CN108251490B - 一种提高液体发酵灵芝菌丝体中灵芝酸a的发酵培养基及发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高液体发酵灵芝菌丝体中灵芝酸A的发酵培养基及发酵方法。以重量百分含量计，所述发酵培养基的组成为：玉米粉2％～5％、黄豆粉1％～2％、葡萄糖1％～3％、磷酸二氢钾0.1％～0.5％、硫酸镁0.05％～0.1％、维生素B150～100ppm、茉莉酸甲酯200～300μmol/L，余量为水。灵芝菌丝体在上述发酵培养基中发酵，能够延长发酵时间，得到高含量灵芝酸A的发酵灵芝菌丝体产物。

Description

一种提高液体发酵灵芝菌丝体中灵芝酸A的发酵培养基及发 酵方法

技术领域

本发明属于食药用菌生产工艺技术领域，具体涉及一种提高液体发酵灵芝菌丝体中灵芝酸A的发酵培养基及发酵方法，提高灵芝菌丝体的灵芝酸A含量。

背景技术

灵芝被我国历代医药学家誉为扶正固本的“瑞草”，对灵芝的药理作用已有大量研究，研究表明灵芝具有广泛的药理作用，如抗肿瘤作用、免疫调节作用、抗放射与抗化疗作用、镇静安神作用、强心及抗心肌缺血作用、调节血脂作用、降血糖作用、平喘作用、保肝作用、抗缺氧和抗衰老作用等。随着现代科学对灵芝研究的深入，至目前为止，总共分离到350余种化学成分，主要是多糖类、萜类、生物碱类、肽类、氨基酸类、甾醇类、维生素类等。

现代药理研究证明，灵芝三萜具有抗肿瘤、保护肝脏、抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性、抗组织胺释放、抗衰老、抗微生物、降血脂、降血糖等作用。现阶段获取灵芝三萜材料的方法有3种，一是野外子实体或人工栽培的子实体，二是孢子，三是液体发酵菌丝体和发酵液。与人工栽培灵芝相比，通过液体深层发酵技术生产灵芝三萜具有不受季节影响、生产周期短、三萜类含量相对稳定等特点，现成为获取灵芝三萜的最有效方法。

运用液体深层发酵技术生产的灵芝菌丝中总三萜含量丰常高，其含量可以达到是栽培灵芝子实体和灵芝孢子粉的2～3倍。属总三萜中灵芝酸A是灵芝中一类具有明显药理活性的天然化合物，是实现增强免疫力、保肝护肝、排毒、降血压、降胆固醇、抗肿瘤等作用主要功效成份。灵芝酸A含量在发酵的菌丝体及发酵液中却非常低，含量极低，约为5～10mg/L，含量不高，药理作用不明显。根据研究发现，灵芝酸A与灵芝生长时间有着密切关系，随着时间的延长灵芝酸A才会逐步合成。但通过液体深层发酵技术生产灵芝菌丝发酵时间过长后，在未达到合成灵芝酸A时，就会产生菌丝自溶，造成产量下降，成本大幅度提高等问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种提高液体发酵灵芝菌丝体中灵酸A的发酵培养基及发酵方法，延长发酵时间，提高灵芝菌丝体发酵产物中灵芝酸A的含量，加强灵芝菌丝体的药理活性。

本发明的技术方案如下：

一种提高液体发酵灵芝菌丝体中灵芝酸A的发酵培养基，以重量百分含量计，所述发酵培养基的组成为：玉米粉2％～5％、黄豆粉1％～2％、葡萄糖1％～3％、磷酸二氢钾0.1％～0.5％、硫酸镁0.05％～0.1％、维生素B1 50～100ppm、茉莉酸甲酯200～300μmol/L，余量为水。

优选的，所述发酵培养基的pH值为6.0～7.0。

本发明还提供了一种提高液体发酵灵芝菌丝体中灵芝酸A的发酵方法，包括以下步骤：将灵芝菌丝体种子液接种至上述技术方案所述发酵培养基中进行发酵，所述发酵的温度为25～26℃，当发酵培养基的pH值降至3.5～4.0时，终止发酵。

