生长的作用弱于N+条件。而P-组细胞密度虽然一直低于对照组，但是其下降程度(17.42％)与N-组(69.31％)相比，也说明氮缺乏比磷缺乏对藻细胞的生长影响更为严重，结果也同时印证了，Fv/Fm的变化P-组细胞明显因营养缺乏其生理状况发生改变，其值降低到0.49，高于N-组(0.37)。P+组Fv/Fm参数保持稳定，说明藻细胞生理状态良好。
②磷胁迫对藻株S7-M11胞内生化组分的影响
P+条件下，油脂含量下降了20.82％,碳水化合物含量基本保持不变，总蛋白含量升高14.7％结合生长曲线分析，表明充足的磷一定程度上促进了细胞的生长***。P-条件下，总蛋白含量下降50.01％，总脂含量升高9.44％。与氮胁迫类似，磷缺乏同样促进了藻细胞积累油脂，营养元素的缺少导致细胞生长受到抑制，蛋白质合成减少。
③磷胁迫对藻株S7-M11总脂脂肪酸组成的影响
磷胁迫培养条件下，S7-M11的总脂脂肪酸组分发生了明显改变，磷充足条件主要促进了MUFA的积累，MUFA总百分比提高了16.34％。具体表现为C16:1百分比提高5.61％，C18:1百分比提高54.90％，短链PUFAs也有一定程度增加，C18:2百分比提高24.53％,C18:3百分比提高8.55％。P-条件下，SFA百分含量升高25.51％，C14:0，C16:0，C18:0的百分含量分别提升60.27％。16.22％，118.07％，总体来说，P-条件有效的促进S7-Mll藻细胞饱和脂肪酸的积累，同时提高了C20:5和C22:5的百分含量，而P+条件主要是促进了MUFA的积累。
④藻株S7-M11各类脂质脂肪酸组成的变化
结果表明，P+条件下，藻细胞GL含量增加了12.90％，而PL含量相比对照组降低了112.47％。NL含量降低2.42％。P-条件下，NL相比对照组升高了17.74％，下降了38，91％.PL升高了27.35％。
脂分离后，分别对NL、GL和PL的脂肪酸组分进行测定，进一步探讨磷胁迫条件下不同脂质脂肪酸组成的变化特点。具体表现在三种脂质中，C16:0与C18:0均有不同程度的升高。不论在P+还是P-条件下，GL中PUFAs均未表现出优势，而C22：5与C22：6的含量均有从GL到PL转移的现象。
(3)铁胁迫对藻株S7-M11脂代谢的影响
①铁胁迫对藻株S7-M11生长的影响实验结果显示Fe+组细胞密度高于对照组。而Fe-组细胞密度低于对照组，铁元素的缺乏对细胞生长造成了抑制。铁元素在藻细胞中参与光***I和光***II的形成，在光合作用、呼吸作用以及DNA合成过程中均起到重要作用，缺铁条件下，藻细胞难以维持正常的生理活动。Fe-组值Fv/Fm值从开始胁迫时的0.61持续降低到0.47，也说明缺铁使藻细胞生理状态持续恶化。对于Fe+组，Fv/Fm值在0.6-0.7之间波动，与对照组保持一致，说明该组藻细胞生理状态保持良好。
②铁胁迫对藻株S7-M11胞内生化组分的影响：与对照组相比，铁充足条件下，藻细胞的总蛋白含量和总脂含量均有提高，分别提高了22.13％和10.05％，碳水化合物占干重百分比降低了31.72％，缺氮条件下，藻细胞中碳水化合物的含量有了显著增加，其占干重百分比是对照组的2.15倍，蛋白和总脂占干重的百分比分别降低了26.73％和8.28％。这一结果表明，高铁胁迫能够促进藻株S7-M11积累油脂，而在缺铁胁迫条件下，藻细胞的防御机制优先选择合成碳水化合物为能量储备，碳代谢流更多流向碳水化合物的积累。
③铁胁迫对藻株S7-M11总脂脂肪酸组成的影响：氮胁迫条件下藻株S7-M11总脂脂肪酸组分的变化如下，与对照组相比，Fe+组SFA百分含量升高了12.43％，具体体现在C16:0和C18:0两种SFA百分含量的上升。Fe-其SFA百分含量降低23.36％,MUFA基本不变。Fe-组SFA百分含量降低17.75％,MUFA百分含量降低5.91％，PUFA百分含量升高26.84％，主要体现在C18:3、C20:4和C20:5三种脂肪酸百分含量的升高，分别为对照组的1.99倍，1.11倍和1.37倍。从C22:6及其前体物质C22:5的百分含量变化来看，高铁和无铁两种条件均不适合促进藻细胞积累DHA高铁条件能够促进藻细胞生长及其油脂的积累，从脂肪酸组分变化来看，高铁条件适合促进饱和脂肪酸的合成，因此对于藻株S7-M11，高铁胁迫条件更加有利于开发其在生物能源领域的应用。缺铁条件能促进藻株S7-M11中亚麻酸、花生四烯酸和EPA的合成，有利于开发其营养价值，但是缺铁条件会导致细胞生长受到抑制，降低生物质产量。
④藻株57-各类脂质脂肪酸组成的变化：铁胁迫培养方式下，对照组、高铁组、缺铁组脂分离结果如下，NL、GL和PL随培养条件的不同呈现出较为规律的含量变化。与对照组相比较，Fe+组NL显著增加30.34％，而GL和PL等极性脂均降低(分别降低了41.92％和47.66％)。这表明高铁胁迫能够有利于S7-M11促进合成中性脂，中性脂中SFA与MUFA含量丰富。Fe-组三种脂质的含量变化与Fe-组相反，其NL含量降低9.31％，GL含量升高21.36％，PL含量基本保持不变。缺铁处理使藻株S7-M11细胞中以GL为主的极性脂含量升高。
结合NL、GL和PL脂肪酸组分的变化进一步研究铁胁迫条件下藻株S7-M11脂代谢的变化。从以上分析得知，Fe+条件能够促进S7-M11藻细胞积累SFA，其中C16:0与C18:O均有显著提高。同时，在Fe+条件下，C18:3与C20:5均呈现出从NL、PL向GL集中的趋势。Fe-条件下，C18:3在中性脂中百分组成基本保持不变，但在GL和PL中所占比例均有明显增加。C20:5的变化与Fe+条件下类似，同样是在GL中的含量明显提高。而对于Fe+和Fe-条件，C22:5与C22:6的均呈现从GL向PL中转移的现象。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