优选的，所述发酵的时间为3～4天。

优选的，所述灵芝菌丝体种子液的接种量为10～15％。

优选的，所述终止发酵后还包括：将发酵后的培养基过滤、干燥后粉碎，得到灵芝菌丝体。

优选的，所述灵芝菌丝体种子液为灵芝菌丝体菌种在液体培养基中25～26℃下培养得到，所述液体培养基按照质量百分数计，包括玉米粉2％～4％、黄豆粉1％～2％、葡萄糖1％～3％、酵母膏1％、磷酸二氢钾0.1％～0.5％、硫酸镁0.05％～0.1％、维生素B1 50～100ppm，余量为水。

优选的，所述培养包括活化培养和放大培养。

更优选的，所述活化培养的时间为3～4天，所述放大培养的周期为2～3天。

本发明还包括上述任意一项所述方法制备得到的灵芝菌丝体，所述灵芝菌丝体中灵芝酸A的含量为60～105mg/g。

现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明提供了一种提高液体发酵灵芝菌丝体中灵芝酸A的发酵培养基，以重量百分含量计，所述发酵培养基的组成为：玉米粉2％～5％、黄豆粉1％～2％、葡萄糖1％～3％、磷酸二氢钾0.1％～0.5％、硫酸镁0.05％～0.1％、维生素B1 50～100ppm、茉莉酸甲酯200～300μmol/L，余量为水。所述发酵培养基中添加了一定量的茉莉酸甲酯，优化培养基配方，能够延长灵芝菌丝体的发酵时间，使菌丝得率不减少情况下确保灵芝酸A的合成时间，提高了发酵产物中灵芝酸A的含量。

本发明提供的一种提高液体发酵灵芝菌丝体中灵芝酸A的发酵方法，用含茉莉酸甲酯的培养基对灵芝菌丝体进行液体深层发酵，使灵芝发酵培养时间延长至3～4天，菌丝自溶后再培养，让灵芝酸A二级代谢时大量合成，形成灵芝菌丝体结构的成分。这样生产出来的灵芝菌丝体中灵芝酸A含量高达60～105mg/L，为灵芝的高效药用价值开发提供了一种途径。且生产过程简单可控，可实现批量生产。

附图说明

图1为本发明液体发酵灵芝菌丝体的发酵流程。

具体实施方式

本发明提供了一种提高液体发酵灵芝菌丝体中灵芝酸A的发酵培养基，以重量百分含量计，所述发酵培养基的组成为：玉米粉2％～5％、黄豆粉1％～2％、葡萄糖1％～3％、磷酸二氢钾0.1％～0.5％、硫酸镁0.05％～0.1％、维生素B1 50～100ppm、茉莉酸甲酯200～300μmol/L，余量为水。

在本发明中，所述发酵培养基的组成优选为：玉米粉3％～4％、黄豆粉1.2％～1.8％、葡萄糖1.5％～2.5％、磷酸二氢钾0.2％～0.4％、硫酸镁0.06％～0.08％、维生素B160～90ppm、茉莉酸甲酯220～270μmol/L，余量为水。

本发明中，所述发酵培养基的pH优选为6.0～7.0，更优选为6.5～7.0。

本发明的发酵培养基中添加了一定量的茉莉酸甲酯，通过优化培养基配方，能够延长灵芝菌丝体的发酵时间，使菌丝得率不减少情况下确保灵芝酸A的合成时间，提高发酵产物中灵芝酸A的含量。

将本发明所述发酵培养基的组分按照上述比例进行混合，制备得到液体发酵灵芝菌丝体的发酵培养基。

本发明还提供了一种提高液体发酵灵芝菌丝体中灵芝酸A的发酵方法，包括以下步骤：将灵芝菌丝体种子液接种至上述技术方案所述发酵培养基中进行发酵，所述发酵的温度为25～26℃，当发酵培养基的pH值降至3.5～4.0时，终止发酵。

本发明所述灵芝菌丝体种子液为灵芝菌丝体菌种在液体培养基中25～26℃下培养得到，所述液体培养基为保藏灵芝菌丝体菌种的平板培养基经稀释后得到的液体培养基。本发明所述液体培养基按照质量百分数计，包括玉米粉2％～4％、黄豆粉1％～2％、葡萄糖1％～3％、酵母膏1％、磷酸二氢钾0.1％～0.5％、硫酸镁0.05％～0.1％、维生素B1 50～100ppm，余量为水；优选为玉米粉2.5％～3.5％、黄豆粉1.5％、葡萄糖1.5％、酵母膏1％、磷酸二氢钾0.2％～0.4％、硫酸镁0.06％～0.08％、维生素B1 60～90ppm，余量为水。所述平板培养基为本领域中的常规灵芝菌丝体保藏的培养基，如PDA培养基。

本发明对灵芝菌丝体菌种的来源没有特殊限定，采用本领域中的常规保藏或市售灵芝菌丝体菌种即可。

本发明中，所述培养优选包括依次进行的活化培养和放大培养。所述活化培养和放大培养所用的培养基优选为上述技术方案所述的液体培养基。

本发明所述活化培养为，将带有灵芝菌丝体的平板培养基用水稀释接种于液体培养基中，所述稀释的倍数优选为1平方厘米左右的带培养基平板菌种稀释接种至100～300ml液体培养基中；更优选为1平方厘米左右的带培养基平板菌种稀释接种至150ml液体培养基中。将稀释后的液体培养基震荡培养。所述震荡的速度为100～120转/min，更优选为110转/min。所述活化培养的时间优选为3～4天。本发明所述活化培养优选在搅拌罐中进行，将所述搅拌罐在振荡器中进行震荡培养。具体的，本发明所述搅拌罐优选为30L搅拌罐。震荡培养后，得到活化的灵芝菌丝体。

将活化的灵芝菌丝体进行放大培养。本发明所述放大培养优选为一级放大培养和二级放大培养。所述放大培养优选在发酵罐中进行，根据发酵罐的容积从小到大进行逐级放大，本发明优选一级放大培养采用300～500L种子罐，二级放大培养采用1～2吨的种子罐。本发明优选每级放大培养的周期优选为2～3天。在发酵2～3天后，液体培养基中的菌丝量过大，液体培养基所提供的营养不能支持菌丝生长所需，从而出现已经“衰老的”菌丝自溶于培养液中，造成菌丝提率下降。因此，放大培养均在出现灵芝菌丝体自溶现象前终止发酵。放大培养后，得到的培养液为灵芝菌丝体种子液。

将灵芝菌丝体种子液接种于本发明的发酵培养基中进行发酵。所述接种量优选为10～15％，更优选为12～13％。本发明所述发酵为有氧发酵。所述发酵过程中的通气比优选为0.5～1.0，更优选为0.6～0.8；所述发酵过程中的搅拌速率为100～120转/min，更优选为110转/min。

随着发酵的进行，发酵培养基的pH值逐渐下降，优选当发酵培养基的pH值降至3.8～3.9时，停止发酵。此时，灵芝菌丝体的发酵时间优选为3～4天。而常规不添加茉莉酸甲酯的液体培养基，对灵芝菌丝体的发酵时间少于3天即出现自溶现象，导致没有足够的时间在灵芝菌丝体中合成灵芝酸A，发酵产物中灵芝酸A的含量很低。

本发明终止发酵后，将带有灵芝菌丝体的发酵培养基取出，过滤、干燥后粉碎，得到灵芝菌丝体产物。本发明所述过滤优选为板框压滤，所述压力优选为50～60kg，更优选为55kg。本发明所述干燥优选为真空干燥，所述真空干燥的温度优选为60～65℃，更优选为62～64℃。本发明所述粉碎的粒径优选为60～80目，更优选为65～70目。

本发明上述发酵方法得到的发酵灵芝菌丝体中，灵芝酸A的含量能够达到60～105mg/g，大大提高了灵芝菌丝体的药物活性，提高其增强免疫力、保肝护肝、排毒、降血压、降胆固醇、抗肿瘤等作用效果。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1)、选取灵芝菌丝体菌种：

2)、摇床种：保持温度在25℃，用1平方厘米左右的带培养基平板菌种稀释到300ml液体培养基中，置于振荡器上，并搅拌3天，控制搅拌速度为100转/min；所述液体培养基包括玉米粉2％、黄豆粉1％、葡萄糖1％、酵母膏1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、维生素B1 50ppm，余量为水。