Claims (5)

1.一种高产PUFAs微藻的筛选及胁迫培养方法，其特征在于，具体包括以下步骤,
(1)藻种分离：采集土样和水样，分别用BG-11培养基和f/2培养基进行藻种分离；
(2)初筛：尼罗红染色法对分离的藻株进行初筛，筛选出油脂相对含量高的藻株；
(3)对备选藻株进行油脂提取及脂肪酸组分分析，以油脂含量和PUFAs在总脂肪酸中的百分含量为标准，筛选出富含PUFAs的藻株；
(4)选取氮、磷、铁三个营养因子对富含PUFAs的藻株进行胁迫培养，测定藻细胞生长环境极其营养成分的改变，对微藻脂肪酸组分进行分析；通过油脂分离，分别测定不同脂类脂肪酸组分的变化，对藻株在营养胁迫条件下油脂代谢的改变进行分析。
2.如权利要求1所述的一种高产PUFAs微藻的筛选及胁迫培养方法，其特征在于，采集的土样和水样需要进行除杂处理，土样需去除肉眼可见的石子和植物根茎叶，水样需经250目筛绢过滤，去除大型浮游生物以及悬浮颗粒。
3.如权利要求1所述的一种高产PUFAs微藻的筛选及胁迫培养方法，其特征在于，所述油脂提取方法为：称取藻粉于离心管中，在氯仿、甲醇和水体系中进行藻细胞破碎与涡旋振荡，使体系分为两层，离心后收集下层氧仿相。在上层体系中加入1ml氯仿，重复旋涡振荡和离心操作，将提取液合并，氮气吹干，剩余在离心管中的组分即为油脂。
4.如权利要求1所述的一种高产PUFAs微藻的筛选及胁迫培养方法，其特征在于，采用分段培养的方法进行胁迫培养，O-7天为正常生长阶段，7-14天为胁迫培养阶段。
5.如权利要求1所述的一种高产PUFAs微藻的筛选及胁迫培养方法，其特征在于，脂肪酸组分测定包括对总脂、中性脂、糖脂、磷脂进行测定。
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CN111172039A (zh) * 2020-03-10 2020-05-19 宁波大学 一种两段式低氮低磷胁迫微藻培养方法

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