3)、一级放大：保持温度在25℃，将所述步骤2)中搅拌后的培养基负压吸入一300L带有液体培养基的种子罐中，培养2天；

4)、二级放大：保持温度在25℃，将所述步骤3)中搅拌后的液体培养基负压吸入一1.5吨带有液体培养基的种子罐中，培养2天，得到灵芝菌丝体种子液；

5)、茉莉酸甲酯培养基发酵：保持温度在25℃，将所述步骤4)中得到的灵芝菌丝体种子液1000L负压吸入一7吨的发酵罐中，并加入5000L含有茉莉酸甲酯(254μmol/L)的发酵培养基中，发酵3天；

按重量分数计，所述茉莉酸甲酯培养基的组成为：玉米粉2％、黄豆粉1％、葡萄糖1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、维生素B1 50ppm、茉莉酸甲酯254μmol/L，余量为去离子水。

发酵后的液体培养基的pH值为3.8。

6)、板框压滤：将所述步骤5)发酵后的液体培养基取出，用50kg的压力压滤，压干，得到固体初产物；

7)、干燥粉碎：将所述步骤6)得到的固体初产物置于真空中干燥，干燥温度为60℃，干燥完成后粉碎，得到粒径为60目的高含量灵芝酸A灵芝菌丝体产物，得率为2％。

实施例2

1)、选取灵芝菌丝体菌种：

2)、摇床种：保持温度在26℃，用1平方厘米左右的带培养基平板菌种稀释到150ml液体培养基中，置于振荡器上，并搅拌4天，控制搅拌速度为120转/min；所述液体培养基按照质量百分数计，包括玉米粉4％、黄豆粉2％、葡萄糖1％～3％、酵母膏1％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸镁0.1％、维生素B1 100ppm，余量为水。

3)、一级放大：保持温度在26℃，将所述步骤2)中搅拌后的培养基负压吸入一300L带有液体培养基的种子罐中，培养3天；

4)、二级放大：保持温度在26℃，将所述步骤3)中搅拌后的液体培养基负压吸入一1.5吨带有液体培养基的种子罐中，培养3天，得到灵芝菌丝体种子液；

5)、茉莉酸甲酯培养基发酵：保持温度在26℃，将所述步骤4)中得到的灵芝菌丝体种子液1000L负压吸入一7吨的发酵罐中，并加入5000L含有茉莉酸甲酯(300μmol/L)的发酵培养基中，发酵3天；

按重量分数计，所述茉莉酸甲酯培养基的组成为：玉米粉5％、黄豆粉2％、葡萄糖3％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸镁0.1％、维生素B1 100ppm、茉莉酸甲酯300μmol/L，余量为去离子水。

发酵后的液体培养基的pH值为4.0。

6)、板框压滤：将所述步骤5)发酵后的液体培养基取出，用60kg的压力压滤，压干，得到固体初产物；

7)、干燥粉碎：将所述步骤6)得到的固体初产物置于真空中干燥，干燥温度为65℃，干燥完成后粉碎，得到粒径为80目的高含量灵芝酸A灵芝菌丝体产物，得率为2.3％。

实施例3

1)、选取灵芝菌丝体菌种：

2)、摇床种：保持温度在26℃，用1平方厘米左右的带培养基平板菌种稀释到200ml液体培养基中，置于振荡器上，并搅拌3天，控制搅拌速度为110转/min；所述液体培养基按照质量百分数计，包括玉米粉3％、黄豆粉2％、葡萄糖2％、酵母膏1％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.08％、维生素B1 75ppm，余量为水。

3)、一级放大：保持温度在25℃，将所述步骤2)中搅拌后的培养基负压吸入一300L带有液体培养基的种子罐中，培养2天；

4)、二级放大：保持温度在25℃，将所述步骤3)中搅拌后的液体培养基负压吸入一1.5吨带有液体培养基的种子罐中，培养2天，得到灵芝菌丝体种子液；

5)、茉莉酸甲酯培养基发酵：保持温度在26℃，将所述步骤4)中得到的灵芝菌丝体种子液1000L负压吸入一7吨的发酵罐中，并加入5000L含有茉莉酸甲酯(200μmol/L)的发酵培养基中，发酵3天；

按重量分数计，所述茉莉酸甲酯培养基的组成为：玉米粉4％、黄豆粉2％、葡萄糖2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.07％、维生素B1 80ppm、茉莉酸甲酯300μmol/L，余量为去离子水。

发酵后的液体培养基的pH值为3.9。

6)、板框压滤：将所述步骤5)发酵后的液体培养基取出，用60kg的压力压滤，压干，得到固体初产物；

7)、干燥粉碎：将所述步骤6)得到的固体初产物置于真空中干燥，干燥温度为63℃，干燥完成后粉碎，得到粒径为70目的高含量灵芝酸A灵芝菌丝体产物，得率为2.1％。

对比例

其他步骤如同实施例1，只是上述步骤5)中的发酵培养基中不含有茉莉酸甲酯。步骤5)发酵至第3天时出现灵芝菌丝体自溶现象。灵芝菌丝体自溶前，得到的灵芝菌丝体产物得率最高为1.3％。

实施例4

检测实施例1～3的灵芝菌丝体中灵芝酸A的含量

灵芝酸检测方法如下：

1、灵芝酸A样品：

市场购灵芝酸A(ganoderic acidA)对照品，质量分数以95.0％计。

2、对照品溶液的制备

精密称取减压干燥至恒定质量的灵芝酸A11.16mg，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得质量浓度为446.4μg/mL的对照品溶液。

3、检测样品溶液的制备

取灵芝菌丝粉粉碎过1号筛。取1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇溶液25ml，超声处理2次，每次40min，滤过，合并滤液，置水浴锅上蒸干。残渣加甲醇溶解，转移至5mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，取续滤液，0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。

4、色谱条件

色谱柱采用WelchXtimate^TM-18C色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)流动相为乙腈-体积分数0.01％醋酸(体积比37：63)流速为1mL/min，柱温为30℃，进样量为10μL，蒸发光散射器漂移管温度为105℃，空气流速为2.8L/min，。分别精密吸取空白溶剂甲醇、对照品、供试品溶液10μL注入高效液相色谱仪，所得HPLC色谱图测得灵芝酸A含量。结果见表1：

表1实施例1～3的灵芝菌丝体中灵芝酸A的含量

含量(mg/g)	实施例1	实施例2	实施例3	对比例
					灵芝酸A	98.2	101.5	72.6	31.3

通过表1可以看出，本发明的发酵培养基能够延长灵芝菌丝体的发酵时间，使菌丝得率不减少情况下确保灵芝酸A的合成时间，提高发酵产物中灵芝酸A的含量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种提高液体发酵灵芝菌丝体中灵芝酸A的发酵方法，其特征在于，以重量百分含量计，发酵培养基的组成为：玉米粉2％～5％、黄豆粉1％～2％、葡萄糖1％～3％、磷酸二氢钾0.1％～0.5％、硫酸镁0.05％～0.1％、维生素B1 50～100ppm、茉莉酸甲酯200～300μmol/L，余量为水；所述发酵培养基的pH值为6.0～7.0；

所述发酵步骤为：将灵芝菌丝体种子液接种至所述发酵培养基中进行发酵，所述发酵的温度为25～26℃，当发酵培养基的pH值降至3.5～4.0时，终止发酵；

所述发酵的时间为3～4天；

所述灵芝菌丝体种子液的接种量为10～15％；

所述终止发酵后还包括：将发酵后的培养基过滤、干燥后粉碎，得到灵芝菌丝体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述灵芝菌丝体种子液为灵芝菌丝体菌种在液体培养基中25～26℃下培养得到，所述液体培养基按照质量百分数计，包括玉米粉2％～4％、黄豆粉1％～2％、葡萄糖1％～3％、酵母膏1％、磷酸二氢钾0.1％～0.5％、硫酸镁0.05％～0.1％、维生素B150～100ppm，余量为水。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养包括活化培养和放大培养。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述活化培养的时间为3～4天，所述放大培养的周期为2～3天。

5.由权利要求1～4任意一项所述方法制备得到的灵芝菌丝体，其特征在于，所述灵芝菌丝体中灵芝酸A的含量为60～105mg/g。

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